تجزیۀ زیستی آنتراسن توسط Bacillus sp. موجود در پساب آلوده به هیدروکربن‌های آروماتیک چندحلقه‌ای

مقدمه.

هیدروکربن‌های آروماتیک چندحلقه ای[1] (PAHs) گروه بزرگی از ترکیبات آلی با دو یا چند حلقه آروماتیک (حلقه بنزن) هستند که در آرایش خط، زاویه‌ای یا خوشه‌ای قرار گرفته‌اند (1). هیدروکربن‌های پلی آروماتیک از مهم‌ترین آلاینده‌های آب، هوا و رسوبات شناخته شده‌اند. این ترکیبات از راه‌های مختلفی وارد محیط زیست می‌شوند و از طریق فعالیت‌های طبیعی و انسانی در محیط انباشته می‌شوند و عمدتاً از احتراق ناقص مواد آلی، سوخت‌های فسیلی، نشت محصولات نفتی و فعالیت‌های مختلف صنعتی و بخشی از آن در اثر فعالیت‌های طبیعی مانند آتش‌سوزی جنگل‌ها و فوران‌های آتش‌فشانی تولید می‌شوند. براساس سمیّت آن‌ها، سازمان حفاظت از محیط زیست ایالت متحده[2]، 16 PAH را به‌عنوان آلاینده در اولویت پالایش مطرح کرده است (2-4). پایداری PAHها در محیط زیست، به عوامل مختلفی نظیر ساختار شیمیایی، غلظت، پراکندگی و دسترسی زیستی آلاینده بستگی دارد. علاوه بر این، عوامل محیطی مانند نوع و ساختار خاک، اسیدیته[3]، دما، سطوح کافی اکسیژن، مواد مغذی و آب جهت فعالیت میکروب‌های تجزیه‌کنندۀ آلاینده، زمان پایداری PAH در طبیعت را کنترل می‌کند. به‌طورکلی، هرچه وزن ملکولی ملکول PAH بیشتر باشد، آبگریزی و سمیّت و پایداری زیست‌محیطی آن ملکول بیشتر می‌شود (5 و 6). از جمله PAH، آنتراسن است که یک هیدروکربن آروماتیک سه‌حلقه‌ای مشتق از قطران ذغال‌سنگ با فرمول شیمیایی  H₁₀C₁₄است (7). آنتراسن از جمله سوبستراهای مدل یا شناساگر در مطالعات تجزیۀ محیطی PAHها است. هیدروکربن‌های پلی‌آروماتیک موجود در طبیعت به‌علت سمیّت، جهش‌زایی و سرطان‌زابودن، موجب نگرانی بزرگ محیط زیست شده‌اند. یکی از راهکارهای ارزان، مؤثر و ایمن جهت مقابله با این ترکیبات، زیست‌پالایی[4]یا همان استفاده از باکتری‌ها، قارچ‌ها و گیاهان به‌منظور تجزیه، شکستن، تغییر شکل و یا اساساً حذف آلاینده‌ها از محیط است. در این فرآیند، ارگانیسم آلایندۀ شیمیایی را به‌عنوان منبع انرژی و کربن استفاده و آن را به محصولات با سمیّت کمتر تبدیل می‌کند (8). هدف از این پژوهشْ جداسازی، شناسایی و بررسی میزان تجزیۀ آنتراسن توسط باکتری بومی جداشده از پساب آلوده به آلاینده‌های نفتی از محل تجمع تانکرهای نفتی در شهرستان رشت است.

مواد و روش‌ها.

نمونۀ پساب و آنالیز آن: نمونۀ موردِآزمایش، پساب آلوده به هیدروکربن‌های نفتی بود که از یک حوضچه واقع در جایگاه تجمع تانکرهای نفتی جمع‌آوری شد (واقع در رشت با مختصات رشت – سنگر (N37.2668 E49.61171)). علت انتخاب این ناحیه، آلوده‌بودن طولانی‌مدت پساب با مواد نفتی است که دستیابی و جداسازی باکتری‌های بومی مقاوم و تجزیه‌کنندۀ این هیدروکربن‌ها را امکان‌پذیر می‌کند. نمونۀ پساب از عمق 30-20 سانتی‌متری جمع‌آوری شد. جهت نمونه‌برداری، از ظروف پلاستیکی و سرنگ استریل استفاده شد که بلافاصله به آزمایشگاه منتقل شد و مقداری از آن نیز جهت اندازه‌گیری مقدار کل هیدروکربن‌های نفتی[5] توسط دستگاه کروماتوگرافی گازی[6] (Agilent 7890A, USA)، شناسایی هیدروکربن‌های آروماتیک پساب توسط دستگاه کروماتوگرافی گازی- طیف سنجی جرمی[7] (Agilent 5975C, USA) و همچنین اندازه‌گیری مقدار اکسیژن زیستی مورد نیاز[8] به آزمایشگاه ارسال شد. BOD خیلی بالا نشان‌دهندۀ بار آلی زیاد و همچنین حضور میکروارگانیسم‌های هوازی زیاد در پساب است.

جداسازی باکتری تجزیه‌کنندۀ آنتراسن: جهت جداسازی باکتری تجزیه‌کنندۀ آنتراسن، از محیط کشت پایه معدنی که در آن آنتراسن به‌عنوان تنها منبع کربن و انرژی بود استفاده شد. بدین منظور به یک ارلن 250 میلی‌لیتری، مقدار 100 میلی‌لیتر محیط کشت پایه معدنی (بر حسب گرم بر لیتر) شامل 84/2 گرم NH₄)₂SO₄)، 38/2 گرم KH₂PO₄، 65/5 گرم K₂HPO₄.3H₂O، 1گرم MgSO₄.7H₂O و 1 میلی‌لیتر عناصر کمیاب (در لیتر) شامل 64/0 گرم CuSO₄.5H₂O، 11/0گرم FeSO₄.5H₂O، 79/0گرم MnCl₂.4H₂O، 15/0 گرم ZnSO₄.7H₂O و همچنین 01/0 گرم آنتراسن و 1 میلی‌لیتر نمونه پساب (اسیدیته محیط کشت برابر 2/7) اضافه شد (9). ارلن حاوی نمونه همراه با شاهد (محیط کشت تنها) در انکوباتور شیکردار با 130 دور در دقیقه و دمای 25 درجه سانتی‌گراد به‌مدت دو هفته قرار داده شد. با مشاهده کدورت در محیط کشت مایع و به‌منظور حصول اطمینان از وجود باکتری، مقدار 1 میلی‌لیتر از محتویات محیط کشت موجود در ارلن به محیط پایه معدنی جامد تلقیح شد.

به‌منظور دستیابی به باکتری‌های خالص تجزیه‌کنندۀ آنتراسن، ارلن حاوی نمونۀ اصلی، 5 بار به‌صورت متوالی با فاصله زمانی یک هفته به محیط پایه معدنی مایع انتقال داده شد و پس از هر بار انتقال، رشد باکتری‌ها از طریق کشت در محیط کشت پایه معدنی جامد بررسی شد.

شناسایی باکتری تجزیه‌کنندۀ آنتراسن: بعد از رشد و تهیۀ کلنی خالص، جهت شناسایی جدایۀ موردِنظر از رنگ‌آمیزی گرم و کپسول، آزمون‌های افتراقی بیوشیمیایی و همچنین آنالیز مولکولی استفاده شد. در آنالیز مولکولی، از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز[9] ژن 16S rDNA و سپس توالی‌یابی آن برای شناسایی استفاده شد. در این آنالیز، استخراج DNA با استفاده از روش جوشاندن انجام گرفت. در این روش، سوسپانسیونی از نمونه باکتری تهیه شد و به‌مدت 12 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد جوشانده شد. سپس PCR (با استفاده از پرایمرهای عمومی[10]27F و 1492R (جدول 1) انجام شد (جدول 2 و 3)(10). بعد از مشاهدۀ باند bp 1500، این باند از ژل استخراج شد تا توالی‌یابی شود (روش سنگر)(شرکت Seqlab، آلمان). توالی به‌دست‌آمده با توالی ژن‌های 16S rDNAموجود در پایگاه اطلاعاتی داده‌های ncbi تطبیق[11] تا مشخص شود به کدام باکتری تعلق دارد.

جدول 1- توالی پرایمرهای عمومی27F و 1492R.

جدول 2- مواد مصرفی در واکنش PCR

جدول 3- چرخه حرارتی PCR ژن 16S rDNA.

بررسی میزان رشد جدایه در محیط حاوی آنتراسن: جهت بررسی میزان رشد باکتریایی در محیط کشت پایه معدنی مایع، از دستگاه اسپکتوفتومتر با طول موج 600 نانومتر استفاده شد. در این قسمت از آزمایش از 5 شاهد استفاده شد که عبارت‌اند از: محیط کشت تنها (شاهد 1)، محیط کشت + 1 میلی‌لیتر پساب غیراستریل (شاهد 2)، محیط کشت + 1 میلی‌لیتر پساب استریل (با استفاده از فیلتر 45/0 میکرون)(شاهد 3)، محیط کشت + آنتراسن (1/0 گرم آنتراسن را در 1 میلی‌لیتر دی کلرومتان حل شد)(شاهد 4) و محیط کشت + پساب استریل + آنتراسن (شاهد 5). جذب نوری محتویات 5 ارلن شامل نمونه اصلی و 4 شاهد (به‌جز شاهد 1)، به فاصله زمانی 4 روز به‌طور متوالی اندازه‌گیری شد. تغییرات اسیدیته نیز در طی تجزیه آنتراسن توسط باکتری، با استفاده از اسیدیته متر بررسی شد.

بررسی میزان تجزیۀ آنتراسن و شناسایی متابولیت‌های حاصل از تجزیه آن: به‌منظور تعیین غلظت قابل‌تحمل آنتراسن و حداکثر غلظتی که توسط باکتری تجزیه می‌شود، سری رقتی از آنتراسن (100، 150، 200، 250 و 300 میلی‌گرم بر لیتر) در محیط پایه معدنی تهیه شد. بعد از گذشت 20 روز و مشاهدۀ کدورت که نشان‌دهندۀ رشد باکتری در غلظت‌های مربوطه است، آنتراسن باقی‌مانده در محیط کشت با استفاده از روش مایع- مایع استخراج شد. برای استخراج، از دکانتور 250میلی‌لیتری استفاده شد. پنجاه میلی‌لیتر محیط کشت به دکانتور منتقل و 25 میلی‌لیتر دی کلرومتان به‌عنوان حلال به‌مرور و طی چند مرحله به آن اضافه شد. سپس محلول به‌خوبی تکان داده شد تا حلال به‌خوبی با محیط همگن شود و بعد از چند دقیقه، دو فاز آبی و آلی به‌راحتی از یکدیگر جدا شدند. سپس ناحیۀ شفاف که حاوی فاز آلی و سوبسترا است، به داخل یک بشر تخلیه و نمونه استخراج می‌شود. جهت آنالیز از روش  PY-ANT.M و از دستگاه GC (Agilent 7890A, USA) استفاده شد (10). به‌منظور شناسایی متابولیت‌های حاصل از تجزیۀ آنتراسن توسط باکتری، فاز آلی موجود در محیط کشت که شامل آنتراسن و متابولیت‌های آن است توسط روش مایع – مایع استخراج و جهت آنالیز از روش PAH-M و دستگاه GC-MS
(Agilent 5975C, USA) استفاده شد (10).

نتایج.

آنالیز پساب: مقدار TPH (شکل 1) و همچنین BOD نمونه پساب بالا و به‌ترتیب 73/16 و 3743 میلی‌گرم بر لیتر بود. نتایج حاصل از اندازه‌گیری هیدروکربن‌های آروماتیک موجود در پساب نیز در شکل 2 و جدول 4 آورده شده است.

شکل 1- کروماتوگرام TPH پساب

شکل 2- کروماتوگرام GC-MS پساب

جدول 4- هیدروکربن‌های آروماتیک موجود در پساب

جدول 5- نتایج آزمون افتراقی بیوشیمیایی

جداسازی و شناسایی باکتری تجزیه‌کنندۀ آنتراسن: نتیجۀ آزمون گرم نشان داد که این جدایه، باسیل گرم مثبت فاقد کپسول با کلنی‌های نسبتاً بزرگ نامنظم و غیرمسطح است. نتایج آزمون افتراقی بیوشیمیایی نیز در جدول 5 آورده شده است. توالی‌یابی محصول PCR نشان داد که سویۀ ذکرشده با 1406 نوکلئوتید به‌میزان 100درصد با توالی 16s rDNAبسیاری از سویه‌های Bacillus cereus، Bacillus  anthracisو Bacillus thuringiensis مشابهت دارد. توالی 16s rDNAاین باکتری در بانک ژنی[12]مربوط به NCBI با شماره دستیابی[13]KX216517 و به‌نام Bacillus sp. Caspian1394 ثبت شد.

میزان رشد جدایه در محیط حاوی آنتراسن: همان‌طور که انتظار می‌رفت با گذشت زمان، میزان رشد باکتری با افزایش جذب نوری تأیید شد و جذب نوری نمونه‌های شاهد اندکی دچار تغییرات شد که احتمالاً می‌تواند ناشی از خطای انسانی و دستگاهی باشد. کمترین میزان جذب نمونه اصلی مربوط به روز چهارم و مقدارش 20/0 و بیشترین آن مربوط به روز بیست و هشتم و مقدارش 85/0 بود. به عبارتی با گذشت زمان میزان رشد و تجزیۀ آنتراسن بیشتر می‌شود (شکل 3).

ازلحاظ تغییرات اسیدیته نیز، در روز اول اسیدیته برابر 2/7 و در روز بیستم به 5/6 رسید. درنتیجه به نظر می‌رسد کاهش اسیدیته به‌دلیل تولید ترکیبات اسیدی ناشی از تجزیۀ آنتراسن باشد.

بررسی میزان تجزیۀ آنتراسن و شناسایی متابولیت‌های حاصل از تجزیۀ آن: در ابتدا جهت تجزیۀ آنتراسن توسط جدایه موردنظر، از غلظت 100 میلی‌گرم بر لیتر آنتراسن استفاده شد و پس از تلقیح باکتری و با گذشت زمان 20 روز، با استفاده از دی کلرومتان میزان آنتراسن باقی‌مانده استخراج و توسط دستگاه GC اندازه گیری شد. نتیجۀ آنالیز نشان داد میزان آنتراسن از 100 میلی‌گرم بر لیتر به 5/0 میلی‌گرم بر لیتر کاهش یافته است، به‌عبارتی راندمان تجزیه 5/99درصد  است (شکل 4).

نتایج حاصل از آنالیز GC نشان داد بیشترین و کمترین میزان تجزیه آنتراسن توسط جدایه به‌ترتیب مربوط به غلظت‌های150 میلی گرم بر لیتر و 350 میلی‌گرم بر لیتر با راندمان‌های تجزیه 3/63درصد و 6/3درصد است؛ بنابراین با افزایش غلظت آنتراسن، میزان رشد باکتری و درنتیجه میزان تجزیۀ آنتراسن توسط آن کاهش می‌یابد (شکل 5).

در ارتباط با شناسایی متابولیت‌های حاصل از تجزیۀ آنتراسن که با استفاده از دستگاه GC-MS انجام گرفت، بیشترین متابولیت‌های حاصل از تجزیه، شامل 1 و 4 متانوآزولن، 2 و 5 سیکلوهگزادین، ایکوزان، هگزادکان، هپتادکان و اکتادکان بودند (شکل 6).

شکل 3- تغییرات جذب نوری محیط حاوی آنتراسن در نمونه‌های اصلی و شاهد در طول موج 600 نانومتر.

شکل 4- کروماتوگرام GC نشان‌دهندۀ آنتراسن.

شکل 5- میزان تجزیۀ آنتراسن در غلظت‌های مختلف. نمونه‌ها، ارلن‌های حاوی غلظت‌های مختلف آنتراسن را نشان می‌دهند.

شکل 6- کروماتوگرام GC-MS مربوط به متابولیت‌های حاصل از تجزیۀ آنتراسن.