سنتز سبز نانوذرات مس توسط باکتری سودوموناس گریمونتی و تعیین ویژگی و فعالیت ضدباکتریایی آن

مقدمه

مس یک عنصر شیمیایی با نماد Cu با عدد اتمی 29 است که در گروه ۱۱ جدول تناوبی قرار می‌گیرد. از خواص این فلز می‌توان به شکل‌پذیری، چکش‌خواری و رسانایی حرارتی و الکتریکی بالا اشاره کرد. از رنگ‌های حاوی این فلز برای بدنة قایق‌ها در حدود دو قرن استفاده می‌شد تا رشد گیاهان و جانوران دریایی روی بدنة این قایق‌ها کنترل شود. همچنین این فلز را در کشاورزی برای آفت‌کشی و تأمین مواد مغذی خاک به کار می‌گیرند. مس یک مادة معدنی ضروری برای اندام‌های زنده است؛ زیرا سهمی کلیدی در ساخت آنزیم تنفسی سیتوکروم اکسیداز C^[1] دارد (1). در میان نانوذرات فلزی، نانوذرات عنصری مس به‌دلیل خواصشان کاربردهای زیادی در زمینه‌های مختلف ازجمله کاتالیست‌ها، نگه‌دارندة چوب، حسگر گاز، روان‌کننده، نانوسیال، انتقال حرارتی، پوشش نانوکامپوزیتی و صنعت رنگرزی الیاف دارند (2). در سالیان متمادی مس به‌دلیل داشتن خواص ضدباکتریایی و ضدویروسی به‌عنوان یک ترکیب ضدعفونی‌کننده استفاده ‌شده است. به‌علت میزان بالای نسبت سطح به حجم، نانوذرات مس دارای خواص ضدمیکروبی بسیار بالا هستند (3). پیداکردن فنون تولید مناسب در نانوفناوری موضوعی است که در چند سال اخیر به شدت درخور توجه پژوهشگران و دانشمندان بوده است. روش‌های فیزیکوشیمیای مختلفی شامل فرزکاری شیمیایی^[2]، سایش لیزری^[3]، ذوب مکانیکی^[4]، کندوپاش^[5]، سل - ژل^[6]، احیای شیمیایی و الکتروشیمیایی و همچنین آذرکافت^[7] برای تهیه مواد نانوساختار با دو رویکرد بالا به پایین^[8] و پایین به بالا^[9] وجود دارند (4). با وجود این، تولید فیزیکوشیمیایی نانوذرات علاوه بر هزینه‌های بالا، آلودگی ناشی از مواد شیمیایی به کار گرفته ‌شده و تولید فرآورده‌های جانبی خطرناک را به دنبال دارد؛ درنتیجه، همین موضوع کاربرد زیست پزشکی نانوذرات تولیدی مذکور را محدود کرده است؛ بنابراین، توسعة روش‌های قابل ‌اعتماد، غیرسمی و سازگار با محیط زیست برای ساخت نانوذرات بسیار اهمیت دارد (5). یکی از گزینه‌های پیش رو برای رسیدن به این هدف استفاده از روش‌های زیستی برای تولید نانوذرات است. در روش زیستی از میکروارگانیسم‌ها، گیاهان و عصاره‌های گیاهی برای ساخت نانوذرات استفاده می‌شود. توسعة این روش‌های زیست‌سازگارانه برای ساخت نانوذرات بسیار مفید است. سنتز سبز، همانند روش کاهش شیمیایی، یک روش پایین به بالا است؛ البته با این تفاوت که در روش سنتز سبز عامل کاهش‌دهندة شیمیایی گران‌قیمت و بعضاً سمی با متابولیت‌های میکروبی یا عصاره‌های گیاهی برای سنتز نانوذرات اکسید فلزی یا فلزی جایگزین می‌شود. منابع زیستی پتانسیل بسیار زیادی برای تولید نانوذرات دارند؛ زیرا بدون استفاده از مواد شیمیایی سمی و گران‌قیمت فرایند احیا را انجام می‌دهند و به همین دلیل توجه بسیاری از محققان را به خود معطوف کرده‌اند (6). طیف وسیعی از منابع زیستی شامل انواع پروکاریوت‌ها و یوکاریوت‌ها برای سنتز زیستی نانوذرات مختلف مانند طلا، نقره، مس، پلاتین، آهن و روی استفاده شده‌اند (7). سیستم‌های میکروبی می‌توانند یون‌های فلزی را با کاهش یا رسوب یون‌های معدنی سمی محلول به نانوساختارهای غیرسمی فلزی سمیت‌زدایی کنند. سم‌زدایی میکروبی با معدنی‌کردن خارج سلولی، رسوب یا ذخیره‌سازی داخل سلولی انجام می‌شود (8). سالوادوری^[10] و همکاران (2013) نشان دادند زیست‌تودة قارچ هایپوکریالیکسی^[11]، بعد از مواجهه با محلول کلرید مس، قادر به سنتز نانوذرات مس در شرایط بهینه‌شده ازنظر دما، pH، غلظت اولیه یون مس و دور شیکر بوده است (9). شانتکریتی^[12] و رانی^[13] (2014) با استفاده از سوپرناتانت عاری از کشت باکتری سودوموناس فلورسنس^[14] موفق به تولید نانوذرات کروی مس به‌صورت برون سلولی با میانگین اندازة 49 نانومتر در  pHطبیعی و در مواجهه با محلول سولفات مس در غلظت 318 میلی‌گرم در لیتر شدند (10). تیواری^[15] و همکاران (2016) با استفاده از سویة باکتری مقاوم به یون مس با نام باسیلوس سرئوس سویة SWSD1^[16]، موفق به سنتز سبز نانوذرات مس در دامنة پراکنش 11 تا 33 نانومتر در مواجهه با محلول سولفات مس در غلظت 10 میلی‌مولار شدند (11). نابیلا^[17] و کانابیران^[18] (2018) با استفاده از جدایة اکتینومیستی با نام  VITBN4موفق به سنتز نانوذرات اکسید مس با میانگین اندازة ذرات 7/61 نانومتر در مواجهه با نمک سولفات مس در غلظت نهایی 10 میلی‌مولار شدند (12). در جدیدترین مطالعة نومان^[19] و همکاران (2020) یک سویة باکتری مقاوم به یون مس از جنس اشریشیا ^[20]با نام  SINT7با قابلیت سنتز نانوذرات مس در دامنة پراکنش 33/22 تا 39 نانومتر و میانگین اندازة 55/28 نانومتر جداسازی و تعیین ویژگی شد (13). در دو دهه اخیر غربالگری‌های میکروبی زیادی برای تولید زیستی نانوذرات فلزی به‌دلیل خواص ویژة نوری، شیمیایی، الکتریکی و فوتوالکتریکی آنها صورت گرفته ‌است که نشان‌دهندة کاربردهای متنوع این مواد در حوزه‌هایی همچون اپتیک، زیست واکنشگرها، داروهای زیستی، مکانیک، مغناطیس و انرژی است. اصولاً برای اینکه فرایندهای میکروبی قابلیت صنعتی‌شدن داشته باشند باید کم‌هزینه و دارای سرعت تولید بالا و عملیات پیوسته باشند که در این راستا غربالگری سویه‌های میکروبی جدید برای رسیدن به این هدف از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است (14). با توجه به مزایای استفاده از سویه‌های باکتریایی (توانایی بالا در سازگاری با شرایط محیطی، رشد سریع و کشت آسان) برای تولید صنعتی نانوذرات در این مطالعه، پتانسیل سویه‌های باکتریایی اندوفیت به‌عنوان زیست کاتالیزگر^[21] در احیای زیستی نمک کلرید مس به نانوذرات ‌مس بررسی شد.

مواد و روش‌ها

.مواد شیمیایی و محیط‌های کشت استفاده‌شده: نمک کلرید مس دو آبه (CuCl₂.2H₂O) با خلوص بالای 99 درصد برای آزمایشات سنتز زیستی نانوذرات مس از شرکت سیگما - آلدریچ آمریکا^[22] خریداری شد. آگار، اسید هیدروکلریک، هیدروکسید سدیم و آب اکسیژنه از شرکت مرک آلمان^[23] خریداری شدند. دیسک اکسیداز (تترا متیل پی فنیلین دی آمین دی هیدروکلراید) از شرکت پادتن طب ایران تهیه شد. کیت رنگ‌آمیزی گرم از تالیژن پارس ایران تهیه شد. قندهای گلوکز، فروکتوز، گالاکتوز، آرابینوز، سوکروز از کیولب انگلستان^[24] خرداری شدند. ال-هیستدین، ال-تریپتوفان و تریپتامین از مرک خرداری شدند. محیط‌های کشت نوترینت آگار، نوترینت براث و محیط کشت آگار زرده تخم‌مرغ^[25] از هایمدیا هند^[26] خریداری شدند. محیط کشت مولر هینتون آگار^[27] از مرک خریداری شد. کیت استخراج DNA از شرکت متابیون آلمان^[28] خریداری شد. مواد به کار گرفته شده در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز^[29] از شرکت سیناژن ایران تهیه شد.

باکتری‌های اندوفیت، شرایط رشد و بررسی الگوی تحمل‌پذیری: 18 جدایة باکتری اندوفیت جداشده از ریشه و طوقة گیاه لوبیای جمع‌آوری‌شده از مزارع مختلف لوبیا در استان لرستان، به‌عنوان جدایه‌های منتخب در بررسی سنتز زیستی نانوذرات مس، از گروه گیاه‌پزشکی دانشکده کشاورزی دانشگاه کردستان تهیه شدند. جدایه‌های مذکور در محیط کشت نوترینت آگار به مدت 24 تا 48 ساعت در شرایط گرماگذاری 25 درجه سانتی‌گراد با هدف فعال‌سازی و حصول اطمینان از خالص‌بودن، کشت خطی داده شدند. پس از تهیه استوک کلرید مس (50 میلی‌مولار)، با هدف اضافه‌کردن غلظت‌های مختلف یون مس به محیط‌های کشت، از روش رقت در آگار^[30] برای تعیین الگوی تحمل‌پذیری جدایه‌های باکتری اندوفیت استفاده شد (15). به ارلن‌های 250 میلی‌لیتری حاوی 50 میلی‌لیتر از محیط کشت نوترینت آگار استریل ذوب‌شده، کلرید مس در غلظت‌های 5/0، 1، 5/1، 2، 5/2، 3، 5/3، 4، 5/4، 5 و 5/5 میلی‌مولار افزوده شد. سپس داخل پلیت‌های پلاستیکی استریل یکبار مصرف 10 سانتی‌متری ریخته شد. پلیت‌های مذکور به مدت 2 ساعت در دمای 40 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند تا سطح مرطوب آنها خشک شود. سپس با سمپلر 50 میکرولیتر از باکتری‌های مورد آزمایش در غلظت استاندارد نیم مک فارلند (cell/ml 10⁸) به‌صورت کشت نقطه‌ای^[31] قرار داده شد. پلیت‌های مذکور پس از 24 تا 72 ساعت گرماگذاری در دمای 25 درجه سانتی‌گراد برای بررسی رشد یا عدم رشد کلنی‌های باکتریایی ازطریق مشاهدات چشمی بررسی شدند. همه آزمایشات سه بار تکرار شدند.

بررسی توانمندی سنتز نانوذرات مس توسط جدایه‌های باکتری اندوفیت مقاوم به یون مس توسط سلول درحال استراحت^[32]: جدایه‌های باکتری اندوفیت با قابلیت تحمل‌پذیری بالا نسبت به مس به‌عنوان جدایه‌های منتخب برای سنتز زیستی نانوذرات مذکور توسط سلول درحال استراحت ارزیابی شدند (16). برای تهیه سلول درحال استراحت، یک لوپ کامل از کلنی خالص باکتری‌های منتخب در ارلن‌های 250 میلی‌لیتری حاوی 50 میلی‌لیتر محیط کشت نوترینت براث در دمای 25 درجه سانتی‌گراد روی شیکر انکوباتوردار (200 دور در دقیقه)، به مدت 24 تا 28 ساعت (رسیدن به انتهای فاز رشد لگاریتمی) انکوبه‌گذاری شد. سپس تودة زیستی باکتری^[33] به کمک سانتریفیوژ یخچالی (8000 دور در دقیقه، 15 دقیقه و 4 درجه سانتی‌گراد) جداسازی شد. پس از سه بار شستشو با آب دیونیزة استریل، معادل 5 گرم از زیست‌تودة خشک سلول، پس از خشک‌شدن در آون 60 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 ساعت و وزن‌کردن ازطریق ترازو، به ارلن‌های 250 میلی‌لیتری حاوی 50 میلی‌لیتر آب دیونیزة استریل غنی‌شده با 2 میلی‌مولار کلرید مس استریل افزوده شد. سپس مخلوط واکنش زیست تبدیلی در شرایط دمایی 25 درجه سانتی‌گراد و دور شیکر rpm 200 گرماگذاری شد. به‌طور همزمان از محلول کلرید مس (بدون تلقیح سلول درحال استراحت برداشت‌شده از انتهای فاز رشد لگاریتمی) و سلول درحال استراحت برداشت‌شده (بدون اضافه‌کردن محلول کلرید مس) به‌عنوان کنترل استفاده شد. وجود نانوذرات مس تشیکل‌شده در مخلوط واکنش، ازطریق تغییر رنگ محلول واکنش کلرید مس تیمارشده با زیست‌تودة تلقیحی و نیز طیف‌های جذبی اسپکتروفتومتری مرئی ماورای بنفش^[34] در طول موج‌های 200 تا 800 نانومتر بررسی شدند (17).

.اثر فاکتورهای مختلف بر سنتز نانوذرات مس توسط سلول درحال استراحت: تأثیر فاکتورهای مختلف شامل اثر غلظت‌های اولیه کلرید مس (1، 2، 3، 4 و 5 میلی‌مولار)، اثر غلظت اولیه زیست‌تودة تلقیحی جدایه (5/2، 5، 5/7، 10 و 5/12 گرم در لیتر برحسب وزن خشک) و اثر دورة گرماگذاری (24، 48، 72، 96 و 120 ساعت ) بر سنتز نانوذرات مس توسط سلول درحال استراحت با بهینه‌سازی به روش تک عاملی بررسی شد (18). تشکیل نانوذرات مس با آنالیز طیف‌سنجی اسپکتروفتومتری سنجش شد. همه آزمایشات در سه تکرار انجام شدند.

.شناسایی مورفولوژیک، بیوشیمیایی و ملکولی جدایة باکتری اندوفیت منتخب: شناسایی اولیه سویة باکتری اندوفیت منتخب براساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی و آزمون‌های تشخیصی بیوشیمیایی معرفی‌شده در کتاب باکتری‌شناسی سیستماتیک برگی انجام شد (19). بررسی ظاهر کلنی و بررسی میکروسکوپی مستقیم پس از رنگ‌آمیزی با استفاده از کیت رنگ‌آمیزی گرم و همچنین ازطریق مشاهدات میکروسکوپ الکترونی روبشی^[35] انجام شد. از تست KOH (3 درصد) برای تأیید واکنش گرم استفاده شد. تست‌های کاتالاز و اکسیداز به‌ترتیب به کمک آب اکسیژنه 3 درصد و دیسک اکسیداز، بررسی حرکت باکتری ازطریق روش قطره معلق، بررسی تولید رنگدانه روی محیط کشت کینگ بی^[36]، تست احیای نیترات روی محیط کشت نیترات براث برای بررسی حضور آنزیم نیترات ردوکتاز، تست هیدرولیز نشاسته روی محیط کشت نشاسته آگار برای بررسی حضور آنزیم آمیلاز، بررسی تولید لوان روی محیط کشت نوترینت آگار غنی‌شده با سوکروز (سوکروز نوترینت آگار)، بررسی وجود آنزیم لسیتیناز روی محیط کشت پایه Egg Yolk Agar غنی‌شده با زرده تخم‌مرغ، رشد در دماها و pHهای مختلف و درنهایت تست‌های مرتبط با جذب و تخمیر قندها انجام شدند. به‌منظور شناسایی دقیق جدایة باکتری اندوفیت منتخب، از روش توالی‌یابی 16S rDNA استفاده شد. استخراج DNA ژنومی با استفاده از کیت استخراج DNA شرکت متابیون^[37] بر طبق دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد. از پرایمرهای همگانی ژن 16s rDNA Fd1 (5´-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3´) و Rp2 (5´-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3´) برای تکثیر توالی مربوط به 16S rDNA استفاده شد (20). تعیین توالی قطعة حاصل از تکثیر ژن16S rDNA  توسط ABI3730xl DNA sequencer شرکت ماکروژن کره جنوبی انجام شد. توالی‌های به‌دست‌آمده پس از ویرایش با نرم‌افزار BioEdit با توالی‌های موجود در بانک اطلاعات ژن^[38] هم‌ردیف شدند. درختچة فیلوژنتیک بر مبنای روش Neighbor Joining با استفاده از نرم‌افزار MEGA ورژن 7.0 ترسیم شد (21).

.بررسی اثر ضدمیکروبی نانوذرات مس سنتزی بر گونه‌های باکتریایی مختلف: فعالیت ضدمیکروبی نانوذرات مس سنتزشده توسط جدایة باکتری اندوفیت منتخب توسط استراتژی سلول درحال استراحت، در برابر پاتوژن‌های باکتری انسانی (اشریشیاکلی^[39] با کد IBRC-M11038 و استافیلوکوکوس اورئوس^[40] با کد IBRC-M10917) و گیاهی (سودوموناس سیرینگه^[41] با کد IBRC-M10702 و زانتوموناس کامپستریس^[42] با کد IBRC-M 11094) خریداری‌شده از مرکز ذخایر زیستی و ژنتیکی ایران، ازطریق اندازه‌گیری هالة عدم رشد و به روش انتشار از چاهک بر سطح آگار سنجش شد (22). در این روش، پس از آماده‌سازی سوسپانسیون میکروبی با کدورت معادل نیم مک فارلند (CFU/ml 10⁸)، کشت چمنی با استفاده از میلة شیشه‌ای سرکج استریل بر سطح محیط کشت مولر هینتون آگار انجام گرفت. پس از خشک‌شدن سطح پلیت‌های محیط کشت، به کمک پیپت پاستور استریل، سه عدد چاهک به قطر ۵ میلی‌متر با فاصلة مناسب از یکدیگر ایجاد شدند. سپس به میزان 50 میکرولیتر از نانوذرات مس سنتزشده از واکنش سلول درحال استراحت، پس از رسوب توسط دستگاه سانتریفیوژ (15000 دور در دقیقه، 45 دقیقه، 4 درجه سانتی‌گراد)، خشک‌کردن توسط دستگاه فریز درایر و دیسپرس‌کردن در آب دیونیزه استریل ازطریق حمام اولتراسونیک، در چاهک‌های ایجادشده ریخته شد. پلیت‌ها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد برای باکتری‌های بیماری‌زای انسانی و دمای 28 درجه سانتی‌گراد برای باکتری‌های بیماری‌زای گیاهی گرماگذاری شدند. درنهایت، میزان حساسیت باکتری‌ها با اندازه‌گیری قطر هالة عدم رشد سنجش شد.

.تعیین ویژگی نانوذرات مس با روش‌های طیف‌سنجی و میکروسکوپی: به‌منظور استخراج نانوذرات مس تشکیل‌شده در مخلوط واکنش، ابتدا سوپرناتانت عاری از تودة زیستی باکتری از فیلترهای میلی پور سرسرنگی 22/0 میکرونی عبور داده شد و سپس با هدف رسوب نانوذرات، از سانتریفیوژ با 15000 دور در دقیقه به مدت 45 دقیقه استفاده شد. درنهایت، پس از چند بار شستشوی نانوذرات با استفاده از آب دیونیزه‌شدة سترون، نمونه نانوذره در دستگاه فریز درایر به مدت 24 ساعت خشک شد (23). نانوذرات مس به‌دست‌آمده در مخلوط واکنش حاصل از واکنش سلول درحال استراحت جدایة باکتری اندوفیت منتخب در معرض CuCl₂، با استفاده از مشاهدات چشمی، طیف‌های اسپکتروفتومتری، میکروسکوپ الکترونی روبشی مجهز به طیف‌سنج پراش انرژی پرتو ایکس^[43]، طیف‌سنجی تبدیل فوریه مادون قرمز^[44] و همچنین دستگاه طیف‌سنجی پراش اشعه ایکس[45] بررسی شدند.

نتایج

.غربالگری جدایه‌های باکتری اندوفیت با قابلیت تحمل‌پذیری بالا نسبت به مس: دستیابی به جدایه‌های باکتری مقاوم به یون سمی مس، گام نخست در توسعة سویه‌های باکتری با قابلیت احیای یون مس به نانوذرات مس است (23). در این راستا، الگوی تحمل‌پذیری 18 جدایة باکتری اندوفیت جداشده از ریشه و طوقة گیاه لوبیا نسبت به یون سمی مس در محیط نوترینت براث غنی‌شده با غلظت‌های مختلف کلرید مس ازطریق روش رقت در آگار تعیین شد (شکل 1). براساس نتایج به‌دست‌آمده میزان تحمل‌پذیری جدایه‌های باکتری منتخب بین 5/0 تا 5 میلی‌مولار تعیین شد. در این میان، پنج جدایة باکتری (نام‌گذاری‌شده با عنوان CN8، CN9، CN10، CN15 و CN18) که بالاترین مقاومت نسبت به یون مس را داشتند (تحمل‌پذیری بالاتر از 4 میلی‌مولار) به‌عنوان جدایه‌های برتر برای آزمایشات سنتز زیستی نانوذرات مس انتخاب شدند.

شکل 1- الگوی تحمل‌پذیری جدایه‌های باکتری اندوفیت منتخب نسبت به یون سمی مس ازطریق روش رقت در آگار در محیط نوترینت براث غنی‌شده با غلظت‌های مختلف کلرید مس در شرایط دمایی 25 درجه سانتی‌گراد و پس از 72 ساعت گرماگذاری

.غربالگری جدایه‌های مقاوم به فلز مس با قابلیت سنتز خارج سلولی نانو سولفید مس: پنج جدایة باکتری منتخب با قابلیت مقاومت بالا نسبت به یون سمی مس توسط استراتژی سلول درحال استراحت برای بررسی توانمندی سنتز نانوذرات مس بررسی شدند. براساس نتایج به‌دست‌آمده تنها جدایة باکتری CN10 (جداشده از ریشة گیاه لوبیا) قادر به احیای کلرید مس به نانوذرات مس در غلظت 2 میلی‌مولار از کلرید مس بود (شکل 2). همان‌گونه که در شکل 2 نشان داده شده است براساس مشاهدات چشمی محلول کلرید مس تیمارنشده با سلول درحال استراحت (محیط کنترل) دارای رنگ آبی روشن است؛ درحالی‌که در نمونة تیمارشده با سلول درحال استراحت رنگ محلول واکنش به‌دلیل تشکیل نانوذرات مس به رنگ سبز تیره (سبز لجنی) تغییر رنگ داده است. علاوه بر این، آنالیز نمونه‌ها با اسپکتروفتومتری UV-vis، یک پیک جذبی مشخص را در طول موج 552 نانومتر نشان داد که بیان‌کنندة وجود نانوذرات مس در مخلوط واکنش است (17). براساس منابع معتبر بیشینة پیک جذبی نانوذرات مس در طول موج‌های 550 تا 600 نانومتر است (24). در محلول کنترل (سلول درحال استراحت تیمارنشده با سوبسترای پیش‌ساز کلرید مس)، در طول موج‌های بین 500 تا 600 نانومتر هیچ پیک جذبی مشاهده نشد. گفتنی است ظهور پیک جذبی در محدودة 270 تا 280 نانومتر در محیط کنترل، مربوط به پروتئین‌های ترشح‌شده از سلول‌های درحال استراحت در سوپرناتانت کشت است.

شکل 2- طیف‌های جذبی اسپکتروفتومتری محلول کلرید مس (غلظت 2 میلی‌مولار، 7 pH و سلول درحال استراحت در غلظت 5 گرم بر لیتر برحسب وزن خشک سلول) و تغییر رنگ محلول واکنش (تغییر رنگ از آبی روشن به سبز لجنی) پس از 48 ساعت واکنش زیست تبدیلی در 25 درجه سانتی‌گراد روی شیکر مدور (200 دور در دقیقه)؛ a. محیط کنترل (سلول درحال استراحت تیمارنشده با محلول کلرید مس) و b. محیط واکنش زیست تبدیلی حاوی نانوذرات مس تشکیل‌شده

.اثر غلظت‌های مختلف کلرید مس، زیست‌تودة تلقیحی. جدایه و زمان گرماگذاری بر سنتز نانوذرات مس: در این بخش از پژوهش نتایج مرتبط با تأثیر فاکتورهای مختلف بر سنتز نانوذرات مس توسط سلول درحال استراحت سویة منتخب CN10 ازطریق روش تک عاملی آورده شده است. با افزایش غلظت کلرید مس از 1 تا 3 میلی‌مولار، افزایش تدریجی در طیف جذبی مربوط به نانوذرات مس در واکنش زیست تبدیلی، بعد از 48 ساعت گرماگذاری، در شرایط دمایی 25 درجه سانتی‌گراد، pH برابر 7 و دور شیکر rpm 200 مشاهده شد. به عبارت دیگر از کلرید مس در غلظت 3 میلی‌مولار به‌عنوان غلظت بهینه در آزمایشات بعدی استفاده شد؛ با وجود این، در غلظت‌های بالاتر از 3 میلی‌مولار، به‌دلیل سمیت یون مس راندمان سنتز کاهش یافته است (شکل 3).

شکل 3- تأثیر غلظت‌های مختلف کلرید مس بر سنتز نانوذرات مس در مخلوط واکنش حاوی 5 گرم در لیتر سلول درحال استراحت سویة منتخب CN10، pH برابر 7 و بعد از 48 ساعت گرماگذاری در دمای 25 درجه سانتی‌گراد روی شیکر مدور (200 دور در دقیقه)

در ادامه و با هدف بهینه‌کردن غلظت زیست‌تودة سلول، تأثیر غلظت‌های مختلف از تودة زیستی برداشت‌شده از انتهای فاز رشد لگاریتمی در محیط واکنش حاوی 3 میلی‌مولار از غلظت بهینة کلرید مس ارزیابی شد (شکل 4). براساس نتایج، بیشترین راندمان سنتز نانوذرات مس در غلظت 5/7 گرم در لیتر وزن تودة زیستی به دست آمده است. راندمان سنتز نانوذرات مس در غلظت‌های بالاتر کاهش یافته است؛ بنابراین، از غلظت بهینة 5/7 گرم در لیتر در آزمایشات بعدی استفاده شد.

شکل 4- تأثیر غلظت‌های زیست‌تودة سلول برحسب وزن خشک بر سنتز نانوذرات مس در مخلوط واکنش حاوی کلرید مس در غلظت بهینة 3 میلی‌مولار، pH برابر 7 و بعد از 48 ساعت گرماگذاری در دمای 25 درجه سانتی‌گراد روی شیکر مدور (200 دور در دقیقه)

درنهایت با هدف بهبود راندمان احیای زیستی کلرید مس به نانوذرات مس، اثرات دورة گرماگذاری در شرایط بهینه‌شده (غلظت‌های بهینة یون مس و تودة زیستی) در مخلوط واکنش زیست تبدیلی مطالعه شدند (شکل 5). همان‌گونه که در شکل مشاهده می‌شود یک افزایش منظم در پیک جذبی مرتبط به نانوذرات مس از ساعت 24ام تا 96ام مشاهده شده است. بین ساعات 96 تا 120 یک کاهش نسبی در جذب مشاهده شده است؛ با این حال در مقایسه با ساعات ابتدایی تشکیل نانوذرات میانگین پیک جذبی نانوذرات مس بالاتر است که نشان‌دهندة پایداری نسبی نانوذرات تشکیل‌شده در مخلوط واکنش زیست تبدیلی است.

شکل 5- اثر دورة گرماگذاری بر سنتز نانوذرات مس در مخلوط واکنش حاوی کلرید مس در غلظت بهینة 3 میلی‌مولار، غلظت بهینة زیست تودة سلول (5/7 گرم در لیتر)، دمای 25 درجه سانتی‌گراد، pH برابر 7 و دور شیکر rpm 100

.نتایج مطالعات طیف‌سنجی و میکروسکوپی نانوذرات مس سنتزشده توسط استراتژی سلول درحال استراحت: به دنبال بهینه‌سازی به روش تک فاکتوری سنتز زیستی نانوذرات مس توسط سلول‌های درحال استراحت جدایة باکتری منتخب CN10، نانوذرات مس سنتزی توسط سانتریفیوژ با دور بالا استخراج و پس از خشک‌کردن با دستگاه فریز درایر، مورفولوژی و دامنة پراکنش توزیع اندازة نانوذرات با میکروسکوپ الکترونی روبشی بررسی شدند. همان‌گونه که در شکل 6 نشان داده شده است، تعیین خصوصیت ساختار سطحی نانوذرات مس سنتزی، سنتز نانوذرات کروی با میانگین اندازة 8/24 نانومتری را نشان داد.

در ادامه طیف EDX که با هدف تجزیه و تحلیل ساختاری نانوذرات سنتزی انجام گرفت، حضور پیک‌های مربوط به مس را در نانوذرات سنتزی نشان داد (شکل 7). گفتنی است وجود پیک‌های مرتبط با کربن و اکسیژن احتمالاً مرتبط به عامل پوشاننده[46] یا عامل احیاکنندة دخیل در احیای کلرید مس به نانوذرات مس است.

شکل 6- a. میکروسکوپ الکترونی SEM و b. هیستوگرام توزیع اندازة نانوذرات مس سنتزشده در شرایط بهینه توسط سلول درحال استراحت جدایة باکتری CN10

شکل 7- طیف EDX نانوذرات مس سنتزی توسط سلول درحال استراحت

نتایج آنالیز پراش اشعه ایکس (XRD) نانوذرات مس سنتزی توسط سلول درحال استراحت جدایة باکتری CN10 در شکل 8 نشان داده شده‌اند.

شکل 8- الگوی پراش پرتو ایکس نانوذرات مس سنتزشده توسط استراتژی سلول درحال استراحت

نتایج آزمون XRD نشان‌دهندة پیک‌های قابل رؤیت در صفحات بلوری 111، 200 و 220 است که منبطق بر صفحات و زوایای پرش آنها با نمونة استاندارد نانوذرات مس است (17)؛ همین موضوع کریستالی‌بودن نانوذرات مس را تأیید کرد. با هدف بررسی گروه‌های عاملی پوشانندة دخیل در سنتز و پایداری نانوذرات مس سنتزشده توسط استراتژی سلول درحال استراحت، آنالیز مشخصه‌یابی طیف‌سنجی مادون قرمز تبدیل فوریه (FTIR) انجام شد (شکل 9). با توجه به نتایج به‌دست‌آمده از آنالیز FTIR می‌توان گفت پیک ظاهرشده در محدودة عدد موجی 3415 مربوط به گروه OH موجود در ساختار ماکروملکول‌های احتمالی در نقش عامل پایدارکننده یا احیاکنندة کلرید مس به نانوذرات مس است. همچنین پیک‌های ظاهرشده در عدد موجی 2924 مربوط به گروه C-H کششی، عدد موجی 1435 مربوط به گروه C-H خمشی و عدد موجی 1345مربوط به گروه CH3 خمشی یا N-O یا C-N مرتبط با ترکیبات آلی موجود در نانوذرات مس به‌عنوان عامل پوشاننده در سنتز زیستی نانوذرات مذکور هستند (25).

شکل 9- طیف FTIR نانوذرات مس سنتزشده توسط استراتژی سلول درحال استراحت

نتایج اثرات ضدمیکروبی نانوذرات مس: نتایج به‌دست‌آمده از بررسی خاصیت ضدمیکروبی نانوذرات مس سنتزشده توسط سلول درحال استراحت جدایة منتخب CN10 به روش انتشار از چاهک بر سطح آگار نشان‌دهندة اثر مهاری نانوذرات مس بر باکتری‌های بیماری‌زای انسانی و گیاهی به کار گرفته شده در این مطالعه است. براساس نتایج به‌دست‌آمده، بیشترین اثر بازدارندگی نانوذرات مذکور علیه باکتری بیماری‌زای گیاهی زانتوموناس کامپستریس با میانگین مهارکنندگی 2/19 میلی‌متر و کمترین میزان مهارکنندگی مربوط به باکتری بیماری‌زای انسانی استافیلوکوکوس اورئوس با میانگین مهارکنندگی 4/9 میلی‌متر است. در مجموع براساس نتایج به‌دست‌آمده، اثرات مهارکنندگی نانوذرات مس سنتزشده در این مطالعه بر باکتری‌های بیماری‌زای گیاهی در مقایسه با باکتری‌های بیماری‌زای انسانی بالاتر بود (شکل 10).

شناسایی فنوتیپی و فیلوژنتیکی جدایة منتخب: سویة باکتری اندوفیت CN10 برای آزمایشات مربوط به تعیین هویت انتخاب شد که براساس آنالیزهای طیف‌سنجی و میکروسکوپی سویة برتر شناخته شد. براساس مطالعات میکروسکوپی (نوری و الکترونی) و واکنش رنگ‌آمیزی گرم و تأیید آن با تست KOH، سویة مذکور ازنظر واکنش گرم و تست KOH به‌صورت گرم منفی و ازنظر ریخت‌شناسی، میله‌ای شکل با میانگین ابعاد 1 تا 2/1 میکرون طول و 5/0 تا 6/0 میکرون عرض بود (شکل 11).

در ادامه و با هدف شناسایی بهتر جدایة منتخب، انواع تست‌های بیوشیمیایی و فیزیولوژیک مختلف مطابق با کتاب‌های مرجع و مقالات منتشرشده انجام شدند که نتایج در جدول 1 آورده شده‌اند.

شکل 10- نتایج حاصل از بررسی فعالیت ضدمیکروبی نانوذرات مس تشیکل‌شده توسط سلول درحال استراحت سویة منتخب CN10 به روش انتشار از چاهک بر سطح آگار

شکل 11- تصویر میکروسکوپ الکترونی SEM سویة باکتری CN10

جدول 1- ویژگی‌های ریخت‌شناسی و بیوشیمیایی سویة باکتری CN10

براساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی و آزمون‌های بیوشیمیایی و بر طبق مقالات منتشرشده در این ارتباط جدایة مذکور به‌طور موقت سودوموناس گریمونتی^[47] شناسایی شد. در ادامه و با هدف شناسایی دقیق جدایة باکتری مذکور، DNA ژنومی این باکتری ازطریق کیت استخراج DNA بازیافت شد. سپس ژن کدکنندة 16S rDNA ازطریق آغازگرهای جهانی توسط واکنش زنجیره‌ای پلیمراز تکثیر شد. در ادامه و با توجه خلوص DNA مدنظر، تعیین توالی ژن مدنظر انجام شد. پس از تعیین توالی، توالی‌های نوکلئوتیدی جدایة مذکور در سایت NCBI بلاست شد. براساس نتایج به‌دست‌آمده جدایة مذکور شباهت 7/99 درصدی با سویه‌های متعلق به سودوموناس گریمونتی داشت. آنالیز فیلوژنتیکی بر پایة ترسیم درخت فیلوژنی نیز تأیید کرد جدایة باکتری مذکور به جنس سودوموناس تعلق دارد و علاوه بر این به‌طور محتمل به‌عنوان سویة جدید متعلق به گونة سودوموناس گریمونتی می‌تواند طبقه‌بندی شود (شکل 12).

شکل 12- درخت فیلوژنی سویة منتخب CN10 و دیگر اعضای جنس سودوموناس براساس تکتیر توالی نوکلئوتیدی مربوط به ژن 16S rDNA. ترسیم درخت فیلوژنی بر پایة روش neighbor-joining با بوت استرپ 1000 انجام شد. شماره دسترسی سویه‌های ثبت‌شده در بانک ژنی در پرانتز آورده شده است.

بحث و نتیجه‌گیری

تولید زیستی نانو‌ذرات فلزی یکی از جنبه‌های جذاب علم ریززیست‌فناوری است. نانوذرات مس به‌دلیل کاربردهای فراوان در علوم زیستی و همچنین سایر علوم شایان توجه قرار گرفته‌اند. تولید این نانوذرات در ابتدا با کمک روش‌های فیزیکی و شیمیایی انجام می‌شد که ازنظر انرژی مقرون‌به‌صرفه نیستند و به‌طور کلی این روش‌ها برای محیط زیست مضرند. میکروارگانیسم‌ها ترکیباتی با قابلیت احیاکنندگی دارند که برای سنتز نانوذرات استفاده می‌شوند و مشکلات روش‌های قبلی را ندارند؛ البته تولید نانوذرات توسط میکروارگانیسم‌ها معایبی مانند وقت‌گیربودن کشت میکروب‌ها، سخت‌بودن کنترل شکل و اندازة نانوذرة تولیدی و همچنین سرعت پایین در تولید نانوذرات دارند؛ با ‌وجود این، بهینه‌سازی شرایطی مانند pH محیط، دما، زمان گرماگذاری، میزان استفاده از غلظت یون فلزی و انتخاب نوع میکروارگانیسم مناسب، امکان استفاده از روش‌های زیستی را برای تولید نانوذرات در مقیاس بزرگ و کاربردهای صنعتی فراهم کرده است. همچنین، می‌توان با کشت و بهره‌گیری از میکروارگانیسم‌های دستکاری‌شده ازنظر ژنتیکی برای تولید یک عامل احیاکننده، میزان تولید، شکل و اندازة نانوذرات را به‌طور مؤثرتری کنترل کرد. باکتری‌های موجود در گیاهان، به‌صورت بین سلولی یا داخل سلولی، در یک رابطة همزیستی با گیاهان‌اند. معمولاً جمعیت بیشتری از باکتری‌های اندوفیت در ریزوسفر در مقایسه با قسمت‌های بالایی گیاه وجود دارند. برای همزیستی پایدار، اندوفیت‌ها ترکیبات مختلفی را ایجاد می‌کنند که رشد گیاه را تحریک می‌کنند و مکانیسم دفاعی گیاهان را بهبود می‌بخشند و آنها را از بیمارگرهای گیاهی محافظت می‌کنند. به تازگی، سنتز نانوذرات فلزی ازطریق باکتری‌های اندوفیت، افق جدیدی از تحقیقات روی روابط زیست‌شناسی و فناوری نانو را به وجود آورده است. میکروب‌های اندوفیت همزیست با گیاهان، مخزن ویژه‌ای از متابولیت‌های ثانویة بالقوه دارند که دارای تمایل به کاهش یون‌های فلزی به نانوذرات‌اند (7). در این پژوهش، پتانسیل جدایة باکتری اندوفیت برای احیای زیستی کلرید مس به نانوذرات مس بررسی شد. در این راستا، الگوی تحمل‌پذیری 18 جدایة باکتری اندوفیت جداشده از ریشه و طوقة گیاه لوبیا نسبت به یون سمی مس با روش رقت در آگار تعیین شد. براساس نتایج به‌دست‌آمده میزان تحمل‌پذیری جدایه‌های باکتری منتخب بین 5/0 تا 5 میلی‌مولار تعیین شد. در این میان، پنج جدایة باکتری با بالاترین مقاومت نسبت به یون مس (تحمل‌پذیری بالاتر از 4 میلی‌مولار) به‌عنوان جدایه‌های برتر برای آزمایشات سنتز زیستی نانوذرات مس انتخاب شدند. سالوادوری و همکاران مقاومت ذاتی نسبت به یون مس را با روش رقت در آگار تعیین کردند (9). کواس[xlviii] و همکاران نیز در مطالعة خود، غلظت 5 میلی‌مولار از یون مس را به‌عنوان غلظت نهایی در آزمایشات مربوط به سنتز نانوذرات مس و اکسید مس انتخاب کردند (26). جلوگیری از تکثیر بیومس سلولی، جداسازی آسان‌تر محصول تولیدی، انجام فرایند زیست تبدیلی در شرایط غیراستریل و همچنین تنطیم بیومس سلولی ورودی از مزایای به‌کارگیری سلول درحال استراحت در مقایسه با سلول‌های رویشی است (5)؛ بنابراین، برای بررسی قابلیت تولید نانوذرات مس، در 5 جدایة باکتری منتخب با قابلیت مقاومت بالا نسبت به یون سمی مس، از سلول درحال استراحت استفاده شد که براساس نتایج حاصل‌شده تنها جدایة باکتری CN10 (جداشده از ریشة گیاه لوبیا) قادر به احیای کلرید مس به نانوذرات مس در غلظت 2 میلی‌مولار از کلرید مس بود. در مطالعة پیش رو پس از انتخاب سویة باکتری اندوفیت CN10 به‌عنوان سویة برتر، این سویه از لحاظ ریخت‌شناسی و مولکولی شناسایی شد. نتایج به‌دست‌آمده از آنالیز توالی 16S rDNA نشان دادند سویة مذکور تشابه 7/99 درصدی با سودوموناس گریمونتی دارد. در ادامه، سنتز خارج سلولی نانوذرات مس توسط باکتری سودوموناس گریمونتی در شرایط بهینه واکنش زیست تبدیلی بررسی شد. طبق نتایج، سویة مدنظر پس از مواجهه با محلول کلرید مس (غلظت بهینة 3 میلی‌مولار)، قادر به سنتز خارج سلولی نانوذرات مس کروی با میانگین اندازة 8/28 نانومتر در pH برابر 7 و دمای 25 درجه سانتی‌گراد، پس از 96 ساعت گرماگذاری در دور شیکر rpm 100 است. حسن^[xlix] و همکاران سنتز باکتریایی نانوذرات مس / اکسید مس را در جنس باکتری سراشیا^[l] گزارش دادند (27). قربانی^[li] و همکاران نیز در مطالعة خود نشان دادند عصارة کشت باکتری سالمونلا تیفی‌موریوم^[lii] پس از مواجهه با محلول نیترات مس 1 میلی‌مولار، قادر به سنتز خارج سلولی نانوذرات مس با میانگین اندازة ذرات 49 نانومتری است (28). حسن^[liii] و همکاران تولید خارج سلولی نانوذرات اکسید مس با میانگین اندازة 78 و 80 نانومتر را توسط دو سویة اندوفیت استرپتومایسس زئومایستیکوس^[liv] و استرپتومایسس سودوگریزئولوس^[lv] گزارش کردند (29). در بخش پایانی این پژوهش خاصیت ضدمیکروبی نانوذرات مس سنتزشده توسط سلول درحال استراحت جدایة باکتری اندوفیت سودوموناس گریمونتی علیه برخی باکتری‌های بیماری‌زای انسانی و گیاهی بررسی شد. در مجموع براساس نتایج به‌دست‌آمده، اثرات مهارکنندگی نانوذرات مس سنتزشده در این مطالعه علیه بیماری‌زاهای گیاهی در مقایسه با پاتوژن‌های انسانی بالاتر بود. در مطالعة انجام‌شده توسط آشنگرف و سهامی سلطانی کارایی فعالیت ضدمیکروبی نانوذرات سولفید مس تشکیل‌شده توسط سوپرناتانت کشت باکتری باسیلوس لیکنیفرمیس^[lvi]، علیه برخی باکتری‌های گرم مثبت، گرم منفی و برخی قارچ‌های بیماری‌زا بررسی شد. نتایج نشان دادند نانوذرات زیستی سنتزشده، علیه همه میکروب‌های تست‌شده اثر مهارکنندگی رشد داشتند؛ اما حساسیت سودوموناس آئروژینوزا^[lvii] و باسیلوس سرئوس^[lviii] در مقایسه با سایر ارگانیسم‌های تست‌شده بیشتر بوده است (23). در مطالعات متعددی اثرات ضدمیکروبی نانوذرات مس علیه سویه‌های باکتریایی مختلفی ازجمله اشریشیاکلی، استافیلوکوکوس اورئوس، میکروکوکوس لوتئوس^[lix]، سودوموناس آئروژینوزا، سالمونلا اینتریکا^[lx] و انتروباکتر آئروژنز^[lxi] به اثبات رسیده‌اند (30 و 31). در ارتباط با مکانیسم اثرات ضدباکتریایی نانوذرات مس گفتنی است این نانو‌ذرات به آسانی به دیوارة سلولی باکتری نفوذ می‌کنند. بار مثبت نانو‌ذرات مس به‌طور الکترواستاتیک با بار منفی پروتئین‌های موجود در دیوارة سلول باکتری تعامل برقرار می‌کند و باعث آزادسازی یون‌هایی می‌شود که با گروه‌های تیول پروتئین‌های موجود در دیوارة سلول واکنش می‌دهند و درنهایت، موجب تشکیل گونه‌های فعال اکسیژن^[lxii] می‌شوند. افزایش سطح این گونه‌های فعال باعث افزایش استرس اکسیداتیو در سلول می‌شود. این استرس علاوه بر آسیب به غشای سلولی می‌تواند به DNA و سیستم‌های داخل سلولی مانند سیستم تنفسی صدمه بزند (32).

نتیجه‌گیری

نتایج پژوهش نشان دادند باکتری‌های اندوفیت می‌توانند به‌عنوان کاتالیزور زیستی ارزان و دوستدار محیط‌زیست، جایگزین مناسبی برای روش‌های فیزیکوشیمیایی، برای سنتز نانوذرات مس باشند. به‌دلیل کاربردهای گسترده و ویژگی‌های ارزندة نانوذرات در علم فناوری نانو، این پژوهش می‌تواند زمینه‌ساز مطالعات فراگیرتر در زمینة استفاده از روش‌های زیستی برای تولید خارج سلولی نانوذرات مس باشد. همچنین امید است نتایج این پژوهش در سطح مجامع داخلی و بین‌المللی در راستای معرفی توان بالقوة باکتری اندوفیت سودوموناس گریمونتی سویة CN10 برای سنتز نانوذرات مس، در مراکز علمی پژوهشی، دانشگاهی و نانو زیست‌فناوری با هدف بهره‌برداری تجاری و استفادة عملی در علوم پزشکی، دارویی و بهداشتی استفاده شوند.

سپاسگزاری

این مقاله پژوهشی مستخرج از پایان‌نامه کارشناسی ارشد دانشجوی بین‌الملل دانشگاه کردستان آقای موسی معتصم زوراب (کد رهگیری در ایران‌داک: 1568505 تاریخ 18/03/1399) با راهنمایی دکتر مراحم آشنگرف و با حمایت مالی و معنوی دانشگاه کردستان اجرا شده است که بدینوسیله، نویسندگان این مقاله مراتب تشکر و قدردانی خود را اعلام می‌دارند.

[1]- Cytochrome c oxidase

[2]- Chemical milling

[3]- Laser Ablation

[4]- Mechanical milling

[5]- Sputtering

[6]- Sol-gel

[7]- Pyrolysis

[8]- top–down

[9]- bottom–up

[10]- Salvadori

[11]- Hypocrea lixii

[12]- Shantkriti

[13]- Rani

[14]- Pseudomonas fluorescens

[15]- Tiwari

[16]- Bacillus cereus strain SWSD1

[17]- Nabila

[18]- Kanabiran

[19]- Noman

[20]- Escherichia sp.

[21]- Biocatalyst

[22]- Sigma-Aldrich, St. Louis, USA

[23]- E. Merck, Darmstadt, Germany

[24]- QUELAB, Engalnd

[25]- Egg Yolk Agar

[26]- HiMedia, India

[27]- Muller Hinton Agar

[28]- Mi-bacterial Genomic DNA Isolation Kit mi-BD 100, Germany

[29]- Polymerase chain reaction

[30]- Agar dilution method

[31]- Spot plate method

[32]- Resting cell

[33]- Biomass

[34]- UV-Vis spectrophotometer Specord 210, Germany

[35]- Scanning electron microscopy (SEM)

[36]- King's B medium

[37]- Mi-bacterial Genomic DNA Isolation Kit mi-BD 100

[38]- http://www.ncbi.nlm.nih.gov

[39]- Escherichia coli

[40]- Staphylococcus aureus

[41]- Pseudomonas syringae

[42]- Xanthomonas campestris

[43]- Field emission scanning electron microscopy; TESCAN Mira 3-LMu, Czech Republic

[44]- Fourier transform infrared spectroscopy; Bruker Vector 22 FT–IR Spectrometer

[45]- X-ray diffractometer (Philips X'Pert-MPD)

[46]- Capping agent

[47]- Pseudomonas grimontii

[xlviii]- Cuevas

[xlix]- Hasan

[l]- Serratia

[li]- Ghorbani

[lii]- Salmonella typhimurium

[liii]- Hassan

[liv]- Streptomyces zaomyceticus 

[lv]- Streptomyces pseudogriseolus

[lvi]- Bacillus licheniformis

[lvii]- Pseudomonas aeruginosa

[lviii]- Bacillus cereus

[lix]- Micrococcus luteus

[lx]- Salmonella enterica

[lxi]-Enterobactor aerogenes

[lxii]- Reactive Oxygen Species=ROS