ساختار ژنتیکی مولفه‌های جوانه‌زنی جو تحت شرایط نرمال و تنش شوری

جو (Hordeum vulgare L.) از غلات مهم ایران و جهان و ازنظر اهمیت، چهارمین غلۀ مهم دنیا پس‌از گندم، ذرت و برنج است که مقام اول را ازنظر کشت‌و‌کار در شرایط متنوع آب‌و‌هوایی به‌ویژه آب‌و‌هوای گرم‌ و‌ خشک دارد (FAO, 2013). شوری ازجمله خطر‌های جدی تهدید‌کنندۀ محیط و کشاورزی در بسیاری از بخش‌های جهان است که عملکرد محصولات را به‌ویژه در مناطق خشک و نیمه‌خشک تحت‌تأثیر قرار می‌دهد؛ این مشکل هرساله با تغییرات آب‌و‌هوایی و مدیریت ضعیف سیستم‌های آبیاری افزایش می‌یابد. میزان تحمل به شوری گیاه زراعی بایستی در مراحل مختلف رشد به‌ویژه در مرحلۀ جوانه‌زنی، رشد گیاهچه و مراحل رویشی و زایشی بررسی شود (Mohamadi, 2003). جوانه‌زنی یکی از بحرانی‌ترین مراحل رشد گیاه در شرایط تنش شوری است. Etesami و Galeshi (2008) در مطالعه‌ای، اثر سطوح مختلف تنش شوری را در مرحلۀ جوانه‌زنی جو بررسی و مشخص کردند سرعت جوانه‌زنی حساس‌ترین مرحله نسبت به تنش شوری است. کاهش سرعت جوانه‌زنی در شرایط تنش شوری ممکن است راهکار سازگاری بذر به شرایط تنش محیطی در راستای استقرار بهتر گیاهچه باشد. Munns و James (2003) گزارش کردند گونه‌های بسیاری مانند گندم و جو می‌توانند در غلظت زیاد (30 دسی‌زیمنس بر متر) نمک جوانه بزنند، اما ریشه‌چه‌ نمی‌تواند در این سطح از شوری رشد کند. ارقام مختلف واکنش‌های متفاوتی در برابر تنش شوری نشان می‌دهند که به‌علت تفاوت آنها ازنظر ژنتیکی است (Hussain et al., 1997). معرفی و اصلاح ارقام متحمل به شوری از روش‌های مؤثر مقابله با شوری محسوب می‌شود که در ترکیب با برنامه‌های مدیریتی، امکان بهره‌‌برداری از زمین‌های شور را فراهم می‌کند (Mohamadi, 2003)؛ مقاومت به شوری در گیاهان زراعی، صفت کمّی ژنتیکی و فیزیولوژیکی پیچیده‌ایست که چندین مکان ژنی آن را کنترل می‌کنند (Flowers, 2004). یکی از چالش‌های اصلاح‌ نباتات، نبود اطلاعات کافی دربارۀ ژن‌های کنترل‌کنندۀ صفت‌های کمّی است. مکان‌یابی ژن‌های کنترل‌کنندۀ صفت‌های کمّی، یکی از روش‌هایی است که به‌تازگی برای مطالعۀ ژنتیکی صفت‌های کمّی استفاده می‌شود؛ با شناسایی نواحی ژنومی کنترل‌کنندۀ صفت‌های کمّی و تعیین سهم هریک از این نواحی در ایجاد تنوع مشاهده‌شدۀ صفت در جمعیت، کارایی برنامه‌های به‌نژادی افزایش یافته است و با اطمینان بیشتری می‌توان به اصلاح جمعیت پرداخت(Collard and Mackill, 2008). Czyczyło- Mysza و همکاران (2014) در بررسی مکان‌های ژنی کنترل‌ مرحلۀ جوانه‌زنی و رویشی در 90 هاپلوئید مضاعف گندم بهاره، درمجموع 38 مکان ژنی برای تمام صفت‌های مربوط به مراحل جوانه‌زنی و رویشی شناسایی کردند. Shahraki و همکاران (2013) در مطالعۀ صفت‌های فنولوژیک 72 لاین هاپلوئید مضاعف جو حاصل از تلاقی استپتو و مورکس در شرایط تنش شوری، 31 مکان ژنی را مکان‌یابی کردند. Colmer و همکاران (2006) در شرایط تنش شوری با استفاده از جمعیت هاپلوئید مضاعف حاصل از تلاقی بین دو واریتۀ جو (CT9993×IR62266)، 1 مکان ژنی روی کروموزوم 2 برای صفت طول ساقه‌چه ردیابی کردند. ازآنجاکه شناسایی ژن‌ها و مکان‌های ژنی مؤثر در تحمل به شوری در جو می‌تواند درک بهتری از اصلاح و تحمل به شوری در اختیار اصلاحگر قرار دهد و کمک شایانی برای شناخت بهتر سازوکارهای مولکولی و فیزیولوژیکی باشد، پژوهش حاضر با هدف شناسایی مکان‌های ژنی کنترل‌کنندۀ مؤلفه‌های جوانه‌زنی جو در جمعیت F₃ حاصل از تلاقی رقم‌های بادیا×کومینو در شرایط طبیعی و شوری و اشباع نقشۀ پیوستگی جو توسط نشانگر‌های SSR، ISSR و iPBS انجام شد.

مواد و روش‌ها.

ارزیابی‌های فنوتیپی: به‌منظور مکان‌یابی صفت‌های مرتبط با جوانه‌زنی، آزمایشی طی سال‌های 1395 و 1396 در آزمایشگاه گیاه‌شناسی دانشگاه گنبد کاووس روی 100 ژنوتیپ نسل F₃ جو حاصل از تلاقی دو رقم بادیا×کومینو در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام شد.

به‌منظور آزمون جوانه‌زنی بذرها، 100 خانوادۀ نسل F₃ جو حاصل از تلاقی دو رقم بادیا و کومینو به همراه والدین آنها به‌دقت ضدعفونی شدند؛ به‌این‌ترتیب که بذر‌ها 50 ثانیه در محلول هیپوکلریت‌سدیم 2/0 درصد قرار گرفتند و سپس به‌خوبی با آب مقطر استریل شستشو ‌شدند؛ سپس 100 بذر از هر خانواده روی کاغذ واتمن درون پتری‌دیش‌های استریل قرار گرفتند و درنهایت، در شش تیمار شامل تیمار بدون تنش شوری (آب مقطر) و پنج سطح تنش شوری (4، 8، 12، 15 و 20 دسی‌زیمنس بر متر) به‌ترتیب T0، T1، T2، T3، T4 و T5 ارزیابی شدند. تیمار‌های یادشده از اضافه‌شدن به‌ترتیب 25/2، 25/4، 5/7، 11 و 5/13 گرم ‌در ‌لیتر NaCl (آب نمک) به دست آمدند. شمارش بذر‌های جوانه‌زده به‌شکل روزانه و در ساعت‌های معین به‌مدت 7 روز انجام شد. سرعت جوانه‌زنی بر حسب جوانه‌زنی نسبی بذر‌ها در روز به‌ترتیب بر اساس روابط 1 و 2 محاسبه شد (Maguire, 1962). قوۀ نامیۀ بذر از نسبت تعداد بذرهای جوانه‌زده بر تعداد بذرهای کاشته‌شده ضرب در 100 محاسبه شد.

PG: درصد جوانه‌زنی، Ni: تعداد بذر‌های جوانه‌زده در روز iام، N: تعداد کل بذر‌ها، RG: سرعت جوانه‌زنی، Yn: تعداد روز از آغاز آزمایش تا زمان شمارش nام و Xn: درصد بذر‌های جوانه‌زده در شمارش nام است.

درنهایت، 50 گیاهچه به‌طور تصادفی (نمونه‌ای از کل گیاهچه‌ها) نمونه‌برداری و صفت‌های وزن تر دانه (به کمک ترازویی با دقت 001/0 گرم)، وزن خشک دانه (پس‌از قرار‌دادن در آون و دمای 70 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 72 ساعت به کمک ترازویی با دقت 0001/0 گرم)، طول ساقه‌چه و ریشه‌چه در هر سطح و در هر تکرار (با خط‌کش 1/0 میلی‌متر)، طول و قطر دانه (با کولیس)، وزن‌ تر ساقه‌چه و ریشه‌چه (به کمک ترازویی با دقت 001/0 گرم)، وزن خشک ساقه‌چه و ریشه‌چه (پس‌از قرار‌دادن نمونه‌ها در آون و دمای 70 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 72 ساعت) اندازه‌گیری شدند.

تجزیه واریانس صفت‌های مختلف در وضعیت تنش خشکی و وضعیت طبیعی با نرم‌افزار SAS انجام شد؛ سپس میانگین صفت‌ها در والدین و خانواده‌ها در سطح احتمال 5 درصد و به روش LSD مقایسه شد تا علاوه‌بر بررسی آثار تنش خشکی بر صفت‌های مختلف، ژنوتیپ‌های متحمل و حساس تعیین شوند.

آزمایش‌های مولکولی: ارزیابی‌های مولکولی در آزمایشگاه ژنتیک دانشگاه گنبد کاووس انجام شدند. استخراج DNA به روش CTAB انجام شد (Saghi Maroof et al., 1994) و DNA‌های استخراجی در دمای منفی 20 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شدند. از 28 نشانگر چندشکل SSR، 10 آلل چند‌شکل ISSR و 90 آلل چندشکل iPBS برای اشباع نقشۀ پیوستگی (Kaviani charati et al., 2017) استفاده شد (جدول 1). مبنای انتخاب نشانگر‌های تصادفی، میزان چند‌شکلی آنها در مطالعه‌های پیشین بود. نشانگر‌های SSR نیز به‌گونه‌ای انتخاب شدند که روی هر کروموزوم، نشانگر یادشده وجود داشته باشد. ازآنجاکه میانگین فاصلۀ بین دو نشانگر در پژوهش حاضر کمتر از 20 سانتی‌مورگان بود، این تعداد نشانگر برای نقشه‌یابی مناسب تشخیص داده ‌شد. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) در حجم 10 میکرولیتر برای هر نمونۀ DNA انجام شد. به‌منظور انجام PCR، ابتدا 2 میکرولیتر DNA ژنومی رقیق‌شده با غلطت 75/0 نانوگرم در هر تیوپ PCR ریخته و سپس 8 میکرولیتر از محلول مادری PCR (غیر از DNA ژنومی) به هر تیوپ اضافه و به‌آرامی تکان داده ‌شد. گفتنی است برای تهیۀ مخلوط واکنش در میکروتیوپ 5/1 میلی‌لیتری به‌ترتیب آب دو بار تقطیر، محلول مادری (با ترکیب Taq DNA Polymerase با غلظت 04/0 واحد بر میکرولیتر، بافر PCR با غلظت نهایی 1x، MgCl₂ با غلظت 50 میلی‌مولار، dNTPs با غلظت 10 میلی‌مولار، DNA رقیق‌شده و آغازگرهای مورد‌استفاده) در تیوپ‌های PCR حاوی DNA ریخته شد. برای آغازگرهای SSR، غلظت هرکدام از آغازگرهای رفت و برگشت 60 نانوگرم به میزان 75/0 میکرولیتر و برای آغازگرهای تصادفی ISSR و iPBS، غلظت 60 نانوگرم به میزان 5/1 میکرولیتر در نظر گرفته شد. درنهایت، 4 میکرولیتر روغن معدنی برای جلوگیری از تبخیر مواد درون هر تیوپ اضافه شد. تیوپ‌های PCR در دستگاه ترموسایکلر مدل iCycler (BIORAD ساخت کشور آمریکا) قرار داده شدند. چرخه‌های حرارتی برای تمام نشانگر‌ها به‌طور تاچ‌ داون تنظیم شد. چرخه‌های حرارتی برای نشانگر‌های SSR شامل یک مرحله واسرشت‌سازی اولیه به‌مدت 5 دقیقه در دمای 94 درجۀ سانتی‌گراد، 35 چرخه شامل واسرشت‌سازی در دمای 94 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 1 دقیقه، اتصال آغاز‌گرها به‌مدت 1 دقیقه در دمای اختصاصی آنها و بسط در دمای 72 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 2 دقیقه و درنهایت، مرحلۀ تکثیر نهایی به‌مدت 5 دقیقه در دمای 72 درجۀ سانتی‌گراد بود. چرخه‌های حرارتی برای نشانگر‌های ISSR وiPBS  شامل یک مرحله واسرشت‌سازی اولیه به‌مدت 5 دقیقه در دمای 95 درجۀ سانتی‌گراد، مرحلۀ واسرشت‌سازی در دمای 95 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 45 ثانیه، 10 چرخۀ اتصال آغازگر‌ها در دمای 52 تا 64 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 45 ثانیه و بسط در دمای 72 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 45 ثانیه، 25 چرخۀ اتصال آغازگر‌ها در دمای اختصاصی آنها به‌مدت 45 ثانیه و درنهایت، یک مرحله تکثیر نهایی در دمای 72 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 5 دقیقه بود. فراورده‌های واکنش PCR با الکتروفورز روی ژل پلی‌اکریل‌آمید واسرشته‌ساز 6 درصد تفکیک و نمایان‌سازی باند‌ها با روشی موسوم به روش سریع رنگ‌آمیزی نقره (Caetano Anolles and Gresshoff, 1994) انجام شد. نظر به اینکه نشانگرهای نقشه‌شده مانند SSR جایگاه ژنومی مشخصی دارند، برای تهیه نقشۀ پیوستگی ابتدا با نشانگرهای SSR آغاز کردیم و پس‌از تعیین نقشۀ اولیه، انکورکردن نشانگرهای تصادفی به نقشۀ اولیه انجام شد.به‌منظور تهیۀ نقشۀ ژنتیکی در جمعیت F₃ از نرم‌افزار Map Manager QTX استفاده شد؛ فـواصل نشانگری در این نقشه بر اساس تابع کوزامبی محاسبه شدند (Kosambi, 1994). به‌منظور یافتن مکان‌های ژنی از QGENE استفاده شد (Nelson, 1997). به‌منظور تعیین مکان‌های ژنی و برآورد اندازۀ آثار آنها از روش نقشه‌یابی فاصله‌ای مرکب CIM استفاده شد و نقطه‌ای که بیشترین مقدار  LODرا داشت، ناحیۀ با بیشترین احتمال وجود مکان ژنی شناسایی شد. در تمام موارد از پرمیوتیشن و 1000 Resampling استفاده و برای هر پایش 5/0 سانتی‌مورگان در نظر گرفته شد و بر اساس آن، LOD 2 به بالا حد بحرانی در نظر گرفته شد. نظر به اینکه برخی از صفت‌ها توزیع نرمال نداشتند، از تبدیل داده‌ها و همچنین روش حداکثر درست‌نمایی برای جلوگیری از اریبی نتایج استفاده ‌شد (Haley and Knott, 1992). به‌منظور تهیۀ نقشۀ ژنتیکی از اسکورهای 1 برای وجود باند و 2 برای وجودنداشتن باند در نشانگرهای ریزماهواره استفاده شد. درمورد نشانگرهای iPBS، از اسکورهای 1برای وجود باند و 3 برای ‌وجودنداشتن باند در مواقعی که باند در والد اول تکثیر یافته بود، استفاده شد. همچنین درمورد نشانگرهای iPBS از نمره‌های 2 برای وجود باند و 4 برای ‌وجودنداشتن باند در مواقعی که باند در والد دوم تکثیر یافته بود، استفاده شد. گفتنی است برچسب‌زدن نشانگرهای تصادفی به نشانگرهای ریزماهواره برای کروموزوم‌ها جداگانه انجام ‌شد.

جدول 1- نشانگرهای SSR، ISSR و iPBS چندشکل مورداستفاده در تهیۀ نقشۀ پیوستگی جمعیت F₃ جو حاصل از تلاقی ارقام بادیا×کومینو (برنامۀ حرارتی و غلظت‌ها در متن درج شده است)

نتایج و بحث

تجزیه واریانس، توزیع فنوتیپی و مقایسه میانگین صفت‌های موردبررسی در والدین: نتایج تجزیه واریانس صفت‌های موردمطالعه در مرحلۀ جوانه‌زنی (جدول 2) پس‌از بررسی و تأیید برقراری مفروضات نشان داد ژنوتیپ‌های بررسی‌شده ازنظر تمام صفت‌های ارزیابی‌شده در سطح احتمال 1 درصد اختلاف معنادار دارند. تأثیر سطوح مختلف شوری بر صفت‌های یادشده نیز در سطح احتمال 1 درصد معنا‌دار بود. این نتیجه نشان‌دهندۀ تنوع فنوتیپی زیاد در جمعیت است. اختلاف آماری معنا‌دار بین ژنوتیپ‌ها بیان‌کنندۀ وجود تنوع زیاد بین مواد گیاهی ارزیابی‌شده و احتمالاً ساز‌وکار‌های متفاوت آنها در واکنش به تنش شوری است که می‌توانند در انتخاب ژنوتیپ مناسب و تولید جمعیت‌های درحال تفرق به‌منظور مکان‌یابی ژنی استفاده شوند. مشابه نتایج پژوهش حاضر از مطالعۀ Fakheri و Khalegh Babaki (2014) روی نقشه‌یابی نواحی ژنومی کنترل‌کنندۀ صفت‌های فیزیولوژیک و مورفولوژیک مرتبط با جوانه‌زنی گندم نان در وضعیت طبیعی و تنش اسمزی بین دو محیط طبیعی و تنش به دست آمده است که اختلاف معنا‌دار بین ژنوتیپ‌ها را مشاهده کردند. طبق نتایج حاصل از آماره‌های توصیفی چولگی و کشیدگی، توزیع فنوتیپی صفت‌ها به‌شکل نرمال بود و بررسی مقایسه میانگین صفت‌های موردبررسی در والدین تلاقی بادیا×کومینو در جدول 3 به روش آزمون t محاسبه شد. نرمال‌بودن صفت‌ها نشان از ماهیت کمّی آنها دارد.

جدول 2- نتایج تجزیه واریانس خانوادۀ F₃ حاصل از تلاقی بادیا×کومینو مرحلۀ جوانه‌زنی در شرایط طبیعی وشوری

جدول 3- مقایسه میانگین صفت‌های موردبررسی در مرحلۀ جوانه‌زنی برای والدین تلاقی (بادیا×کومینو)

^**، ^* و ns به‌ترتیب نشان‌دهندۀ معناداری در سطح احتمال 1 درصد، 5 درصد و غیر‌معنا‌دار است.

T0، T1، T2، T3، T4 و T5 به‌ترتیب تیمار بدون تنش شوری (آب مقطر) و پنج سطح تنش شوری 4، 8، 12، 15 و 20 دسی‌زیمنس بر متر را نشان می‌دهند.

.مکان‌یابی مکان‌های ژنی کنترل‌کنندۀ صفت‌های موردبررسی: نقشۀ پیوستگی جو با استفاده از نشانگر‌های SSR، ISSR و iPBS ترسیم شد و 6/665 سانتی‌مورگان از ژنوم جو را پوشش داد (شکل 1). طی مرحلۀ جوانه‌زنی در شرایط طبیعی و تنش شوری، درمجموع 26 عدد مکان‌ ژنی برای صفت‌های موردمطالعه شناسایی شدند (جدول 4). نواحی ژنومی و کروموزومی مکان‌های ژنی مکان‌یابی‌شده در شرایط موردارزیابی به‌طور واضح‌تر در شکل 1 مشاهده می‌شوند.

شکل 1- نقشه پیوستگی حاصل از شانگر‌های SSR، ISSR و IPBS در جمععیت F₃ جوحاصل از تلاقی بادیا × کومینو (محل تقریبی QTLها در جداول 4 و 5 آمده است).

الف- شرایط طبیعی: در شرایط طبیعی، یک مکان‌ ژنی روی کروموزوم 5 برای صفت وزن خشک دانه شناسایی شد. qSDW-5a توانست 3/12 درصد از واریانس فنوتیپی را توجیه کند و والد بادیا سبب افزایش وزن خشک دانه شد. Khalili و Mohammadi (2015) سه مکان ژنی روی کروموزوم‌های 1، 2 و 3 جو برای وزن خشک دانه گزارش کردند که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت ندارد. یک مکان ژنی روی کروموزوم‌ 2 برای صفت طول ساقه‌چه و در فاصلۀ ژنومی IPBS2077-5-EBMAO624 شناسایی شد که 4/14 درصد از تغییرات فنوتیپی را توجیه کرد. این مکان ژنی به‌عنوان مکان ژنی بزرگ‌اثر کنترل‌کنندۀ طول ساقه‌چه در شرایط طبیعی شناسایی شد و برای گزینش پیشنهاد می‌شود. Sabouri و همکاران (2010( شش مکان ژنی مرتبط با طول ساقه‌چه‌ را در شرایط تنش اسمزی ناشی از سوربیتول روی کروموزوم‌های 1، 2، 4، 5، 7 و 12 شناسایی کردند که با مطالعۀ حاضر مطابقت دارد. یک مکان‌ ژنی روی کروموزوم 4 برای صفت وزن خشک ساقه‌چه در فاصلۀ نشانگری IPBS2239-2–IPBS2241-1 شناسایی شد. این مکان‌ ژنی توانست 8/9 درصد از واریانس فنوتیپی وزن خشک ساقه‌چه را توجیه کند و آلل‌های والد کومینو سبب کاهش وزن خشک ساقه‌چه شدند. Rabie و همکاران (2013) یک مکان ژنی برای صفت وزن خشک ساقه‌چه در حدفاصل نشانگر‌های RM5711-E36-M59-1 روی کروموزوم 7 در دو وضعیت شوری و خشکی شناسایی کردند که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت ندارد.

ب- تنش 4 دسی‌زیمنس بر متر: در تنش 4 دسی‌زیمنس بر متر، دو مکان ژنی  بزرگ‌اثر روی کروموزوم‌های 6 و 7 برای صفت سرعت جوانه‌زنی شناسایی شدند و این مکان‌های ژنی به‌ترتیب با نشانگر‌های iPBS2077-2–GBMS0183 و HVM65–BMAC0040 پیوستگی داشتند و به‌ترتیب دارای واریانس فنوتیپی 6/11 و 6/10 درصد بودند. Zhang و همکاران (2005) مکان‌های ژنی مرتبط با سرعت جوانه‌زنی را روی کروموزوم‌های 1، 4 و 7 ردیابی کردند. موقعیت مکانی qGS4-7 در مطالعۀ حاضر با مکان‌های ژنی‌ای مطابقت دارد که Zhang و همکاران (2005) ردیابی‌ کردند. در مقابل، Liang و همکاران (2006) دو مکان‌ ژنی روی کروموزوم‌های 3 و 10 برای سرعت جوانه‌زنی تعیین کردند که با نتایج پژوهش حاضر کاملاً متفاوت است. ازجمله دلایل مطابقت‌نداشتن نتایج پژوهش حاضر با نتایج سایر پژوهشگران را می‌توان تعداد و نوع نشانگرهای بررسی‌شده، نوع جمعیت، تعداد افراد استفاده‌شده در جمعیت، نوع والدین استفاده‌شده و شرایط محیطی دانست. دو مکان ژنی بزرگ‌اثر روی کروموزوم‌های 6 و 7 برای صفت درصد جوانه‌زنی در فاصلۀ نشانگری مشابه صفت سرعت جوانه‌زنی شناسایی شدند و درمجموع، 3/22 درصد از تغییرات فنوتیپی را توجیه کردند. Miura و همکاران (2004) در وضعیت تنش دمایی، پنج مکان ژنی را برای درصد جوانه‌زنی روی کروموزوم‌های 2، 4، 5 و 11 (دو مکان‌ ژنی) به‌ترتیب با 9/11، 9/14، 1/10، 6/10، 5/11 درصد توجیه تغییرات فنوتیپی ردیابی کردند که با مکان‌های ژنی شناسایی‌شده در پژوهش حاضر مطابقت ندارد. دو مکان‌ ژنی روی کروموزوم‌های ‌7 و 2 برای قوۀ نامیه بذر شناسایی شدند که درمجموع، 1/21 درصد از تغییرات فنوتیپی صفت قوۀ نامیه بذر را توصیف کردند و آلل‌های والدین به‌ترتیب بادیا و کومینو باعث کاهش و افزایش این صفت شدند. یک مکان ژنی برای وزن خشک دانه روی کروموزوم 4 مکان‌یابی شد؛ والد بادیا سبب افزایش این صفت شد. qSDW4-4a در فاصلۀ نشانگری IPBS2240-IPBS2081-3، 7/9 درصد از تغییرات فنوتیپی را توجیه کرد. یک مکان‌ ژنی برای صفت طول ساقه‌چه روی کروموزوم‌ 2 مکان‌یابی شد. qASL-2a در فاصلۀ ژنومی IPBS2077-5–EBMAO624 قرار داشت و 4/11 درصد از واریانس تغییرات را توجیه کرد و آلل‌های والد کومینو باعث افزایش این صفت شدند. یک مکان‌ ژنی دیگر در این سطح از تنش شوری برای صفت وزن‌ تر ساقه‌چه روی کروموزوم 2 مکان‌یابی شد.qSFW-2a  دارای اثر افزایشی کاهشی بود که از والد بادیا به نتایج منتقل شده‌ بود.

ج- تنش 12 دسی‌زیمنس بر متر: در شرایط تنش شوری 12 دسی‌زیمنس بر متر، سه مکان‌ ژنی برای صفت‌های ارزیابی‌شده در مرحلۀ جوانه‌زنی شناسایی شدند (جدول 4). دو مکان‌ ژنی در کنترل صفت وزن خشک دانه نقش داشتند که درمجموع 5/22 درصد از تغییرات فنوتیپی را توجیه کردند. یک مکان ژنی برای صفت طول ساقه‌چه روی کروموزوم 1 مکان‌یابی شد؛ این مکان‌ ژنی در فاصلۀ نشانگری BMAG0211–IPBS2221-3 قرار داشت و 5/12 درصد از واریانس فنوتیپی را توجیه کرد.Rabei  و همکاران (2014) مکان‌های ژنی مرتبط با تحمل به شوری و خشکی را در دو مرحلۀ جوانه‌زنی و گیاهچه‌ای جمعیت F_2:4 با استفاده از 105 نشانگر AFLP و 131 نشانگر ریزماهواره ردیابی کردند و یک مکان‌ ژنی برای سرعت جوانه‌زنی، یک مکان ژنی برای درصد جوانه‌زنی و یک مکان ژنی برای طول ساقه‌چه‌ در کروموزوم 1 ردیابی کردند.

د- تنش 15 دسی‌زیمنس بر متر: در تنش 15 دسی‌زیمنس بر متر، سه مکان‌ ژنی کنترل‌کنندۀ طول ریشه‌چه‌ روی کروموزوم‌های 2، 6 و 7 مکان‌یابی شدند؛ این سه مکان‌ ژنی درمجموع 4/30 درصد از تغییرات فنوتیپی را توجیه کردند. Khalili و همکاران (2017) سه مکان‌ ژنی روی کروموزوم‌های 3B، 2A و 2D برای طول ریشه‌چه‌ مکان‌یابی کردند؛ این سه مکان ژنی درمجموع 8/48 درصد از تغییرات فنوتیپی را تبیین کردند که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد. یک مکان ژنی روی کروموزوم 4 برای صفت وزن‌ تر ساقه‌چه در فاصلۀ نشانگری D4ff–iPBS2241-2 شناسایی شد و 4/9 درصد از تغییرات فنوتیپی را توجیه کرد. مکان‌های ژنی qRFW15-4a و qRFW15-7a برای صفت وزن تر ریشه‌چه روی کروموزوم‌های 4 و 7 شناسایی شدند. ضریب تبیین برای دو مکان ژنی به‌ترتیب برابر با 9/10 و 7/9 درصد بود. اثر افزایشی نیز به‌ترتیب افزایشی و کاهشی بود که والد کومینو سبب افزایش این صفت و والد بادیا سبب کاهش این صفت شد. یک مکان ژنی برای صفت قوۀ نامیۀ بذر روی کروموزوم 1 و در فاصلۀ نشانگری IPBS2221-2–IPBS2239-3 و ضریب تبیین برابر با 7/11 درصد مکان‌یابی شد. یک مکان‌ ژنی در فاصلۀ نشانگری HVM36–IPBS2240-7 روی کروموزوم 2 برای وزن خشک دانه شناسایی شد. qSV15-1a دارای LOD برابر با 280/2 و ضریب تبیین 10 بود. درنهایت، یک مکان‌ ژنی برای قطر دانه روی کروموزوم 6 و در فاصلۀ ژنومی IPBS2241-4–IPBS2077-1 مکان‌یابی شد و 8/12 درصد از واریانس فنوتیپی را توجیه کرد. اثر افزایشی برای این صفت منفی و از والد کومینو گرفته شد.

م- تنش 20 دسی‌زیمنس بر متر: در شرایط تنش 20 دسی‌زیمنس بر متر، دو مکان ژنی در کنترل صفت طول ریشه‌چه نقش داشتند که روی کروموزوم‌های 2 و 7 شناسایی شدند. ضریب تبیین برای این دو مکان ژنی به‌ترتیب برابر با 4/15 و 1/9 درصد بود.

جدول 4- مکان‌یابی مکان‌های ژنی کنترل‌کنندۀ صفت‌های موردبررسی در مرحلۀ جوانه‌زنی در شرایط طبیعی و تنش شوری

مکان‌های ژنی ‌مکان‌یابی‌شدۀ مشترک برای صفت‌های مطالعه‌شده: جایگاه کروموزومی مکان‌های ژنی مکان‌یابی‌شدۀ مشترک برای صفت‌های موردمطالعه در جدول 5 ارائه شده است. مقایسۀ جایگاه کروموزومی مکان‌های ژنی شناسایی‌شده در مرحلۀ جوانه‌زنی نشان داد برخی از مکان‌های ژنی روی نواحی ژنومی و کروموزومی مشترک قرار دارند؛ این موضوع احتمالاً به‌علت پیوستگی ژنتیکی یا اثر پلیوتروپیک ژنی است.