بهینه‌سازی استقرار ریشه موئین و افزایش تولید کاتارانتین توسط محرک متیل جاسمونات در Catharanthus roseus

مقدمه

Catharanthus roseus که معمولاً به عنوان گل پروانش شناخته می­شود، یک گیاه چند ساله همیشه سبز از خانواده Apocynaceae بومی ماداگاسکار است و در سراسر جهان در مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری کشت می­شود. این گیاه دارای برگ­های براق، بیضوی و خوشه­های گل­های جذاب و نامتقارن است که به­طور معمول صورتی یا سفید با رگه­های قرمز هستند. میوه­های باریک و شبیه کپسول آن برای پراکندگی بذر باز می­شوند و از تکثیر طبیعی مؤثر اطمینان می­دهند. فراتر از جذابیت زینتی خود، C. Roseus به­علّت آلکالوئیدهای ایندول بیواکتیو خود مانند وین­کریستین، وین­بلاستین و کاتارانتین که آن را به یک سنگ بنای پژوهش‌های دارویی و درمان سرطان تبدیل کرده است، مشهور هستند (Oakeley, 2023). کاتارانتین یک آلکالوئید ایندول مونو ترپنوئید پیچیده است که نقش مهمی در بیوسنتز عوامل ضد سرطان مانند وین بلاستین و وین­کریستین ایفا می­کند. اگر چه مسیر کامل آنزیمی که مسئول سنتز آن از پیش سازها مانند استریسوسیدین است، همچنان یک منطقه فعال از پژوهش‌ها است، اما کاتارانتین همچنان به­علّت کمک­های خود در شیمی محصول طبیعی و کاربرد آن به­عنوان یک ساختمان برای توسعه داروهای درمانی، علاقه علمی را به خود جلب می­کند. این ارتباط دارویی بر اهمیت پژوهش‌ها در حال انجام در مسیرهای متابولیک آن و کاربردهای احتمالی در درمان سرطان تأکید می­کند (Pan et al., 2015). گیاهان متابولیت­های ثانویه مانند آلکالوئیدها، فلاونوئیدها و ترپنوئیدها را توسط مسیرهای بیوسنتز پیچیده که نقش مهمی در دفاع، پاسخ استرس و تعامل اکولوژیکی دارند، سنتز می­کنند (Pandey et al., 2023). تکنیک­های کشت بافت آزمایشگاهی یک جایگزین قوی برای کشت گیاه برای تولید متابولیت­های ثانویه ارائه می­دهند. این روش­ها سبب می­شوند تا محیط­های بسیار کنترل شده­ای ایجاد شوند که در آن عواملی مانند ترکیب مواد مغذی، نور و کاربرد  الیسیتور بتوانند ظرفیت بیوسنتز سلول­های گیاهی را به حداکثر برسانند. با کاهش اثرات تغییر پذیری محیطی و دور زدن محدودیت­های فصلی، روش­های کشت بافت، تأمین مداوم، مقیاس پذیر و پایدار ترکیبات مانند آلکالوئیدها، فلاونوئیدها و ترپنوئیدها را تضمین می­کنند. علاوه بر این، توانایی اجرای سریع استراتژی­های بیوتکنولوژیکی مانند انتخاب و مهندسی متابولیک نه تنها سبب افزایش بازده متابولیت می­شود، بلکه منجر به کاهش فشار زیست محیطی بر روی جمعیت گیاهان طبیعی می­شود (Ozyigit et al., 2023). در مقایسه با سایر سیستم‌های کشت بافت مانند کشت کالوس یا سوسپانسیون، کشت ریشه‌های موئین مزایای متمایزی برای تولید متابولیت‌های ثانویه ارائه می‌دهد. ریشه‌های موئین ویژگی‌های متمایز و ظرفیت بیوسنتزی ریشه‌های گیاه را حفظ می‌کنند که منجر به پایداری ژنتیکی بالاتر و تولید پایدارتر ترکیباتی مانند آلکالوئیدها، فنول‌ها و ترپنوئیدها می‌شود. سرعت رشد سریع آن­ها که اغلب در محیط‌های بدون هورمون حاصل می‌شود، تجمع زیست‌توده مقیاس ‌پذیر و افزایش سنتز متابولیت را تسهیل می‌کند. این ویژگی‌ها کشت ریشه‌های موئین را به ابزاری ضروری در صنایع دارویی و غذایی تبدیل می‌کند، جایی که تولید متابولیت پایدار و قابل اعتماد از اهمیت بالایی برخوردار است (Faraz et al., 2020). کشت موفقیت‌آمیز ریشه‌های موئین به ترکیبی از عوامل بستگی دارد که در کنار هم، کارایی و پایداری سیستم‌های ریشه القایی را تعیین می‌کنند. انتخاب ریزنمونه‌هایی با پاسخگویی بالا ترجیحاً از بافت‌های گیاهی جوان و با رشد قوی برای تسهیل تراریختی مؤثر توسط آگروباکتریوم رایزوژنز ضروری است. بهینه‌سازی دقیق شرایط کشت، از جمله مدت زمان مناسب آلودگی، غلظت صحیح استوسیرینگون برای فعال کردن ژن‌های بیماری‌زایی باکتری و تنظیم دقیق pH محیط کشت، ترکیب مواد مغذی و منابع کربن نیز به همان اندازه مهم هستند. حفظ شرایط استریل و واکشت منظم، پایداری ژنتیکی و تجمع مداوم زیست‌توده را بیشتر تضمین می‌کند. این فاکتورهای کنترل‌شده دقیق، به­طور قابل توجهی در به حداکثر رساندن تولید متابولیت‌های ثانویه ارزشمند در سیستم‌های ریشه موئین برای کاربردهای دارویی و صنعتی نقش دارند (Gutierrez-Valdes et al., 2020). الیسیتورها در تحریک پاسخ‌های دفاعی گیاه که منجر به افزایش بیوسنتز متابولیت‌های ثانویه می‌شوند، نقش اساسی دارند. الیسیتورهایی مانند متیل جاسمونات و اسید سالیسیلیک با شبیه‌سازی شرایط تنش زیستی یا غیرزیستی، مسیرهای سیگنالینگ کلیدی را فعال می‌کنند و بیان ژن‌های دخیل در تولید ترکیبات ارزشمندی مانند آلکالوئیدها، فلاونوئیدها و ترپنوئیدها را افزایش می‌دهند. این تحریک هدفمند نه تنها بازده این مواد شیمیایی گیاهی با ارزش بالا را افزایش می‌دهد، بلکه در مقایسه با روش‌های سنتی استخراج کل گیاه، روشی قابل کنترل و پایدار برای تولید فراهم می‌کند. علاوه بر این، استفاده از الیسیتورها در سیستم‌های کشت درون شیشه‌ای تضمین می‌کند که تولید متابولیت ثانویه کمتر به تغییرات محیطی وابسته است و مزایای قابل توجهی را برای صنایع دارویی، غذایی و شیمیایی کشاورزی ارائه می‌دهد (Rajendran et al., 2023). متیل جاسمونات یک الیسیتور مهم در بیوتکنولوژی گیاهی است که به علّت توانایی‌اش در تحریک فعال‌سازی ژن‌های مرتبط با دفاع که بیوسنتز متابولیت‌های ثانویه را افزایش می‌دهند، به­طور گسترده شناخته شده است. متیل جاسمونات با اتصال به گیرنده‌های خاص، آبشاری از رویدادهای انتقال سیگنال را آغاز می‌کند که منجر به افزایش بیان آنزیم‌های کلیدی و فاکتورهای رونویسی می‌شود که تولید این ترکیبات فعال زیستی ارزشمند را هدایت می‌کنند. این استراتژی استخراج نه تنها عملکرد متابولیت را در شرایط کنترل ‌شده آزمایشگاهی افزایش می‌دهد، بلکه با کاهش تغییرات محیطی و برداشت بیش از حد گیاهان وحشی، رویکردی پایدارتر به سنتز محصولات طبیعی را تسهیل می‌کند.

در آزمایشی جهت القاء ریشه موئین در گیاه پروانش، توسط ریزنمونه­های برگی و تلقیح با ﺑﺎﮐﺘﺮی آگروباکتریوم تومفاسینس حامل وﮐﺘﻮر CAMVS35 حاوی ژن rolC گزارش شد که می‌توان از ژن rolC ﺑﺮای ﺑﻬﺒﻮد رﯾﺸﻪ­دﻫﯽ و اﻟﻘﺎء رﯾﺸﻪ در ﮔﯿﺎﻫﺎن داروﯾﯽ اﺳﺘﻔﺎده ﮐﺮد، ﻫﻤﭽﻨﯿﻦ ژن rolC ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ﺗﺮﮐﯿﺐﻫﺎی ﻣﺨﺘﻠﻒ ﻫﻮرﻣﻮﻧﯽ در اﻟﻘﺎء رﯾﺸﻪ ﻣﻮئین موفق‌تر است (Sahandi et al., 2016). در آزمایش دیگری دو نوع ریز نمونه برگ و گیاهچه پروانش را با 4 سویه A4، 15834، 10266 و 2659 آگروباکتریوم رایزوژنز تلقیح کردند. نتایج نشان داد که اثر نوع سویه باکتری بر درصد تولید ریشه ­موئین معنی‌دار است، به­طوری­که بیشترین تولید ریشه­های­ موئین در سویه­های 10266 حاصل شد. همچنین استفاده از ریز نمونه متفاوت نیز بر میزان تولید ریشه­های­ موئین معنی­دار بود و ریز نمونه برگ نسبت به گیاهچه برای تولید ریشه­ موئین پاسخ مناسب­تری داد (Sathasivam et al., 2022). در پژوهش دیگری دریافتند در ریزنمونه گلخانه­ای پروانش بیشترین میزان تولید ریشه‎ موئین با 43/56 درصد مربوط به سویه A4 و میزان استوسیرینگون 100 میکرومولار و کمترین مقدار مربوط به سویه A13 و در 50 میکرومولار استوسیرینگون بود و در اکثر سویه­های باکتری با افزایش میزان استوسیرینگون، میزان تولید ریشه ‎موئین نیز بیشتر شد (Hamidi, 2013). این پژوهش، به بررسی یک استراتژی بیوتکنولوژیکی پیشرفته جهت افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه با بهینه‌سازی ایجاد ریشه‌های موئین می‌پردازد، روشی که از قابلیت‌های طبیعی تبدیل ژنتیکی آگروباکتریوم رایزوژنز برای تولید کشت‌های ریشه‌ای با رشد سریع و مستقل از هورمون با پتانسیل بیوسنتز بالا استفاده می­کنند.

مواد و روش­ها

مواد گیاهی

بذرهای سالم و یکنواخت بدون شکستگی و خراشیدگی به­مدت 3 دقیقه در الکل 70 درصد غوطه­ور شدند و سپس به­مدت 15 دقیقه در هیپوکلریت سدیم 5/1 درصد ضدعفونی سطحی شدند و پس از 3 بار شستشو با آب مقطر استریل به­مدت 5 دقیقه، روی محیط کشت MS (Murashige & Skoog, 1962) کشت داده ­شدند. کشت­ها تا مرحله جوانه‌زنی در تاریکی نگهداری و پس از حدود 7 روز به دوره­ نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در اتاقک رشد با شرایط دمای 2±24 درجه سانتی‌گراد انتقال یافتند. بعد از گذشت 3 تا 8 هفته، از گیاهچه­ها برای تهیه ریزنمونه و القاء ریشه موئین استفاده شد.

سویه­های باکتری مورد استفاده

برای تعیین بهترین سویه­ی باکتری برای القاء ریشه‎ موئین، یک کلونی از هر یک از سویه­های A4، A7، A13، 11325، 15834 و K599 آگروباکتریوم رایزوژنز به­صورت جداگانه به 10 میلی­لیتر محیط کشت MYA (Morton & Fuqua, 2012)، مایع حاوی 50 میلی­گرم در لیتر آنتی­بیوتیک ریفامپسین انتقال یافت و به­صورت شبانه در 28 درجه سانتی­گراد و با 110 دور در دقیقه در شیکر انکوباتور رشد داده شدند. سپس 2 میلی­لیتر از کشت شبانه باکتری­ها به­صورت جداگانه به 25 میلی­لیتر محیط کشت MYA حاوی استوسرینگون اضافه شده و تا رسیدن به OD₆₀₀ در شیکر انکوباتور با شرایط مذکور رشد داده شد.

تلقیح با باکتری

ریزنمونه­های برگی، ساقه، لپه و گره­ها، جداسازی و به قطعات کوچک برش داده ­شدند، سپس تزریق باکتری به ریزنمونه­ها انجام شد و به­صورت جداگانه در سوسپانسیون باکتری­های مورد نظر به مدت 7 دقیقه غوطه­ور شدند. پس از حذف باکتری اضافی، ریزنمونه­ها به مدت 72 ساعت در محیط هم­کشتی MS در تاریکی و دمای 2±24 درجه سانتی­گراد نگهداری شدند.

محیط کشت­های مورد استفاده

جهت حذف باکتری­های اضافی، ریزنمونه‌ها بعد از شستشو با آب مقطر اتوکلاو شده به مدت 5 دقیقه، به محیط کشت­های B5، B52/1، B54/1،MS ، MS2/1و MS4/1حاوی mg/L 400 آنتی‌بیوتیک سفوتاکسیم منتقل شدند. متناسب با شرایط و میزان مشاهده آلودگی باکتریایی ریزنمونه­ها هر دو هفته، به محیط کشت جدید حاوی آنتی بیوتیک سفوتاکسیم واکشت شدند. بعد از گذشت حدود 10 روز از زمان تلقیح، محل زخم­های ایجاد شده بر روی برگ­ها متورم شده و سپس ریشه­های موئین ظاهرشدند.

انتقال ریشه ‎موئین به محیط کشت مایع

بعد از رشد 10 تا 12 سانتی متری ریشه، برای اطمینان از یافتن بهترین نوع محیط کشت مایع برای رشد و گسترش ریشه­های موئین از محیط کشت MS، MS2/1، MS4/1، MS8/1، B5، B52/1، B54/1 و B58/1 حاوی 300 میلی­گرم در لیتر سفوتاکسیم استفاده شد. برای هوادهی و رشد بهتر ریشه­های ­موئین، بر روی شیکر با دور 110 دور در دقیقه و در تاریکی نگهداری شدند. هر دو هفته یکبار ریشه­های موئین به محیط کشت جدید منتقل شدند.

اعمال تیمار محرک

پس از این که رشد ریشه­های موئین به اندازه مورد نظر رسید، وزن مشخصی از ریشه­ها به محیط B54/1 منتقل شد. یک هفته پس از واکشت ریشه­ها، محرک متیل جاسمونات (0، 100 و 200 میکرومولار) اعمال شد. به این صورت که متیل ‎جاسمونات توسط فیلتر 22/0 میکرومتر فیلتر شد و پس از اتوکلاو محیط کشت و قبل از انتقال ریشه­ها به آن اضافه شد. 72 ساعت پس از اعمال تیمار، نمونه­برداری انجام و بررسی­های مربوطه انجام شد.

اندازه­گیری پروتئین­

برای استخراج عصاره پروتئینی از ریشه‎ موئین پروانش از روش Hazrati et al. (2023) استفاده شد. ابتدا ریشه­های موئین برداشت شده توسط ازت مایع پودر شدند و به 1/0 گرم از آن بافر فسفات 1/0 مولار با 8/7pH= اضافه شد و به­مدت 20 دقیقه با 10000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتی­گراد سانتریفیوژ شدند. فاز بالایی محلول برداشته و برای تعیین مقدار ‎پروتئین‌ به­روش برادفورد مورد استفاده قرار گرفت (Bradford, 1976). در این روش برای اندازه­گیری محتوی پروتئین از دستگاه اسپکتروفتومتر با طول موج 595 نانومتر استفاده شد. سپس با استفاده از نمودار استاندارد آلبومین سرم گاوی (BSA)، غلظت نهایی پروتئین نمونه­ها بر حسب میلی­گرم در میلی‌لیتر عصاره محاسبه شد.

اندازه­گیری هدایت الکتریکی

پس از جدا کردن ریشه­های موئین، 15 میلی­لیتر از محیط کشت بدون ریشه برداشته شده و هدایت الکتریکی (EC) آن توسط دستگاه EC­متر اندازه­گیری شد.

سنجش میزان مالون‌دی‌آلدئید

برای اندازه­گیری میزان مالون دی­آلدئید (MDA) از روش Zare & Hazrati (2025) استفاده شد. بدین ترتیب که به 1/0 گرم از نمونه پودر شده، 5/1 میلی­لیتر محلول تری­کلرواستیک اسید یک درصد اضافه و با سرعت 12000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه و در دمای 4 درجه سانتی­گراد سانتریفیوژ شد و محلول رویی برداشته شد. برای تهیه محلول واکنش، ابتدا محلول 20% تری­کلرو­استیک­اسید تهیه شد و سپس تیوباربیتوریک اسید 5/0% در دمای 40 درجه سانتی‌گراد به آن اضافه و حل شد. 750 میلی­لیتر از عصاره سلولی را به میکروتیوب‌های 2 میلی­لیتری منتقل کرده و 5/1 میلی­لیتر از محلول واکنش به آن اضافه و به مدت 30 دقیقه در بن ماری دمای 100 درجه سانتی­گراد نگهداری شد. بلافاصله نمونه در یخ به­مدت 5 دقیقه قرار داده شد. سپس 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد و با 10000 دور در دقیقه سانتریفیوژ و مایع رویی برداشت شد. میزان جذب مایع رویی در دو طول موج 532 و 600 نانومتر توسط اسپکتروفتومترخوانده شد.

اندازه­گیری مقدار کاتارانتین

به 300 میلی­گرم نمونه پودر شده، 5 میلی‎لیتر متانول  اضافه شده و برای چند دقیقه ورتکس شد. به­مدت 20 دقیقه بر روی شیکر و سپس 20 دقیقه در حمام اولتراسونیک قرار گرفت. این مراحل دو مرتبه دیگر نیز تکرار شد و در نهایت حدود 40 دقیقه بر روی شیکر قرار گرفته و به مدت 5 دقیقه با دور 15000 سانتریفیوژ شد. سپس مایع رویی برداشت شده و به مدت 10 ساعت در آون قرار گرفته و عصاره متانولی تهیه شد (Tikhomiroff et al., 2002). برای تعیین مقدار کاتارانتین از دستگاه HPLC  (YL9100 HPLC system) و ستون C18 استفاده شد. فاز متحرک شامل بافر فسفات 5 میلی مولار (6 =pH) و استونیتریل به نسبت 20 به 80 بود که با شدت جریان 1 میلی­لیتر در دقیقه از ستون عبور می­کرد. همچنین حجم تزریق 20 میکرولیتر بود. مقدار کاتارانتین هر نمونه با طول موج 275 نانومتر و توسط استاندارد کاتارانتین (شرکت سیگما) اندازه­گیری شد.

آنالیز آماری

آزمایش مربوط به تأثیر محیط کشت­ها و سویه­های مختلف در القاء ریشه موئین به­صورت فاکتوریل در قالب طرح کامل تصادفی در سه تکرار انجام شد. آزمایش­های تأثیر محیط­های کشت مایع­ در رشد ریشه­های موئین، میزان پروتئین، مالون دی­آلدئید، هدایت الکتریکی و کاتارانتین به­صورت طرح کامل تصادفی در سه تکرار انجام شد. محاسبات آماری و تجزیه و تحلیل داده­ها با نرم افزار SPSS 16 و مقایسه میانگین داده­ها توسط آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام شد.

نتایج

تأثیر نوع ریزنمونه بر ریشه‌زایی موئین

ریزنمونه­های برگی، ساقه، لپه و گره­ها با آگروباکتریوم رایزوژنز تلقیح شدند. ریزنمونه­های ساقه­ به­علت آلودگی بالا، از بین ­رفتند و ریشه­های موئین به‌ندرت قابل رشد بوده و اغلب قابلیت تشکیل انشعابات زیاد را دارا نبودند. ریزنمونه­های لپه کاملا آلوده و نکروزه شدند و گره­ها ساقه نابجا ایجاد کردند. در نتیجه برگ به­عنوان ریزنمونه مناسب انتخاب و جهت هم­کشتی مورد استفاده قرار گرفت (شکل 1). ریزنمونه­ها طی زمان‎های متعدد برای تلقیح با باکتری مورد آزمایش قرار گرفتند. به­علت کوچک و ظریف بودن گیاهچه­های 3 تا 4 هفته، نمونه­های برگی قادر به مقاومت در برابر باکتری و محیط جدید نبوده و نکروزه شدند و ریزنمونه­های 6 تا 8 هفته، توانایی ریشه­زایی نشان دادند. ظهور ریشه­‌های ­موئین با محیط کشت و باکتری مناسب، از روز 6 ام آغاز شد و بقیه­ی ریشه­هایی که قابلیت رشد داشتند تا روز 14 علایم رشدی را نشان دادند.

شکل 1- ریزنمونه­های مختلف تلقیح شده با آگروباکتریوم رایزوژنز؛ A) ساقه، B) کوتیلدون، C) گره، D) برگ

Figure 1- Different explants inoculated with Agrobacterium rhizogenes; A) stem, B) cotyledon, C) node, D) leaf

اثر محیط ­کشت­ها و سویه­های مختلف باکتری بر ظهور ریشه­های ­موئین

در ریزنمونه­های برگ تلقیح شده با سویه­های آگروباکتریوم رایزوژنز، به­طور میانگین بعد از 13 روز ریشه‌های موئین ظاهر شدند. با توجه به نتایج تجزیه واریانس اثر سویه باکتری و محیط­ کشت ریشه­زایی در سطح احتمال 1 درصد بر تولید ریشه­های موئین در گیاه پروانش معنی­دار بود. علاوه بر این اثر متقابل سویه باکتری در محیط ­کشت ریشه­زایی نیز در سطح احتمال 5 درصد معنی­دار بود (جدول 1). به­طور کلی بیشترین درصد ریشه‌زایی با سویه A4 در محیط­کشت B54/1 (67/60%) و سویه A4 در محیط کشت B52/1 (54% ( و همچنین سویه 15834 در محیط کشت B54/1 (52% (مشاهده شد (جدول 2). از بین سویه­های باکتری به­کار رفته، سویه A4 با میانگین ریشه­زایی 72/34 درصد بیشترین درصد ریشه‌زایی را نشان داد، سویه 15834 با میانگین ریشه­زایی 61/21 درصد در رتبه بعدی قرار داشت. کمترین درصد ریشه­زایی هم با سویه A13 و K599 به­ترتیب با میانگین 5/6 و 11/7 به­دست آمد. در مورد محیط­ کشت­های ریشه­زایی، محیط­کشت B54/1 و B52/1 با میانگین ریشه­زایی 66/34 درصد و 11/29 درصد بیشترین تأثیر را در ایجاد ریشه داشتند. محیط کشت MS با میانگین 66/1 درصد کمترین میزان ریشه‌زایی را داشت. ریشه­های موئین حاصل از سویه A4 در محیط کشت B54/1 با انشعابات بیشتر و رشد سریع­تر ظاهر شدند و درصد ریشه­زایی موئین در این تیمار بیشتر از بقیه سویه­ها و محیط کشت­ها بود (شکل 2). در تمام سویه‌ها با کاهش غلظت محیط کشت، درصد ریشه­زایی موئین افزایش نشان داد و این افزایش در محیط کشت B5 بیشتر از محیط کشت MS بود (جدول 2).

جدول 1- تجزیه واریانس درصد ریشه­زایی موئین در محیط کشت­ها و سویه­های مختلف در گیاه پروانش

Table 1. Variance analysis of hairy root percentage in different media and strains in periwinkle

 ^** و ^* به ترتیب معنی­داری در سطح احتمال 1 درصد و 5 درصد

^** and ^* Significant at the 1%  and 5% probability level

جدول 2- تأثیر سویه آگروباکتریوم رایزوژنز و محیط کشت بر ریشه­زایی موئین در ریزنمونه برگی گیاه پروانش.

Table 2- Effect of Agrobacterium rhizogenes strain and medium on hairy rooting in leaf explants of periwinkle.

 میانگین 3 تکرار ± SE، طبق آزمون دانکن مقادیر با حروف متفاوت اختلاف معنی‌داری در سطحP ≤ 0.05  دارند.

Average of 3 repetitions ± SE, according to Duncan test values with different letters have significant differences at P≤ 0.05

شکل 2- ریشه­های موئین ایجاد شده در محیط کشت B54/1 از ریزنمونه‌های تلقیح شده با سویه­های A) A4، B) 15834، C) A7، D) 11325، E) A13، F) K599

Figure 2- Hairy roots formed in 1/4B5 medium from explants inoculated with strains A) A4, B) 15834, C) A7, D) 11325, E) A13, F) K599

تعیین محیط­ کشت مایع مناسب برای رشد ریشه موئین

پس از تعیین سویه A4 به­عنوان بهترین سویه برای ریشه­زایی، برای تعیین محیط ­کشت مایع مناسب برای رشد و گسترش سریع­تر، ریشه­های موئین از محیط کشت جامد وارد محیط­ کشت­های مایع B58/1، B54/1، B52/1، B5، MS8/1، MS4/1، MS2/1، MS شدند و پس از 25 روز وزن تر آن‎ها اندازه­گیری شد. با توجه به نتایج تجزیه واریانس (جدول 3) محیط کشت­های مختلف در سطح احتمال 1 درصد بر رشد ریشه­های موئین در گیاه پروانش تأثیر معنی‌داری داشتند. محیط کشت مایع B54/1 بهترین محیط کشت برای رشد و گسترش بیشتر و سریع‌تر ریشه‌های موئین بود (شکل 3). اگر چه در محیط کشت‌های جامد نیز اصل کاهش غلظت نمک‌های B5 با افزایش ریشه‌زایی و گسترش ریشه‌های موئین برقرار بود، امّا در محیط کشت با غلظت کمتر از B54/1 مانند B58/1 مواد مغذی ریشه­ها کمتر شده و به مرور گسترش ریشه­های موئین کاهش یافت و کمترین وزن تر ریشه‌های موئین نیز متعلق به محیط کشت مایع MS و B5 بود (شکل 4).

جدول 3- تجزیه واریانس تأثیر محیط­های کشت مایع مختلف بر وزن تر ریشه‌های موئین در گیاه پروانش

Table 3- Variance analysis of the effect of different liquid media on the fresh weight of hairy roots in periwinkle

                           ^** معنی­دار در سطح احتمال 1% 

                  ^** Significant at the 1%  probability level

شکل 3- تأثیر محیط­های کشت مایع مختلف بر وزن تر ریشه‌های موئین. میانگین 3 تکرار ± SE، طبق آزمون دانکن مقادیر با حروف متفاوت اختلاف معنی‌داری در سطحP ≤ 0.05  دارند.

Figure 3- Effect of different liquid media on the fresh weight of hairy roots. Average of 3 repetitions ± SE, according to Duncan test values with different letters have significant differences at P ≤ 0.05

شکل 4- مقایسه محیط کشت‌های مایع مختلف در رشد ریشه­های موئین A) B58/1، B) B54/1، C) B52/1، D) B5، E) MS8/1، F) MS4/1، G) MS2/1، H) MS

Figure 4- Comparison of different liquid media in hairy root growth A) 1/8B5, B) 1/4B5, C) 1/2B5, D) B5, E) 1/8MS, F) 1/4MS, G) 1/2MS, H) MS

پروتئین کل

بر اساس جدول تجزیه واریانس، بین تیمارها از نظر میزان پروتئین کل اختلاف معنی‌داری وجود دارد (جدول 4). در تیمار 200 میکرومولار متیل جاسمونات بیشترین مقدار پروتئین مشاهده شد. تیمار 100 میکرومولار متیل جاسمونات هم به­طور معنی‌داری پروتئین بیشتری نسبت به شاهد داشت (شکل 5).

هدایت الکتریکی محیط ‌کشت

اثر متیل­ جاسمونات بر روی میزان هدایت الکتریکی محیط ‌کشت در سطح احتمال 1% معنی­دار بود (جدول 4). بیشترین مقدار آن در تیمار 200 میکرومولار متیل ‎جاسمونات و کمترین مقدار آن در تیمار شاهد مشاهده شد (شکل 5). اگر محرک­ها را عامل آزاد شدن گونه­های اکسیژن فعال در نظر داشته باشیم، در این صورت غشاء در حال تخریب شدن خواهد بود و در نتیجه میزان الکترولیت نیز افزایش خواهد یافت.

میزان مالون‌دی‌آلدئید

اثر متیل­جاسمونات بر میزان مالون‌دی‌آلدئید در سطح احتمال 1% معنی­دار بود (جدول 4). بیشترین مقدار مالون‌دی‌آلدئید در تیمار 200 میکرومولار متیل جاسمونات مشاهده شد و کمترین مقدار آن در تیمار شاهد مشاهده شد (شکل 5). سطح مالون‌دی‌آلدئید به عنوان نشانگر سطح رادیکال های آزاد سلولی که در شرایط استرس به غشای سلولی آسیب می رساند استفاده شده است (Jaleel et al., 2007).

میزان تولید کاتارانتین

تعیین مقدار کاتارانتین تولید شده در ریشه موئین پروانش بر اساس محلول استاندارد و تعیین زمان نگهداری مربوط به آن انجام گرفت. به مقدار 20 میکرولیتر استاندارد کاتارانتین به‎ دستگاه HPLC تزریق شد و زمان نگهداری، 96/17 دقیقه مشخص شد (شکل 6). سطح زیر منحنی در دقیقه اعلام شده نشان دهنده­ی مقدار کاتارانتین است (جدول 4)، و با در دست داشتن غلظت اولیه‌ی استاندارد تزریق شده به دستگاه HPLC و مشخص بودن سطح زیر ­منحنی استاندارد، غلظت کاتارانتین هر نمونه توسط اندازه سطح زیر منحنی نمونه تعیین شد. با توجه به نتایج تجزیه واریانس (جدول 4) میزان کاتارانتین در ریشه‌های موئین گیاه پروانش به‌طور معنی‌داری در سطح احتمال 5 درصد تحت تأثیر متیل جاسمونات قرار گرفت. نمونه­های تیمار شده با متیل جاسمونات 100 میکرومولار و متیل جاسمونات 200 میکرومولار به ترتیب 1505/0 و 1431/0 میلی­گرم کاتارانتین در گرم وزن تر داشتند که نسبت به نمونه­های شاهد افزایش نشان دادند (شکل 5).

جدول 4- تجزیه واریانس تأثیر متیل جاسمونات بر ویژگی‌های بیوشیمیایی ریشه­های موئین پروانش

Table 4- Variance analysis of the effect of methyl Jasmonate on the biochemical properties of hairy roots of periwinkle

^** و ^* به ترتیب معنی­داری در سطح احتمال 1 درصد و 5 درصد

^** and ^* Significant at the 1%  and 5% probability level

شکل 5- تأثیر متیل جاسمونات (MeJ) بر میزان پروتئین کل (A)، هدایت الکتریکی محیط کشت (B)، مالون‌دی‌آلدئید (C) و کاتارانتین (D) در ریشه‌های موئین پروانش. میانگین 3 تکرار ± SE، طبق آزمون دانکن مقادیر با حروف متفاوت اختلاف معنی‌داری در سطح P ≤ 0.05  دارند.

Figure 5- Effect of methyl jasmonate on total protein content (A), EC (B), MDA (C), and catharanthine (D) in hairy roots of Perennial. Average of 3 repetitions ± SE, according to Duncan test values with different letters have significant differences at P ≤ 0.05

شکل 6- زمان نگهداری استاندارد کاتارانتین در HPLC

Figure 6- Retention time of catharanthine standard in HPLC

بحث

در این پژوهش از بین ریزنمونه­های ساقه، لپه، برگ و گره از ریزنمونه برگ 6 تا 8 هفته­ای به‌عنوان ریزنمونه مناسب برای هم­کشتی استفاده شد. تمام ریزنمونه­های گیاهان پاسخ مشابهی را برای تولید ریشه ‎موئین نمی­دهند. در گیاه Eurycoma longifolia برای تولید ریشه ‎موئین از بین ریزنمونه­های برگ، دمبرگ، جنین، رویان بدنی و محور زیر لپه، فقط ریزنمونه هیپوکوتیل قادر به تولید ریشه ‎موئین بود (Sajap et al., 2014).

نتایج این پژوهش نشان داد سویه A4 از آگروباکتریوم رایزوژنز در القاء ریشه‌های موئین گیاه پروانش عملکرد به ‌مراتب بهتری دارد و در ترکیب با محیط کشت B54/1 جامد، بالاترین درصد ریشه‌زایی را فراهم می­کند. این یافته با گزارش‌های پیشین مبنی بر تأثیر سویه و ترکیب محیط کشت بر راندمان ریشه‌زایی در گونه‌های دیگر مانند Solanum lycopersicum مطابقت دارد و نشان می‌دهند تفاوت‌های ژنتیکی سویه‌ها نقش کلیدی در فعال‌سازی ژن‌های rol دارند. Kardoost Parizi & Mahmoudnia (2016) در آزمایشی تأثیر سه سویه باکتری A4،11325  و  2656را  بر ریشه­زایی موئین گیاه پروانش مورد ارزیابی قرار داده و گزارش کردند که اثر متقابل معنی‌داری بین سویه آگروباکتریوم و ریزنمونه گیاه وجود دارد. بر اساس یافته‌های موجود سویه A4 و ریزنمونه برگ بیشترین میزان تولید ریشه ‎موئین را با 76/53 درصد نشان دادند. همچنین همین سویه در ریزنمونه ساقه 08/3 درصد تولید ریشه ‎موئین داشته است. بر اساس نتایج Sohrabi-Nejad et al. (2018) دو محیط کشت B52/1 و MS2/1 از نظر درصد تولید ریشه موئین اختلاف معنی­داری نشان داده­اند. محیط کشت B52/1 با 84/35 درصد، نسبت به محیط کشت MS2/1 با 67/25 درصد، برای بالا بردن میزان تولید ریشه ­موئین در Calendula officinalis، محیط مناسب­تری بوده است. رشد ریشه‌های موئین در محیط‌های مایع نیز توسط  B54/1 بهترین عملکرد را نشان داد که احتمالاً ناشی از تعادل مطلوب یون‌ها و مواد مغذی در این محیط است. تفاوت قابل ‌توجه رشد میان محیط‌های مایع مختلف حاکی از آن است که نسبت مبتنی بر غلظت B5 و MS با تغییرات جزئی در غلظت و ترکیب ویتامین‌ها می‌تواند به بهینه‌سازی بیشتر بیان ژن‌های مرتبط با رشد ریشه موئین کمک کند. محیط کشت­های مختلف از نظر غلظت یا ترکیب برخی از نمک­ها با هم متفاوت هستند. غلظت یا ترکیب بالای نمک­ها در محیط کشت می­تواند جذب مواد غذایی توسط گیاه را تحت تأثیر قرار دهد. محیط کشت MS بیشترین غلظت یا ترکیب نمک­ها را به­همراه دارد. علاوه بر وجود تفاوت در عناصر پرمصرف، محیط کشت B5 برخلاف محیط کشت MS فاقد گلایسین است، امّا تیامین بیشتری دارد. گونه­ها و حتی ارقام مختلف یک گونه ممکن است به عناصر غذایی متفاوتی نیاز داشته باشند و همین موضوع ممکن است بر ریشه­زایی آن­ها تأثیر داشته باشد (Hazrati et al., 2022). به‌عبارت دیگر، زمانی که از محیط کشت B5 با غلظت‌های کمتر (B52/1 و یا B54/1) استفاده شد، تأثیر بسیار بهتری در رشد ریشه­های موئین داشت. این نتایج بیانگر این است که ریشه­های موئین به محیط کشت و ترکیبات آن از نظر میزان رشد و ریخت شناسی ریشه عکس­العمل بارزی نشان می‌دهند. می­توان چنین تصور کرد که ریشه‌های­ موئین برای استقرار، رشد مناسب و حفظ ساختار به محیط کشت رقیق شده­ای نیاز دارند. به نظر می‌رسد حداقل بخشی از این تأثیر ناشی از عکس‌العمل ریشه‌های موئین به فشار ایزوتونیک محیط هستند.

تیمار با متیل‌جاسمونات با دو غلظت ۱۰۰ و ۲۰۰ میکرومولار، موجب افزایش معنی­دار محتوای پروتئین کل، هدایت الکتریکی، میزان مالون دی‌آلدئید و کاتارانتین شد. این نتایج حاکی از القاء پاسخ استرسی کنترل ‌شده و فعال ‌شدن مسیرهای متابولیکی مرتبط با سنتز پروتئین و متابولیت‌های ثانویه است. افزایش هدایت الکتریکی نشان‌دهنده نشت یونی تنظیم‌ شده از سلول‌های ریشه موئین است که به تقویت تبادل یونی و دسترسی به پیش‌سازهای ضروری برای سنتز کاتارانتین کمک می‌کند. پژوهش‌های اخیر نشان داده‌اند تیمار کشت ریشه‌های موئین با متیل ‌جاسمونات می‌تواند علاوه بر القاء مسیرهای زیستی متابولیت‌های ثانویه، سبب افزایش قابل ‌توجه پروتئین کل در این سیستم‌های کشت شود؛ به‌طور مثال، در کشت‌های ریشه موئینSolanum lycopersicum  پس از افزودن 100 میکرومولار متیل ‌جاسمونات به محیط کشت به‌مدت 72 ساعت، میزان پروتئین کل به‌طور معنی­داری تا 35 درصد افزایش یافت که ناشی از القاء بیان ژن‌های مرتبط با سنتز پروتئین و بهبود جذب نیتروژن بود. بنابراین متیل ‌جاسمونات می‌تواند به‌عنوان یک محرک برای ارتقاء کیفیت بیوماسی در ریشه‌های موئین گیاهان مورد بهره‌برداری قرار گیرد (Amani et al., 2024). پژوهش‌ها نشان داده‌اند اعمال متیل ‌جاسمونات به کشت‌های ریشه ‌موئین موجب افزایش معنی‌دار هدایت الکتریکی محیط کشت می‌شود؛ به‌عنوان مثال، در کشت ریشه ‌موئین Datura stramonium، افزودن 100 میکرومولار متیل ‌جاسمونات به محیط کشت به مدت 48 ساعت، هدایت الکتریکی را از 2/1 به 8/1 میلی‌زیمنس بر سانتی‌متر افزایش داد که این تغییر بازتاب ‌دهنده نشت بیشتر یون‌ها از غشاهای سلولی و تقویت تبادل یونی بین ساختار ریشه و محیط کشت است (Amani et al., 2024). Hamidi (2013) در پژوهشی گزارش کرد با افزودن 150 میکرومولار متیل جاسمونات به­عنوان محرک، افزایش تولید وین بلاستین نسبت به ریشه ‎موئین شاهد مشاهده شد، امّا استفاده بیشتر از متیل­جاسمونات (300 میکرومولار) سبب کاهش تولید آلکالوئید شد.

نتیجه­گیری

در پژوهش حاضر، روش بهینه شده برای ایجاد ریشه موئین درCatharanthus roseus  و انتخاب هدفمند متیل جاسمونات به­عنوان محرک، یک روش قوی برای تقویت تولید کاتارانتین ارائه داد. مشخص شد که بیشترین درصد ریشه­زایی موئین در ترکیب سویه­ی A4 و محیط کشت B54/1 جامد به­دست آمد. بهترین محیط مایع برای رشد ریشه موئین نیز محیط کشت B54/1 بود. بررسی اثر محرک متیل جاسمونات بر میزان پروتئین، مالون­دی­آلدئید، هدایت الکتریکی و مقدار کاتارانتین در ریشه‌های موئین پروانش انجام شد. تجمع و تولید کاتارانتین در کروماتوگرام HPLC در ریشه موئین این گیاه تأیید شد و محرک متیل جاسمونات در هر دو غلظت 100 و 200 میکرومولار افزایش مقدار تولید کاتارانتین را به همراه داشت. علاوه بر افزایش سریع شاخص‌های رشد، استفاده متیل ‌جاسمونات به‌عنوان محرکی زیستی می‌تواند به‌عنوان یک استراتژی مؤثر برای افزایش تولید ترکیبات دارویی در مقیاس بیوراکتوری مطرح شود. این رویکرد هم از نظر اقتصادی مقرون ‌به‌صرفه است و هم امکان تولید پایدار آلکالوئیدهای کمیاب با کیفیت بالا را فراهم می‌آورد. ترکیب بهینه سویه‌های باکتری، محیط کشت و محرک زیستی، بستری مناسب برای مقیاس‌گذاری این سیستم در شرایط صنعتی ایجاد می­کند. با این وجود، پیشنهاد می­شود با شناسایی ژن­های مسیر کاتارانتین در پروانش، تأثیر محرک­های دیگر بر بیان این ژن­ها نیز مورد بررسی قرار گیرد. این رویکرد نه تنها درک ما از متابولیسم ثانویه گیاه را بیشتر می­کند، بلکه یک راه حل مقیاس پذیر برای تولید صنعتی ترکیبات دارویی با ارزش نیز فراهم می­کند.