تأثیر عصاره مخمر بر رشد، ویژگی‌های بیوشمیایی و تولید متابولیت‌های ثانویه در کشت‌های درون‌شیشه‌ایی قره‌قاط (Vaccinium arctostaphylos L.)

مقدمه

گیاه قره‌قاط (بلوبری قفقازی) با نام علمی Vaccinium arctostaphylos L. عضوی از خانواده‌ی اریکاسه است. برگ، ریشه و میوه آن خواص دارویی از جمله کاهش‌دهنده فشار و قند خون دارند (Hokanson and Hancock, 2000). جنس Vaccinium دارای بیش از 450 گونه است که گونه‌های V. arctostaphylos و V. corymbosum به‌علت خواص دارویی مهم از ارزش تجاری بالاتری نسبت به سایر گونه‌های این جنس برخوردار هستند. خاستگاه اصلی V. arctostaphylos مربوط به راشستان جنگل‌های شمال ایران است. روش‌های مختلفی برای ازدیاد گیاه قره‌قاط وجود دارد که از جمله آن می‌توان به ازدیاد به کمک بذر، قلمه‌زدن، خوابانیدن، استفاده از پاجوش و ریزازدیادی درون‌شیشه‌ایی اشاره کرد (Akhondzadeh, 2000). پایین بودن سرعت شاخه‌زایی و طویل‌شدگی ساقه و مقدار بالای آلودگی میکروبی از عوامل اصلی محدودکننده موفقیت در کشت بافت و ریزازدیادی درختان است. بنابراین، اغلب برای به‌حداقل رساندن مشکلات، از بافت جوان (قاعده جوانه) درختان بالغ استفاده می‌شود (Meiners et al., 2007; Gonzalez et al., 2013). در پژوهش Meiners و همکاران (2007) بر گونه‌های Vaccinium corymbosum و Vaccinium idaea نشان داده شد که 2 میلی‌گرم بر لیتر زآتین در ترکیب با 1/0 میلی‌گرم بر لیتر ایندول-3- استیک اسید (IAA) در محیط‌کشت WPM به‌طور معنی‌داری (72%) تکثیر نهال‌ها را افزایش می‌دهد (Meiners et al., 2007). همچنین، Noruzpour و همکاران (2019) گزارش کردند که محیط‌کشت MS حاوی 1/0 میلی‌گرم بر لیتر IBA به‌همراه 1 تا 2 میلی‌گرم بر لیتر زآتین یا BAP، محیط‌کشت مناسبی برای رشد ریزنمونه‌های Vaccinium arctostaphylos است (Noruzpour et al., 2019a).

متابولیت‌های ثانویه گروه متنوعی از مولکول‌های آلی هستند که کارکردهای مهمی در فرایندهای فیزیولوژیک و حفاظت گیاه در برابر تنش‌های زیستی و غیرزیستی ایفا می‌کنند. متابولیت‌های ثانویه همیشه و در همه بخش‌های گیاه تولید نمی‌شوند، بلکه به‌سرعت در پاسخ به تنش‌های زیستی مثل آلودگی‌های میکروبی و حمله حشرات و همچنین، در پاسخ به تنش‌های غیر‌زیستی مانند سرما، گرما، آسیب فیزیکی و تنش اسمزی تولید می‌شوند (Wink, 2010). ازجمله متابولیت‌های ثانویه بسیار مهم در انواع گونه‌های جنس Vaccinium می‌توان به کوئرستین، میریستین، کامفرول، روتین و ایزورهمنتین اشاره کرد که فراوان‌ترین نوع فلاونول‌های موجود در رژیم غذایی گیاهی نیز محسوب می‌شوند (Markham, 1989). نتایج به دست آمده از مطالعات انجام‌شده بر گونه‌های مختلف جنس Vaccinium نشان داده است که مقدار فلاونول کوئرستین در میوه‌های گونه‌های V. arctostaphylos وV. corymbosum و میریستین در میوه گونه‌ی V. myrtillus بیش از سایر گونه‌ها است (Maatta-Riihinen et al., 2004). به‌طورکلی کوئرستین به‌عنوان فلاونول اصلی در برگ‌های گونه‌های جنس Vaccinium گزارش شده است. تابش نور خورشید باعث افزایش محتوای کوئرستین و کامفرول در برگ‌های این گیاه می‌شود و این امر نشان می‌دهد این ترکیبات در محافظت از گیاهان در برابر اشعه خورشید نقش دارند (Harris et al., 2007). گزارش‌های محدودی در زمینه تولید متابولیت‌های ثانویه در کشت‌های درون‌شیشه‌ایی گونه‌های جنس Vaccinium وجود دارد. با بررسی تأثیر غلظت‌های مختلف (صفر تا 500 میکرومولار) متیل‌جاسمونات بر میزان آنتوسیانین در کشت تعلیقی سلول‌های Vaccinium pahalae نشان داده شده است که میزان آنتوسیانین سلول‌ها در محیط‌کشت حاوی 5/0 میکرومولار متیل‌جاسمونات به‌طور معنی‌داری بیشتر از محیط‌کشت‌های حاوی سایر غلظت‌های متیل‌جاسمونات و همچنین گیاهان شاهد بود (Fang et al., 1999). همچنین Noruzpour و همکاران (2019) با بررسی تأثیر سالیسیلیک اسید، جیبرلیک ‌اسید، کازئین‌ هیدرولایسیت بر رشد ریزنمونه‌ها و تولید متابولیت‌های ثانویه در کشت درون‌شیشه‌ای گیاه Vaccinium arctostaphylos بیان کردند که استفاده از سالیسیلیک اسید به‌ویژه در غلظت 15 میلی‌گرم بر لیتر میزان فلاونوئید و فنل کل را به‌طور معنی‌داری افزایش می‌دهد. این‌در‌حالی است که استفاده از جیبرلیک اسید، کازئین هیدرولایسیت و پوتریسین تأثیر معنی‌داری بر میزان متابولیت‌های ثانویه در مقایسه با تیمار شاهد نداشته است (Noruzpour et al., 2019a).

علی‌رغم پیشرفت‌های به دست آمده در زمینه شیمی، هنوز برای تولید برخی از متابولیت‌های ثانویه ازجمله ترکیبات دارویی، به گیاهان به‌عنوان منابع زیستی نیاز است. مطالعات متعدد نشان داده است که بسیاری از متابولیت‌های ثانویه که توسط گیاهان تولید می‌شوند، در کشت‌های ‌سلولی و درون‌شیشه‌ای گیاهان دارویی نیز تولیده ‌شده و به‌عنوان منبع مهمی برای تهیه ترکیبات با ارزش اقتصادی مورد استفاده قرار می‌گیرند(Firoozi et al., 2019; Noruzpour et al., 2019b; Zare et al., 2014). باتوجه‌به اینکه پتانسیل و سرعت تولید متابولیت‌های ثانویه در شرایط طبیعی محدود است، می‌توان به کمک کشت‌های درون‌شیشه‌ای و افزودن محرک‌ها (الیسیتورها) به محیط‌کشت، میزان تولید متابولیت‌های ثانویه را افزایش داد (Ramachandra and Ravishankar, 2002; Askari et al., 2016). محرک‌ها، ترکیباتی زیستی (زنده) یا غیرزیستی (غیرزنده) هستند که باعث القای پاسخ‌های دفاعی گیاه ازجمله مسیرهای بیوسنتزی متابولیت‌های ثانویه می‌شوند. در نتیجه، این تحریک موجب سنتز یا افزایش سنتز متابولیت‌های ثانویه به‌وسیله گیاه به‌منظور بقا، مقاومت و رقابت می‌شود (Zhang et al., 2009; Madani et al., 2020). محرک‌های زنده با منشأ قارچی، باکتریایی و مخمر، و محرک‌های غیرزنده نظیر پلی‌ساکاریدها، گلیکوپروتئین‌ها، اشعه ماورابنفش، نمک فلزات سنگین و برخی از مولکول‌های علامت‌رسان (Signalling molecules) مانند جاسمونیک اسید و سالیسیلیک اسید برای افزایش تقویت تولید ترکیبات ثانویه در کشت سلول و بافت گیاهی استفاده شده است (Zhao et al., 2005; Zare et al., 2014; Taherkhani et al., 2019). در بین محرک‌های زیستی، محرک‌های قارچی ازجمله عصاره مخمر و ترکیبات اصلی دیواره سلولی بسیاری از گونه‌های قارچی مانند کیتین و کیتوزان به‌طور گسترده‌ای مورد استفاده قرار می‌گیرند. آثار ویژه و متنوع محرک‌های قارچی در ارتباط با برهم‌کنش محرک با سلول گیاهی و مسیر علامت‌رسانی مربوطه و همچنین، پاسخ‌های دفاعی سلول گیاهی است (Ramachandra and Ravishankar, 2002). عصاره مخمر از ترکیبات مختلفی مانند آمینواسیدها، ویتامین‌ها و ترکیبات معدنی تشکیل شده است. اثر عصاره مخمر به‌عنوان محرک می‌تواند ناشی از ترکیبات دیگری باشد که هنوز به‌درستی شناسایی نشده‌اند (George et al., 2008). بنابراین، باتوجه‌به وجود متابولیت‌های ثانویه مهم از نظر ارزش دارویی ازجمله کوئرستین، میریستین، کامفرول و روتین در گیاه V. arctostaphylos L.، این پژوهش به‌منظور ارزیابی تأثیر عصاره مخمر در غلظت‌های مختلف بر رشد کشت‌های درون‌شیشه‌ایی V. arctostaphylos L.، بررسی ویژگی‌های بیوشیمیایی و تولید متابولیت‌های ثانویه در آنها انجام شد.

مواد و روش‌ها

تهیه ریزنمونه‌ها

سرشاخه‌های تازه رشدیافته قره‌قاط در فصل تابستان از مناطق جنگلی روستای سوها (25/38N^°: و 64/48 E^°: و ارتفاع 1670 متر) از توابع شهرستان اردبیل تهیه و به آزمایشگاه منتقل شدند. ریزنمونه‌های حاوی یک یا دو گره با آب جاری به‌مدت 30 دقیقه شستشو داده شدند. برای ضدعفونی سطحی، ریزنمونه‌ها در محلول بنومیل (3 گرم در لیتر) به‌مدت 2 ساعت و محلول H₂O₂ 5% (حجمی-حجمی) به‌مدت 10 دقیقه غوطه‌ور شدند. سپس، ریزنمونه‌ها به‌مدت 2 دقیقه با آب مقطر استریل آبکشی شده و با هیپوکلریت‌سدیم با اسیدیته 10 و حاوی Tween 20 1/0% به‌مدت زمان 12 دقیقه ضدعفونی شدند. ریزنمونه‌ها پس از سه‌بار آبکشی با آب مقطر استریل، روی محیط‌کشت MS فاقد تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی و محیط‌کشت MS حاوی 2 میلی‌گرم بر لیتر BAP، 1/0 میلی‌گرم بر لیتر IBA (Noruzpour et al., 2019a) و غلظت‌های مختلف عصاره مخمر (0، 500، 1000 و 2000 میلی‌گرم بر لیتر) کشت شدند (جدول 1). عصاره مورد استفاده در این پژوهش از شرکت مرک (آلمان) تهیه شد. تمام کشت‌ها در اتاقک رشد با دمای 25 درجه سانتیگراد و تناوب نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی با شدت نور 3000 الی 3500 میکرومول فوتون بر متر مربع بر ثانیه نگهداری شدند. حدود 6 هفته پس از کشت، درصد زنده‌مانی ریزنمونه‌ها، درصد ریزنمونه‌های برگ‌داده، درصد ساقه‌زایی و تعداد برگ در هر ریزنمونه ثبت شد. برای ارزیابی ویژگی‌های بیوشیمیایی و اندازه‌گیری متابولیت‌های ثانویه (فلاونویید کل، آنتوسیانین، روتین و کوئرستین)، نمونه‌های گیاهی از کشت‌های درون‌شیشه‌ایی برداشت شده و بلافاصله پس از انجماد در ازت مایع، در دمای 80- درجه سانتیگراد نگه‌داری شدند.

اندازه‌گیری ویژگی‌های بیوشیمیایی

تهیه عصاره آنزیمی

برای استخراج عصاره آنزیمی و پروتئینی، 1/0 گرم از نمونه گیاهی درون هاون چینی و ازت مایع ساییده شد. نمونه‌ها به‌مدت 10 دقیقه با سرعت 13000 دور در دقیقه و در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شدند و فاز رویی به‌عنوان عصاره پروتئینی برای اندازه‌گیری مقدار پروتئین و فعالیت آنزیم‌ها استفاده شد. برای اندازه‌گیری مقدار پروتئین کل در برگ‌ها از روش Bradford (1976) استفاده شد. همچنین برای کمّی‌سازی مقدار پروتئین نمونه‌ها از منحنی استانداد غلظت‌های مختلف سرم آلبومین گاوی (BSA) استفاده شد.

جدول 1- غلظت‌های مختلف عصاره مخمر مورد بررسی در کشت‌های درون‌شیشه‌ایی قره‌قاط

Table 1- Different concentrations of yeast extract used for in vitro culture of Whortleberry

اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز و کاتالاز

سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز به روش Mac-Adam و همکاران (1992) با کمی تغییر انجام شد. مخلوط واکنش شامل 81/0 میلی‌لیتر بافر فسفات پتاسیم 100 میلی‌مولار با اسیدیته 7، 20 میکرولیتر عصاره پروتئینی، 90 میکرولیتر گایاکول (10 میلی‌مولار) و 90 میکرولیتر آب‌اکسیژنه (5 میلی‌مولار) بود. جذب نوری نمونه‌ها در طول موج 425 نانومتر و دمای 25 درجه سانتیگراد، به‌مدت 60 ثانیه با استفاده از اسپکتروفتومتر BIORAD, Smartspec^TM plus)، ساخت کشور آمریکا( اندازه‌گیری شد. از بافر فسفات با اسیدیته 5/7 برای صفر کردن دستگاه استفاده شد. فعالیت آنزیمی بر حسب میکرومول H₂O₂ تجزیه‌شده در یک دقیقه بر میلی‌گرم پروتئین بیان شد.

فعالیت آنزیم کاتالاز با استفاده از روش Chanes و Mahely (1996) با کمی تغییرات و از طریق ارزیابی کاهش مقدار پراکسید هیدروژن 30% در حضور عصاره آنزیم اندازه‌گیری شد. محلول واکنش شامل بافر فسفات 20 میلی‌مولار با اسیدیته 7 و 20 میکرولیتر پراکسید هیدروژن (H₂O₂) با غلظت 5 میلی‌مولار بود که 60 میکرولیتر عصاره پروتئینی در حمام یخ به آن اضافه شد و تغییرات جذب نوری در طول موج 240 نانومتر به‌مدت 2 دقیقه اندازه‌گیری شد. فعالیت آنزیمی بر حسب میکرومول H₂O₂ تجزیه‌شده در یک دقیقه بر میلی‌گرم پروتئین بیان شد.

اندازه‌گیری اسیدآمینه پرولین

برای اندازه‌گیری پرولین آزاد از روش Bates (1973) استفاده شد. برای این منظور 1/0 گرم نمونه گیاهی در سولفوسالیسیلیک اسید 3/3 درصد (حجمی-حجمی) سابیده شد. همگن حاصل با 4000 دور در دقیقه و در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد و محلول رویی به میکروتیوب جداگانه‌ای منتقل گردید. سپس یک میلی‌لیتر از معرف نین‌هیدرین و یک میلی‌لیتر استیک اسید خالص به آن اضافه شد. پس از سرد شدن نمونه، 2 میلی‌لیتر تولوئن به آن اضافه شد و سپس به‌مدت 2 دقیقه ورتکس گردید. در نهایت جذب نوری محلول رویی با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 520 نانومتر اندازه‌گیری شد. غلظت پرولین آزاد در نمونه‌های گیاهی با استفاده از منحنی استاندارد پرولین محاسبه گردید. 

استخراج متابولیت‌های ثانویه

به‌منظور استخراج متابولیت‌های ثانویه، 1/0 گرم از نمونه گیاهی (نمونه تازه) درون هاون‌چینی با 5 میلی‌لیتر متانول اسیدی (متانول خالص و کلریدریک اسید خالص با نسبت حجمی 99:1) ساییده شد و عصاره به دست آمده درون لوله‌های سر‌پیچ‌دار به‌مدت 72 ساعت در تاریکی و در دمای 25 درجه سانتیگراد نگه‌داری شد (Chang et al., 2002). پس از سانتریفیوژ به‌مدت 10 دقیقه در 4000 دور در دقیقه مقدار فلاونوئیدکل و آنتوسیانین در محلول رویی اندازه‌گیری شد.

اندازه‌گیری فلاونوئید کل

فلاونوئید کل در نمونه‌ها بر اساس منحنی استاندارد کوئرستین و با استفاده از روش Chang و همکاران (2002) سنجیده شد. 250 میکرولیتر از محلول کلرید آلومینیوم 10 درصد (وزنی-حجمی) و 250 میکرولیتر پتاسیم‌استات یک مولار به یک میلی‌لیتر عصاره گیاهی اضافه و سپس جذب نمونه‌ها با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتری و در طول موج 415 نانومتر قرائت شد. از منحنی استاندارد کوئرستین و معادله رگرسیون حاصل از آن برای کمّی‌سازی مقدار فلاونوئید نمونه‌ها استفاده شد. سپس مقدار فلاونوئید با استفاده از رابطه T=(C*V)/M بر حسب میلی‌گرم در یک گرم برگ تازه محاسبه گردید. در این رابطه، T برابر با محتوای فلاونوئید بر حسب میلی‌گرم کوئرستین در گرم برگ تر؛ C برابر است با غلظت فلاونوئید بر حسب میلی‌گرم در میلی‌لیتر، V حجم نهایی عصاره (برحسب میلی‌لیتر) و M وزن نمونه گیاهی (برحسب گرم نمونه تازه) است.

اندازه‌گیری آنتوسیانین

برای اندازه‌گیری مقدار آنتوسیانین از روش Wagner (1979) استفاده شد. برای این منظور جذب نوری عصاره گیاهی در طول موج 550 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر ثبت گردید. غلظت آنتوسیانین با استفاده از رابطه A=εbc و ضریب خاموشی LM^-1cm^-1 33000 محاسبه شد. در رابطه فوق A برابر مقدار عدد جذبی؛ b برابر عرض کووت (1 سانتی‌متر)؛ ε برابر ضریب خاموشی و c برابر غلظت آنتوسیانین است.

اندازه‌گیری مقدار کوئرستین و روتین با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)

برای آماده‌سازی نمونه‌ها به منظور اندازه‌گیری کوئرستین و روتین با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)، یک گرم (وزن تر) از نمونه برگ حاصل از کشت‌های درون‌شیشه‌ای قره‌قاط درون هاون‌چینی به‌همراه 5/1 میلی‌لیتر اتانول 90 درصد ساییده شد. سپس، نمونه‌ها به‌مدت 5 تا 10 دقیقه ورتکس و دو مرتبه و هر بار به‌مدت 15 دقیقه در حمام اولتراسونیک (Bandelin electronic®, Germany) در دمای 35 درجه سانتیگراد تیمار شدند. نمونه‌ها با 10000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شده و محلول رویی پس از عبور دادن از ﻓﻴﻠﺘﺮ سرسرنگی با منافذ 2/0 میکرومتر به دستگاه HPLC تزریق شدند (Zu et al., 2006).

کروماتوگرافی با استفاده از دستگاه HPLC شرکت Sykam مدل 1130 (SYKAM 1130, Sykam GmbH, Germany) مجهز به شناساگر (diode-array detector) DAD، ستون فاز معکوس C18 به طول 25 سانتی‌متر و قطر 6/4 میلی‌متر که با ذراتی به قطر 5 میکرومتر (HIQ SIL C18V reversed-phase column 250mm×4.6 mm) پر شده بود، انجام گرفت. اﺑﺘﺪا آشکارساز UV ﺑﻪ‌ﻣﺪت 15دﻗﻴﻘﻪ روشن شد و پیش از ﺗﺰرﻳﻖ ﻧﻤﻮﻧﻪ، ﻓﺎز ﻣﺘﺤﺮک ﺑﻪ‌ﻣﺪت 20 دﻗﻴﻘﻪ در ﺷﺮاﻳﻂ آزﻣﺎﻳﺶ از ﺳﺘﻮن ﺟﺪاﺳﺎزی ﻋﺒﻮر داده ﺷﺪ. سپس 25 میکرولیتر از عصاره ﺑﻪ دﺳﺘﮕﺎه ﺗﺰرﻳﻖ گردید. فاز متحرک شامل متانول، استونیتریل و آب مقطر (به‌ترتیب با نسبت 40، 15 و 45 درصد) بود که با سرعت جریان ml/min 1 از ستون عبور می‌کرد. تشخیص کوئرستین و روتین به‌ترتیب درطول موج nm 368 و nm 257 و کمّی‌سازی آنها با استفاده از منحنی استاندارد انجام شد (Zu et al., 2006).

برای رسم منحنی استاندارد، غلظت‌های 5، 50، 100 و 500 میلی‌گرم‌ بر لیتر از کوئرستین (Sigma-Aldrich, Q4951, CAS: 117-39-5) و غلظت‌های 5، 50 و 100 میلی‌گرم ‌بر لیتر از روتین (Sigma-AldrichA) با استفاده از اتانل 90 درصد تهیه و به HPLC تزریق شد. معادله رگرسیون حاصل از HPLC استانداردهای فوق برای محاسبه مقدار کوئرستین و روتین در نمونه‌های حاصل از کشت‌های درون‌شیشه‌ای گیاه قره‌قاط استفاده شد.

تجزیه و تحلیل داده‌ها

آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار و حداقل 15 لوله آزمایش در هر تکرار انجام شد. پیش از انجام تجزیه و تحلیل داده‌ها، تست نرمال بودن توزیع داده‌ها با استفاده از آزمون تک‌نمونه‌ایی کولموگروف- اسمیرنوف انجام شد. تجزیه و تحلیل داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 22 انجام گرفت. برای مقایسه میانگین‌ها از آزمون چند‌دامنه‌ایی دانکن (DMRTs) در سطح احتمال 5 درصد و برای رسم نمودارها از نرم‌افزار Excel استفاده شد.

نتایج

تأثیر غلظت‌های مختلف عصاره مخمر بر رشد ریزنمونه‌های قره‌قاط در کشت درون‌شیشه‌ای

نتایج حاصل از تجزیه داده‌ها نشان داد که درصد ساقه‌زایی، درصد برگ‌دهی و درصد زنده‌مانی ریزنمونه‌های قره‌قاط به‌طور معنی‌داری تحت تأثیر تیمارهای عصاره مخمر قرار گرفتند. با وجود این، بین تیمارها از نظر میانگین تعداد برگ در هر ریزنمونه برگ‌داده اختلاف معنی‌داری مشاهده نشد (جدول 2).

کمترین درصد ساقه‌زایی مربوط به محیط‌کشت MS فاقد تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی (صفر درصد) و بیشترین آن (8/47 درصد) نیز مربوط به محیط‌کشت MS + 2mg/L BAP + 0.1mg/L IBA بود (شکل1 و شکل A2). استفاده از عصاره مخمر با غلظت 500 و 2000 میلی‌گرم بر لیتر در ترکیب محیط‌کشت درصد زنده‌مانی و برگ‌دهی ریزنمونه‌های گره قره‌قاط را در مقایسه با تیمار فاقد عصاره مخمر به‌طور معنی‌داری تغییر نداد، درحالی‌که غلظت 1000 میلی‌گرم بر لیتر باعث کاهش معنی‌دار درصد زنده‌مانی و برگ‌دهی ریزنمونه‌ها شده است (شکل 1). به‌طوری‌که بیشترین درصد زنده‌مانی و برگ‌دهی ریزنمونه‌ها در محیط‌کشت MS + 2mg/L BAP + 0.1mg/L IBA فاقد عصاره مخمر و حاوی غلظت‌های 500 و 2000 میلی‌گرم بر لیتر عصاره مخمر و کمترین آنها در محیط‌کشت MS فاقد تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی مشاهده گردید. استقرار و رشد ریزنمونه‌های گره قره‌قاط در کشت‌های درون‌شیشه‌ای در شکل 2 نشان داده شده است.

جدول 2- میانگین مربعات تأثیر غلظت‌های مختلف عصاره مخمر بر رشد و زنده‌مانی ریزنمونه‌ها، ویژگی‌های بیوشیمیایی و متابولیت‌های ثانویه برگ‌ گیاه قره‌قاط رشدیافته در شرایط درون‌شیشه‌ای

Table 2- Mean squares of the effect of different concentrations of yeast extract on the growth and viability of explants, biochemical properties and secondary metabolites of V. arctostaphylos leaves grown under in vitro conditions

^ns و ^*: به‌ترتیب غیرمعنی‌دار و معنی‌دار در سطح احتمال 5%؛ ^**: معنی‌دار در سطح احتمال 1%

^ns and *: non-significant and significant at 5% level of probability, respectively; **: significant at 1% level of probability

شکل 1- تأثیر غلظت‌های مختلف عصاره مخمر بر درصد برگ‌دهی، درصد ساقه‌زایی و درصد زنده‌مانی ریزنمونه گره گیاه قره‌قاط در شرایط درون‌شیشه‌ای؛ YE: عصاره مخمر؛ حروف متفاوت در هر ستون بیانگر اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد با استفاده از آزمون چند دامنه‌ای دانکن (DMRT) است.

Figure 1- Effect of different concentrations of yeast extract on the percentage of leaf and stem producing explants and percentage of explant viability in V. arctostaphylos node explants under in vitro conditions; YE: yeast extract; Different letters indicate significant difference at the 5% probability level according to the Duncan Multi-Range Test (DMRT).

ویژگی‌های بیوشیمیایی و میزان متابولیت‌های ثانویه در کشت‌های درون‌شیشه‌ای

نتایج حاصل از تجزیه داده‌ها نشان داد که اختلاف مقدار پروتئین کل، پرولین، آنتوسیانین و فعالیت آنزیم پراکسیداز در برگ‌های حاصل از کشت درون‌شیشه‌ای گیاه قره‌قاط، بین تیمارهای مختلف در سطح احتمال 1% معنی‌دار بود
(جدول 1). بااین‌حال، بین تیمارهای مختلف از نظر مقدار فلاونوئید کل و فعالیت آنزیم کاتالاز اختلاف معنی‌داری وجود نداشت.

شکل 2- استقرار و رشد ریزنمونه‌های گره قره‌قاط در محیط‌های کشت حاوی غلظت‌های مختلف عصاره مخمر. A:یک هفته پس از کشت ریزنمونه در محیط‌کشت MS فاقد تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی و عصاره مخمر؛ B، C و D: رشد ریزنمونه‌ها در محیط‌کشت MS حاوی 2 میلی‌گرم بر لیتر BAP به‌همراه 1/0 میلی‌گرم بر لیتر IBA همراه با عصاره مخمر به‌ترتیب با غلظت‌های 500، 1000 و 2000 میلی‌گرم بر لیتر حدود 45 روز پس از کشت؛ E: رشد ریزنمونه‌ها در محیط‌کشت MS حاوی 2 میلی‌گرم بر لیتر BAP به‌همراه 1/0 میلی‌گرم بر لیتر IBA (45 روز پس از کشت) ؛ F: نمایی از کشت‌های درون‌شیشه‌ای در اتاقک رشد با شدت نوری 3500-3000 لوکس.

Figure 2- Establishment and growth of V. arctostaphylos node explants in culture media containing different concentrations of yeast extract; (A) one week after explant culture in MS culture medium without plant growth regulators and yeast extract; (B, C and D) explant growth about 45 days after culture in MS culture medium containing 2 mg/L BAP with 0.1 mg/L IBA and 500, 1000 and 2000 mg/L yeast extract, respectively; (E) growth of explants in MS medium containing 2 mg/L BAP with 0.1 mg/L IBA about 45 days after culture; (F) The in vitro cultures of V. arctostaphylos in a growth chamber with a light intensity of 3000-3500 lux.

همان‌طوری‌که در جدول (3) مشاهده می‌شود کمترین مقدار پروتئین کل در محیط‌کشت MS فاقد تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی مشاهده شد. بین محیط‌کشت MS +2mg/L BAP +0.1mg/L IBA فاقد و حاوی عصاره مخمر، اختلاف آماری معنی‌داری از نظر مقدار پروتئین در برگ وجود نداشت. غلظت‌های بالای عصاره مخمر در محیط‌کشت موجب افزایش تولید و تجمع پرولین در برگ قره‌قاط شد، به‌طوری‌که بیشترین مقدار پرولین (75/2 میکروگرم بر میلی‌لیتر) در برگ‌های رشدکرده در محیط‌کشت MS + 2mg/L BAP + 0.1mg/L IBA حاوی 2000 میلی‌گرم بر لیتر عصاره مخمر به دست آمد. کمترین مقدار پرولین در محیط کشت MS فاقد تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی و عصاره مخمر مشاهده شد که با مقدار آن در محیط‌کشت حاوی 500 میلی‌گرم بر لیتر عصاره مخمر اختلاف معنی‌داری نداشت (جدول 3). همچنین، از نظر مقدار فعالیت آنزیم پراکسیداز بین نمونه برگ به‌دست‌آمده از محیط‌کشت MS فاقد تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی و سایر محیط‌های کشت اختلاف معنی‌داری مشاهده شد. طبق نتایج به دست آمده (جدول 3) بیشترین مقدار فعالیت آنزیم پراکسیداز (211/90 µmol H₂o₂ min^-1mg^-1 protein) مربوط به محیط‌کشت MS فاقد تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی بود که بیانگر تأثیر منفی هورمون‌های رشدی و همچنین، عصاره مخمر بر مقدار فعالیت آنزیم پراکسیداز است. مقدار آنتوسیانین نیز در برگ نمونه‌های کشت‌شده در محیط‌کشت MS + 2mg/L BAP + 0.1mg/L IBA فاقد عصاره مخمر و حاوی 500 میلی‌گرم بر لیتر عصاره مخمر به‌ترتیب 02/15 و 50/13 میکرومول بر گرم وزن تر، به‌شکل معنی‌داری بیشتر از سایر تیمارها بود (جدول 3). بین تیمارهای حاوی 1000 و 2000 میلی‌گرم بر لیتر عصاره مخمر و محیط‌کشت MS فاقد تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی از نظر مقدار آنتوسیانین اختلاف آماری معنی‌داری وجود نداشت. به‌عبارت‌دیگر، استفاده از عصاره مخمر تولید و تجمع آنتوسیانین در برگ‌های حاصل از کشت‌های درون‌شیشه‌ای قره‌قاط را به‌طور مؤثری افزایش نداده است. از نظر فعالیت آنزیم کاتالاز و مقدار فلاونوئید کل نیز بین برگ‌های به‌دست‌آمده از محیط‌کشت شاهد و سایر محیط‌های کشت اختلاف معنی‌داری مشاهده نشد (جدول3).

اندازه‌گیری مقدار روتین و کوئرستین در برگ‌های قره‌قاط با استفاده از HPLC

بر اساس نتایج حاصل از تجزیه داده‌های HPLC از نظر مقدار روتین بین تیمارها اختلاف آماری معنی‌داری وجود داشت، ولی تفاوت در مقدار کوئرستین در تیمارهای مختلف از نظر آماری معنی‌دار نبود (جدول 4). طبق نتایج به دست آمده از مقایسه میانگین داده‌ها (شکل 3)، استفاده از 1000 میلی‌گرم بر لیتر عصاره مخمر در ترکیب محیط‌کشت موجب افزایش معنی‌دار مقدار روتین (59/130 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) در برگ‌ها‌ی قره‌قاط در شرایط درون‌شیشه‌ای شده است. بین محیط‌کشت‌های حاوی 500 و 2000 میلی‌گرم بر لیتر مخمر با محیط‌کشت فاقد آن و همچنین محیط‌کشت فاقد تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی اختلاف معنی‌داری وجود نداشت (شکل 3). اگرچه مقدار کوئرستین در برگ‌های حاصل از محیط‌کشت‌های مختلف از 21/4 تا 22/5 متغیر بود، بااین‌حال، بین تیمارهای مختلف مورد استفاده اختلاف آماری معنی‌داری مشاهده نشد (شکل 3).

جدول 3- تأثیر غلظت‌های مختلف عصاره مخمر بر مقدار پروتئین، پرولین، فلاونوئید و آنتوسیانین و فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز وکاتالاز در برگ‌های قره‌قاط در شرایط درون‌شیشه‌ای.

Table 3- The effect of different concentrations of yeast extract on the amount of protein, proline, flavonoids and anthocyanins and activity of peroxidase, catalase enzymes in V. arctostaphylos leaves under in vitro growth conditions

حروف متفاوت در هر ستون بیانگر اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد با استفاده از آزمون چند دامنه‌ای دانکن (DMRT) است.

Different letters in a column indicate significant difference at the 5% probability level according to the Duncan Multi-Range Test (DMRT).

جدول4- میانگین مربعات تأثیر عصاره مخمر بر روتین و کوئرستین در برگ‌های گیاه قره‌قاط در شرایط درون‌شیشه‌ای

Table 4- Mean squares of the effect of yeast extract on rutin and quercetin in V. arctostaphylos leaves under in vitro conditions

^ns و ^*: به‌ترتیب غیرمعنی‌دار و معنی‌دار در سطح احتمال 5%؛ ^**: معنی‌دار در سطح احتمال 1%

^ns and *: non-significant and significant at 5% level of probability, respectively; **: significant at 1% level of probability

بحث

تکنیک کشت سلول و بافت گیاهی رهیافت‌های مفیدی را برای ریزازدیادی گیاهان و افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه گیاهی با ارزش دارویی و اقتصادی فراهم می‌کند. روش‌های مختلفی به‌منظور بهبود رشد و ویژگی‌های فیزیولوژیک و متابولیک کشت‌های درون‌شیشه‌ای استفاده می‌شود که ازجمله آنها می‌توان به بهینه‌سازی ترکیبات محیط‌کشت و استفاده از محرک‌ها اشاره کرد (Vasconsuelo and Boland, 2007; Zare et al., 2014). بنابراین، در این پژوهش، تأثیر غلظت‌های مختلف عصاره مخمر بر رشد و درصد زنده‌مانی ریزنمونه‌ها و همچنین ویژگی‌های بیوشیمیایی و تولید متابولیت‌های ثانویه در کشت‌های درون‌شیشه‌ای قره‌قاط ارزیابی شد. در پژوهش حاضر، درصد ساقه‌دهی ریزنمونه‌ها‌ی گره قره‌قاط در تیمار شاهد (حاوی تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی) به‌صورت معنی‌دار بیشتر از نمونه‌های حاوی عصاره مخمر بود. درصد زنده‌مانی ریزنمونه‌ها نیز اگرچه در تیمارهای حاوی مخمر کاهش یافت، بااین‌وجود، از نظر آماری اختلاف معنی‌داری با تیمار حاوی تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی و فاقد مخمر نداشت. یافته‌های پژوهش حاضر با نتایج Komalavalli و Rao (2000) در گیاه Gymnema sylvestre مطابقت دارد. ایشان گزارش نموده‌اند که استفاده از عصاره مخمر در ترکیب محیط‌کشت، تشکیل و رشد جوانه از ریزنمونه‌های گره در گیاه Gymnema sylvestre را مهار کرده و برعکس، القا و تولید کالوس را تقویت می‌کند (Komalavalli and Rao, 2000). در ارزیابی تأثیر عصاره مخمر بر رشد ریزنمونه‌های برگ و دمبرگ گیاه Glehnia littoralis گزارش شد که عصاره مخمر پاسخ رشد درون‌شیشه‌ای هردو ریزنمونه را کاهش می‌دهد (Ishikawa et al., 2007). در مطالعه Abraham و همکاران (2011)، بررسی کشت درون شیشه‌ای Curcuma manggaنشان داد که وجود عصاره مخمر به‌عنوان ترکیب مکمل در محیط‌کشت این گیاه تأثیری بر تکثیر شاخه و رشد ریزنمونه‌ها ندارد (Abraham et al., 2011) که با یافته‌های پژوهش حاضر در گیاه قره‌قاط همسو است. گونه‌های مختلف گیاهی عکس‌العمل‌های متفاوتی در برابر عصاره مخمر اضافه‌شده به محیط‌کشت نشان می‌دهند. برای مثال، استفاده از عصاره مخمر باعث افزایش رشد گیاهچه‌های درون‌شیشه‌ایی بذرالبنج و تولید زیتوده در این گیاه شده است (Shahabivand et al., 2019). همچنین، غلظت عصاره مخمر مورد استفاده درون محیط‌کشت نیز از اهمیّت بالایی برخوردار است و غلظت بالای عصاره مخمر در محیط‌کشت ممکن است باعث مهار رشد شود (George et al., 2008).

شکل 3- تأثیر غلظت‌های مختلف عصاره مخمر بر مقدار روتین و کوئرستین در برگ‌های قره‌قاط در شرایط درون‌شیشه‌ای. حروف متفاوت در هر صفت بیانگر اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد با استفاده از آزمون چند‌دامنه‌ای دانکن (DMRT) است.

Figure 3- Effect of different concentrations of yeast extract on the amount of rutin and quercetin in the V. arctostaphylos leaves under in vitro condition. Different letters indicate a significant difference at the 5% probability level according to the Duncan Multi-Range Test (DMRT).

طبق نتایج به دست آمده در پژوهش حاضر، بیشترین مقدار فعالیت آنزیم پراکسیداز در کشت‌های درون‌شیشه‌ای قره‌قاط مربوط به نمونه برگ به‌دست‌آمده از محیط‌کشت فاقد تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی بود. به‌عبارت‌دیگر، استفاده از تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی و عصاره مخمر در ترکیب محیط‌کشت باعث کاهش مقدار فعالیت این آنزیم در کشت‌های درون‌شیشه‌ای قره‌قاط شده است. این کاهش فعالیت آنزیم پراکسیداز در تیمارهای حاوی عصاره مخمر ممکن است به‌علت نیاز کمتر سلول‌ها برای فعالیت آنتی‌اکسیدانی در این تیمارها یا مدت زمان تیمار باشد. چراکه در این پژوهش، کشت‌ها به‌مدت طولانی (6 هفته) در معرض محیط‌کشت حاوی عصاره مخمر بودند که در این مدت‌زمان ممکن است آثار تنشی به‌ویژه تنش اکسیداتیو توسط سیستم‌های آنتی‌اکسیدانی سلول‌ها از بین رفته باشد. با افزایش مدت‌زمان تیمار با عصاره مخمر، مقدار فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان کاتالاز و پراکسیداز کاهش می‌یابد. برای مثال، Moharrami و همکاران (2017) در کشت‌های ریشه‌ مویین بذرالبنج مشبک (Hyoscyamus reticulatus) نشان دادند که تیمار عصاره مخمر فعالیت آنزیم‌های کاتالاز و پراکسیداز را افزایش داده است، درحالی‌که با افزایش مدت‌زمان تیمار از 48 ساعت به 72 ساعت، مقدار فعالیت‌ این آنزیم‌ها کاهش یافته است (Moharrami et al., 2017). علاوه‌براین، مقدار پرولین برگ‌های قره‌قاط در شرایط درون‌شیشه‌ای به‌طور معنی‌داری تحت تأثیر عصاره مخمر قرار گرفت و با افزایش غلظت عصاره مخمر مقدار پرولین نیز افزایش یافت. افزایش مقدار پرولین در سلول‌ها و بافت‌های گیاهی یکی از پاسخ‌های مهم گیاهان به تنش‌های زیستی و غیرزیستی است. پرولین در رشد گیاه در شرایط طبیعی و همچنین، افزایش مقاومت گیاه در شرایط تنش‌های زیستی و غیرزیستی مؤثر ‌است. این اسیدآمینه نقش‌های فیزیولوژیک متعددی در حفاظت سلول‌ها در برابر تنش به‌ویژه گونه‌های فعال اکسیژن و در نتیجه بهبود رشد و نمو سلول‌ها ایفا می‌کند (Wink, 2010). افزایش مقدار پرولین در اثر تیمار عصاره مخمر در کشت‌های درون‌شیشه‌ای ریشه مویین بذرالبنج مشبک (Hyoscyamus reticulatus) نیز گزارش شده است (Moharrami et al., 2017). تنش‌های زیستی و غیرزیستی باعث افزایش تولید گونه‌های فعال اکسیژن مانند H₂O₂، OH^- و O₂^- (سوپراکسید) در سلول‌ها می‌شوند. رادیکال‌های آزاد (گونه‌های فعال اکسیژن) با پراکسیداسیون لیپیدهای غشای سلول سبب تغییر ساختار و نسبت لیپیدهای غشا شده و باعث کاهش یکپارچگی غشا و در نتیجه افزایش نفوذپذیری آن می‌گردند. گیاه با استفاده از مکانیسم‌های آنزیمی و غیرآنزیمی می‌تواند غلظت گونه‌های فعال اکسیژن را کاهش داده و از این طریق از آثار مخرب آن بکاهد. البته موفقیت کامل گیاه در این راستا به میزان فعالیت سیستم‌های آنتی‌اکسیدانی گیاه و مقدار تولید و تجمع گونه‌های فعال اکسیژن در سلول‌ها نیز بستگی دارد. دستگاه دفاعی آنتی‌اکسیدانی آنزیمی شامل آنزیم‌هایی نظیر پراکسیداز، کاتالاز، سوپراکسیددیسموتاز و آنتی‌اکسیدان‌های غیرآنزیمی شامل فلاونوئیدها، آنتوسیانین‌ها و سایر ترکیبات فنولی است (Karabal et al., 2003).

روتین از جمله متابولیت‌های ثانویه باارزش و با ویژگی‌های دارویی مهم و متعدد از قبیل اثرات ضدباکتریایی، ضدالتهابی، ضدسرطان و ضد‌دیابت است (Canuto et al., 2016). کشت‌های درون‌شیشه‌ای قره‌قاط از نظر تولید روتین پاسخ وابسته به غلظت عصاره مخمر نشان دادند. افزایش غلظت عصاره مخمر از 500 به 1000 میلی‌گرم بر لیتر باعث تحریک تولید و تجمع روتین در کشت‌های درون‌شیشه‌ای این گیاه نسبت به شاهد شده است. عصاره مخمر در گیاهان متعدد به‌منظور افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه مختلفی به‌کار رفته است که از جمله آنها می‌توان به‌موارد زیر اشاره کرد: عصاره مخمر تولیــد هیوســیامین و اســکوپولامین را در ریشه‌های مویین بذر‌البنج مشبک (Hyoscyamus reticulatus) افزایش داده، بااین‌حال، مقدار تولید و تجمع این متابولیت‌های ثانویه بسته به غلظت عصاره مخمر متفاوت گزارش شده است (Moharrami et al., 2017). علاوه‌براین، افزودن عصاره مخمر به محیط‌کشت باعث افزایش تولید و تجمع متابولیت‌های ثانویه کافئیک اسید، کوماریک اسید و فرولیک اسید در ساقه و ریشه کشت‌های درون‌شیشه‌ایی Glehnia littoralis شده است (Ishikawa et al., 2007). عصاره مخمر، غنی از آمینواسیدهای مختلف، ویتامین‌ها و سایر ترکیب‌هاست که می‌تواند رشد سلول‌ها و بافت‌های گیاهی و تولید متابولیت‌های ثانویه در آن را تحت تأثیر قرار دهد. مکانیسم عمل محرک‌های زیستی به‌طور کامل روشن نیست، ولی باتوجه‌به اینکه مخمر موجودی زنده است، اولیگوساکاریدهای موجود در عصاره مخمر می‌تواند به‌عنوان محرک و از طریق گیرنده‌های موجود در سطح غشای سلولی برهمکـنش الیسـیتور-گیرنـده را ایجاد کند و فرایند تحریک را فعال نماید (Wink, 2010). در اثر این برهمکنش و تحریک، پیام‌رسان‌های متعددی مانند افزایش غلظت سیتوسولی Ca²⁺، ایزوپنتیل‌تری‌فسفات (IP₃) و دی‌اسیل‌گلیسرول (DAG) تولید شده و آبشاری از سیگنال‌ها از طریق مسیرهای انتقال پیام به هسته سلول انتقال می‌یابد. این سیگنال‌ها در نهایت از طریق پروتئین‌کینازهای فعال‌شده با میتوژن بیان ژن‌های مرتبط با پاسخ‌های دفاعی سلول‌های گیاهی ازجمله افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه را تحت تأثیر قرار می‌دهد (Vasconsuelo and Boland, 2007; Wink, 2010). بااین‌حال، پاسخ بیوشیمیایی و متابولیک سلول‌ها و گیاهان مختلف به محرک‌‌های مختلف زیستی و غیرزیستی متفاوت است. به‌طوری‌که تاکنون هیچ محرکی گزارش نشده است که دارای یک اثر عمومی و ثابت بر سیستم‌های مختلف کشت درون شیشه‌ای و گونه‌های گیاهی مختلف باشد (Vasconsuelo and Boland, 2007). بنابراین، غربالگری و بهینه‌سازی غلظت محرک، زمان اعمال محرک و مدت‌زمان تیمار برای هر محرک خاص به‌منظور حصول بیشینه پاسخ مولکولی و متابولیک به‌ویژه تولید و تجمع متابولیت‌های ثانویه مورد نظر، ضروری است.

جمع‌بندی

نتایج پژوهش حاضر نشان داد که درکشت درون‌شیشه‌ای قره‌قاط، تأثیر عصاره مخمر بر زنده‌مانی و رشد ریزنمونه‌ها بسته به غلظت آن متفاوت است. به‌طوری‌که‌ غلظت 1000 میلی‌گرم بر لیتر عصاره مخمر باعث کاهش معنی‌دار زنده‌مانی و برگ‌دهی ریزنمونه‌های گرهی قره‌قاط شده است، درحالی‌که این کاهش زنده‌مانی و رشد ریزنمونه‌ها در تیمارهای حاوی 500 و 2000 میلی‌گرم بر لیتر عصاره مخمر در مقایسه با تیمار فاقد آن مشاهده نشد. علاوه‌براین، عصاره مخمر تولید متابولیت‌های ثانویه آنتوسانین و روتین در کشت‌های درون‌شیشه‌ایی قره‌قاط را به‌طور معنی‌داری تحت تأثیر قرار داد. بیشترین مقدار تولید و تجمع متابولیت ثانویه روتین در محیط‌کشت MS حاوی 2 میلی‌گرم بر لیتر BAP، 1/0 میلی‌گرم برلیتر IBA و 1000 میلی‌گرم بر لیتر عصاره مخمر (YE) به‌دست آمد.

سپاسگزاری

نویسندگان از معاونت پژوهش و فناوری دانشگاه محقق اردبیلی که حمایت مالی پژوهش حاضر را برعهده داشت، سپاسگزاری می‌کنند.