تغییرات غلظت کربوهیدرات محلول و نشاسته و ویژگی‌های ریخت‌شناسی ریشه در ژنوتیپ‌های شبدر Trifolium spp. تحت تنش سرما

گستردگی کشت شبدر و کاشت پاییزه گونه‌های آن، احتمال مواجهه با تنش سرما را افزایش می‌دهد. انتخاب تاریخ کاشت و ژنوتیپ مناسب در هر منطقه می‌تواند مانع از کاهش عملکرد ناشی از تنش‌های محیطی به‌ویژه تنش سرما شود. در این زمینه شناسایی مکانیسم‌های مواجهه گیاهان با سرما برای انتخاب بهترین تاریخ کاشت و ژنوتیپ در گیاه شبدر می‌تواند کمک شایانی کند (Zamanian and Yamada, 2017). صفات مرتبط با تحمل به سرما را می‌توان در دو گروه تقسیم‌بندی کرد. گروه اول که بقای گیاهان در طول زمستان را موجب می‌شوند و گروه دوم آنهایی که رشد مجدد بهاره را تقویت می‌کنند. رشد مجدد بهاره در شروع فصل بهار با فتوسنتز و ظرفیت رشد در دماهای پایین‌تر از دمای بهینه مرتبط است، درحالی‌که بقای گیاه در زمستان به‌طور عمده با سنتز و کاتابولیسم اسمولیت‌های سازگار در طول زمستان مرتبط است (Annicchiarico et al., 2015). در شبدر سفید (Trifolium repens L.) متداول‌ترین اسمولیت‌های سازگار قندهای محلول، پروتئین و اسیدهای آمینه از جمله پرولین هستند (Goulas et al., 2003; Annicchiarico et al., 2015). در این گونه گیاهی بین کربوهیدرات محلول موجود در استولن و تحمل سرما رابطه فیزیولوژیک وجود دارد (Dalmannsdóttir et al., 2001). در شبدر سفید تجمع نشاسته در استولن‌ها و ریشه‌ها در آغاز فصل سرما به‌عنوان یک فرآیند سازگاری القا می‌شود. نشاسته در طول دوره سرما، انرژی لازم برای فعالیت متابولیک پایه را فراهم می‌کند و هیدرولیز آن کربوهیدرات محلول را تأمین می‌کند. غلظت بیشتر کربوهیدرات‌های محلول در استولن پتانسیل اسمزی را افزایش و نقطه انجماد سلول را کاهش می‌دهد (Castonguay et al., 2006; Dalmannsdottir et al., 2001). مطالعات در شرایط کنترل‌شده نشان داده است که محتوای بیشتر کربوهیدرات‌های محلول در استولن بقای گیاه را در شرایط سرد افزایش می‌دهد (Dalmannsdottir et al., 2001; Frankow-Lindberg, 2001). بر اساس این رابطه، غلظت کربوهیدرات محلول در استولن به‌عنوان معیار انتخاب امیدوارکننده‌ برای برنامه‌های اصلاح‌نژاد در نظر گرفته می‌شود که هدف آنها توسعه ارقام متحمل به سرما است. Inostroza و همکاران (2017) نشان دادند میزان تجزیه کربوهیدارت‌ها در طول دوره زمستان ارتباط ژنتیکی معنی‌داری با تولید ماده خشک در طول بهار دارد که نتیجه مکانیسم‌های ژنتیکی-فیزیولوژیکی طی دوره سرما است.

در پژوهش دیگر نشان داده شد که در شبدر سفیدی که نسبت به سرما سازگار شده است، تحت تنش سرما محتوای نسبی آب برگ نسبت به گیاهانی که به سرما سازگار نشده‌اند، بیشتر حفظ می‌شود و این گیاهان تحت تنش سرما تنظیم اسمزی انجام می‌دهند. فقط 30 تا 40 درصد کاهش در پتانسیل اسمزی تحت تنش سرما به‌علت افزایش کربوهیدرات‌های محلول ایجاد می‌شود. ترکیبات دیگری از جمله اسیدهای آمینه و مواد معدنی نیز در کاهش پتانسیل اسمزی و تنظیم اسمزی در گیاهان سازگار‌شده به سرما ممکن است نقش داشته باشند (Santarius, 1994). کربوهیدرات‌ها در گیاه به‌راحتی منتقل می‌شوند و به‌عنوان منبع انرژی قابل دسترس، می‌توانند نقطه انجماد را پایین بیاورند. اگرچه ممکن است تنها راهکار مقاومت به تنش یخ‌زدگی نباشند (Guinchard et al., 1997). محتوای کربوهیدرات درگیاهان سازگارنشده طی تنش سرما افزایش و مقدار نشاسته طی تنش یخ‌زدگی کاهش می‌یابد. گیاهانی که با یخ‌زدگی مواجه شده‌اند، تنها زمانی غلظت نشاسته بالاتری در استولن‌های خود نشان می‌دهند که قبلاً نسبت به سرما سازگار شده باشند. محتوای بالای نشاسته در شبدر سفید پیش‌نیازی برای بقای زمستانه است و غلظت بالای نشاسته در استولن ظرفیت بهتری برای رشد مجدد بهاره از طریق انتقال مجدد خود فراهم می‌کند (Guinchard et al., 1997). در دم‌گربه چمنی (Phleum pratense L.) تجمع مقادیر بالای کربوهیدرات‌های محلول مانند فروکتان با درجه بالای پلیمریزاسیون ممکن است در مقاومت بیشتر زمستانه نقش داشته باشد. نقش کارکردی مستقیم فروکتان در تحمل تنش سرما مرتبط با افزایش پایداری غشاء سلولی است (Sandve et al., 2011). در شبدر قرمز (Trifolium pratense L.)، افزایش غلظت ساکاروز طی دوره سازگار شدن به سرما در پاییز با کاهش شدید غلظت نشاسته در طوقه همراه بود. غلظت فروکتوز و گلوکز ناچیز بود و طی دوره سازگار شدن و زمستان‌گذرانی به‌طور معنی‌داری کاهش یافت. مقدار رافینوز که پیش از دوره سازگارشدن به سرما مقدار ناچیز و غیرقابل اندازه‌گیری داشت، در اواسط این دوره به مقدار 3/1 میلی‌گرم در گرم ماده خشک رسید (Bertrand et al., 2020). تجزیه و تحلیل کامل تغییرات کربوهیدرات‌ها و زمستان‌گذرانی، حاکی از افزایش چشمگیر ساکاروز همراه با کاهش نشاسته در طوقه شبدر قرمز طی دوره خوسرمایی پاییزه بود. تجزیه نشاسته، قندهای محلول را تأمین می‌کند که این امر نقش مهمی در دستیابی به تحمل انجماد در بسیاری از گونه‌های علفی معتدل دارد ((Klotke et al., 2004 و میزان آن برای تأمین پایدار کربن در طول زمستان بسیار تحت کنترل است (Lu et al., 2005). همچنین، Wani و همکاران (2018) افزایش درخور توجهی در میزان کربوهیدرات محلول در گیاه کیسه کشیش (Capsella bursa pastoris L.) در واکنش به تنش سرما مشاهده کردند. در یونجه ارتباط قوی بین تحمل به تنش سرما و غلظت کربوهیدرات ریشه و طوقه گزارش شده است (Castonguay et al., 2006; Bertrand et al., 2017) و این تحمل به سرما، بیشتر با تجمع الیگوساکاریدهای خانواده رافینوز (رافینوز و استاکیوز) مرتبط بود تا ساکاروز (Castonguay et al., 1995). الیگوساکاریدهای خانواده رافینوز و ساکاروز برای بیشینه محافظت از غشاء به‌صورت هم‌افزا عمل می‌کنند (Hincha et al., 2002; Uemura and Steponkus, 2003) در مطالعه دیگری در ارتباط با گیاه یونجه، Xu و همکاران (2020) اعلام کردند که ژنوتیپ متحمل به سرمای یونجه، محتوای نشاسته بیشتری در ابتدای تیمار سرما داشت و متعاقب آن محتوای بیشتری از رافینوز و استاکیوز پس از سازگاری به سرما و حذف سازگاری به سرما مشاهده شد. در این فرایند ابتدا نشاسته به مالتوز هیدرولیز می‌شود و در ادامه مالتوز به ساکاروز و سپس ساکاروز، رافینوز و استاکیوز را تولید می‌کند. مشابه این فرایند در آرابیدوپسیس نیز مشاهده شد (Kaplan et al., 2006). 

تحقیقات نشان داد که دامنه دمایی 24 تا 32 درجه سانتی‌گراد، مقدار کل ماده قابل هضم را افزایش و مقدار مجموع کربوهیدرات‌های غیرساختمانی را کاهش می‌دهد، ولی در شرایط سردتر ذخیره این مواد افزایش پیدا می‌کند. همچنین، مقدار انباشت پتاسیم، فسفر و کلسیم در شرایط سردتر (18-10 درجه سانتی‌گراد) بیش از مقدار آن در شرایط گرم‌تر (35-18 درجه سانتی‌گراد) است (Casler, 2001). در مطالعه انجام‌شده توسط Moriyama و همکاران (2003) نشان داده شده است که میزان تجمع کربوهیدرات‌های محلول در گندمیان مناطق معتدله می‌تواند به‌عنوان منبع انرژی در دماهای پایین برای گیاه محسوب ‌شود. در گراس‌ها (Tronsmo, 1993) و غلات (Gaudet et al., 2002) نیز بین کربوهیدرات‌های محلول و تحمل تنش سرما و یخبندان ارتباط دیده شد.

یکی از چالش‌های مهم در کشور ایران، کمبود علوفه مورد نیاز احشام است. افزایش سطح زیر کشت، افزایش عملکرد در واحد سطح و معرفی ارقام پُرمحصول گونه‌های شبدر از راهکارهای مناسب برای افزایش تولید علوفه است. باتوجه‌به اینکه در حال حاضر در ایران فقط دو گونه شبدر ایرانی و شبدر برسیم کشت می‌شود و با عنایت به شرایط متنوع آب‌و‌هوایی در کشور می‌توان گفت امکان کشت گونه‌های جدید شبدر مانند شبدر قرمز و لاکی وجود دارد. توسعه کشت گونه‌های مختلف شبدر امکان مواجه با تنش سرما و یخ‌زدگی را بالا می‌برد. این پژوهش با هدف شناخت صفات ریخت‌شناسی ریشه در کنار صفات فیزیولوژیک مانند غلظت کربوهیدرات‌های ریشه و طوقه و ارتباط این صفات با تحمل به تنش سرما (کشت‌های تأخیری) و سرعت رشد مجدد بهاره در گونه‌های مختلف شبدر (به‌ویژه در مورد ارقام بومی گونه شبدر ایرانی که منشأ آن کشور ایران است) انجام شده است. این بررسی می‌تواند امکان انتخاب ژنوتیپ‌های متحمل به سرما و انتخاب بهترین تاریخ کاشت را در نقاطی که دارای تنش‌های سرما و یخ‌زدگی است، فراهم کند. همچنین، ارتباط بین گروه‌های رسیدگی (زودرس و دیررس) با میزان کربوهیدرات‌های محلول و تحمل به سرما در ژنوتیپ‌های شبدر بررسی شده است.

مواد و روش‌ها

این پژوهش در مزرعه تحقیقاتی مؤسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر کرج (طول جغرافیایی 51 درجه و6 دقیقه شرقی و عرض جغرافیایی 35 درجه و 59 دقیقه شمالی و ارتفاع 1321 متری از سطح دریا)، ایران، طی دو سال زراعی 90-1389 و 91-1390 اجرا شد. منطقه کرج دارای آب‌و‌هوای سرد و نیمه‌سرد خشک با متوسط دمای سالانه 97/14 درجه سانتیگراد است. بیشینه درجه حرارت مربوط به ماه‌های تیر و مرداد و کمینه درجه حرارت مربوط به دی‌ماه است. بر اساس میانگین دو ساله بیشترین تعداد روزهای یخبندان مربوط به ماه ‌دی (میانگین 5/19 روز) است. متوسط بارندگی 30 ساله منطقه کرج 240 میلی‌متر گزارش شده است. عمده بارندگی‌ها در اواخر پاییز و اوایل بهار انجام شده، کمترین بارندگی در ماه‌های تیر و مرداد و بیشترین بارندگی در ماه‌های فروردین و آبان صورت گرفته است. شکل (1) دماهای کمینه، بیشینه و میزان بارش را به‌صورت روزانه طی فصل رشد نشان می‌دهد. ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی خاک محل آزمایش در جدول (1) آمده است (Iran Meteorological Organization).  تعداد روزهای یخبندان طی دو فصل زراعی در جدول (2) آورده شده است.

شکل 1- دماهای کمینه و بیشینه (سانتی گراد) و بارش روزانه (میلی متر) سال اول (A) و سال دوم (B)

Figure 1. Daily maximum and minimum air temperatures (°C), and precipitation (mm) recorded during the first (A) and second year (B)

جدول 1- ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی خاک محل آزمایش

Table 1- physico-chemical properties of the soil of the experimental field

جدول 2- آمار هواشناسی در ماه‌های رشد گونه‌های شبدر در منطقه کرج (90-1389 و 91-1390)

Table 2- Meteorological statistics in the months of clover species growth in Karaj region (2010-2011 and 2011-2012)

برای اجرای این پژوهش، هر ساله قطعه زمین یکنواخت به مساحت حدود 1500 متر مربع که در سال قبل به‌صورت آیش بود، انتخاب گردید. در مرحله اول حدود 50 کیلوگرم کود سوپر فسفات تریپل و 40 کیلوگرم کود نیتروژن (کود استارتر) با کودپاش در سطح زمین پخش و سپس توسط فاروئر اقدام به احداث جوی و پشته‌ها با فاصله بین خطوط50 سانتی‌متر گردید. پس از آماده نمودن زمین آزمایش و ایجاد جوی و پشته‌ها کاشت به‌طریق خشکه‌کاری انجام گرفت. میزان بذر مصرفی در هکتار بر مبنای 20 کیلوگرم در هکتار برای شبدر ایرانی و شبدر قرمز و 25 کیلوگرم در هکتار برای شبدر برسیم و شبدر لاکی محاسبه شد. تاریخ نخستین آبیاری به‌عنوان تاریخ کاشت محسوب شد (Zmanian and Yamada, 2017). برای اندازه‌گیری کربوهیدرات‌های محلول در ریشه، نمونه‌برداری از پلات‌ها در زمستان هنگام رکود رشد بوته‌ها، شروع رشد. مجدد در اسفند، قبل و10-7 روز پس از چین‌برداری علوفه (شامل ریشه و 5 سانتی‌متری بالای ریشه) صورت گرفت. نمونه‌ها در آون با دمای 70 درجه سانتیگراد به‌مدت 48 ساعت خشک و پس از پودر کردن کربوهیدرات‌های محلول با استفاده از دستگاه طیف‌سنج مادون قرمز NIR مدل TRIM-FM-IMKO- 3 ساخت کشورفرانسه اندازه‌گیری شد (Sanada and Yamada, 2010).

آزمایش به‌صورت کرت‌های دوبار خرد شده در زمان انجام شد و در مورد صفاتی که تعداد رقم‌ها در چین‌ها یکسان نبود، آزمایش به‌صورت اسپلیت اسپلیت پلات در زمان آشیانه‌ای انجام شد. در پایان هر سال آزمایش، روی داده‏ها تجزیه آماری ساده و در پایان دوره اجرای طرح، تجزیه واریانس مرکب به‌منظور بررسی اثر متقابل بین سال‌ها و ژنوتیپ (بر مبنای مدل تصادفی بودن اثر سال) انجام شد. مقایسه میانگین‏ها به روش دانکن در سطح احتمال 5% صورت گرفت. برای تعیین روابط بین صفات و تفسیر نتایج، روابط همبستگی بین صفات محاسبه شد. آنالیزهای آماری توسط نرم‌افزار SAS انجام شد.

جدول 3- اسامی و مشخصات رقم‌های شبدر مورد بررسی

Table 3- The name and origin of clover genotypes studied

نتایج و بحث

ویژگی‌های ریخت‌شناختی ریشه

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که بین تاریخ‌های کاشت و رقم‌ها از نظر طول ریشه، وزن تر ریشه، وزن خشک ریشه، نسبت ریشه به اندام هوایی، قطر طوقه، وزن تر طوقه و وزن خشک طوقه تفاوت معنی‌داری وجود دارد (جدول 4). نتایج مقایسه میانگین نشان داد که در تاریخ کاشت اول شبدر ایرانی (لاین 13) و در تاریخ‌های کاشت دوم و سوم شبدر ایرانی (یک‌چین) بیشترین طول ریشه و وزن خشک ریشه را نشان دادند. در تاریخ کاشت اول، شبدر ایرانی (متوسط‌ رس) بالاترین قطر طوقه را نشان داد، درحالی‌که در تاریخ‌های کاشت دوم و سوم، شبدر ایرانی (دیر رس) بیشترین قطر طوقه را نشان داد. تأخیر در تاریخ کاشت از تاریخ کاشت اول تا سوم موجب کاهش 43 درصدی در وزن خشک و تر طوقه شد. شبدر ایرانی (یک‌چین) از نظر وزن تر و خشک طوقه در هر سه تاریخ کاشت در گروه اول آماری قرار گرفت. بالاترین نسبت ریشه به شاخساره در تاریخ‌های کاشت اول و دوم متعلق بود به شبدر قرمز و در تاریخ کاشت سوم، شبدر ایرانی (زود رس) بالاترین میزان را نشان داد (جدول 5). با تأخیر در کاشت، طول ریشه، وزن تر ریشه، وزن خشک ریشه و قطر طوقه در ژنوتیپ‌های شبدر کاهش یافت. نسبت ریشه به اندام هوایی فقط با تأخیر در کاشت از تاریخ کاشت اول به دوم در تمام ژنوتیپ‌ها افزایش داشت (p<0.01) و با تأخیر بیشتر به تاریخ کاشت سوم کاهش اندک و غیر معنی‌دار نشان داد. درجه مقاومت به سرما به شرایط مورفوفیزیولوژیک گیاه در زمستان بستگی دارد. اندام‌ها و بافت‌های مختلف از نظر مقاومت به تنش سرما و یخبندان نسبت به هم متفاوت هستند. در این ارتباط بیان شده است که گزینش برای بهبود بنیه ریشه‌های نخستین صفتی مهم برای افزایش تحمل سرما است (Imran et al., 2013). همچنین Kerstin و همکاران (2009) بیان داشتند که حجم ریشه معیار مهم انتخابی برای تحمل به سرما است و تأکید کردند که در گزینش برای بهبود تحمل به سرما از والدینی استفاده شود که حجم ریشه بیشتری دارند. شدت مقاومت به تنش سرما با جذب عنصرهای غذایی خاک و افزایش غلظت کربوهیدرات‌های بافت ریشه مرتبط است (Solfjeld and Johnsen, 2006). طول ریشه را می‌توان پرکاربردترین ویژگی ریشه دانست، زیرا طول ریشه در واحد حجم خاک بهترین ویژگی برای محاسبه جذب آب توسط گیاه است (Eshghizadeh et al., 2011). با تأخیر در تاریخ کاشت به‌علت کوتاه شدن دوره رشدی با دمای مناسب و مواجه سریعتر با سرما، سیستم ریشه‌ای فرصت کمتری برای افزایش وزن و طول خود دارد. تمامی صفات ریخت‌شناسی ریشه تحت تأثیر تأخیر در تاریخ کاشت قرار گرفتند. دراین‌میان، نسبت ریشه به اندام هوایی به‌ویژه با تأخیر در کاشت از تاریخ کاشت اول به دوم افزایش معنی‌داری نشان داد. با تأخیر در کاشت از تاریخ کاشت اول به دوم، رشد شاخساره نسبت به ریشه بیشتر تحت تأثیر تغییر شرایط محیطی قرار گرفته است و در نهایت نسبت ریشه به شاخساره افزایش یافته است. تخصیص بیشتر مواد نورساختی در مراحل نخستین رشد به سمت ریشه نسبت به اندام‌های هوایی عاملی شناخته‌شده برای تحمل به سرما است (Imran et al., 2013). اندام‌های مختلف گیاهی واکنش متفاوتی به دمای کم دارند. کاهش رشد ریشه در اثر کاهش دما، خود سبب کم‌شدن ظرفیت جذب آب و مواد معدنی توسط ریشه و به‌دنبال آن ظهور آثار ثانویة ناشی از کمبود مواد غذایی و اختلال در رشد گیاه می‌شود (Zmanian and Yamada, 2017). صفاتی مانند تعداد برگ در بوته در مرحلة روزت، وزن خشک و تر طوقه، مقدار آب نسبی طوقه و بقای زمستانه LT₅₀ (دمایی که موجب از بین رفتن 50 % گیاه می‌شود) به‌عنوان شاخص‌های تحمل به تنش سرما در نظر گرفته شده است (Asghari et al., 2008).

بین طول ریشه با وزن خشک ریشه (r=0.92) (p<0.01) و بین وزن خشک ریشه با وزن خشک طوقه (r=0.83) (p<0.01) همبستگی مثبت و معنی‌داری مشاهده شد؛ این‌در‌حالی است که بین نسبت ریشه به شاخساره با طول ریشه (r=-0.58) (p<0.01)، وزن تر ریشه (r=-0.71) (p<0.01)، وزن خشک ریشه (r=-0.59) (p<0.01)، قطر طوقه (r=-0.81) (p<0.01)، وزن تر طوقه (r=-0.59) (p<0.01) و وزن خشک طوقه (r=-0.41) (p<0.01) همبستگی منفی وجود داشت و هرچه نسبت ریشه به شاخساره زیاد شد، از طول ریشه، وزن تر و خشک ریشه، قطر طوقه و وزن تر و خشک طوقه کم شد.

جدول4- تجزیه واریانس میانگین مربعات تحت تأثیر تاریخ کاشت و رقم بر ویژگی‌های ریخت‌شناختی ریشه ارقام شبدر

Table 4- analysis of variance (mean squares) for root morphological characteristics of clover cultivars and planting date over seasons

^ns، ^* و ^**: به‌ترتیب غیر معنی‌دار، معنی‌دار در سطح احتمال خطای 5 و 1 درصد

^ns, ^* and ^**: non-significant, significant at the 0.05 probability levels, significant at the 0.01 probability levels, respectively

غلظت قندهای محلول و نشاسته ریشه

نتایج تجزیه واریانس مرکب (جدول 6) نشان داد که اثر سال (به‌جز برای نشاسته)، تاریخ کاشت، رقم، رقم درون چین‌ها و اثر متقابل بین عامل‌ها برای غلظت قندهای محلول، گلوکز، فروکتوز و نشاسته در ریشه در سطح احتمال خطای یک درصد معنی‌دار بود. مقایسه تاریخ‌های کاشت نشان داد تأخیر در کاشت باعث کاهش 13 و 12درصدی کربوهیدرات‌های محلول ریشه به‌ترتیب در سال اول و دوم شد (p<0.01). همچنین غلظت قندهای محلول در تمام تاریخ‌های کاشت در سال دوم بیشتر از سال اول بود. مقایسه رقم‌های شبدر نشان داد که میزان ذخیره کربوهیدرات‌های محلول ریشه متفاوت است و این میزان در سال دوم برتر از سال اول است. بین رقم‌ها، در هر سه تاریخ کاشت شبدر قرمز و شبدر ایرانی (دیر رس و متوسط رس) از غلظت کربوهیدرات محلول بالاتری در ریشه برخوردار بودند، ولی رقم‌های شبدر ایرانی (یک‌چین) و شبدر لاکی به‌علت زود رسی کمترین غلظت قند محلول در ریشه را دارا بودند (جدول 7). علاوه‌براین مشخص شد که یکی از دلایل یک‌چین بودن این رقم‌ها، غلظت پایین کربوهیدرات محلول در ریشه است. نتایج نشان داد که فرم اصلی ذخیره قندها در ریشه ژنوتیپ‌های مختلف شبدر بیشتر به شکل فروکتوز بود. میزان فروکتوز در همه تاریخ‌های کاشت در سال دوم برتر از سال اول است. تأخیر در کاشت موجب کاهش 18 و 28 درصدی در فروکتوز به‌ترتیب در سال اول و دوم شد (p<0.01). از بین رقم‌های شبدر، شبدر ایرانی (دیر رس) و شبدر قرمز بیشترین غلظت فروکتوز را نشان دادند و شبدر ایرانی (یک‌چین) و شبدر قرمز به‌علت زود رسی از غلظت فروکتوز کمتری نسبت به سایر رقم‌ها برخورداربودند. تأخیر در کاشت، کاهش 19 و 20 درصدی در فروکتوز را به‌ترتیب در سال اول و دوم به دنبال داشت (p<0.01). همچنین در تمامی تاریخ‌های کاشت، میزان گلوکز در سال اول کمتر از سال دوم است. از بین رقم‌های شبدر، شبدر ایرانی (دیر رس) و شبدر قرمز دارای بیشترین غلظت گلوکز بودند. این‌در‌حالی است که در رقم‌های شبدر ایرانی (یک‌چین) و شبدر لاکی کمترین غلظت گلوکز مشاهده شد. این نتایج نشان می‌دهد که دیر رسی باعث افزایش گلوکز و
زود رسی باعث کاهش گلوکز می‌گردد.

برخلاف کربوهیدرات‌های محلول، ذخیره نشاسته در تاریخ‌های مختلف کاشت و رقم‌ها در سال اول بیشتر از سال دوم بود. در سال اول درصد ذخیره نشاسته بیشتر از کربوهیدرات‌های محلول است، ولی در سال دوم میزان نشاسته کمتر از کربوهیدرات‌های محلول است. داده‌های هواشناسی نشان داد که در ماه آبان سال اول و دوم، تعداد روزهای یخبندان به‌ترتیب صفر و چهار روز بود. همچنین، تعداد روزهای یخبندان در ماه آذر سال اول و دوم به‌ترتیب 3 و 20 روز بود (شکل 1) (جدول 2). به‌علت تعداد بیشتر روزهای یخبندان در آبان و آذر سال دوم آزمایش، گیاه برای مقابله با سرما میزان نشاسته بیشتری را به کربوهیدرات محلول تبدیل و با افزایش فشار اسمزی داخل سلول میزان تحمل به سرمای گیاه افزایش یافت.

تأخیر در کاشت باعث کاهش 11 و 7 درصدی در غلظت نشاسته به‌ترتیب در سال اول و دوم آزمایش شد. مقایسه ذخیره نشاسته در رقم‌ها در سال‌های آزمایش نشان داد که بین رقم‌ها تفاوت وجود دارد و این تفاوت در سال اول بیشتر از سال دوم است. رقم‌های دیر رس مانند شبدر ایرانی
(دیر رس) و شبدر قرمز دارای بیشترین غلظت نشاسته در ریشه بودند و شبدر لاکی و شبدر ایرانی (یک‌چین) کمترین غلظت را نشان دادند (جدول 7).

نتایج نشان داد که رقم‌هایی که در پاییز دارای رشد رویشی بیشتری هستند (شبدر ایرانی یک‌چین، شبدر برسیم تولیدی کرج و شبدر لاکی البرز 1) نسبت به رقم‌هایی که رشد رویشی کمتری دارند، درصد قندهای محلول و نشاسته ریشه آنها کمتر است و این بیانگر اختصاص بیشتر مواد فتوسنتزی به شاخساره در این رقم‌هاست. همچنین، تأخیر در کاشت باعث کاهش درصد قندهای محلول و نشاسته در ریشه و حساسیت رقم‌های شبدر به سرما می‌شود. در رقم‌هایی که رشد مجدد آنها در اواخر زمستان سریع‌تر شروع می‌شود (شبدر ایرانی یک‌چین و شبدر لاکی) درصد قندهای محلول و نشاسته در آنها به‌علت مصرف بیشتر کمتر است. در کشت‌های تأخیری به‌ویژه در تاریخ کاشت سوم تأثیر کاهش مواد قندی بر میزان رشد مجدد رقم‌ها بیشتر دیده می‌شود. نتایج نشان داد که درصد قندهای محلول و نشاسته ریشه در رقم‌های دیر رس (شبدر ایرانی دیر رس و شبدر قرمز) بیشتر از سایر رقم‌هاست، از جمله دلایل آن می‌تواند رشد رویشی طولانی و دیر رس آنها باشد که همین مسئله باعث تولید بیشتر مواد فتوسنتزی و ذخیره آنها در ریشه می‌گردد. از بین گروه‌های رسیدگی شبدر ایرانی گروه دیر رس دارای درصد قندهای محلول و نشاسته بیشتری نسبت به گروه‌های متوسط رس و زود رس است. تجمع نشاسته به‌عنوان یک مقصد برای کربن حاصل از فتوسنتز جاری است که مازاد بر نیاز رشد می‌باشد. ذخایر نشاسته دارای دو کارکرد در طول زمستان هستند. نخست اینکه آنها به‌عنوان ذخایر کربوهیدرات برای تولید انرژی مورد نیاز متابولیسم پایه در شرایطی هستند که میزان فتوسنتز پایین است و دوم اینکه تجزیه آنها تأمین‌کننده ساکاروز و سایر قندها برای افزایش پتانسیل اسمزی و کاهش نقطه انجماد سلول هستند. تجمع ساکاروز دلالت بر واکنش‌های افزایش تحمل به سرما دارد (Turner and Pollock, 1998). این قندها علاوه‌بر‌اینکه به‌عنوان اسموپروتکتانت عمل می‌کنند، غشاهای سلولی را نیز از صدمات ناشی از تنش یخ‌زدگی محافظت می‌کنند و این کار را از طریق برهم‌کنش با غشاهای دولایه و همچنین، عمل‌کردن به‌عنوان ناقلین پیام تنش انجام می‌دهند (John et al., 2017; Jan et al., 2018). این یافته‌ها با نتایج Ball و همکاران (2002) و Shahba و همکاران (2003)که معتقدند سطوح بالای کربوهیدرات‌های غیرساختمانی در زمستان باعث افزایش بقا و حیات گیاهان علوفه‌ای در دماهای پایین می‌شود و Fry و Huang (2004)که اعلام کردند میزان رشد مجدد بهاره پس از خواب زمستانه به میزان کافی کربوهیدرات‌های غیرساختمانی بستگی دارد، هماهنگ بود. همچنین، Moriyama و همکاران (2003) بیان کردند که میزان تجمع کربوهیدرات‌های محلول در گندمیان معتدله به‌عنوان یک منبع انرژی در دماهای پایین برای گیاه است.

جدول 5- مقایسه میانگین برهم‌کنش تاریخ کاشت و رقم بر صفات ریشه ارقام شبدر

Table 5- planting date × cultivar interaction on root morphological characteristics of clover cultivars

میانگین‌هایی که در هر ستون، حداقل دارای یک حرف مشترک هستند، در سطح احتمال 5 درصد تفاوت معنی‌دار ندارند.

Means within a column followed by the same letter are not significantly different at the level of 5%.

ادامه جدول 5

Continuation of Table 5

میانگین‌هایی که در هر ستون، حداقل دارای یک حرف مشترک هستند، در سطح احتمال 5 درصد تفاوت معنی‌دار ندارند.

Means within a column followed by the same letter are not significantly different at the level of 5%.

جدول 6- تجزیه واریانس مرکب میانگین مربعات قندهای محلول و نشاسته ریشه در رقم‌های شبدر تحت تأثیر تاریخ کاشت، رقم و سال

Table 6- analysis of variance (mean squares) for root soluble carbohydrate and starch of clover cultivars and planting date over seasons

^ns، ^* و ^**: به‌ترتیب غیر معنی‌دار، معنی‌دار در سطح احتمال خطای 5 و 1 درصد

^ns, ^* and ^**: non-significant, significant at the 0.05 probability levels and significant at the 0.01 probability levels, respectively

جدول 7- مقایسه میانگین تأثیر سطوح تاریخ کاشت در رقم بر قندهای محلول و نشاسته ریشه

Table 7- planting date × cultivar interaction on root soluble carbohydrate and starch

میانگین‌هایی که در هر ستون، حداقل دارای یک حرف مشترک هستند، در سطح احتمال 5 درصد تفاوت معنی‌دار ندارند.

Means within a column followed by the same letter are not significantly different at the level of 5%.

روند تغییرات قندهای محلول و نشاسته ریشه ارقام شبدر در مراحل مختلف رشدی

الگوی ذخیره و مصرف قندهای محلول،گلوکز و فروکتوز در ریشه در همه رقم‌ها دارای یک روند متناوب کاهشی-افزایشی است، یعنی با هر بار چین‌برداری کاهش و با رشد مجدد گیاه افزایش می‌یابد (شکل‌های 2- 5). شیب کاهش و افزایش منحنی ذخیره قند در رقم‌های شبدر متفاوت است. بیشترین میزان ذخیره قند پیش از چین اول مشاهده شد و با هر بار چین‌برداری میزان ذخیره نسبت به مرحله قبل کاهش یافت که در نهایت به‌علت عدم وجود میزان کافی قند در ریشه، گیاه توان رشد مجدد را از دست می‌دهد و دوره حیات آن به اتمام می‌رسد. همان‌طور‌که در شکل‌های 2 و 3 مشاهده می‌شود، شیب کاهش و افزایش منحنی ذخیره کربوهیدرات در رقم‌های زود رس ملایم‌تر از سایر رقم‌هاست. یکی از علل عدم رشد مجدد رقم‌های زود رس شبدر ایرانی (یک‌چین) و شبدر لاکی ذخیره پایین قند در ریشه آنها پس از چین اول است، به‌عبارت‌دیگر یکی از علل تولید علوفه بالای این رقم‌ها در چین اول مصرف کامل ذخیره کربوهیدرات‌های ریشه است، ولی در رقم‌های چندچین گیاه برای اینکه بتواند پس از هر بار چین‌برداری رشد مجدد داشته باشد، اقدام به تقسیط ذخیره کربوهیدرات‌های ریشه خود می‌کند که یک نوع سازگاری اکوفیزیولوژیک در آنها محسوب می‌شود (Zamanian and Yamada, 2017). شیب منحنی ذخیره قند بین دو مرحله رکود زمستانی و رشد مجدد می‌تواند بیانگر میزان خواب زمستانی رقم‌های شبدر باشد و رقم‌هایی که دارای خواب زمستانی بیشتری بودند، شیب منحنی ملایم‌تری نشان دادند. به‌عبارت‌دیگر از ذخیره قند موجود در ریشه کمتر استفاده شده است. شبدر قرمز، شبدر برسیم، شبدر ایرانی یک‌چین و شبدر لاکی از این الگو پیروی کردند. شیب منحنی ذخیره قند بین دو مرحله شروع رشد مجدد و پیش از چین اول می‌تواند بیانگر سرعت رشد مجدد رقم‌های شبدر باشد. در این مرحله شبدر برسیم و شبدر لاکی از شیب منحنی بیشتری برخوردار بودند. نکته مهم این است که چنانچه در مناطق کشت در این محدوده زمانی تنش سرما وجود داشته باشد از این رقم‌ها می‌توان استفاده نمود، زیرا با رشد سریع قادر به فرار از تنش هستند. روند کاهشی شدیدتر در منحنی ذخیره قند رقم‌های مورد بررسی پس از هر بار چین‌برداری، بیانگر تخلیه بیشتر مواد قندی ریشه برای رشد مجدد این رقم‌هاست و در رقم‌هایی که صعود منحنی شدیدتر است، میزان فتوسنتز بیشتر و ذخیره مواد قندی در ریشه سریع‌تر است. به‌طورکلی، در بین رقم‌های شبدر، شبدر قرمز به‌علت رشد بطئی و آهسته‌تر، روند کاهش و افزایش منحنی ذخیره قند ملایم‌تری نشان داد. همان‌طورکه در شکل‌های 2 تا 5 مشاهده می‌شود، پیش و پس از چین سوم منحنی ذخیره قند ریشه از الگوی زیگزاکی پیروی نمی‌کند که از علل آن می‌توان به رشد سریع گیاه در این زمان به‌علت مساعد بودن شرایط محیطی و گرم شدن هوا اشاره نمود که در نتیجه آن ریشه خیلی سریع از منبع به مقصد تبدیل می‌شود (Zamanian and Yamada, 2017).

نتایج این پژوهش نشان داد که درصد نشاسته ریشه در رقم‌های زود رس شبدر ایرانی یک‌چین و شبدر لاکی در تمام دوره رشد روند تقریباً کاهشی دارد (شکل 5) و این نشان می‌دهد که نشاسته مهمترین قند ذخیره‌ای در ریشه آنهاست و به‌طور دائم در حال تبدیل شدن به قندهای ساده است. البته این کاهش در شبدر ایرانی یک‌چین کمتر است و در نتیجه رشد ضعیفی پس از چین اول دارد. باتوجه‌به این نتیجه می‌توان پی برد که میزان ذخیره کربوهیدرات محلول و نشاسته می‌توانند یکی از عوامل مهم در گروه‌بندی شبدر ایرانی به یک، دو و چند چین باشد.

شکل 2- روند تغییرات درصد قندهای محلول موجود در ریشه رقم‌های شبدر در مراحل مختلف رشدی در سال اول (A) و سال دوم (B).

Figure 2- trend of changes in the percentage of soluble carbohydrates in the roots of clover cultivars at different stages of growth in the first year (A) and second year (B).

شکل 3- روند تغییرات درصد فروکتوز موجود در ریشه رقم‌های شبدر در مراحل مختلف رشدی در سال اول (A) و سال دوم (B).

Figure 3- trend of changes in the percentage of fructose in the roots of clover cultivars at different stages of growth in the first year (A) and second year (B).

شکل 4- روند تغییرات درصد گلوکز موجود در ریشه ارقام شبدر در مراحل مختلف رشدی در سال اول (A) و سال دوم (B).

Figure 4- trend of changes in the percentage of glucose in the roots of clover cultivars at different stages of growth in the first year (A) and second year (B).

شکل 5- روند تغییرات درصد نشاسته موجود در ریشه رقم‌های شبدر در مراحل مختلف رشدی در سال اول (A) و سال دوم (B).

Figure 3- trend of changes in the percentage of starch in the roots of clover cultivars at different stages of growth in the first year (A) and second year (B)

.

نتیجه‌گیری

تأخیر در کاشت به‌علت افزایش احتمال مواجه با تنش سرما بر خصوصیات ریخت‌شناسی و کربوهیدرات ریشه اثر منفی دارد و بنابراین، بررسی مسائل به‌زراعی از جمله تعیین دقیق تاریخ کاشت شبدر در مناطق مختلف کشور برای دستیابی به پتانسیل عملکرد علوفه ضروری است. برای زراعت شبدر در مناطقی که دارای محدودیت فصل کشت هستند، رقم‌های شبدر ایرانی توصیه می‌شود و بایستی از کشت شبدر قرمز خودداری گردد. همچنین، در مناطقی که با بحران آب و تولید علوفه تازه در ابتدای فصل بهار مواجه هستند، کاشت رقم‌های زود رس مثل شبدر ایرانی (یک‌چین) و شبدر لاکی پیشنهاد می‌شود. همچنین، در کشت‌های تأخیری در صورت لزوم کشت شبدر، فقط رقم‌های شبدر ایرانی توصیه می‌گردد.