مقدمه.

سیب‌زمینی یکی از محصولات مهم کشاورزی در ایران است که از نظر تولید سالیانه بعد از گندم، برنج، ذرت و جو در مقام پنجم قرار دارد. بیماری جرب [1] معمولی سیب‌زمینی یکی از بیماری‌های مهم گیاهی است که به‏وسیله باکتری Streptomyces scabies و سایر گونه‌های مشابه دیگر روی سیب‌زمینی و سایر سبزیجات غده‌ای (تربچه، شلغم و غیره) ایجاد می‌شود (1). ایجاد علائمی نظیر زخم‌های نکروتیک برجسته، سطحی یا فرورفته از علائم مشخص جرب معمولی بر روی غده‌های سیب‌زمینی است که ارزش بازارپسندی و کیفیت غده‌های سیب‌زمینی را کاهش می‌دهد و باعث خسارت اقتصادی به محصول می‌شود (2). گونه‌های مهم عامل جرب سیب‌زمینی، Streptomyces scabies، S. acidiscabies و S. turgidiscabies هستند (3). acidiscabie S. به‌عنوان عامل جرب معمولی سیب‌زمینی در خاک‌های اسیدی نام‌گذاری شده است. S. acidiscabies و  S. turgidiscabies دارای پراکنش کمتری در جهان هستند. سایر گونه‌های بیماری‌زای Streptomycesشامل S. setonii ، S. griseus ،S. tendae، aureofaciensS.وS. caviscabies است کهشدت بیماری‌زایی کمتری دارند (4 و 5).

گونۀ S. scabies به‌عنوان مهم‌ترین عامل ایجاد جرب معمولی سیب‌زمینی در جهان، دارای پراکنش وسیعی در جهان است و در اکثر نقاط جهان به‌عنوان مهم‌ترین عامل ایجاد جرب شناخته شده است (6). در ایران برخی از گونه‌های بیماری‌زای گیاهی Streptomyces نظیر S. scabies، S. acidiscabies، S. turgidiscabies، aureofaciensS.،
 S. reticuliscabies و ... از برخی مناطق ایران گزارش شده‌اند اما از میزان دقیق خسارت و پراکنش واقعی آن‌ها اطلاع دقیقی در دست نیست (7).

در بیماری‌زایی گونه‌های جنسStreptomycesبه‌خصوص گونه‌های بیماری‌زای گیاهی، توکسین‌ها نقش بسیار مهمی دارند.در بین توکسین‌های S. scabies غالب‌ترین توکسین تولیدشده، تاکستومین [2]A و بعد از آن تاکستومین B است که مقدار آن ۵درصد مقدار تاکستومین A گزارش شده است (8). ردیابی ژن سنتزکنندۀ تاکستومین A (txtA) اهمیت زیادی در شناخت مکانیسم بیماری‌زایی این باکتری ایفا می‌کند. ژن تاکستومینA تاکنون فقط در سه گونۀ S. scabies، S. acidiscabiesوS. turgidiscabies شناسایی شده و در سایر گونه‌های بیماری‌زای گیاهی یا این ژن وجود نداشته و یا اندازۀ این ژن در آن‌ها متفاوت با طول ژن در این دو گونه است (3) بنابراین با توجه به مشکلات و پیچیدگی‌های موجود در تفکیک اعضای جنس Streptomycesدر سطح گونه و نیز مشکلات تشخیص نژادهای بیماری‌زا از نژادهای غیربیماری‌زا، شناسایی وجود ژن تاکستومین راهی آسان برای اثبات گونه و قدرت بیماری‌زایی عامل اسکب سیب‌زمینی خواهد بود.

جرب معمولی سیب‌زمینی در سال‌های اخیر در بعضی مناطق کشت سیب‌زمینی در استان‌های آذربایجان شرقی و کردستان به وفور مشاهده شده است. ازآنجایی‌که در بعضی مزارع شدت بیماری بالا است و به‌صورت یکی از مسائل عمده در کشت سیب‌زمینی در آمده است و نیز به‌علت عدم وجود گزارش رسمی از عامل اصلی این بیماری در استان‌های آذربایجان شرقی و کردستان، شناسایی عامل اسکب معمولی سیب‌زمینی با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز و آزمون‌های بیوشیمیایی و مورفولوژیکی و همچنین شناسایی ژن سنتزکنندۀ تاکستومین در جدایه‌ها می‌تواند سودمند باشد. نتایج این پژوهش همچنین می‌تواند جهت اتخاذ استراتژی مناسب برای کاهش خسارت بیماری در استان‌های آذربایجان شرقی و کردستان کاربردهای فراوانی داشته باشد.

مواد و روش‌ها.

نمونه‌برداری و تهیه جدایه‌ها:       طی فصول زراعی سال 1389-1391 در زمان برداشت از مناطق مختلف سیب‌زمینی‌کاری استان‌های آذربایجان شرقی (شهرستان‌های سراب و بستان‌آباد) و کردستان (شهرستان‌های قروه و ده‌گلان) بازدید و غده‌های دارای علائم بیماری از نقاط مختلف مزارع جمع‌آوری و به آزمایشگاه منتقل شد. قسمت‌های آلوده از غده‌های دارای علائم اسکب به‌روش شاد[3] و همکاران (9) جداسازی شد. برای جداسازی از محیط کشت YME [4] (عصارۀ مخمر 4 گرم ؛ عصارۀ مالت 10 گرم ؛ دکستروز 4 گرم؛ آگار 20 گرم، در یک لیتر آب مقطر با pH=7.2) حاوی آنتی‌بیوتیک‌های50 میلی‌گرم نیستاتین، 5 میلی‌گرم پلی‌میکسین‌سولفات، 10میلی‌گرم سدیم پنی‌سیلینG و 50 میلی‌گرم سیکلوهیگزامیددر لیتر استفاده شد. تشتک‌ها به‌صورت وارونه در دمای 25 تا 30 درجه سانتی‌گراد نگهداری و پس از 5 تا 7 روز از پرگنه‌های رشدکرده که ظاهری شاخه و پودری داشتند، انتخاب شد و مجدداً تا خالص‌سازی کامل روی محیط YME به‌صورت مخطط کشت شدند. جهت نگهداری باکتری از کشت‌های 10 تا 14روزه هر جدایه سوسپانسیونی از اسپور در آب مقطر سترون تهیه و در شیشه‌های کوچک در‌دار داخل یخچال در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.

اثبات بیماری‌زایی: اثبات بیماری‌زایی استرین‌ها روی غدۀ سیب‌زمینی به‌روش لوریا و همکاران[5] (10) انجام شد. ابتدا غدۀ سیب‌زمینی رقم آگریا[6] با آب شستشو و در شرایط استریل پوست غده‌ها جدا شد و از قسمت وسط غده قطعاتی به اندازۀ دو سانتی‌متر مربعتهیه شد و در تشتک‌های پتری استریل حاوی کاغذ صافی و مقداری آب مقطر استریل قرار داده شدند. از هر جدایه که قبلاً روی محیط غذایی OMA[7] کشت و تولید اسپور شده بود (کشت‌های 14روزه) قطعه‌ای از محیط کشت برداشته شد و به‌طور وارونه روی قطعات سیب‌زمینی قرار گرفت. از محیط OMA تلقیح‌نشده به‌عنوان شاهد منفی استفاده شد. پتری‌ها در انکوباتور در دمای 25 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 3 تا 5 روز نگهداری شدند، این آزمایش برای هر جدایه سه بار تکرار شد. ایجاد نکروز و یا نکروز همراه با فرورفتگی به‌عنوان بیماری‌زایی جدایه‌ها در نظر گرفته شد. اثبات بیماری‌زایی روی گیاهچه تربچه به‌روش شاد و همکاران (9) انجام شد. بذر تربچه به‌طور سطحی با هیپوکلریت‌سدیم 5 تا۱۰درصد به‌مدت یک دقیقه ضدعفونی شد و به‌منظور جوانه‌زنی روی محیط آب آگار ۱درصد به‌مدت 24 ساعت در دمای 25 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. بذرهای جوانه‌زده با سوسپانسیونی از اسپور باکتری مایه‌زنی و در لوله‌های حاوی محیط کشت آب آگار (۱درصد) سترون قرار داده شدند. علائم بیماری روی گیاهچه تربچه یک تا دو هفته بعد بررسی شد.

.بررسی خصوصیات مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی جدایه‌ها: رنگ‌آمیزی گرم، آزمون رشد هوازی و بی‌هوازی (OF[8])، تست کاتالاز، هیدرولیز نشاسته، هیدرولیز ژلاتین و هیدرولیز کازئین به‌روششاد و همکاران (8) انجام شد. ویژگی‌های مورفولوژیکی جدایه‌ها شامل تعیین نوع و طول زنجیرۀ اسپور، شکل پرگنه و نیز رنگ پرگنه به‌روش شیرلینگ وگوتلیب[9] (11) بررسی شد. به‌منظور بررسی تولید ملانین، جدایه‌ها به‌ترتیب برروی محیط کشت PYIA[10] و YME کشت شد و نتایج 7 تا 10 روز بعد یادداشت شد. تولید رنگدانۀ ملانین قهوه‌ای‌رنگ به‌عنوان نتیجۀ مثبت تست ارزیابی شد (4). محیط کشت فوق، اختصاصی باکتری است که فقط بعضی از جدایه‌ها تولید ملانین[11] می‌کنند.

واکنش زنجیره‌ای پلی مراز (PCR): استخراج DNA ژنومی از جدایه‌ها به‌روش تعدیل‌یافتۀ لی و دبور[12] (12) انجام شد. برای استخراج DNA ژنومی، جدایه‌ها ابتدا در محیط [13]NA کشت شدند و به‌مدت چند روز در شیکر قرار داده شدند. سپس محیط کشت در لولۀ فالکن ریخته و در دور 3000 دور در دقیقه به‌مدت سه دقیقه سانتریفیوژ شد تا باکتری در ته لوله رسوب کند. چند لوپ از باکتری به داخل تیوب جدید منتقل و به آن 400 میکرولیتر آب مقطر سترون اضافه شد. به سوسپانسیون حاصل 400 میکرولیتر بافر استخراج X2 (50 میلی‌مولار Tris-HCl، 25 میلی‌مولار EDTA[14]، ۱درصد SDS [15]و 10 میکروگرم بر لیتر پروتئیناز [16]K) اضافه شد و نمونه‌ها به‌مدت سه ساعت در دمای 55 سانتی‌گراد قرار گرفتند. سپس400 میکرولیتر از آمونیوم استات 5/7 مولار به هر لوله اضافه و به‌مدت 2 تا 3 دقیقه تکان داده شد. بعد از این مرحله، لوله‌ها به‌مدت 10 دقیقه در 12500 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس750 میکرولیتر از رونشین به لولۀ جدید منتقل شد و 750 میکرولیتر ایزوپروپانول سرد به آن اضافه و به‌وسیلۀ دست تکان داده شد. نمونه‌ها به‌مدت یک شب در دمای 20- تا 30- درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند. پس از این مدت نمونه‌ها به‌مدت 30 دقیقه در 12500 دور در دقیقه در دمایچهار درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شدند و رسوب حاصل با 750 میکرولیتر اتانول 70 درصد سرد دو بار شسته شد و در دمای 56 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 30 دقیقه خشک شد. رسوب حاصل در 100 میکرولیتر آب مقطر سترون حل و در چهار درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. DNA خارج‌شده در واکنش PCR با آغازگرهای مختلف استفاده شد. کیفیت و کمیت DNA خارج‌شده با اسپکروفتومتر و الکتروفورز در ژل آگارز بررسی شد.

 از آغازگرهایStrepB و StrepF برای شناسایی جنس Streptomyces استفاده شد. این جفت آغازگر برای ناحیۀ 16srRNA طراحی شده است و قادر به شناسایی تقریباً همه گونه‌های جنس Streptomyces است (جدول 1)(9). چرخه‌های حرارتی شامل یک چرخه واسرشت‌سازی[17] اولیه به‌مدت پنج دقیقه در 95 درجه سانتی‌گراد، 40 چرخه واسرشت‌سازی در 94 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 20 ثانیه، اتصال [18]آغازگر در دمای 52 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 30 ثانیه و بسط [19]در 72 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 30 ثانیه و درنهایت یک چرخه بسط نهایی به‌مدت 5 دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد بود.

از آغازگرهایASE3 و scab2m نیز که اختصاصی برای شناسایی گونۀ S. scabiesو چند گونه نزدیک آن که بیماری‌زای گیاهی هستند استفاده شد (جدول1)(9). چرخه‌های حرارتی شامل یک چرخه واسرشت‌سازی اولیه به‌مدت ۵ دقیقه در 95 درجه سانتی‌گراد، 40 چرخه واسرشت‌سازی در 94 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 20ثانیه، اتصال آغازگر در دمای 52 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 30 ثانیه و بسط در 72 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 30 ثانیه و درنهایت یک چرخه بسط نهایی به‌مدت ۵ دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد بود.

از آغازگرهایtxtA F2 و txtA R2 برای شناسایی ژن سنتزکنندۀ تاکستومین A در گونه‌های بیماری‌زای گیاهی S. scabies استفاده شد (جدول 1) (13). چرخه‌های حرارتی شامل یک چرخه واسرشت‌سازی اولیه به‌مدت ۵ دقیقه در 95 درجه سانتی‌گراد، 30 چرخه واسرشت‌سازی در 95 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 20 ثانیه، اتصال آغازگر در دمای 52 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 30 ثانیه و بسط در 72 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 30 ثانیه و درنهایت یک چرخه بسط نهایی به‌مدت 5 دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد بود.

نتایج.

درمجموع بیش از 120 غده با علائم مشکوک به بیماری اسکب عمومی سیب‌زمینی شناسایی و جمع‌آوری شد. بیشتر غده‌های جمع‌آوری‌شده از ارقام مارفونا، اسپریت و اگریا بودند. علائم موجود در روی غده‌های جمع‌آوری‌شده متفاوت و عمدتاً شامل جرب برجسته، فرورفته و سطحی و یا زخم‌های سطحی یا عمیق بودند (شکل 1).

پس از جداسازی باکتری، مجموعاً 32 جدایه با خصوصیات مورفولوژیک جنسStreptomyces (با پیکره‌های هیفی‌شکل) بر روی محیط کشت YME جداسازی و خالص‌سازی شد. پرگنه جدایه‌ها به‌رنگ خاکستری روشن یا تیره بر روی محیط کشت عصارۀ مخمر مالت آگار مشاهده شد. آزمون گرم، تست کاتالاز، تست OF (هوازی و بی‌هوازی‌بودن) و تست تجزیۀ نشاسته برای این جدایه‌ها مثبت و تست تجزیه ژلاتین منفی بود (جدول 2).

جدول 1- آغازگرهای استفاده‌شده در واکنش‌های زنجیره‌ای پلی‌مراز و توالی آن‌ها و اندازۀ جفت محصول این آغازگرها

شکل1- علائم مختلف باکتری اسکب بر روی غده‌های سیب‌زمینی

جدول 2- نتایج آزمون‌های بیوشیمیایی و فنوتیپی

اسپور جدایه‌ها با میکروسکوپ نوری عموماً به‌صورت زنجیره‌ای صاف و بعضاً مارپیچ مشاهده شدند که دلالت بر تعلق آن‌ها به جنسStreptomyces داشت (شکل2)(9).

آزمون بیماری‌زایی روی جدایه‌های جمع‌آوری‌شده نشان داد 26 جدایه از 32 جدایه خالص‌شده، قادر به ایجاد علائم نکروز روی تکه‌های سیب‌زمینی و گیاهچه تربچه هستند و 6 جدایه باقیمانده دارای قدرت بیماری‌زای خفیف و یا فاقد توانایی ایجاد نکروز روی سیب‌زمینی و یا گیاهچه تربچه هستند. نتایج بررسی تولید رنگدانه ملانین برروی محیط کشت PYIA و YME نشان داد که فقط سه جدایه روی محیط کشت PYIA تولید ملانین کردند و باقی جدایه‌ها قادر به تولید ملانین نیستند (شکل 3).

 برای شناسایی جنس Streptomyces از جفت پرایمر Strep B و Strep Fاستفاده شد که باندهایی به‌اندازۀ 1027 باز برای هر 32 جدایه منتخب پس از الکتروفورز مشاهده شد (شکل 4).

شکل 2-.زنجیره اسپورهای Streptomyces scabies

شکل 3- تولید رنگدانه قهوه‌ای‌رنگ ملانین برروی محیط کشت PYIA

از 32 جدایۀ منتخب، 26جدایه با استفاده از آغازگر اختصاصیscab2m و ASE3 باندهای به وزن 475 باز را تکثیر کردند (شکل 5) ولی 6 جدایه علی‌رغم تولید قطعۀ 1027 بازی با جفت پرایمر اول، قادر به تولید باند 475 نوکلئوتیدی نبودند و باندی برای آن‌ها مشاهده نشد. برای شناسایی ژن سنتزکنندۀ تاکستومینA از جفت آغازگر txtA F2 وtxtA R2 استفاده شد که قطعۀ 522 نوکلئوتیدی در هر 26 جدایه با قدرت بیماری‌زایی روی سیب‌زمینی و تربچه تکثیر شد (شکل 6).

شکل 4-.الکتروفورز در ژل آگارز 2/1درصد، PCR با آغازگرهای Strep Fو Strep R. چاهک‌های 1 تا 6 ( از چپ به راست) جدایه‌های منتخب جمع‌آوری‌شده از آذربایجان شرقی، چاهک‌های 7-9 جدایه‌های منتخب جمع‌آوری‌شده از کردستان، چاهک 9 شاهد مثبت، M DNA Ladder

شکل 5-الکتروفورز در ژل آگارز 2/1درصد قطعات DNA تولیدشده در PCR با آغازگرهای اختصاصی scab2m و ASE3. چاهک شماره 1: جدایه جمع‌آوری شده از کردستان، چاهک‌های 2 تا 8 ( از چپ به راست) جدایه‌های منتخب از آذربایجان شرقی، 8:شاهد مثبت، M : DNA Ladder

شکل 6- الکتروفورز در ژل آگارز 2/1درصد قطعات DNA در PCR با آغازگرهای txtA F2 و txtAR2 ، چاهک‌های 1 تا 4 ( از چپ به راست ) جدایه‌های منتخب از کردستان، چاهک‌های 5-8 جدایه‌های منتخب از آذربایجان شرقی، چاهک شماره 9 شاهد مثبت