تاثیر دیواره سلولی و عصاره سیتوپلاسمی باکتری لاکتوباسیلوس روتری بر تحریک تولید سایتوکاین های اینترلوکین-4 و اینترفرون گاما

مقدمه.

پروبیوتیک‌ها، ریزموجودات زنده‌ای‌اند که در معده، ترشحات صفراوی و پانکراس وجود دارند، به سلول‌های اپی‌تلیال متصل و در رودۀ انسان کلونیزه می‌شوند. بسیاری از پروبیوتیک‌ها به گروه بزرگی از باکتری‌ها به نام باکتری‌های لاکتیک‌اسید تعلق دارند (1). از میان ریزموجودات پروبیوتیک، باکتری‌های لاکتیک‌اسید مهم‌ترین گروه به شمار می‌آیند و در این میان، جنس لاکتوباسیلوس متداول‌ترین ریزموجود به‌کار‌رفته در تولید محصولات پروبیوتیکی است (2). سـودآوری پژوهش‌ها در زمینـۀ بـاکتری‌هـای لاکتیک‌اسـید و نیاز تمام کشورها به این باکتری‌ها سبب شده است کشورهای درحال توسعه از مدت‌ها پیش به‌طور جدی برای شناسایی باکتری‌های لاکتیک‌اسید بومی تلاش‌ کنند (3).

پروبیوتیک‌ها از طریق تولیدات خود مانند اجزای سلولی، متابولیت‌ها و DNA بر عملکرد سیستم ایمنی میزبان اثر می‌گذارند؛ به عبارتی، اجزای پروبیوتیک‌ها به‌ویژه DNA و پپتیدوگلیکان پاسخ‌هایی را در سیستم ایمنی ذاتی به راه می‌اندازند (4).

در بین پروبیوتیک‌ها، لاکتوباسیلوس‌ها توجه بیشتری را به خود معطوف کرده‌اند. مهم‌ترین اثر پروبیوتیک‌ها، جایگزینی آنها در رودۀ کوچک است که سبب تحریک روده و پاک‌سازی آن و به‌این‌ترتیب، مانع چسبیدن بیماری‌زاها و مهار اثر سمی توکسین‌ها می‌شود. مصرف پروبیوتیک‌ها آثار مفیدی بر سلامت افراد دارد که ازجملۀ آنها عبارتند از: 1- بهبود هضم لاکتوز در افرادی که تحمل لاکتوز ندارند؛ 2- کم‌شدن کلسترول؛ 3- کمک به پیشگیری از سرطان؛ 4- تحریک سیستم ایمنی؛ 5- کنترل عفونت ادراری در خانم‌ها؛ 6- کنترل و پیشگیری عفونت‌های روده‌ای؛ 7- تعادل باکتری‌های بومی (5).

لاکتوباسیلوس روتری، باکتری گرم مثبتی است که به‌طور طبیعی در رودۀ پستانداران و پرندگان زندگی می‌کند. ابتدا در دهۀ 1980 توضیح داده شد برخی گونه‌های این باکتری پروبیوتیک هستند. از قرن نوزدهم، لاکتوباسیلوس روتری در طبقه‌بندی علمی باکتری‌های لاکتیک‌اسید ثبت شد (6). پروبیوتیک‌ها نه‌تنها محرک رشد به شمار می‌آیند، برای تحریک سیستم ایمنی بدن و پیشگیری از ابتلا به بسیاری از بیماری‌های عفونی به کار می‌روند (7).

پروبیوتیک‌ها در سطوح متعددی ازجملـه افـزایش سـطح سیتوکاین‌ها و ایمونوگلوبولین‌ها، افزایش تکثیر سلول‌های مونونوکلئـاز، فعـال‌کــردن ماکروفاژهــا، افـزایش فعالیــت سلول‌های killer Natural، تعدیل خـود‌ایمنـی و تحریـک ایمنی در برابر باکتری‌های بیماری‌زا و پروتوزوآها روی سیسـتم ایمنـی تأثیر می‌گذارند (8).

ایمنی‌درمانی یا ایمونوتراپی، روشی درمانی برای برخی بیماری‌ها ازجمله سرطان است که با تحریک یا سرکوب پاسخ سیستم ایمنی عمل می‌کند. برخی اینترلوکین‌ها، سیتوکین‌ها و کموکین‌ها در این روش درمانی به کار می‌روند. تحریک سیستم ایمنی برای درمان سرطان و برخی از انواع نقص‌های سیستم ایمنی به کار رفته و سرکوب سیستم ایمنی در درمان حساسیت ، رد پیوند اعضا و ... آزموده شده است. درمان سرطان یکی از مهم‌ترین زمینه‌های پژوهشی علوم پایه و بالینی در علوم پزشکی است. پس‌از جراحی، شیمی‌درمانی و رادیوتراپی، روش ایمونوتراپی با استفاده از سیستم ایمنی مهم‌ترین روش مکمل و تأثیرگذار در درمان سرطان است و امروزه، کارآزمایی‌های بالینی وسیعی در انواع مختلف آن درحال انجام است. بررسی پیچیدگی برخورد سیستم ایمنی با تومور لازمۀ ارائۀ راهکار درمانی مناسب برای ایمونوتراپی سرطان است (9 و 10).

هدف مطالعۀ حاضر، ارزیابی تحریک سیستم ایمنی تیپ 1 و 2 در سلول‌های تک‌هسته‌ای خون محیطی انسانی با استفاده از لاکتوباسیلوس روتری است.

مواد و روش‌ها.

نوع مطالعه:مطالعه به‌طور مقطعی از خرداد 1397 تا اردیبهشت 1398 انجام شد. جمع‌آوری نمونه برای جداسازی باکتری‌ها به‌طور تصادفی از محصولات لبنی انجام، شناسایی باکتری‌ها به روش مولکولی انجام و اثر باکتری‌های جداشده بر سلول‌های منوکلئار و تحریک تولید اینترلوکین 4 و اینترفرون گاما با استفاده از آزمایش الایزا ارزیابی شد.

جمع‌آوری نمونه:تعداد 20 نمونه از محصولات لبنی سنتی و پاستوریزه شامل شیر، ماست، پنیر، کشک و ... به‌طور تصادفی از استان فارس جمع‌آوری و برای جداسازی باکتری به آزمایشگاه میکروب‌شناسی منتقل شدند.

.جداسازی لاکتوباسیلوس‌ها از محصولات لبنی: تعلیق باکتریایی از نمونه‌های محصولات لبنی با استفاده از محلول پپتون فیزیولوژیکی استریل (5/8 گرم‌بر‌لیتر کلرید‌سدیم و 1 گرم‌بر‌لیتر پپتون باکتریولوژیکی) تهیه شد. ابتدا حدود 10 گرم از نمونه‌های لبنی با قاشقک استریل و 10 میلی‌لیتر از نمونه‌های شیر و دوغ به‌طور جداگانه به 100 میلی‌لیتر PPS (Physiological Peptone Solution) استریل منتقل شد. پس‌از یکنواخت‌کردن نمونه‌ها با تکان‌دادن به‌مدت نیم ساعت، 10 میلی‌لیتر از تعلیق‌های تهیه‌شده به‌طور جداگانه به 200 میلی‌لیتر محیط‌کشت MRS (Man, Rogosa and Sharp) مایع (شرکت سیگما‌- آلدریچ آمریکا) منتقل شد تا باکتری‌ها به بیشترین مقدار خود برسند و به‌مدت 24 ساعت در شرایط کم‌هوازی (شرایط اتمسفری با فشار اکسیژن کم) و دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد گرماگذاری شد؛ تمام مراحل یادشده زیر هود لامینار و شرایط استریل انجام شدند (11).

شناسایی اولیۀ باکتری‌:شناسایی باکتری‌های خالص‌شده بر اساس صفت‌های شکلی کلنی، رنگ‌آمیزی گرم، آزمون کاتالاز و اکسیداز انجام شد (12).

شناسایی مولکولی: استخراج DNA با استفاده از کیت (یکتاتجهیزآزما- ایران) و بر اساس دستورعمل آن انجام شد. به‌منظور شناسایی دقیق‌تر و تکثیر از آغازگرهای اختصاصی لاکتوباسیلوس و تکثیر ژن 16S rDNA استفاده شد (12). واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با دستگاه ترموسایکلر (Bio Rad-USA) انجام شد. تمام اجزای واکنش از شرکت یکتاتجهیزآزما خریداری شدند. مخلوط واکنش شامل 25 ماکرولیتر Master Mix (شامل بافر PCR با غلظت 10 برابر، کلریدمنیزیم dNTP، آنزیم Taq DNAپلیمراز)، 3 ماکرولیتر DNA، 2 ماکرولیتر آغازگر رفت FLB190 (5′- AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG -3′)، 2 ماکرولیتر آغازگر برگشت RLB190 (5′- CGG TAT TAG CATG TTT CC -3′) با غلظت 10 پیکومول و 18 ماکرولیتر آب بود (13). به‌منظور آغاز فرایند پلیمریزاسیون در این روش، دستگاه ترموسایکلر به‌مدت 1 دقیقه روی دمای 94 درجۀ سلسیوس تنظیم و متعاقباً 35 چرخۀ PCR به‌شکل 1 دقیقه در 94 درجۀ سلسیوس، 30 ثانیه در 55 درجۀ سلسیوس و 1 دقیقه در دمای 72 درجۀ سلسیوس اجرا شد؛ درنهایت، عمل طویل‌سازی نهایی به‌مدت 4 دقیقه در 72 درجۀ سلسیوس انجام شد و سپس برای اطمینان‌یافتن از تکثیر ژن 16S rDNA، الکتروفورز روی ژل آگارز 1 درصد حاوی بافر TBE 1X به‌مدت 60 دقیقه در ولتاژ 90 انجام شد. درنهایت، دستگاه UV Transilluminator-USA برای مشاهدۀ نتایج ژل استفاده شد (13 و 14).

توالی‌یابی: محصول نهایی واکنش PCR برای تعیین توالی به شرکت First Base مالزی ارسال شد.

.تهیۀ عصارۀ سیتوپلاسمی و دیوارۀ سلولی از لاکتوباسیلوس‌ها:مقدار 10 میلی‌لیتر محیط‌کشت MRS به‌مدت 48 تا 72 ساعت در شرایط ﺑﯽﻫﻮازی و دﻣـﺎی 30 درجۀ سلسیوس ﮐﺸـﺖ ﺷـﺪ. پس‌از رشد باکتری‌ها، ﺳـﺎﻧﺘﺮیفیوژ به‌مدت 15 دقیقه در 3500 دوردردقیقه و دمای 4 درجۀ سلسیوس انجام و رﺳـﻮب ﺣﺎﺻــﻞ دوباره ﺑـﺎ ﺑــﺎﻓﺮ فسفات 1/0 مولار (اسیدیتۀ 9/6) شستشو شد. رسوب حاصل به‌مدت یک شبانه‌روز در دمای منفی 80 درجۀ سلسیوس نگهداری شد و سپس، باکتری‌ها از حالت انجماد خارج شدند و 1 میلی‌لیتر بافر لیزکننده به آنها اضافه شد. بافر لیزکننده به شرح زیر تهیه شد:

ابتدا محلولی شامل 140 میلی‌مولار NaCl، 7/2 میلی‌مولار KCL، 10 میلی‌مولار Na₂HPO₄، 8/1 میلی‌مولار KH₂PO₄ با اسیدیتۀ 3/7 تهیه و در اتوکلاو، استریل شد؛ محلول حاصل تا زمان استفاده در یخچال نگهداری شد. به‌منظور تهیۀ بافر، 10 درصد گلیسیرین، 2/0 میلی‌مولار لیزوزیم، 10 میلی‌مولار 2- مرکاپتواتانول و 1/0 تا 2 درصد تریتون 100- x به‌طور روزانه به محلول یادشده اضافه شد؛ در مرحلۀ بعد، عمل خردکردن باکتری‌ها در کنار یخ به‌مدت دو دقیقه و به کمک دستگاه سونیکاتور با دامنۀ 60 درصد انجام شد. به‌منظور جلوگیری از افزایش دمای محلول و پروب سونیکاتور، دستگاه به‌مدت چهار دقیقه خاموش شد؛ درنهایت، نمونه‌ها به‌مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجۀ سلسیوس با 15000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شدند، محلول رویی جدا و رسوب حاصل (دیوارۀ سلولی) جدا شد؛ سپس رسوب حاصل به‌مدت یک شبانه‌روز درون دستگاه خشک‌کن انجمادی قرار داده شد تا خشک شود. به‌منظور تهیۀ غلظت‌های مختلف، مقادیر لازم وزن و به‌مدت 15 دقیقه در دمای 121 درجۀ سلسیوس گرمخانه‌‌گذاری شدند تا استریل شوند. عمل رقیق‌سازی به کمک محیط‌کشت RPMI-1640 انجام شد و در شرایط استریل، رقت‌های 1000، 2000، 4000 و 8000 میکروگرم‌در‌میلی‌لیتر از رسوب تهیه شدند (15).

.جداسازی و کشت ردۀ سلول‌های تک‌هسته‌ای خون محیطی: به‌منظور جداسازی سلول‌های تک‌هسته‌ای خون محیطی از خون، 10 میلی‌لیتر خون انسانی حاوی مادۀ ضد‌انعقاد هپارین تهیه شد؛ سپس 5 میلی‌لیتر نرمال‌سالین سرد به خون اضافه و به‌آرامی مخلوط شد تا خون لیز نشود. فایکول در لولۀ سانتریفیوژ تمیز ریخته و 8 تا 10 میلی‌لیتر خون رقیق‌شده با نرمال‌سالین سرد به‌آرامی به آن افزوده شد. لولۀ حاوی فایکول و خون به‌مدت 20 دقیقه در 14000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شد و لایۀ حاوی سلول‌های تک‌هسته‌ای خون محیطی با پییت شارژی که بین فایکول در زیر و نرمال‌سالین در بالا قرار دارد، جدا و به لولۀ تمیز منتقل شد. سلول‌های تک‌هسته‌ای دو بار با نرمال‌سالین شسته و پس‌از آخرین شستشو به حجم 1 میلی‌لیتر رسانده شدند؛ سپس یک قطره از آن برای شمارش استفاده شد. در ادامه، سلول‌ها در محیط‌کشت RPMI-1640 حاوی 10 درصد آلبومین سرم گاوی، 2 میلی‌مولار ال- گلوتامین، 100 میکروگرم‌در‌میلی لیتر استرپتومایسین و 100 میکروگرم‌درمیلی‌لیتر پنی‌سیلین کشت شدند (16 و 17).

.کشت سلول‌های تک‌هسته‌ای خون محیطی و تیمار آنها با عصارۀ سیتوپلاسمی و دیوارۀ سلولی:پلیت‌های 96تایی برای کشت سلول استفاده شدند. برای هر بیمار، 3 ردیف 8 تایی چاهک در نظر گرفته و تعداد 10⁵×1 سلول در هر چاهک اضافه شد. به‌منظور ارزیابی تحریک سلول‌های تک‌هسته‌ای خون محیطی به‌واسطۀ دیوارۀ سلولی و عصارۀ سیتوپلاسمی باکتری، مقدار 100 نانوگرم‌درمیلی‌لیتر دیوارۀ سلولی باکتریایی و 5 میکرولیتر عصارۀ باکتریایی استخراج‌شده به چاهک‌های جداگانه اضافه شد. در آزمایش حاضر، سلول‌های بدون تیمار برای شاهد منفی و لیپوپلی‌ساکارید باکتری برای شاهد مثبت استفاده شد. سلول‌ها به‌مدت 72 ساعت در گرمخانۀ 37 درجۀ سلسیوس حاوی 5 درصد CO₂ و 95 درصد رطوبت نگهداری شدند. پس‌از گذشت 72 ساعت، مایع رویی کشت جمع‌آوری، به تیوب‌های اپندورف منتقل و به‌منظور بررسی سیتوکین IL-4 و IFN-γ به روش الایزا در فریزر منفی 20 درجۀ سلسیوس ذخیره شد (18).

.جمع‌آوری محلول رویی و اندازه‌گیری اینترفرون گاما و اینترلوکین-4:در پژوهش حاضر از کیت الایزا (شرکت کارمانیا پارس ژن، ایران) استفاده شد. پلیت الایزا از کیت خارج و در محیط خشک به دمای اتاق رسانده شد. به‌منظور اندازه‌گیری اینترلوکین-4، میزان 60 میکرولیتر از استاندارد شمارۀ 5 (استاندارد (HI4S-KPG: CN) با غلظت 855 پیکوگرم‌بر‌میلی‌لیتر) به ویال A₁، میزان 60 میکرولیتر از استاندارد شمارۀ 4 (266 پیکوگرم‌بر‌میلی‌لیتر) به ویال B₁، میزان 60 میکرولیتر از استاندارد شمارۀ 3 ( 88 پیکوگرم‌بر‌میلی‌لیتر) به ویال C₁، میزان 60 میکرولیتر از استاندارد شمارۀ 2 (29 پیکوگرم‌بر‌میلی‌لیتر)به ویال D₁، میزان 60 میکرولیتر از استاندارد شمارۀ 1 (9 پیکوگرم‌بر‌میلی‌لیتر) به ویال E₁ و میزان 65 میکرولیتر از استاندارد صفر (HI4Sz-KPG: CN) به ویال F₁ اضافه شد. میزان 60 میکرولیتر به باقی ویال‌ها نمونۀ مدنظر اضافه شد. به‌منظور اندازه‌گیری میزان تولید اینترفرون گاما، میزان 60 میکرولیتر از استاندارد شمارۀ 5 (استاندارد(IFNS-KPG: CN با غلظت 600 پیکوگرم‌بر‌میلی‌لیتر) به ویال A₁، میزان 60 میکرولیتر از استاندارد شمارۀ 4 (200 پیکوگرم‌بر‌میلی‌لیتر) به ویال B₁، میزان 60 میکرولیتر از استاندارد شمارۀ 3 (6/66 پیکوگرم‌بر‌میلی‌لیتر) به ویال C₁، میزان 60 میکرولیتر از استاندارد شمارۀ 2(2/22 پیکوگرم‌بر‌میلی‌لیتر)به ویال D₁، میزان 60 میکرولیتر از استاندارد شمارۀ 1 ( 4/7 پیکوگرم‌بر‌میلی‌لیتر)به ویال E₁ و میزان 60 میکرولیتر از استاندارد صفر (HIFNSz-KPG: CN) به ویال F₁ ضافه شد؛ در ادامه، نمونه‌ها به‌مدت دو ساعت روی شیکر و در دمای 37 درجۀ سلسیوس گرمخانه‌گذاری شدند. پس‌از گرمخانه‌گذاری مناسب، سه مرتبه شستشوی پلیت‌ها با محلول شستشو انجام شد. میزان 60 میکرولیتر از آنتی‌بادی کونژوگه به تمام حفره‌ها اضافه و به‌مدت 1 ساعت در دمای اتاق روی شیکر گرمخانه‌گذاری شد. پس‌از گرمخانه‌گذاری مناسب، سه مرتبه شستشوی پلیت‌ها با محلول شستشو انجام شد. میزان 60 میکرولیتر از محلول Avidin-HRP به تمام حفره‌ها اضافه و به‌مدت نیم ساعت در دمای اتاق و روی شیکر گرمخانه‌گذاری شد. پس‌از گرمخانه‌گذاری مناسب، پنج مرتبه شستشوی پلیت‌ها با محلول شستشو انجام شد. میزان 60 میکرولـیتر از پیش‌ماده به تمام حفره‌ها اضافـه شد و به‌مدت 15 دقیقه در دمای اتاق و روی شیکر گرمخانه‌گذاری شدند. میزان 30 میکرولیتر از محلول متوقف‌کننده به تمام حفره‌ها اضافه شد و میزان جذب نمونه‌ها در دستگاه Elisa reader و طول موج 450 نانومتر اندازه‌گیری شد.

تجزیه‌وتحلیل آماری:نرم‌افزارهای آماری SPSS (نسخۀ 25) و (GraphPad) Prism V5.01 برای تجزیه‌وتحلیل آماری استفاده شدند. آزمون شاخصی میانگین برای به‌دست‌آوردن Mean±SD استفاده شد.

نتایج

جداسازی باکتری: تعداد 16 جدایه با ویژگی‌های لاکتوباسیلوس از 20 محصول لبنی جمع‌آوری‌شده از مناطق مختلف استان فارس جداسازی شد. کلنی‌های لاکتوباسیلوس، کروی‌شکل، سفید‌رنگ، نرم، صاف، صیقلی، مات و برخی خشک و ناصاف بودند. در رنگ‌آمیزی گرم، باسیل‌های گرم مثبت، کاتالاز و اکسیداز منفی جداسازی و شناسایی مولکولی شدند (شکل 1).

شکل 1- کلنی لاکتوباسیلوس روتری (شکل سمت چپ)، رنگ‌آمیزی گرم با بزرگ‌نمایی 100× (سمت راست)

.شناسایی مولکولی لاکتوباسیلوس‌های جداسازی‌شده:پس‌از استخراج DNA، دستگاه ژل الکتروفورز برای مشاهدۀ باندهای حاصل از PCR استفاده شد. از 16 جدایۀ اکسیداز و کاتالاز منفی، 8 جدایۀ لاکتوباسیلوس با اندازۀ 190 جفت باز حاصل شد؛ نتایج در شکل 2 مشاهده می‌شوند.

شکل 2- شناسایی مولکولی لاکتوباسیلوس‌های جداسازی‌شده؛ شناساگر 100 جفت بازی سیناژن، چاهک 1 تا 8 جدایه‌های جداسازی‌شده در پژوهش حاضر، شاهد منفی سویۀ استاندارد باکتری لاکتوباسیلوس، شاهد منفی تمام مواد واکنش PCR به‌جز DNA باکتری