کاربرد باکتری سودوموناس.GSN23 و روشهای الکتروشیمیایی در شناسایی آلاینده فنل

مقدمه
بر مبنای گزارش سازمان جهانی بهداشت، ترکیبات آروماتیک برای انسان و محیط‌زیست بسیار خطرناکند و به‌آسانی تجزیه نمی‌شوند. درحقیقت انرژی زیاد رزونانس بنزن و مشتقات آن سبب پایداری این ترکیبات می‌شود و شکست حلقه را دشوار می‌کند (1).
فنل یکی از اجزای اصلی پساب بیشتر پالایشگاه‌ها، مجتمع‌های پتروشیمی، صنایع تبدیل زغال‌سنگ، صنایع کاغذ و ریخته‌گری فلزات است. منابع آلودگی فنل در پساب‌های صنعتی عبارتند از: استخراج سوخت‌های فسیلی، فرایندهای شیمیایی نظیر واحد تولید فنل، صنایع دارویی، صنایع چوب و کارخانجات تولید حشره‌کش‌ها. فنل به‌علت قابلیت فراریت کم و انحلال‌پذیری زیاد، مهم‌ترین خطر آلودگی آب برای انسان محسوب می‌شود (2).
راه‌های مختلفی برای بررسی حضور و ارزیابی زیست‌محیطی آلاینده‌ای مانند فنل وجود دارند و اگرچه گاز کروماتوگرافی، اسپکتروفوتومتری و کروماتوگرافی مایع با طیف‌سنجی جرمی کاربرد وسیع و دقت زیادی در تشخیص حضور این آلاینده دارند، این گونه روش‌ها ازنظر آماده‌سازی نمونه، سخت و پیچیده و ازنظر اجرا، گران‌قیمت و وقت‌‌گیرند (3).
امروزه، فناوری زیست‌حسگرها این امکان را فراهم کرده است که از اجزای زیستی یا محصولات آنها برای اندازه‌گیری مواد شیمیایی استفاده شود. بیشتر زیست‌حسگرهای گزارش‌شده برای تشخیص ترکیبات فنلی بر پایۀ آنزیم‌هایی مانند تیروزیناز ، لاکاز و پراکسیداز ترب کوهی هستند. دقت زیاد و عملکرد دقیق آنزیم‌ها در شناسایی ترکیبات فنلی، آنها را به گزینه‌ای مناسب در طراحی زیست‌حسگرها تبدیل کرده است؛ هرچند نقاط ضعف کاربرد آنزیم‌ها را نمی توان نادیده گرفت. هزینۀ استخراج، جداسازی وخالص‌سازی آنزیم‌ها زیاد است و تعدادی از آنزیم‌ها طی جداسازی، تخلیص یا تثبیت روی الکترودها فعالیت خود را از دست می‌دهند؛ زیرا ساختار مولکولی آنها تغییر می‌کند. یکی از راهکارهای جایگزین برای غلبه بر موانع یادشده و نقاط ضعف آنزیم‌ها، کاربرد سلول‌های میکروبی در زیست‌حسگرهاست (3). نقاط ضعف زیست‌حسگرهای سلولی مانند حساسیت کمتر نسبت به آنزیم‌ها را نیز می‌توان با رو‌به‌روکردن سلول میکروبی با پیش‌مادۀ مدنظر تا حد زیادی بهبود بخشید (4).
ریزموجوداتی که برای آشکارسازی ترکیبات فنلی در زیست‌حسگرها گزارش شده‌اند شامل جنس‌های رودوکوکوس ، سودوموناس ، موراکسلا ، آرتروباکتر و تریکوسپورون هستند (3).
از میان روش‌های مختلف طراحی زیست‌حسگرها، روش‌های الکتروشیمیایی پرکاربردترین و تجاری‌ترین روش به شمار می‌آیند. این دسته از زیست‌حسگرها قابلیت تلفیق آسان با روش‌های الکترونیک را دارند و انرژی کمی مصرف می‌کنند که ازنظر اقتصادی به‌صرفه است (5). در این روش، واکنش‌های شیمیایی بین مولکول‌های زیستی و آنالیت سبب تولید یا مصرف الکترون یا یون‌هایی می‌شوند که روی ویژگی‌های الکتریکی محلول مانند جریان الکتریکی یا پتانسیل تأثیر می‌گذارند؛ سپس سیگنال‌های الکتروشیمیایی تولیدشده برای تخمین میزان آنالیت موجود در محیط استفاده می‌شوند.
در روش ولتامتری (زیرمجموعه‌ای از روش‌های الکتروشیمیایی) می توان جریان را به‌عنوان تابعی از ولتاژ در طول فرایند مطالعه کرد. در طول آزمایش، ولتاژ ثابت یا متغیر به سامانه اعمال و جریان ثبت می‌شود.
در روش هدایت‌سنجی ، تغییر مقدار یون‌های موجود در محیط به‌سبب واکنش‌های انجام‌شده سنجیده می‌شود؛ با تغییر میزان یون‌ها، هدایت الکتریکی در محلول واکنش تغییر می‌کند که قابل‌اندازه‌گیری است. محلول‌های حاوی یون‌ها جریان الکتریسیته را از خود عبور می‌دهند؛ میزان این هدایت جریان بسته به حضور یک مادۀ شیمیایی یا یک واکنش تغییر می‌کند. ارتباط هدایت جریان و غلظت به ماهیت واکنش بستگی دارد و اندازه‌گیری آن امکان‌پذیر است (5).
امروزه، الکترودهای بر پایۀ کربن در سطح وسیع برای بررسی‌های الکتروشیمیایی استفاده می‌شوند. دامنۀ وسیع پتانسیل آنها با جریان زمینه‌ای کمتر، ارزان‌قیمت‌بودن و بی‌اثر‌بودن شیمیایی ازجمله مزایای این الکترودها برای کاربردهای تشخیصی‌اند؛ هرچند در این الکترودها، سرعت انتقال الکترون در سطح کربن از سرعت مشاهده‌شده در الکترودهای فلزی کمتر است. کربن شیشه‌ای به‌علت داشتن ویژگی‌های مکانیکی و الکترونیکی مناسب، گسترۀ وسیع پتانسیلی، بی‌اثربودن ازنظر شیمیایی و قابلیت استفادۀ مکرر معروف است. ساختار کربن شیشه‌ای شامل نوارهای ظریف و در‌هم‌پیچیده‌ای متشکل از صفحه‌های گرافیت با اتصال عرضی است. گسترش و توسعۀ میکروالکترونیک باعث ایجاد میکروالکترودهایی با طول عمر بیشتر شده است که نسبت سیگنال به نویز را بهبود و هزینۀ راه‌اندازی سیستم را کاهش داده‌اند. میکروالکترودها نسبت به الکترودهای بزرگ‌تر مزایایی دارند که سازگاری زیستی، آسانی کار برای مشاهده زیر میکروسکوپ، استفادۀ بلندمدت و زیادبودن سرعت انتقال مادۀ موردسنجش به الکترود ازجمله مزایای این گونه میکروالکترودها به شمار می‌روند و دقت کار در طراحی زیست‌حسگرها را افزایش می‌دهند. این الکترودها شامل دو میکروالکترود هستند که کنار یکدیگر جفت می‌شوند و محل قرارگیری نمونه مساحتی حدود 1 میلی‌مترمربع دارد که امکان قرارگیری حجم‌های بسیار کمی از نمونه را روی آرایش نواری الکترودها فراهم می‌کند. سطح الکترودهای مرکب از پراکندگی منظم یا تصادفی منطقۀ رسانایی مانند طلا، ایریدیوم و پلاتین روی بدنۀ عایق (مانند شیشه) تشکیل می‌شود (6).
در پژوهش حاضر، به‌منظور دستیابی به روشی مقرون به‌صرفه و سریع برای سنجش فنل از دو روش الکتروشیمیایی (ولتامتری موج مربعی و هدایت‌سنجی) استفاده شد. باکتری سودوموناس .GSN23 که از خاک آلوده به پساب پالایشگاه نفت تهران جداسازی شده بود، عامل شناساگر در پژوهش حاضر انتخاب شد. استفاده از روش‌های الکتروشیمیایی دقیق در صرف زمان و استفاده از زیست‌حسگرهای میکروبی در مقایسه با انواع آنزیمی در هزینه‌ها صرفه‌جویی می‌کند. در مطالعۀ حاضر، باکتری مدنظر روی الکترودهای کار- الکترودهای کربن شیشه‌ای و میکروالکترودهای به‌هم‌جفت‌شدۀ طلا- تثبیت و پاسخ در حضور پیش‌مادۀ فنل ثبت شد.

مواد و روش‌ها.
.سازگارکردن باکتری مصرف‌کنندۀ فنل با غلظت‌های زیاد پیش‌ماده: باکتری سودوموناس.GSN23 به‌شکل ویال لیوفیلیزه (خشک‌شده در خلأ و منجمد) از آزمایشگاه ملی میکروبیولوژی صنعتی تحویل گرفته و روی محیط آگار مغذی کشت داده شد. تک‌کلنی‌های ایجادشده به محیط پایۀ معدنی با غلظت 1 میلی‌مولار فنل منتقل شدند؛ این محیط دارای فنل (تنها منبع کربن) و سایر ترکیبات آن شامل 325 سولفات‌آمونیوم ، 45/9 میلی‌گرم‌در‌لیتر سولفات‌منگنز ، 07/133 میلی‌گرم‌در‌لیتر سولفات‌منیزیم با هفت مولکول آب همراه ، 33/3 میلی‌گرم‌در‌لیتر کلریدآهن با سه مولکول آب همراه ، 91/11 میلی‌گرم‌در‌لیتر کلریدکلسیم با دو مولکول آب همراه، 2627 میلی‌گرم‌در‌‌لیتر فسفات‌هیدروژن‌پتاسیم و 1436 میلی‌گرم‌در‌لیتر فسفات‌دی‌هیدروژن‌پتاسیم بود و 2 درصد وزنی آگار-آگار شسته‌شده و دارای درصد خلوص زیاد برای جامدکردن محیط استفاده شد. در مرحلۀ بعد، باکتری به فلاسک‌های 250 میلی‌لیتری حاوی 50 میلی‌لیتر محیط‌کشت (100 میلی‌گرم‌درلیتر فنل) به مقداری که کدورت اولیۀ 1/0 را ایجاد کند، تلقیح شد. شرایط بررسی 30 درجۀ سانتی‌گراد و دور شیکر 130 دوردردقیقه در نظر گرفته شد. پس‌از ثابت‌شدن جذب نوری در طول موج 600 نانومتر، تمام حجم فلاسک به‌مدت 10 دقیقه در دمای اتاق و دور 8000 دوردردقیقه و در شرایط استریل سانتریفیوژ و سپس رسوب سلولی به محیط جدید تلقیح شد. محیط جدید دارای غلظت فنل بیشتری (200 میلی‌گرم‌در‌لیتر) بود و میزان کدورت ابتدایی در این بررسی نیز 1/0 تنظیم شد. همانند مرحلۀ پیش، پس‌از ثابت‌شدن جذب نوری در طول موج 600 نانومتر، انتقال به محیط‌کشت دارای 300 میلی‌گرم‌در‌لیتر فنل انجام شد. مراحل یادشده تا غلظت 1000 میلی‌گرم‌در‌لیتر فنل تکرار شدند. سویه‌های سازگارشده روی محیط‌کشت معدنی دارای 1000 میلی‌گرم‌در‌لیتر فنل در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شدند (7).
به‌منظور دستیابی به اطلاعاتی در زمینۀ میزان کمّی رشد و تجزیۀ فنل سویۀ سازگارشده با گذشت زمان، میزان رشد و سنجش فنل باقیمانده در محیط سنتزی هر 8 ساعت ثبت و منحنی‌های مربوطه رسم شدند (7). در فواصل زمانی 8 ساعت از محیط‌های کشت که فلاسک‌های 250 میلی‌لیتری حاوی 50 میلی‌لیتر محیط‌کشت (1000 میلی‌گرم‌در‌لیتر فنل) بودند، نمونه گرفته شد. 1 میلی‌لیتر از نمونۀ گرفته‌شده به‌مدت 20 دقیقه در 8000 دوردردقیقه و دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد سانتریفیوژ شد؛ مایع رویی برای سنجش فنل استفاده و رسوب سلولی در آب مقطر حل شد و جذب نوری آن در برابر شاهد آب مقطر در طول موج 600 نانومتر خوانده شد. در تمام مراحل، دما 30 درجۀ سانتی‌گراد و دور شیکر 130 دوردردقیقه تنظیم شد. در تمام مراحلی که سنجش فنل در آنها انجام شد، محیط‌های شاهدی نیز وجود داشتند که سلول‌های باکتری را نداشتند، اما در آنها نیز سنجش فنل باقیمانده انجام شد تا اگر مقداری از فنل از طریق سایر واکنش‌ها و بدون دخالت باکتری حذف شده است، مشخص شود (8).
.بررسی میزان رشد به روش اسپکتروفوتومتری: با‌توجه‌به اینکه فنل تنها منبع کربن و انرژی در محیط پایۀ معدنی است، می‌توان رشد ریزموجودات را شاخصی از تجزیۀ فنل و استفادۀ ریزموجودات از آن به‌عنوان منبع کربن و انرژی در نظر گرفت؛ با این پیش‌فرض، تغییرات میزان جذب نوری محیط‌کشت پایه در طول موج 600 نانومتر (A600) در فواصل زمانی معین اندازه‌گیری و از آن برای رسم نمودار رشد بر حسب زمان استفاده شد (8).
.بررسی میزان تجزیۀ فنل با روش اسپکتروفوتومتری: به‌منظور به‌دست‌‌آوردن مقدار فنل حذف‌‌شده توسط باکتری از روش رنگ‌سنجی مستقیم با معرف 4-آمینو‌آنتی‌پیرین بر اساس روش استاندارد D 5530 استفاده شد (9). محلول‌های لازم عبارتند از:
1- NH4OH (0.5 N): 35 میلی‌لیتر از NH4OH غلیظ تا 1 لیتر رقیق شد.
2- محلول بافر فسفات: 5/104 گرم از K2HPO4 و 3/72 گرم از KH2PO4 تا 1 لیتر رقیق و اسیدیتۀ آن روی 8/6 تنظیم شد.
3- معرف 4 آمینوآنتی‌پیرین: 5/0 گرم از این ماده در آب حل و تا 25 میلی‌لیتر رقیق شد؛ این معرف ناپایدار است.
4- معرف پتاسیم‌فری‌سیانید: 8 گرم از K3Fe(CN6) در آب حل و تا 100 میلی‌لیتر رقیق شد.
محلول 100 میلی‌گرم‌در‌لیتر فنل به‌عنوان محلول ذخیره ساخته و محلول‌های 1 تا 5 میلی‌گرم‌در‌لیتر فنل به کمک بالن ژوژۀ 100 میلی‌لیتری تهیه شدند.
محلول‌های تهیه‌شده در ارلن‌های 250 میلی‌لیتری ریخته و مراحل زیر به‌ترتیب انجام شدند:
5/2 میلی‌لیتر از محلول NH4OH اضافه و اسیدیتۀ آن بی‌درنگ با محلول بافری در حدود 9/7 تنظیم شد؛ سپس 2 میلی‌لیتر از محلول معرف 4 آمینو‌آنتی‌پیرین و 2 میلی لیتر محلول پتاسیم‌فری‌سیانید به آن اضافه شد. رنگ محلول در این مرحله زرد تا قرمز است. محلول به‌خوبی ‌هم زده شد و 15 دقیقه فرصت داده شد تا واکنش کامل شود.
نمونۀ شاهد شامل 100 میلی‌لیتر آب مقطر بود که مراحل یادشده برای آن نیز تکرار شدند. جذب نمونه‌ها بر حسب شاهد در طول موج 500 نانومتر اندازه‌گیری شد.
پس‌از خواندن جذب نوری، منحنی استاندارد رسم شد و از آن برای به‌دست‌آوردن غلظت مجهول فنل در مراحل مختلف آزمایش استفاده شد. مقدار غلظت مجهول فنل در محیط‌های کشت با استفاده از منحنی کالیبراسیون فنل محاسبه شد؛ این منحنی کالیبراسیون برای غلظت‌های صفر تا 5 میلی‌گرم‌در‌لیتر فنل تهیه شده است و با استناد به معادلۀ Y=0.108x-0.0027 و توجه ‌به ضریب همبستگی زیاد آن (0.994)، غلظت‌های مجهول فنل در محیط‌های کشت محاسبه می‌شوند. نمونه‌هایی که جذب نوری آنها خارج از این محدوده باشد، غلظت آنها پس‌از رقیق‌کردن محاسبه می‌شود. دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد و دور شیکر 130 دوردردقیقه، شرایط گرماگذاری در تمام مراحل بود.
.آماده‌سازی باکتری برای استفاده روی الکترودکربن شیشه‌ای: باکتری مصرف‌کنندۀ فنل در محیط پایۀ معدنی حاوی 1000 میلی‌گرم‌درلیتر فنل کشت داده شد، به‌مدت 30 ساعت در دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد و دور شیکر 130 دوردردقیقه گرماگذاری شد و با سانتریفوژ‌کردن محیط‌کشت در فاز نمایی رشد به دست آمد و در بافر فسفات 5 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 7) به حالت سوسپانسیون درآمد. کدورت استفاده‌شده برای بارگذاری روی الکترود با استاندارد 4 مک فارلند با کدورت 4/0 در طول موج 600 نانومتر در بافر فسفات 5 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 7) تنظیم شد.
.الکترود کربن شیشه‌ای اصلاح‌شده با پلی‌آنیلین- کیتوسان: شکل نانوفیبری پلی‌آنیلین به‌واسطۀ واکنش پلیمریزاسیون شیمیایی آنیلین از طریق اضافه‌کردن آمونیوم‌پروکسی‌دی‌سولفات به‌عنوان اکسید‌کننده تهیه شد. درون بشر، 2/3 میلی‌لیتر آنیلین در 8/6 میلی‌لیتر کلریدریک‌اسید 1 مولار حل و سپس 2 میلی‌گرم آمونیوم‌پراکسی‌دی‌سولفات به محلول اضافه شد و به‌مدت 45 دقیقه در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد روی همزن مغناطیسی با یکدیگر ترکیب شدند. رسوب سبزرنگ حاصل در 8000 دوردردقیقه سانتریفوژ، با استون و آب دیونیزه شسته و به‌مدت 24 ساعت در دمای اتاق خشک شد. در مرحلۀ بعد، محلول 5/0 درصد وزنی کیتوسان در استیک‌اسید 1 درصد تهیه شد (پلیمرهای کیتوسان روی رشد سلول‌ها اثر سمی ندارند و به ایجاد ساختار ژل‌مانند تمایل دارند) و پلی‌آنیلین سنتزشده به میزان 5/0 میلی‌گرم‌در‌میلی‌لیتر در محلول کیتوسان پراکنده شد (10). 50 میکرولیتر از محلول حاصل روی سطح الکترود کربن شیشه‌ای قرار گرفت و پس‌از خشک‌شدن کامل در دمای اتاق، سوسپانسیون باکتریایی در غلظت‌های مختلف (استاندارد مک فارلند 5/0، 3، 4 و 5) روی سطح الکترود پراکنده شد. الکترودها در دمای اتاق خشک و برای انجام بررسی ولتامتری موج مربعی استفاده شدند.
.میکروالکترودهای به‌هم‌جفت‌شده : میکروالکترودهای به‌هم‌جفت‌شدۀ مورداستفاده ابعاد 30×5 میلی‌متر دارند و با قرارگرفتن لایه‌ای از بخار طلا روی سطح شیشه ساخته شده‌اند؛ لایه‌ای 20 نانومتری از تیتانیوم نیز برای بهبود اتصال لایۀ طلا به شیشه به‌شکل حدواسط روی شیشه قرار گرفته است. بخش حساس الکترودها 9/2 میلی‌مترمربع مساحت دارد و ارتفاع و فاصلۀ بین آرایه‌های قرار‌گرفته در بخش حساس الکترودها 20 میکرومتر است. الکترودهای استفاده‌شده درآزمایشگاه بیوفیزیک و سطوح دانشگاه لیون-1 ساخته شده‌اند و به‌شکل تجاری در دسترس قرار دارند. الکترودها در حمام آبی اولتراسونیک به‌مدت 10 دقیقه در استون قرار گرفتند و سپس در حضور گاز نیتروژن خشک شدند. الکترودها به‌مدت 2 دقیقه زیر هود شیمیایی در محلول پیرانا ) قرار گرفتند و سپس با اتانول شسته شدند؛ الکترودها در آغاز و بین هر مرحله به‌طور کامل با آب دیونیزه آب‌کشی شدند (11).
100 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتریایی در غلظت‌های مختلف (استاندارد مک فارلند 5/0، 3، 4 و 5) و در بافر فسفات 5 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 2/7) تهیه و به این سوسپانسون‌ها، 5 میلی‌گرم پروتئین آلبومین سرم گاوی اضافه شد. محلول دیگری شامل 5 میلی‌گرم پروتئین آلبومین سرم گاوی در بافر فسفات 5 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 2/7) نیز تهیه و شاهد در نظر گرفته شد.
8 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتریایی روی میکروالکترود کار و 8/0 میکرولیتر از محلول شاهد روی میکروالکترود شاهد قرار گرفت و پس‌از خشک‌شدن در دمای اتاق، میکرو‌الکترودها به‌مدت 5 دقیقه در دسیکاتور حاوی بخار گلوتارآلدئید (3 درصد گلوتارآلدئید در بافر فسفات 5 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 2/7)) زیر هود شیمیایی قرار گرفتند؛ سپس به‌مدت 30 دقیقه در دمای اتاق کاملاً خشک و برای انجام بررسی‌های هدایت‌سنجی استفاده شدند. شرایط نگهداری الکترودها برای زمان طولانی‌تر در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد است.
روی هر دو میکروالکترود کار و شاهد سری دیگری از الکترودها، 8/0 میکرولیتر محلول پروتئینی آلبومین سرم گاوی در بافر فسفات 5 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 2/7) (بدون حضور باکتری) قرار گرفت و این الکترودها نیز پس‌از خشک‌شدن به‌مدت 5 دقیقه در دسیکاتور حاوی بخار گلوتارآلدئید (3 درصد گلوتارآلدئید در بافر فسفات 5 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 2/7)) زیر هود شیمیایی قرار گرفتند. این سری از الکترودها و الکترودهای بدون پروتئین و باکتری به‌عنوان شاهد منفی در مطالعه‌های هدایت‌سنجی بررسی شدند.
آماده‌سازی میکروالکترودها برای مشاهده با میکروسکوپ الکترونی نگاره: دو میکروالکترود از میکروالکترودهای آماده‌‌شده به‌منظور بررسی هدایت‌سنجی برای مشاهده با میکروسکوپ الکترونی نگاره آماده شدند. میکروالکترودهای مدنظر به‌مدت 45 دقیقه در گلوتارآلدئید 3 درصد (گلوتارآلدئید خالص‌شدۀ مخصوص تثبیت‌کردن نمونه‌های میکروسکوپ الکترونی) غوطه‌ور شدند؛ سپس مرحلۀ آب‌گیری انجام شد؛ به‌طوری‌که، میکروالکترودها در اتانول- آب با درصد به‌ترتیب 20، 40، 60، 80 و 100 و هرکدام به‌مدت 10 دقیقه غوطه‌ور شدند. در مرحلۀ پایانی، میکروالکترودها در دمای اتاق کاملاً خشک و برای بررسی میکروسکوپی استفاده شدند (11).
بررسی ولتامتری موج مربعی: تجزیه‌وتحلیل‌های ولتامتری موج مربعی به کمک دستگاه پتانسیواستات ) Ultra Lab Micro System.Co) مجهز به نرم‌افزار Ultrateklab انجام شد. سِل به‌کار‌رفته از نوع سِل‌های الکتروشیمیایی سه الکترودی شامل الکترود مرجع ازجنس کلرید‌نقره Ag/AgCl، الکترود کمکی از جنس گرافیت و الکترود کار کربن شیشه‌ای اصلاح‌شده با پلی‌آنیلین- کیتوسان و دارای باکتری بود. در این روش، اندازه گیری‌ها با تزریق مقادیر متفاوتی از محلول ذخیرۀ پیش‌مادۀ فنل به سِل الکتروشیمیایی 5 میلی‌لیتری حاوی بافر فسفات 5 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 7) انجام شد.
هر الکترود کار در محلول الکترولیت (بافر فسفات 5 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 7)) قرار گرفت و پس‌از تزریق فنل، مقدار پتانسیل در بازۀ 500- تا 1000 میلی‌ولت و فرکانس 88 هرتز اسکن شد.

بررسی هدایت‌سنجی: در روش هدایت‌سنجی، اندازه‌گیری‌ها با تزریق مقادیر متفاوتی از محلول ذخیرۀ فنل به سِل الکتروشیمیایی 5 میلی‌لیتری حاوی بافر فسفات 5 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 7) انجام شد. ولتاژ متناوبی با دامنۀ 10 میلی‌ولت و فرکانس 100 کیلوهرتز توسط مولد SR830 Lock-in, Stanford research system)) به میکروالکترودهای مرکب و سِل الکتروشیمیایی اعمال شد. پس‌از ثابت‌شدن سیگنال خروجی، مقادیر مختلفی از هر پیش‌ماده به سِل الکتروشیمیایی تزریق و نمودارهای تیپیک پاسخ هدایت‌سنجی توسط دستگاه ثبت شد. نمودارهای تیپیک پاسخ باتوجه‌به نمودارکالیبراسیون به دست آمدند. با توجه‌به این نمودارها، میزان حساسیت در برابر پاسخ‌گویی، زمان پاسخ و حداقل میزان شناسایی هر پیش‌ماده توسط باکتری‌های مدنظر محاسبه شد.
بررسی میزان انتخاب‌پذیری زیست‌حسگر هدایت‌سنجی باکتریایی به پیش‌ماده‌‌های مشابه فنل با ساختار آروماتیک: به‌منظور بررسی میزان انتخاب‌پذیری زیست‌حسگر طراحی‌شده بر اساس روش هدایت‌سنجی، پیش‌ماده‌های دیگری از‌جمله 2-4-6 تری‌‌کلروفنل، 2-3-6 تری‌کلرو‌فنل، 4 کلروفنل، بیس‌فنل‌آ و ‌پارانیتروفنل نیز به‌شکل مجزا به سِل الکتروشیمیایی تزریق شدند. محلول ذخیره از پیش‌ماده‌های یادشده تهیه شد و با تزریق مقادیر معین، غلظت‌هایی در محدودۀ غلظت‌های بررسی‌شده برای فنل (1 تا 300 میلی‌گرم‌در‌لیتر) به دست آمد.

نتایج.
شکل 1 میزان رشد و تجزیۀ فنل باکتری سودوموناس GSN23 را نشان می‌دهد. همان‌‌طور که در شکل دیده می‌شود، سرعت رشد این باکتری که مراحل سازگارشدن با فنل را پشت‌سر گذاشته است، در حضور پیش‌مادۀ فنل (تنها منبع کربن و انرژی) زیاد است؛ به‌طوری‌که در ساعت 32، این باکتری 73 درصد از غلظت اولیۀ فنل را مصرف کرده و در ساعت 48، میزان فنل باقیمانده در محیط به حداقل ممکن و نزدیک به صفر رسیده است.

شکل 1- میزان رشد و تجزیه فنل باکتری سودوموناس.GSN23

ولتامتری موج مربعی: در این روش، اندازه‌گیری‌ها با تزریق مقادیر متفاوتی از محلول ذخیرۀ پیش‌مادۀ فنل به سِل الکتروشیمیایی 5 میلی‌لیتری (سِل سه الکترودی با الکترود مرجع کلریدنقره Ag/AgCl، الکترود کمکی گرافیتی و الکترود کار کربن شیشه‌ای اصلاح‌شده با پلی‌آنیلین- کیتوسان و دارای باکتری سودوموناس GSN23) حاوی بافر فسفات 5 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 7) انجام شد.
شکل 2 ولتاموگرام موج مربعی مربوط به غلظت‌های 10 و 50 میلی‌گرم‌در‌لیتر فنل را نشان می‌دهد، قلۀ مشاهده‌شده در هر دو غلظت، ولتاژ حدود 550 میلی‌ولت است. باتوجه‌به پژوهش‌های انجام‌شده در حوزۀ سنسورهای شیمیایی، قلۀ مشاهده‌شده در 550 میلی‌ولت با این مراجع تطابق دارد و با فعالیت باکتری روی سطح الکترود مرتبط نیست (10 و 12)؛ از سویی، با بررسی دقیق سطح الکترودها پس‌از آزمون‌های مکرر مشخص شد غشای قرار‌گرفته روی سطح الکترود ثبات ندارد و به مرور در محلول الکترولیت شسته خواهد شد. با‌توجه‌به مشاهده‌های یادشده و بررسی الکترودهای کربن شیشه‌ای به‌تنهایی در حضور فنل، ولتاموگرام مشاهده‌شده در شکل 2 حاصل فعالیت باکتری در حضور پیش‌مادۀ مدنظر (فنل) نیست، بلکه حاصل واکنش الکترود کرین شیشه‌ای با فنل است.

شکل 2- ولتاموگرام به‌دست‌آمده از الکترود کربن شیشه‌ای اصلاح‌شده با پلی‌آنیلین- کیتوسان در حضور فنل

هدایت‌سنجی: در روش هدایت‌سنجی، اندازه‌گیری‌ها با سِل الکتروشیمیایی 5 میلی‌لیتری حاوی بافر فسفات 5 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 7) و با تزریق مقادیر مختلفی از پیش‌مادۀ فنل انجام شدند. ولتاژ متناوبی با دامنۀ 10 میلی‌ولت و فرکانس 100 کیلوهرتز توسط مولد (SR830 Lock-in, Stanford research system) به میکروالکترودهای مرکب و سِل الکتروشیمیایی اعمال شد.
مقادیر متفاوتی از باکتری سودوموناس GSN23 با‌توجه‌به استاندارد مک فارلند در فاز نمایی به همراه پروتئین آلبومین سرم گاوی روی سطح میکروالکترود (شکل 3) در حضور بخار گلوتارآلدئید تثبیت شد؛ تعداد باکتری‌های موجود روی سطح الکترود، عامل بسیار مهمی در پاسخ سِل الکتروشیمیایی است. پس‌از تکرارهای متعدد از الکترودهای مختلف، میزان مناسب تعداد باکتری‌ها برای داشتن پاسخ هدایت‌سنجی مناسب، استاندارد 4 مک فارلند با جذب نوری 6/0 در طول موج 600 نانومتر برآورد شد. تصویر میکروسکوپ الکترونی نگاره از سطح الکترود کار در شکل 4، تراکم مناسب باکتری‌ها روی سطح الکترود را نشان می‌دهد.

شکل3- آرایش محل قرارگیری نمونه روی الکترودهای مرکب

شکل 4- تراکم مناسب باکتری سودوموناس GSN23 روی سطح الکترود
ابتدا الکترودهای بدون باکتری تثبیت‌شده با اعمال ولتاژ متناوبی با دامنۀ 10 میلی ولت و فرکانس 100 کیلوهرتز در سِل الکتروشیمایی به‌عنوان شاهد منفی بررسی و مقادیر متفاوتی از فنل به سِل الکتروشیمیایی تزریق شدند. در مرحلۀ بعد، الکترودهایی بررسی شدند که باکتری نداشتند، اما در حضور بخار گلوتارآلدئید قرار گرفته بودند. در هر دو مورد، از غلظت نخست فنل تا غلظت‌های نهایی این پیش‌ماده، پاسخ درخور گزارشی مشاهده نشد؛ درنتیجه، الکترودها به‌تنهایی پاسخی با پیش‌ماده ایجاد نمی‌کنند. در مرحلۀ بعد، الکترودهای دارای باکتری تثبیت‌شده آزمایش شدند. نمودار تیپیک پاسخ هدایت‌سنجی برای باکتری سودوموناس GSN23 درشکل 5 دیده می‌شود. مطابق شکل، تزریق مقادیر مختلفی از فنل به‌شکلی انجام شده است که غلظت‌های نهایی 1، 10، 20، 40، 60، 80، 100، 150، 250 و 300 میلی‌گرم‌در‌لیتر را در سِل ایجاد کند و پس‌از هر تزریق به سِل الکتروشیمیایی زمان داده شده است تا نمودار به حالت ثابت درآید و سپس تزریق بعدی برای به‌دست‌آوردن غلظت بیشتر انجام شده است. در مقادیر کمتر و بیشتر از مقادیر یادشده، پاسخ درخور گزارشی در سِل ایجاد نشد و محدودۀ 1 تا 300 میلی‌گرم‌در‌لیتر، محدودۀ خطی پاسخ به حضور فنل در سِل گزارش شد.
بررسی‌ها به کمک 12 میکروالکترود مشابه که درصد انحراف معیار نسبی حساسیت زیست‌حسگر برای آنها 41/8 درصد محاسبه شده بود، انجام و سه تکرار برای هر غلظت در نظر گرفته شد. حد تشخیص با استفاده از رابطۀ مربوطه محاسبه و زمان پاسخ به پیش‌مادۀ فنل تخمین زده شد. به‌منظور به‌دست‌آوردن حد تشخیص، سه برابر میزان نویز بر حساسیت (شیب خط نمودار کالیبراسیون به‌دست‌آمده) تقسیم و عدد به‌دست‌آمده 2/0 میلی‌گرم‌بر‌لیتر و زمان پاسخ 120 ثانیه تخمین زده شد.


شکل 5- نمودار کالیبراسیون زیست‌حسگر فنل بر پایۀ سلول باکتریایی سودوموناس GSN-23 (شکل بالا) و نمودار تیپیک هدایت‌سنجی (شکل پایین)

.بررسی میزان انتخاب‌پذیری زیست‌حسگر باکتریایی به پیش‌ماده‌های مشابه فنل با ساختار آروماتیک: به‌منظور بررسی میزان انتخاب‌پذیری زیست‌حسگر طراحی‌شده، پیش‌ماده‌های دیگری ازجمله 2-4-6 تری‌کلروفنل، 2-3-6 تری‌کلرو‌فنل، 4 کلروفنل، بیس‌فنل‌آ و ‌پارانیتروفنل نیز به‌طور مجزا به سِل الکتروشیمیایی تزریق شدند. محلول ذخیره از پیش‌ماده‌های یادشده تهیه شد و با تزریق مقادیر معین، غلظت‌هایی در محدودۀ غلظت‌های بررسی‌شده برای فنل به دست آمد. بررسی‌ها در سه تکرار برای هر پیش‌ماده انجام شدند. نمودار کالیبراسیون برای پیش‌ماده‌های کلرینۀ فنل خطی بود، اما میزان حساسیت در برابر فنل بسیار کمتر مشاهده شد. نمودار کالیبراسیون برای پیش ماده‌های پارانیتروفنل و بیس‌فنل‌آ تا غلظت 100 میلی‌گرم‌در‌لیتر خطی بود و در غلظت‌های بیشتر از100 میلی گرم‌درلیتر، وجود پیش‌ماده گزارش نشد. درصد حساسیت نسبی این زیست‌حسگرها (در مقایسه با فنل)، 25 درصد برای پیش‌مادۀ پارانیتروفنل و 16 درصد برای پیش‌مادۀ بیس‌فنل‌آ برآورد شد.
درصد حساسیت نسبی در زمینۀ پیش‌ماده‌های دیگری مانند 2-4-6- تری‌کلروفنل، 2-3-6- تری‌کلرو‌فنل و 4 کلروفنل به‌ترتیب 20، 22و 26 درصد محاسبه شد. در جدول 1، شاخص‌های مختلف زیست‌حسگر مدنظر بر اساس سلول باکتریایی سودوموناس GSN-23 برای سایر پیش‌ماده‌های بررسی‌شده ارائه شده است.

جدول 1- مقایسۀ شاخص‌های مختلف در زیست‌حسگر فنل در حضور پیش‌ماده‌های آروماتیک
پیش‌مادۀ بررسی‌شده محدودۀ خطی نمودار
(mg L-1) محدودۀ تشخیص زیست‌حسگر (mg L-1 ( میزان حساسیت
(µS ppm-1) ضریب همبستگی نمودار کالیبراسیون (در محدودۀ خطی نمودار)
فنل 300-1 300-1 5423/0 9781/0
2-4-6 تری‌کلروفنل 300-1 300-1 0475/0 9815/0
2-3-6 تری‌کلروفنل 300-1 300-1 0437/0 9678/0
4 کلروفنل 300-1 300-1 0551/0 9877/0
بیس‌فنل‌آ 100-1 80-1 1019/0 9615/0
پارانیتروفنل 100-1 80-1 15/0 9599/0

بحث و نتیجه‌گیری.
ترکیبات آروماتیک موجود در پساب کارخانه‌های پتروشیمی بیشتر شامل ترکیبات فنلی و مشتقات بنزن است. ازآنجاکه فنل در بافت‌های بدن انسان و دیگر موجودات زنده تجمع می‌یابد، حتی مقادیر بسیار ناچیز آن در خروجی پساب صنایع مختلف مشکلی جهانی تعبیر می‌شود و فزون‌سازی زیستی در زنجیره‌های غذایی سبب تشدید نگرانی‌های مجامع بین‌المللی در این زمینه شده است (13).
در زیست‌حسگرهای تشخیص فنل بر اساس سلول‌های باکتریایی، تمرکز پژوهشگران روی کاربرد باکتری‌های گرم منفی و به‌ویژه جنس سودوموناس بوده است. Skla´dal و همکاران در سال 2002، باکتری‌هایی از جنس سودوموناس را برای بررسی آمپرومتری وتشخیص فنل استفاده کردند و نتیجه گرفتند از بین تعداد متعددی از این باکتری‌ها، تنها سه گونه می‌توانند در بررسی آمپرومتری روی اسکرین پرینت الکترود کربنی و با استفاده از میانجی فروسن، پاسخ مثبت داشته باشند؛ در مطالعه‌های این گروه، میزان اختصاصیت زیست‌حسگر طراحی‌شده نسبت به سایر ترکیبات آروماتیک در غلظت مشخص (5/0 میلی‌مولار) نیز بررسی شد، ترکیباتی مانند کتکول، وانیلین، پنتافلوئوروفنل و ترکیبات کلرینۀ فنل بررسی شدند و درصد پاسخ نسبی در مقایسه با فنل گزارش شد. در تمام موارد (به‌جز وانیلین) و در هر سه باکتری (سودوموناس. 394 ، سودوموناس. 83-IV ، سودوموناس. 74-III. ) پاسخ زیست‌حسگر به فنل بیشتر از سایر پیش‌ماده‌ها بود (14). در سال 2006، Kirgőz و همکاران از باکتری سودوموناس پوتیدا. DSM 50026 در روش آمپرومتری و با به‌کاربردن الکترود کار کامپوزیت گرافیت اپوکسی استفاده کردند (15). Timur و همکاران نیز باکتری سودوموناس پوتیدا. DSM 50026. را در مطالعه‌های آمپرومتری خود مدنظر گرفتند و الکترود کلارک، اسکرین پرینت الکترودهای گرافیتی و الکترود خمیر کربن را به‌عنوان الکترود کار استفاده کردند (16-19).
در زیست‌حسگرهای طراحی‌شده برای تشخیص فنل و با استفاده از باکتری‌ها، روش‌های جذب سطحی (15-17)، به‌دام‌اندازی در میکروکپسول‌ها با استفاده از استات‌سلولز و ژلاتین (18‌ و 19) و اتصال عرضی با استفاده از گلوتارآلدئید برای ثابت‌کردن جزء زیستی روی مبدل کاربرد داشته‌اند (19). در جذب سطحی، پیوندهای فیزیکی ایجادشده بین سطح مدنظر و جزء زیستی ضعیفند و بر اساس پیوندهای واندروالس، میان‌کنش‌های یونی یا پیوندهای هیدروژنی‌اند. در پژوهش حاضر، روش جذب سطحی روی الکترودهای بر پایۀ کربن استفاده شد. در روش جذب سطحی، فعالیت جزء زیستی به میزان زیادی حفظ می‌شود، اما اتصال ضعیف است و بسیار تابع دما، اسیدیتۀ محیط و حضور یون‌های مختلف در محیط است. زیست‌حسگرهای طراحی‌شده با این روش تثبیت را نمی‌توان بلند‌مدت نگهداری کرد که ضعف بزرگی برای این روش به شمار می‌آید؛ زیرا پس‌از چندین بار استفاده از زیست‌حسگر، آنزیم یا جزء زیستی به‌علت اتصال ضعیف از روی سطح مدنظر شسته می‌شود (16).
ایجاد اتصال عرضی توسط یک مادۀ دو عاملی مانند گلوتارآلدئید، گلی‌اکسال یا هگزامتیلن‌دی‌آمین باعث ایجاد شبکه‌ای ثابت و غیرمحلول می‌شود؛ در این روش، جزء زیستی به‌طور مستحکم در شبکۀ ایجاد‌شده قرار می‌گیرد و امکان نشت آن در محلول بسیار ضعیف است. اکثراً پروتئینی خنثی مانند سرم آلبومین گاوی برای تشکیل شبکه با جزء زیستی به کار می‌رود (20).
.در پژوهش حاضر نیز باکتری سودوموناس.GSN23- جداسازی‌شده از خاک آلوده به پساب پالایشگاه نفت تهران (21)- برای تشخیص فنل استفاده شد. این باکتری قابلیت استفاده از فنل به‌عنوان تنها منبع کربن و انرژی را از خود نشان داد و قادر به تجزیۀ فنل در غلظت‌های زیاد بود. در روش نخست، ابتدا ولتامتری موج مربعی با الکترود کار بر پایۀ کربن (کربن شیشه‌ای) و بستر تثبیت پلی‌آنیلین- کیتوسان انتخاب شد. در این روش، الکترودهای کربن شیشه‌ای با پیش‌مادۀ فنل واکنش دادند و از سوی دیگر، با‌توجه‌به پیوندهای ضعیف جذب سطحی باکتری و غشای قرارگرفته روی الکترود، ثبات و ماندگاری طولانی‌مدت نداشت. در مرحلۀ بعد، بررسی‌های هدایت‌سنجی مدنظر پژوهش حاضر قرار گرفتند. این سیستم‌ها مزیت‌هایی ازجمله هزینۀ استفاده و انرژی لازم کم، تشخیص طیف گسترده‌ای از مواد در محیط‌های گوناگون، استفاده از الکترودهای مینیاتوری و نیازنداشتن به الکترودهای مرجع دارند (22). با تغییر میزان یون‌ها، هدایت الکتریکی در محلول واکنش تغییر می‌کند که قابل‌اندازه‌گیری است؛ از سوی دیگر، کار با الکترودهای به‌هم‌جفت‌شده که از آنها با عنوان الکترودهای مجتمع یا مرکب نیز یاد می‌شود، بهترین طراحی در سنجش‌های هدایت‌سنجی است (6، 11 و 23). در پژوهش حاضر، از گلوتارآلدئید به‌عنوان مادۀ دو عاملی برای ایجاد شبکه‌ای ثابت و غیرمحلول استفاده شد (17). نتایج و تصویر میکروسکوپ الکترونی، ایجاد شبکه‌ای پایدار را روی سطح میکروالکترودها نشان می‌دهند که در مقایسه با روش جذب سطحی ثبات بیشتری دارد. زیست‌حسگر طراحی‌شده بر پایۀ باکتری گرم منفی سودوموناس. GSN23، پاسخ‌های تکرارپذیری در گسترۀ تشخیص 1 تا 300 میلی‌گرم‌در‌لیتر (10 تا 3187 میکرومولار) نشان داد. پاسخ باکتری سودوموناس.GSN23 نسبت به سایر پیش‌ماده‌های آروماتیک (2-4-6 تری‌کلروفنل، 2-3-6 تری‌کلرو فنل،4 کلروفنل، بیس‌فنل‌آ و پارانیتروفنل) به‌ مراتب کمتر از فنل (5 برابر) گزارش شد که با مطالعه های Skla´dal و همکاران روی سایر گونه های سودوموناس همخوانی دارد (14).
کاربرد سلول‌های میکروبی یکی از گزینه‌های جایگزین آنزیم‌ها در زیست‌حسگرها به شمار می‌آید و از آنجاکه صرفۀ اقتصادی بسیار زیادی در مقایسه با آنزیم‌‌ها دارد، مدنظر پژوهشگران قرار گرفته است. با سازگارکردن ریزموجودات با پیش‌مادۀ موردسنجش، میزان حساسیت این گونه زیست‌حسگرها به میزان زیادی افزایش می‌یابد.
طراحی زیست‌حسگرهای بر پایۀ سلول‌های پروکاریوتی علاوه‌بر کاربرد در مقیاس آزمایشگاهی، گزینه‌ای نوید‌بخش در طراحی زیست‌حسگرهایی پیچیده‌تر و با همراهی سیستم‌های میکروفلوئیدیک به شمار می‌رود.

سپاسگزاری.
نویسندگان مقالۀ حاضر از همکاری اعضای محترم گروه خانم پروفسور نیکول جافرزیک- رنو (مؤسسۀ علوم آنالیز- دانشگاه کلودبرنارد لیون 1- فرانسه) در بخش الکتروشیمی و بخش علوم و سطوح برای تهیۀ تصویر میکروسکوپ الکترونی نگاره سپاسگزاری می‌کنند.