مقایسۀ آثار ضدباکتریایی عصارۀ گلسنگ‌های Glypholecia scabra و Rhizoplaca melanophthalma بر برخی باکتری‌های استاندارد

مقدمه.

گلسنگ‌ها سیستم‌های هم‌زیست اجباری متشکل از قارچ‌های رشته‌ای و یک شریک فتوسنتزکننده (جلبک یا سیانوباکتر) می‌باشند که قرن‌ها به‌عنوان عناصر تشکیل‌دهنده در تهیۀ داروها به کار رفته‌اند و در بسیاری از جوامع به‌عنوان داروهای سنتی برای درمان بسیاری از بیماری‌ها استفاده شده‌اند (2 و 1). خواص دارویی برخی از گلسنگ‌ها در سیستم‌های طب سنتی ذکر شده است و از آن‌ها برای درمان طیف وسیعی از بیماری‌های شایع از جمله خون، بیماری‌های قلبی، برونشیت، گال، جذام، التهاب آسم، اختلالات معده وغیره استفاده شده است(3). پیشرفت‌های اخیر در زمینۀ پزشکی منجر به کشف فعالیت بیولوژیک تعداد محدودی از ترکیبات گلسنگی شده است. در برخی از مطالعات نشان داده شده است که برخی از مواد شیمیایی گلسنگی می‌توانند به‌عنوان منابع دارویی امیدوارکننده‌ای در آینده باشند. خواص آنتی‌بیوتیکی، ضدویروسی، ضدتکثیری، آنتی‌اکسیدانی و ضدسرطانی برای ترکیبات گلسنگی نشان داده است (7-4).

در حال حاضر مقاومت ضدمیکروبی در میان باکتری‌ها و دیگر موجودات بیماری‌زا تهدید جدی برای مدیریت بیماری‌های عفونی است. در جستجوی داروهای فعال زیستی جدید با منشأ طبیعی، گلسنگ‌ها موضوع بسیاری از گروه‌های تحقیقاتی هستند. در بسیاری از گونه‌های گلسنگی، فعالیت‌های ضدباکتریایی علیه باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی نشان داده شده است. اولین آزمایشات دربارۀ خواص آنتی‌بیوتیکی گلسنگ‌ها را بورخلدر [1] و همکارانش در سال1944 انجام داده بودند که آن‌ها عصارۀ آبی 42 گونه گلسنگ را علیهاشرشیا کلی[2]، باسیلوس سوبتلیس[3] و استافیلوکوکوس اورئوس[4] آزمایش کردند. نتایج حاصل از این مطالعات اولیه نشان داد که 27 گلسنگ علیه باسیلوس سوبتلیس و استافیلوکوکوس اورئوس فعال بودند اما هیچ‌یک از گونه‌ها فعالیتی علیه اشرشیا کلی نشان ندادند(5). تورک[5] و همکارانش در سال 2003 با مطالعات خود، فعالیت ضدباکتریایی عصارۀ استونی، دی اتیل اتر و اتانولی گلسنگ ستراریا آکولئاتا[6] را در مقابل 12 گونه باکتری بررسی کردند و به این نتیجه رسیدند که عصارۀ این گلسنگ دارای خواص قابلِ‌توجهی در برابر باکتری‌های سودوموناس آئروژینوزا[7]، پروتئوس ولگاریس[8]، استافیلوکوکوس اورئوس، لیستریا مونوسایتوژنز[9]، باسیلوس سرئوس[10]، باسیلوس سوبتلیس، استرپتوکوکوس فیکالیس[11] و اشرشیا کلی است و عصاره‌هایی که دارای فعالیت ضدمیکروبی هستند، حاوی اسید پروتولیکسترینیک[12] هستند(8). دیوی[13]و همکارانش در سال 2010 با بررسی فعالیت ضدمیکروبی عصاره‏های مختلف گلسنگ روشلا بلانگرین[14] در مقابل باکتری‌های مختلف بیشترین تأثیر بازدارنده را مربوط به عصارۀ متانولی و در مقابل ویبریو کلرا[15] گزارش کردند (9). لوکارین[16] و همکارانش در سال 2014 فعالیت ضدباکتری گلسنگ اوسنا استینری[17] را در مقابل مایکوباکتریوم کانساسی[18] گزارش کردند (10). ولدبیگی و همکارش در سال 2013 فعالیت ضدباکتریایی عصارۀ متانولی و استونی گلسنگ‌های فولجنسیا فولجنس[19]و پلاسیدیوم سیمافوروننز[20] را در مقابل چند گونه باکتری بررسی کردند و نشان دادند که عصارۀ متانولی فولجنسیا فولجنس دارایبیشترین اثر باکتریسیدالدر غلظت 250 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر بر استافیلوکوکوس اورئوس و عصارۀ پلاسیدیوم سیمافوروننز در غلظت 500 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر بر استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس[21]هستند(11).

‏‏مواد و روش‏ها.

استون (مرک [22]آلمان)، محلول نیم مک فارلند، محلول نمکی 9/0درصد، دیسک‌های آنتی‌بیوتیک شامل موارد زیر است: آزیترومایسین، جنتامایسین و کربنیسیلین و دیسکخام (شرکت پادتن طب)، دی متیل سولفوکساید (مرک آلمان با جرم مولکولی 13/78 گرم بر مول)، پلیت، سواپ، پنس، ویال، محیط‌های مولر هینتون و نوترینت آگار.

جمع‌آورى گلسنگ‌ها: گلسنگ‌ها در سال 1392 از نواحی نقده واقع در آذربایجان غربی با طول و عرض جغرافیایی( 36.9176 ،45.3726) جمع‌آوری شدند. در این مطالعه از دو گونه گلسنگ گلیفولکیا اسکابرا[23]و ریزوپلاکا ملانوفتالما[24]برای بررسی فعالیت ضدمیکروبی استفاده شد.

میکروارگانیسم‌های مطالعه‌شده: در این پژوهش از نه باکتری شاخص از جمله استافیلوکوکوس اورئوسPTCC1431، میکروکوکوس لوتئوس[25]PTCC1110، باسیلوس سرئوس PTCC1247، باسیلوس سوبتلیس PTCC1023، اشرشیا کلی PTCC1330، کلبسیلا پنومونیه[26]PTCC1290، سراشیا مارسنس[27]PTTC1111، پروتئوس ولگاریس PTCC1312 وسودوموناس آئروجینوزا PTCC1074، جهت ارزیابی آثار ضدباکتریایی گلسنگ‌های مطالعه‌شده استفاده شد.

عصاره‌گیری از گلسنگ‌ها: ابتدا نمونه‌های موردنظر از مواد زائد از جمله خزه، خاک و دیگر مواد جداسازی شدند. سپس گلسنگ‌ها به‌منظور عصاره‌گیری در مجاورت هوا به‌مدت دو هفته خشک شدند. نمونه‌های خشک‌شده، آسیاب شدند تا به‌صورت پودر تقریباً یکنواختی درآیند. برای عصاره‌گیری گلسنگ‌ها از دستگاه سوکسله به‌مدت 10 ساعت استفاده شد. به‌منظور تغلیظ‌کردن عصارۀ استخراج‌شده و خارج‌کردن حلال از عصاره ازدستگاه روتاری اوپراتور (تحت فشار پایین) استفاده شد. سپس عصارۀ تغلیظ‌شده تا انجام مراحل بعدی آزمایش در دمای منفی 18 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت.

ارزیابی اثر ضدباکتریایی: جهت ارزیابی اثر ضدباکتریایی از روش دیسک‌گذاری(کربی بائر) استفاده شد( 12). براساس این روش ابتدا باکتری‌های بررسی‌شده در مرحلۀ رشدنمایی به مقدار نیم مک فارلند کدورت رقیق‌سازی شد. سپس باکتری‌ها بر روی محیط کشت مولر هینتون آگار به‌شکل چمنی کشت داده شدند. به‌وسیلۀ دی متیل سولفوکساید رقت‌های 50، 25 و 5 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر عصاره استونی گلسنگ‌ها تهیه شد. دیسک‌های پیپر بلانک 6میلی‌متری به‌عنوان حامل رقت‌های مختلف استفاده شد. روی هرکدام از دیسک‌های خام حدود 25 میکرولیتر از سه رقت مختلف عصاره‌های گلسنگی ریخته شد و بر روی محیط کشت قرار گرفت. بر روی یکی از دیسک‌های خام حلال مربوطه دی متیل سولفاکساید ریخته و به‌عنوان کنترل منفی روی محیط کشت قرار داده شد. آنتی‌بیوتیک‌های استاندارد کربنیسیلین[28] (برای باکتری‌های گرم مثبت)، آزیترومایسین[29] و جنتامایسین[30] (برای باکتری‌های گرم منفی) به‌عنوان کنترل مثبت استفاده شدند. سپس پلیت‌ها به‌مدت 18 تا 24 ساعت در داخل انکوباتور 35 درجه سانتی‏گراد قرار داده شدند. بعد از گذشت مدت‌زمان موردنظر، قطر هاله عدم رشد اطراف دیسک‌ها بررسی شد (کلیۀ آزمایش‌ها حداقل سه بار تکرار شدند).

تعیین MIC و MBC: دربارۀ گلسنگ‌هایی که دارای اثر ضدباکتریایی بودند حداقل غلظت مهارکننده[31] (MIC) و حداقل غلظت کشنده[32]((MBC تعیین شد. تعیین MICبا استفاده از پلیت 96خانه‌ای استریل و روش براث میکرودیلوشن انجام شد(13). به این صورت که از 15 چاهک پلیت برای هر آزمون استفاده شد. یکی از چاهک‌ها که فقط حاوی محیط کشت و باکتری بود به‌عنوان کنترل مثبت و چاهک دیگر که فقط حاوی محیط کشت بود به‌عنوان کنترل منفی انتخاب شد. در 13 چاهک بعدی غلظت‌های 5/12 ، 25/6 ،12/3 ، 56/1، 78/0 ، 39/0 ، 195/0 ، 097/0 ، 048/0 ، 024/0 ، 012/0، 006/0 و 003/0 میلی‌گرم در میلی‌لیتر از عصاره‌های گلسنگی تهیه شد. سپس از سوسپانسیون باکتریایی تهیه‌شده مقدار 5/1 میکرولیتر برداشته شد و داخل تمام چاهک‌ها به‌جز کنترل منفی ریخته شد و به‌مدت 24 ساعت در دمای 35 درجه سانتی‏گراد نگهداری شد و سپس رشد یا عدم رشد باکتری‌ها براساس IC90 بررسی شد. برای بررسی دقیق‌تر و تعیین حداقل غلظت کشنده، از محلول یکنواخت چاهک‌ها برداشته و در محیط کشت مولر هینتون آگار انتقال داده شد و در دمای 35 درجه سانتی‏گراد به‌مدت 24 ساعت نگهداری شد. کمترین غلظتی که هیچ رشدی از باکتری در آن مشاهده نشد به‌عنوان حداقل غلظت کشنده در نظر گرفته شد.

تجزیه و تحلیل آماری: هر آزمون سه بار تکرار شد و داده‌های به‌دست‌آمده به‌صورت میانگین± انحراف معیار[33] بیان شدند. جهت تجزیه و تحلیل داده‌ها از روش آنالیز واریانس یک طرف[34] ، (ANOVA نرم‌افزار SPSS نسخه 21) و آزمون توکی[35] استفاده شد. در تمام بررسی‌ها میزان معنی‌داری آزمون‌ها 05/0 P< در نظر گرفته شده است.

نتایج.

در این پژوهش عصارۀ استونی هر دو گلسنگ اثر ضدباکتریایی نشان دادند. طبق جدول 1 عصارۀ استونی گلیفولسیا اس کابرا به‌طور معنی‌داریاثر بازدارندگی و مهاری بر باکتری‌های باسیلوس سرئوس، باسیلوس سوبتلیس، میکروکوکوس لوتئوس و پروتئوس ولگاریس)شکل 1 - الف) دارد. درحالی‌که بر باکتری‌های استافیلو کوکوس اورئوس، اشرشیا کلای، سراشیا مارسسنس، سودوموناس آئروجینوزا و کلبسیلا پنومونیه بی تاثیر است. همچنین طبق جدول 2 عصارۀ گلسنگ ریزوپلاکا ملانوفتالما به‌طور معنی‌داری اثر بازدارندگی و مهاری بر باکتری‌های گرم مثبت باسیلوس سرئوس(شکل ا- ب)، باسیلوس سوبتلیس، استافیلو- کوکوس اورئوس و میکروکوکوس لوتئوس داشت. درحالی‌که بر باکتری‌های گرم منفی اشرشیا کلای، سراشیا مارسسنس، سودوموناس آئروجینوزا ، کلبسیلا پنومونیه و پروتئوس ولگاریس اثر نداشت.

جدول 1- ارزیابی آثار ضدباکتریایی عصاره گلسنگگلیفولسیا اس کابرا  .

جدول 2- ارزیابی آثار ضدباکتریایی عصارۀ گلسنگ ریزوپلاکا ملانوفتالما

شکل1- اثر ضدباکتریایی Glypholecia scabra بر پروتئوس ولگاریس (الف)و اثر ضدباکتریایی melanophthalma Rhizoplaca بر باسیلوس سرئوس (ب)