شناسایی مولکولی برخی از گونه‌های پادمان خانواده Onychiuridae (Collembola: Poduromorpha) در ایران

مقدمه

راسته Poduromorpha با داشتن 8 خانواده، متنوع‌ترین و فراوان‌ترین بندپایان در رده پادمان هستند (Bellinger et al., 2025). از این راسته تاکنون، 138 گونه متعلق به 48 جنس و 7 خانواده گزارش شده است که خانواده Hypogastruridae با بیش از 37 گونه فراوان‌ترین خانواده است (Yoosefi Lafooraki & Shayanmehr, 2015b; Salimi et al., 2022; Shayanmehr et al., 2023). از خانواده Tullbergidae که شباهت نزدیکی به خانواده Onychiuridae دارد نیز تنها 14 گونه از ایران گزارش شده است (Shayanmehr & Yoosefi Lafooraki, 2024). خانواده Onychiuridae با 53 جنس و 765 گونه، دومین خانواده بزرگ در راسته Poduromorpha است و شامل سه زیرخانواده Onychiurinae با 48 جنس و 759 گونه، Tetrodontophorinae با 3 جنس و 4 گونه و Lophognathellinae با 2 جنس و 2 گونه است (Bellinger et al., 2025). زیرخانواده Onychiurinae با 13 جنس و 33 گونه، تاکنون دارای بیشترین فراوانی در بین گونه‌های شناسایی‌شده در کشور است (Shayanmehr et al., 2023). فقدان رنگ‌دانه، چشم و فورکا از مهم‌ترین ویژگی‌های این خانواده است. همچنین دیگر ویژگی‌های این خانواده وجود حفره‌های جلدی به نام چشم‌های دروغین است که درواقع بخش‌های کوچکی از کوتیکول نازک‌شده برای خروج مایع دفاعی هستند. اعضای این خانواده معمولاً در عمق‌های مختلف خاک و خاک‌برگ فعالیت دارند؛ اما در مکان‌های دیگر ازجمله زیر سنگ‌ها یا چوب‌های درحال پوسیدن نیز یافت می‌شوند (Hopkin, 1997).

اولین گزارش از خانواده Onychiuridae در ایران مربوط به مطالعه‌ای است که توسط Cox (1982) در تعدادی از استان‌های کشور درزمینة شناسایی فون پادمان انجام شد و 7 گونه از این خانواده گزارش شد. در فهرستی که Shayanmehr et al. (2013) از گونه‌های پادمان ایران ارائه کردند، تنها دو گونه به گونه‌های گزارش‌شده توسط کاکس اضافه شد. در سال‌های بعد خانواده Onychiuridae بیشتر درخور توجه پژوهشگران قرار گرفت؛ به‌طوری‌که در سال‌های 2016 و 2017 چهار گونه جدید از این خانواده برای اولین‌بار از ایران توصیف شد (Ghazi & Shayanmehr, 2016; Kahrarian et al., 2016; Arbea & Kahrarian, 2017; Kaprus et al., 2017). در سال 2019 تعداد 8 جنس و 14 گونه از غرب ایران گزارش شد (Kahrarian, 2019) و در سال 2020 در فهرستی که توسط شایانمهر و همکاران برای گونه‌های پادمان ایران ارائه شد، خانواده Onychiuridae شامل 14 جنس و 28 گونه بود. در همین سال 5 گونه متعلق به 4 جنس از این خانواده از جنگل‌های استان مازندران جمع‌آوری و توصیف شدند (Yahyapour et al., 2020). مطالعه‌ای نیز برای بررسی فون پادمان جنگل‌های بلوط و توده‌های سوزنی برگ شهرستان مریوان واقع در غرب استان کردستان انجام شد که یک گونه دیگر به فون خانواده Onychiuridae در ایران اضافه کرد (Ahmadi et al., 2023). طبق آخرین فهرستی که برای پادمان راسته Poduromorpha در ایران ارائه شد، از خانواده Onychiuridae 34 گونه متعلق به 14 جنس معرفی شد (Shayanmehr et al., 2023). با توجه به نقش و اهمیت پادمان در چرخه زیستی طبیعت (Chahartaghi et al., 2005) لازم است از فون آنها اطلاعات دقیقی داشته باشیم؛ بنابراین، شناسایی و معرفی این رده از بندپایان در نواحی مختلف کشور الزامی است. شناسایی دقیق گونه‌های خانواده Onychiuridae به‌دلیل عدم دسترسی به کلید شناسایی کامل و معتبر، کمبود متخصص‌های مجرب و مشکلات موجود در رابطه با ارسال نمونه‌ها به خارج از کشور، با مشکلات متعددی روبه‌رو است؛ بنابراین، در کنار بررسی‌های شکل‌شناسی مطالعات مولکولی با استفاده از تکنیک بارکدینگ می‌تواند به حل مشکلات مربوط به شناسایی نمونه‌ها کمک کند. با ظهور تکنیک‌های جدید در علم زیست‌شناسی مولکولی، سیستماتیک مولکولی پادمان طی سال‌های اخیر پیشرفت چشمگیری داشته است. ژنوم میتوکندری و هسته بارها برای تعیین روابط فرگشتی بین گروه‌های مختلف پادمان استفاده شدند و اطلاعات ارزشمندی در این زمینه ارائه شده است. بارکدگذاری DNA برای کامل کردن تاکسونومی شکل‌شناسی در چندین جنس ازجمله Deutonura، Heteromurus، Homidia، Lepidobrya، Protaphorura، Tomocerus، Isotomurus، Thalassaphorura و Lepidocyrtus استفاده شده است (Carapelli et al., 1995, 2001b; 2005; Porco et al., 2010; Lukić et al., 2015; Pan, 2015; Sun et al., 2017; Yu et al., 2017; Zhang et al., 2017; Mateos et al., 2018; Potapov et al., 2018; Sun et al., 2018; Winkler et al., 2020). از آنجا که اطلاعات مولکولی چندانی از خانواده Onychiuridae در ایران در دسترس نیست، در پژوهش حاضر، شناسایی مولکولی چند گونه از پادمان این خانواده در ایران ارائه شده است.

• مواد و روش

جمع‌آوری و شناسایی گونه‌ها براساس صفات شکل‌شناسی

به‌منظور شناسایی گونه‌های پادمان خانواده Onychiuridae، از مناطق مختلف در استان گیلان و فضاهایی سبز داخل شهر اصفهان (استان اصفهان)، نمونه‌برداری‌هایی از خاک و لاش‌برگ در سال‌های 1396 (گیلان) و 1400 (اصفهان) انجام شد. نمونه‌ها در کیسه‌های پلاستیکی قرار گرفتند و به هر نمونه یک کد اختصاص داده شد که نشان‌دهندة اطلاعات مربوط به جمع‌آوری نمونه شامل محل نمونه‌برداری، تاریخ و زیستگاه بود. این اطلاعات به همراه کد مربوطه در یک دفترچه یادداشت شد. سپس نمونه‌ها به آزمایشگاه منتقل شدند و در قیف برلیز قرار گرفتند. بعد از گذشت 3 تا 4 روز، بندپایان موجود در نمونه‌ها، استخراج و از بین آنها پادمان جداسازی شد. در مرحله بعد نمونه‌های متعلق به خانواده Onychiuridae با مشاهده زیر دستگاه استریومیکروسکوپ از سایر پادمان تفکیک شدند. نمونه‌ها در میکروتیوب‌های حاوی الکل 70 درصد و در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. برای شناسایی و تشخیص نمونه‌های این خانواده در سطح جنس و گونه اسلایدهای میکروسکوپی تهیه شد. برای دیدن بهتر موها و چشم‌های کاذب روی سر و بدن، نمونه‌ها به مدت 3-2 دقیقه در محلول پتاس 10 درصد قرار گرفتند (Christiansen, 1957). شناسایی نمونه‌ها با استفاده از کلیدهای شناسایی معتبر انجام شد (Fjellberg, 1998; Yahyapour et al., 2020).

شناسایی مولکولی

استخراج DNA با استفاده از کیت استخراج سیناکلون و براساس دستورالعمل موجود در کیت انجام شد. از نشانگر میتوکندریایی COI  برای شناسایی مولکولی گونه‌ها استفاده شد. برای تکثیر این قطعه از ژنوم میتوکندریایی از جفت آغازگرهای  LCO1490 (5ʹ -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3') به‌عنوان آغازگر مستقیم و HCO2198 (5ʹ -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3') به‌عنوان آغازگر معکوس استفاده شد (Folmer et al., 1994). واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در حجم 25 میکرولیتر انجام شد. اجزای واکنش شامل 6/15 میکرولیتر ddH2O، 3 میکرولیتر DNA الگو، 5/2 میکرولیتر بافر، 5/0 میکرولیتر dNTP (15 میلی‌مولار)، 1 میکرولیتر MgCl2 (25 میلی‌مولار)، 1 میکرولیتر از هر آغازگر (10 میکرومولار) و 4/0 میکرولیتر آنزیم TaqPolymerase (5 واحد بر میکرولیتر، شرکت سیناکلون) بود. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز برای تکثیر قطعه COI در دستگاه ترموسایکلر در شرایط زیر انجام شد: 5 چرخه شامل واسرشته‌سازی در دمای 96 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه، اتصال در دمای 48 درجه سانتی‌گراد به مدت 35 ثانیه و گسترش در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 40 ثانیه و 30 چرخه شامل واسرشته‌سازی در دمای 96 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه، اتصال در دمای 51 درجه سانتی‌گراد به مدت 35 ثانیه و گسترش در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 40 ثانیه. واسرشته‌سازی اولیه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه و گسترش نهایی در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 6 دقیقه انجام شد. توالی‌یابی با استفاده از آغازگر مستقیم، توسط شرکت میکروسینس سوئیس و به روش سنگر انجام شد. به‌منظور همترازکردن توالی‌ها و محاسبه میزان اختلاف ژنتیکی بین ژن‌ها از نرم‌افزار MEGA v.6 استفاده شد (Tamura et al., 2013). همترازی توالی‌ها با الگوریتم ماسل انجام شد. درخت فیلوژنی به روش اتصال همسایه با 10000 بار تکرار با استفاده از نرم‌افزار iqtree (version 1,6,12) ترسیم شد (Nguyen et al., 2015). در ترسیم درخت فیلوژنی علاوه بر توالی‌های به‌دست‌آمده در این پژوهش، از توالی‌های بانک ژن نیز استفاده شد.

• نتایج و بحث

در این پژوهش 4 جنس و 6 گونه متعلق به زیرخانواده Onychiurinae جمع‌آوری و شناسایی شدند. گونه‌های Thalassaphorura encarpata (Denis, 1931)، Heteraphorura iranica Kaprus’ et al., 2017 و Protaphorura levantina (Christiansen, 1956) برای اولین‌بار از استان گیلان و گونه Protaphorura sakatoi (Yosii, 1966) برای اولین‌بار از اصفهان گزارش شدند. در ادامه، اطلاعات جمع‌آوری و مناطق انتشار گونه‌های جمع‌آوری‌شده در این تحقیق و بررسی مولکولی گونه‌ها و روابط فیلوژنی ارائه می‌شود.

جنس Heteraphorura Bagnall, 1948

گونه Heteraphorura iranica Kaprus’ et al., 2017

اطلاعات جمع‌آوری: 10 نمونه از این گونه از سلانسر واقع در شهرستان رودبار استان گیلان (طول جغرافیایی ʺ7 ʹ22 °49 شرقی، عرض جغرافیایی ʺ47 ʹ01 °37 شمالی) در تاریخ 13/12/1396، دو گونه از روستای امامزاده ابراهیم واقع در شهرستان شفت استان گیلان (طول جغرافیایی ʺ31 ʹ19 °49 شرقی، عرض جغرافیایی ʺ47 ʹ59 °36 شمالی) در تاریخ 13/12/ 1396و 10 گونه از جنگل کاج روستای اسکولک واقع در شهرستان رودبار استان گیلان (طول جغرافیایی ʺ58 ʹ34 °49 شرقی، عرض جغرافیایی ʺ45 ʹ00 °37 شمالی) در تاریخ 13/12/1396 جمع‌آوری شدند.

مناطق انتشار: این گونه اولین‌بار از استان کرمانشاه گزارش شده بود و برای اولین‌بار از استان گیلان گزارش می‌شود (Kaprus et al., 2017; Shayanmehr et al., 2023).

جنس Orthonychiurus Stach, 1954

گونه Orthonychiurus stachianus (Bagnall, 1939)

اطلاعات جمع‌آوری: 10 نمونه از این گونه از پارک جنگلی ناژوان واقع در استان اصفهان (طول جغرافیایی ʺ3 ʹ37 °51 شرقی، عرض جغرافیایی ʺ14 ʹ38 °32 شمالی) در تاریخ 25/9/1400 و 8 گونه از سلانسر واقع در شهرستان رودبار استان گیلان (طول جغرافیایی ʺ7 ʹ22 °49 شرقی، عرض جغرافیایی ʺ47 ʹ1 °37 شمالی) در تاریخ 13/12/ 1396 جمع‌آوری شدند.

مناطق انتشار: گونه Orthonychiurus stachianus (Bagnall, 1939) قبلاً از استان‌های کرمانشاه، مازندران (بابل) و تهران گزارش شده بود و برای اولین‌بار از استان اصفهان و گیلان گزارش می‌شود (Shayanmehr et al., 2023).

جنس Protaphorura Absolon, 1901

گونه Protaphorura fimata (Gisin, 1952)

اطلاعات جمع‌آوری: 10 نمونه از این گونه از پارک جنگلی ناژوان واقع در استان اصفهان (طول جغرافیایی ʺ3 ʹ37 °51 شرقی، عرض جغرافیایی ʺ14 ʹ38 °32 شمالی) در تاریخ 25/9/1400 جمع‌آوری شدند.

مناطق انتشار: گونه Protaphorura fimata (Gisin, 1952) قبلاً از استان‌های مرکزی، گیلان، آذربایجان شرقی، آذربایجان غربی، زنجان، اصفهان، مازندران، تهران، کرمانشاه و لرستان گزارش شده بود (Shayanmehr et al., 2023).

گونه Protaphorura levantina (Christiansen, 1956)

اطلاعات جمع‌آوری: 10 نمونه از این گونه از جنگل کاج روستای اسکولک واقع در شهرستان رودبار استان گیلان (طول جغرافیایی ʺ58 ʹ34 °49 شرقی، عرض جغرافیایی ʺ45 ʹ0 °37 شمالی) در تاریخ 13/12/1396 و 11 گونه از جنگل کاج واقع در شهرستان رودبار استان گیلان (طول جغرافیایی ʺ59 ʹ25 °49 شرقی، عرض جغرافیایی ʺ10 ʹ49 °36 شمالی) در تاریخ 13/12/1396 جمع‌آوری شدند.

مناطق انتشار: این گونه اولین‌بار از استان کرمانشاه گزارش شده بود و برای اولین‌بار از استان گیلان گزارش می‌شود (Kahrarian et al., 2016; Shayanmehr et al., 2023).

گونه Protaphorura sakatoi (Yosii, 1966)

اطلاعات جمع‌آوری: 10 نمونه از این گونه از پارک جنگلی ناژوان واقع در استان اصفهان (طول جغرافیایی ʺ3 ʹ37 °51 شرقی، عرض جغرافیایی ʺ14 ʹ38 °32 شمالی) در تاریخ 25/9/1400 جمع‌آوری شدند.

مناطق انتشار: این گونه قبلاً از استان مازندران گزارش شده بود و برای اولین‌بار از استان اصفهان گزارش می‌شود (Yoosefi Lafooraki & Shayanmehr, 2015a; Shayanmehr et al., 2023).

جنس Thalassaphorura Bagnall, 1949

گونه Thalassaphorura encarpata (Denis, 1931)

اطلاعات جمع‌آوری: تنها یک نمونه از این گونه از شهر چوبر واقع در استان گیلان (طول جغرافیایی ʺ49 ʹ22 °49 شرقی، عرض جغرافیایی ʺ0 ʹ7 °37 شمالی) در تاریخ 14/12/1396، 2 گونه از امامزاده ابراهیم واقع در شهرستان شفت استان گیلان (طول جغرافیایی ʺ31 ʹ19 °49 شرقی، عرض جغرافیایی ʺ47 ʹ59 °36 شمالی) در تاریخ 14/12/1396 و 5 گونه از جاده ماسوله واقع در فومن استان گیلان (طول جغرافیایی ʺ23 ʹ9 °49 شرقی، عرض جغرافیایی ʺ51 ʹ10 °37 شمالی) در تاریخ 15/12/1396 جمع‌آوری شد.

مناطق انتشار: این گونه قبلاً از استان مازندران گزارش شده بود و برای اولین‌بار از استان گیلان گزارش می‌شود (Yoosefi Lafooraki & Shayanmehr, 2015a; Shayanmehr et al., 2023).

شناسایی مولکولی و فیلوژنی

در این پژوهش 8 توالی از ژن COI متعلق به خانواده Onychiuridae به دست آمد. این توالی‌ها مربوط به گونه‌های Heteraphorura kaprusi، H. cf. iranica و Protaphorura cf. sakatoi هستند که برای اولین‌بار و با شماره دسترسی‌های OR887479-OR887484 و OR887488-OR887489 در بانک ژن ثبت شدند.

درخت فیلوژنی خانواده Onychiuridae با استفاده از 8 توالی به‌دست‌آمده در پژوهش حاضر و 17 توالی استخراج‌شده از بانک ژن به روش اتصال همسایه با تکرار 10000 بوت استرپ رسم شد (شکل 1). در این درخت، گونه Ceratophysella gibbosa به‌عنوان برون‌گروه تعیین شد. توالی‌های استفاده‌شده از خانواده Onychiuridae در این مطالعه از جنس‌های Heteraphorura، Thalasaphorura، Proaphorura و Deuteraphorura هستند که وضعیت تک تباری این جنس‌ها در درخت فیلوژنی رسم‌شده براساس ژن COI مورد حمایت است. این درخت فیلوژنی به دو کلاد اصلی تقسیم شده است. کلاد شماره 1، شامل گونه‌های جنس Deuteraphorura است که به شکل خواهری نسبت به سایر جنس‌های این خانواده قرار گرفته است. مهم‌ترین تفاوت این جنس با جنس‌های دیگر این درخت فیلوژنی، عدم وجود خار انتهایی روی بند ششم شکم در این جنس است. در کلاد شماره 2، توالی‌های مربوط به جنس Protaphorura (کلاد 4) به شکل خواهری نسبت به توالی‌های مربوط به دو جنس Thalassaphorura و Heteraphorura (کلاد 3) قرار گرفته است. ویژگی مهمی که جنس Protaphorura را از دو جنس دیگر متمایز می‌کند، تبدیل‌شدن فورکا به یک تاخوردگی کوچک و منفرد است که در دو جنس دیگر دیده نمی‌شود. همچنین در این درخت فیلوژنی، ژن COI با بالاترین بوت‌استرپ (100 درصد) گونه‌های خانوده Onychiuridae را شناسایی کرد (Heteraphorura sp.، H. cf. iranica، Thalassaphorura biquatemata، Protaphorura cf. sakatoi، Protaphorura sp.، P. genheensis، Deuteraphorura gibbosa).

شکل 1- درخت فیلوژنی Neighbour Joining پادمان خانواده Onychiuridae از ایران و چند کشور دیگر مربوط به ژن COΙ؛ اعداد مشکی نشان‌دهندة میزان بوت‌استرپ (اعداد کمتر از 50 حذف شدند) است. نمونه‌های مربوط به ایران با فونت پررنگ مشخص شدند و سایر نمونه‌ها مربوط به بانک ژن هستند.

Figure 1- Neighbor Joining consensus tree generated from the COI gene. Bootstrap values more than 50% are given for appropriate clades; newly obtained sequences are in bold letters, others are from GenBank (NCBI).

• جمع‌بندی

در نتیجه بررسی فون پادمان خانواده Onychiuridae در استان‌های گیلان و اصفهان 4 جنس و 6 گونه جمع‌آوری شدند. گونه‌های Thalassaphorura encarpata (Denis, 1931)، Heteraphorura iranica Kaprus’ et al., 2017 و Protaphorura levantina (Christiansen, 1956) برای اولین‌بار از استان گیلان و گونه P. sakatoi (Yosii, 1966) برای اولین‌بار از استان اصفهان گزارش می‌شوند. در این پژوهش 8 توالی از خانواده Onychiuridae مربوط به ژن COI به دست آمد که متعلق به دو جنس Heteraphorura و Protaphorura هستند. توالی‌ها مربوط به گونه‌های Heteraphorura kaprusi، H. cf. iranica و Protaphorura cf. sakatoi برای اولین‌بار در بانک ژن ثبت شدند. در درخت فیلوژنی رسم‌شده براساس ژن COI برای خانواده Onychiuridae، وضعیت تک تباری جنس‌های Heteraphorura، Thalasaphorura، Proaphorura و Deuteraphorura حمایت شده است. همچنین ویژگی‌های شکل‌شناسی که در تمایز جنس‌های این خانواده استفاده می‌شود، ازجمله وجود یا عدم وجود خار انتهایی و تبدیل‌شدن فورکا به یک تاخوردگی کوچک و منفرد یا عدم وجود اثری از فورکا، براساس داده‌های مولکولی حاصل از ژن COI تأیید شده است. ژن COI به‌عنوان یک مارکر مولکولی به‌خوبی قادر به شناسایی گونه‌های خانواده Onychiuridae بوده است. پژوهش حاضر اولین مطالعه مولکولی خانواده Onychiuridae در ایران است. با توجه به اینکه از لحاظ مولکولی این خانواده در ایران شناخته‌شده نیست، لازم است در آینده مطالعات بیشتری با استفاده از توالی‌های ژن COI مربوط به گونه‌های دیگر این خانواده و همچنین ژن‌های دیگری انجام شود تا به درک بهتری از روابط بین گونه‌های این خانواده دست یابیم.

سپاسگزاری

این پژوهش بخشی از نتایج پایان‌نامه کارشناسی ارشد نویسنده اول در دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری است؛ بنابراین، نویسندگان مقاله به‌دلیل تأمین اعتبار انجام این پایان‌نامه سپاسگزاری و قدردانی می‌نمایند.