برآورد فاکتورهای ژنتیکی و پاسخ ارقام مختلف چغندرقند (Beta vulgaris L.) نسبت به دماهای پائین در مرحله رسیدگی

مقدمه
چغندرقند با نام علمی Beta vulgaris L. یکی از دوازده گیاه اصلی است که غذای مردم جهان را تأمین می‌کند. شکر یکی از عمده‌ترین و ارزان‌ترین مواد غذایی است که جایگاه خاصی در تغذیه انسان دارد و به عنوان سرچشمه انرژی و غذای خالص با جنبه‌های حیاتی محسوب می‌شود (Basati et al., 2003). همانند سایر گیاهان چغندرقند نیز در اثر تنش سرما دچار خسارت و کاهش عملکرد می‌شود. در آخر فصل رشد، سرمای شدید و یخبندان‌های طولانی مدت، سبب یخ زدن و از بین رفتن محصول می‌شود و تأثیر منفی بر کیفیت فرآوری چغندرقند دارد (Deihimfard et al., 2019; Barbier et al., 1982 ). 
به‌نژادی برای تحمل سرما می‌تواند به علّت محدودیت‌های مهم مربوط به شرایط مزرعه‌ای در طول ارزیابی صفت، محدود شود. در حقیقت، برنامه‌های به‌نژادی مزرعه‌ای به علّت تغییرات محیطی پیشرفت در انتخاب را محدود می‌کنند (Li et al., 2018)، اگر چه برنامه‌هایی که تحت شرایط کنترل شده در آزمایشگاه انجام می‌شوند، دارای معایبی هستند، این محدودیت را ندارند. به همین علّت اتاقک‌های سرد اغلب جهت انتخاب برای تحمل سرما و برای تلفیق ارزیابی‌های انجام شده در مزرعه استفاده می‌شوند (Revilla et al., 2016).
مثال‌های گسترده‌ای از کنترل ژنتیکی تحمل به سرما توسط (2005)Revilla et al.  گزارش شده است، که اشاره کردند تحمل در مراحل مختلف رشد تحت کنترل مجموعه‌های مختلف ژن هستند. از آنجا که مقاومت به دمای کم در گیاهان در بیشتر مواقع صفت بسیار پیچیده‌ای است، به‌نژادی توسط صفات فیزیولوژیکی به‌عنوان یک روش کارآمد برای جمع کردن مؤلفه‌های مختلف تحمل، در یک ژنوتیپ پیشنهاد شده است (Reynolds, & Langridge, 2016). در این زمینه، پژوهش کنترل ژنتیکی تحمل به سرما مبنایی برای اجرای برنامه‌های نوین به‌نژادی و بنابراین برای بهبود سازگاری گیاهان با محیط‌های سرد خواهند بود (Takeda & Matsuoka, 2008). وراثت‌پذیری مهمترین شاخص بویژه برای صفات کمی است که روند و میزان انتقال صفات از والدین به فرزندان را نشان می‌دهد به‌گونه‌ای که هر قدر مقدار آن زیادتر باشد، سهم واریانس ژنتیکی زیادتر و اصلاح آن صفت ساده تر خواهد بود (Sharma, 1998). بنابراین این شاخص نقش کلیدی در طراحی برنامه‌های به-نژادی دارد.
Nezami et al. (2011) نشان دادند ارقام برتر چغندرقند که مقاومت بیشتری نسبت به سرما و یخ‌زدگی داشتند، در تعداد، سطح و وزن خشک برگ و نیز قطر ریشه عملکرد بهتری داشتند. همچنین بیان داشتند که بین درصد بقاء و صفات ریخت شناسی اشاره شده همبستگی مثبت و معنی-داری وجود دارد که بیش‌ترین همبستگی بین درصد بقاء با تعداد برگ و طول ریشه مشاهده شد. در حالی که درجه حرارت مطلوب برای ذخیره‌سازی و توجه به عوامل مؤثر بر ذخیره‌سازی چغندرقند مهم است، امّا تعیین درجه حرارت بهینه برای ذخیره‌سازی دشوار است Wyse, 1978)). در پژوهش‌های مختلف به صفات مهمی مثل قندهای محلول (Nezami et al., 2011)، نشت الکترولیت (Bagheri et al., 2020; Hajmohammadnia Ghalibaf et al., 2010) و کارایی فتوسیستم ∏ (Maxwell & Johnson, 2000) و پرولین (Siosemardeh et al., 2012; Barzan et al., 2018) مرتبط با تحمل به سرما اشاره شده است. Nezami et al. (2011) نشان دادند در چغندرقند با کاهش دما و رفتن به سمت یخ‌زدگی محتوی کلروفیل کاهش می-یابد. در فلفل سبز توانستند قبل از مشاهده آثار ظاهری خسارت سرما توسط تغییرات فلورسانس کلروفیل تفاوت‌ها در اثر سرما را تشخیص دهند. بنابراین اندازه‌گیری فلورسانس کلروفیل یک روش سودمند جهت تشخیص زودهنگام و اندازه‌گیری کمّی تخریب سلولی ایجاد شده توسط دماهای پائین است (Maxwell & Johnson, 2000). 
گیاه به‌عنوان یک موجود زنده به طور همزمان تحت تأثیر متغیرهای مختلف قرار می‌گیرد، به همین علّت استفاده از تجزیه و تحلیل‌های چند متغیره برای شناسایی ژنوتیپ‌های برتر در برنامه‌های به‌نژادی نتایج معتبرتری در بر خواهد داشت (Li et al., 2018). تجزیه به عامل‌ها از جمله روش‌های آماری چند متغیره هستند که جهت بررسی روابط بین متغیرها و گروه‌بندی مشاهدات به‌کار می‌رود (Johnson, 1998). این روش به علّت برخورداری از مدل آماری بر سایر روش‌ها از جمله تجزیه به مولفه‌های اصلی ارجحیت دارد. 
با توجه به اینکه، زمان مناسب برای برداشت چغندرقند در مناطق سردسیر، آبان ماه و گاهی آذر ماه است، بنابراین احتمال وقوع تنش سرما و وارد آمدن خسارات بر محصول این گیاه امکان پذیر است (Khayamim & Taleghani, 2008). با وجود اهمیت تنش سرما و خسارات وارده به تولید چغندرقند، اطلاعات اندکی درباره تحمّل به سرمای ارقام رایج وجود دارد و پژوهش‌ها بیشتر در رابطه با جنبه‌های زراعی و فیزیولوژیکی سرما و یخ‌زدگی بر روی چغندرقند انجام شده، در این پژوهش واکنش ژنتیکی ارقام به تنش سرما و روابط ژنتیکی میان صفات مهم آنها در شرایط سرما در مرحله رسیدگی مورد بررسی قرار گرفت. 

مواد و روش‌ها
مواد گیاهی و شرایط آزمایش
این پژوهش در دانشکده کشاورزی دانشگاه یاسوج در شرایط کنترل شده گلخانه و اتاقک رشد اجرا شد. در پژوهش حاضر، ده رقم چغندرقند (شیرین، کرجی، راستاد، زرقان، پرشیا، SBSI-005، دروتی، آناکوندا، مراک، آنتیک) در معرض چهار سطح دمایی شامل (0، 5، 10، 25 (شاهد) درجه سانتی‌گراد) قرار گرفتند. آزمایش در هر کدام از سطوح دمایی به صورت کامل تصادفی در سه تکرار به اجرا درآمد. ابتدا بذور با هیپوکلریت سدیم 5/0 درصد به مدت پنج دقیقه ضدعفونی و تعداد هفت الی هشت عدد بذر از هر رقم در هر گلدان به ابعاد 35×45 سانتیمتر (به‌عنوان یک تکرار) که حاوی مخلوط خاک، ماسه و کود حیوانی به ترتیب به نسبت 1:1:2 بود، کشت شدند و آبیاری به مقدار مورد نیاز صورت پذیرفت و زمانی‌که گیاهچه‌ها استقرار کامل پیدا کردند، بوته‌ها طوری تنک شدند که در هر گلدان فقط یک بوته سالم و قوی وجود داشته باشد. دو هفته قبل از برداشت (مرحله رشد 39 بر اساس BBCH)، زمانی که برگ‌ها در حال قهوه‌ای شدن بودند گلدان‌ها برای اعمال تنش سرما درون اتاقک رشد با دمای مورد نظر (با توجه به سطوح حرارتی ذکر شده)، دوره نوری 12 ساعت شب / روز و شدت نوری 50 ±400 میکرومول فوتون بر مترمربع بر ثانیه قرار داده شدند. 

اندازه‌گیری صفات
پس از گذشت 10 روز سرما‌دهی، صفات ارتفاع بوته، وزن خشک اندام هوایی، ارتفاع طوقه، طول، قطر و وزن ریشه (غده) اندازه‌گیری شدند. همچنین عیار قند و صفات فیزیولوژیک به شرح زیر اندازه‌گیری شدند:
اندازه‌گیری محتوای قند: ابتدا ریشه به دقت شسته و سپس یک برش طولی روی ریشه انجام شد، به طوری‌که قطعه جدا شده شامل قسمت‌های انتها، وسط و طوقه ریشه باشد. سپس قسمت جدا شده به صورت خلالی رنده شد ( به وزن 28 گرم) و در 177 میلی‌لیتر استات سرب قلیائی رقیق ریخته شده و به مدت 45 دقیقه در حمام آب گرم قرار گرفت. در این مدت به طور مداوم به کمک همزن، هم زده شدند تا قند آن در محلول استات سرب قلیایی کاملاً آزاد شود. سپس نمونه مجدد هم زده شد و از کاغذ صافی عبور داده شد تا نمونه صاف شود (توجه شود نمونه باید کاملاً شفاف باشد). سپس عصاره‌ها را در فالکون ریخته و بلافاصله نمونه‌ها توسط دستگاه پلاریمتر (Saccharomat V, Schmidt + Haensch GmbH & Co. ) Germany خوانده شدند (Babaeei et al., 2013). 
همچنین وزن قند (SY) توسط رابطه SY= RY × SC محاسبه شد که در این رابطه RY وزن ریشه و SC عیار قند است.
بعد از اعمال تیمارهای حرارتی مقدار 5/0 گرم برگ تر از بوته‌های هر گلدان بلافاصله برداشت و در دمای 40- درجه سانتی‌گراد نگه‌داری شدند. جهت اندازه‌گیری محتوی پرولین و قندهای محلول، ابتدا عصاره الکلی از برگ‌ها تهیه شد.
 میزان پرولین و قندهای محلول به ترتیب با روش‌های Paquine & Lechasseur (1979) و  Irigoyen et al. (1992) اندازه گیری شدند. 
اندازه‌گیری محتوای پرولین: برای اندازه‌گیری پرولین ابتدا به تعداد تیمارها لوله آزمایشی درب دار به حجم حداقل 30 میلی‌لیتر تهیه شد. در مرحله بعد، 1 میلی‌لیتر از عصاره الکلی را به لوله‌های مذکور منتقل و 10 میلی‌لیتر آب دو بار تقطیر شده به آن اضافه شد. سپس 5 میلی‌لیتر نین‌هیدرین (به ازای هر نمونه 125/0 گرم نین‌هیدرین در 2 میلی‌لیتر اسید فسفریک 6 مولار و 3 میلی‌لیتر اسید استیک گلاسیال (9/99 %) حل شد و به مدت 16 ساعت توسط همزن مگنت دار به هم زده شد تا کاملاً حل شود) به نمونه‌ها اضافه شد و بعداز آن 5 میلی‌لیتر اسید استیک گلاسیال (9/99 %) به هر نمونه اضافه شد و نمونه‌ها به مدت 45 دقیقه داخل حمام آب جوش (بن‌ماری، 95 درجه سانتی‌گراد) قرار داده شدند. سپس نمونه-ها خارج شدند و در دمای محیط خنک شدند. بعد از آن، به هر نمونه 10 میلی‌لیتر بنزن اضافه و به شدت تکان داده شدند، تا پرولین وارد فاز بنزن شود. بعد از این مرحله، نمونه‌ها به مدت نیم ساعت به حالت سکون نگه‌داری و سپس میزان جذب نوری نمونه‌ها در طول موج 515 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Lambda ez 210 USA) خوانده شد.
اندازه‌گیری محتوای قندهای محلول: برای اندازه‌گیری قندهای محلول 1/0 میلی‌لیتر از عصاره الکلی هر نمونه داخل لوله آزمایش ریخته شد. سپس سه میلی‌لیتر آنترون تازه به آن اضافه و به مدت 10 دقیقه در حمام آب جوش قرار داده شد. پس از خنک شدن نمونه‌ها در محیط آزمایشگاه، میزان جذب نوری نمونه‌ها در طول موج 625 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Lambda ez 210 USA) خوانده شد. قبل از انجام مراحل فوق، استانداردهایی از گلوکز تهیه و کلیه مراحل مذکور روی آن‌ها نیز انجام شد. سپس منحنی کالیبراسیون با استاندارد گلوگز رسم و میزان قندهای محلول نمونه‌ها بر اساس میلی‌گرم در هر گرم وزن تر برگ محاسبه شد.
برای اندازه‌گیری فلورسانس کلروفیل، بعد از اعمال تیمار دمایی و قبل از برداشت نمونه‌های برگی، فاکتورهای میزان فلورسانس کلروفیل(Fo، Fm، Fv، Fv/Fm) نیز توسط دستگاه فلوری‌متر مدل(OS1-FL) خوانده شد. اندازه‌گیری میزان کلروفیل برگ‌ ارقام مختلف چغندرقند نیز با دستگاه اسپاد (SPAD-502 Readings Minolta, Japan) انجام گرفت. جهت میانگین سه برگ همسان در هر گلدان، به عنوان عدد اسپاد هر تیمار ثبت شدند. 
شدت تنش و شاخص تحمل به تنش نیز به کمک رابطه‌های زیر محاسبه شدند (Fernandez, 1992):
رابطه (1):
 (Stress Intensity)                        
رابطه (2): 
(Stress Tolerance Index)  
  و   به ترتیب میانگین کلیه ژنوتیپ‌ها برای صفات در شرایط شاهد و تنش سرما و Yp و Ys مقدار صفت هر ژنوتیپ در شرایط شاهد و تنش سرما است.

تجزیه‌های آماری
بعد از اندازه‌گیری صفات، ابتدا تجزیه مرکب انجام شد و مقایسه میانگین‌های آثار اصلی به روش LSD و بر همکنش‌ها بر اساس رویه LSmeans صورت گرفت. اجزاء واریانس، ضرایب تنوع ژنتیکی و فنوتیپی و وراثت‌پذیری عمومی صفات توسط امید ریاضی میانگین مربعات محاسبه شدند (Sharma, 1998). 
رابطه (3):
     
در این رابطه CVp و   به ترتیب ضریب تنوع فنوتیپی و واریانس فنوتیپی و   میانگین کل است.
رابطه (4):     
دراین رابطه CVg و   به ترتیب ضریب تنوع ژنوتیپی و واریانس ژنتیکی و   میانگین کل است. 
رابطه (5):     
در این رابطه   وراثت‌پذیری عمومی است.   و  به ترتیب واریانس ژنوتیپی و واریانس فنوتیپی هستند.
جهت محاسبه ضریب همبستگی ژنتیکی نیز از رابطه‌های زیر استفاده شد (Sharma, 1998).
رابطه (6):
    Rg(x,y)= COVg(x,y)/(Sx.Sy)

در رابطه فوق، COVg کوواریانس ژنتیکی دو صفت x و y و Sx و Sy انحراف معیار ژنتیکی دو صفت مذکور است. کوواریانس ژنتیکی دو صفت توسط اطلاعات حاصل از تجزیه واریانس چند متغیره طرح کامل تصادفی به کمک رابطه زیر محاسبه شد. 
رابطه (7):
COVg= (SSCPv/dfv – SSCPe/dfe)/r

در این رابطه، SSCPv از ماتریس مجموع حاصل ضرب‌های واریته (رقم) و SSCPe نیز از ماتریس مجموع مربعات حاصل ضرب‌های خطا بدست آمد. dfv، dfe و r به ترتیب درجه‌های آزادی رقم، خطا و تعداد تکرار است.
تجزیه به عامل‌ها به روش مؤلفه‌های اصلی انجام شد و به روش واریماکس دوران داده شدند، سپس مهمترین عامل-های اول تفسیر شدند. در مرحله بعد امتیاز عامل‌ها برای سه عامل اول محاسبه شدند و نمودار سه بعدی پراکنش ژنوتیپ-ها برای امتیاز سه عامل اول ترسیم شد. ژنوتیپ‌ها براساس قرار گرفتن در چهار ناحیه حاصل (نواحی A، B، C و D) از نظر تحمل به سرما گروه‌بندی شدند. از نرم افزارهای آماری SAS 9.1(SAS Institute, Cary NC)  و SPSS version 22 (IBM Corp., Armonk, N.Y., USA). جهت انجام تجزیه‌های آماری استفاده شد.

نتایج و بحث
نتایج حاصل از تجزیه واریانس (جدول 1) نشان دادند تأثیر دما برای کلیه صفات اندازه‌گیری شده، اثر ژنوتیپ برای تمام صفات به‌جز قطر ریشه، نشت الکترولیت و Fv/Fm و بر همکنش دما و رقم برای تمام صفات اندازه‌گیری شده به جز نشت الکترولیت معنی‌دار بودند. بنابراین ارقام مورد بررسی از لحاظ صفات اندازه‌گیری شده واکنش‌های متفاوتی نسبت به سطوح دمایی مورد بررسی داشتند. با توجه به نتایج حاصل جهت خلاصه نویسی سایر تجزیه‌های آماری بر روی مشاهدات سطح شاهد (دمای˚C25) و سطح تنش (صفر درجه سانتی‌گراد) صورت گرفت. 
بررسی میانگین‌ها (جدول 2) نشان دادند میانگین کلیه صفات ریخت شناسی اندازه‌گیری شده در حالت تنش نسبت به عدم تنش کاهش یافت. در شرایط سرما، انرژی متابولیکی کمتری در دسترس گیاهان زراعی است، جذب آب و عناصر غذایی توسط آن‌ها محدود می‌شود، بیوسنتز کمتری ایجاد می شود، آسیمیلاسون کاهش یافته و رشد متوقف می‌شود (Morris et al., 1990). میانگین ارتفاع اندام هوایی در حالت عدم تنش 2/40 سانتی‌متر و در حالت تنش 3/25 بود، که کاهش 37 درصدی را نسبت به حالت عدم تنش نشان می‌دهد. Reinsdorf et al (2013) نیز از ارتفاع و سن گیاه به‌عنوان یک معیار جهت بررسی تحمل به یخ‌زدگی استفاده کرده‌اند. گیاهان وقتی در دمای تنش سرما رشد می‌کنند ارتفاع کوتاهی ازخود نشان می‌دهند. علّت این پدیده را می-توان به کاهش میزان متابولیسم اولیه، کاهش فعالیت‌های آنزیمی و تغییرات هورمون‌هایی از جمله اسیدسالیسیلیک و اکسین‌ها نسبت داد (Shabala, 2012). مقایسه میانگین وزن ریشه در حالت تنش نسبت به عدم تنش سرما کاهش 35 درصدی را نشان می‌دهد. میانگین صفات وزن تر اندام هوایی، قطر ریشه، وزن خشک اندام هوایی، ارتفاع طوقه و طول ریشه به ترتیب 40، 17، 55، 15 و 9 درصد کاهش نسبت به حالت عدم تنش نشان دادند. در سایر گیاهان از جمله در لوبیا نیز کاهش این صفات در اثر سرما گزارش شده است (Amooaghaie & Shariat, 2014). میانگین نشت الکترولیت، شاخص کلروفیل (اسپد)، قندهای محلول و پرولین در سطح تنش نسبت به عدم تنش به ترتیب 40، 20، 27 و 58 درصد افزایش نشان داد. در مجموع، افزایش قندهای محلول در زمان تنش را می‌توان به علت توقف رشد یا سنتز این ترکیبات از مسیرهای غیرفتوسنتزی و همچنین تخریب قندهای نامحلول که سبب افزایش قندهای محلول می‌شود، بیان کرد (Ghorbanli & Niakan, 2005; Alavilli et al., 2023). محتوی قندهای محلول در برگ اکثرگیاهان به طور چشمگیری در شرایط تنش سرما افزایش می‌یابد (Shabala, 2012). با وجود افزایش میزان پرولین در اکثر گیاهان تحت تنش سرما، اما ارتباط آن با تحمل به سرما در همه گیاهان به اثبات نرسیده است (Wani & Herath, 2018). در زمان سرمادهی محتوای نسبی آب سلول‌های برگ کاهش و غلظت کلروفیل در سلول‌های برگ به تدریج افزایش می‌یابد. این روند می‌تواند ناشی از کند شدن رشد، کاهش تقسیم سلولی، کوچک‌تر شدن برگ‌ها و افزایش کلروفیل در واحد سطح باشد (Chen et al., 2006). 
بررسی میانگین صفات فلورسانس کلروفیل نیز نشان داد صفت Fv/Fm در حالت تنش نسبت به عدم تنش به ترتیب تغییر چندانی نداشت. Jalilian et al. (2009) کاهش حداکثر فلورسانس کلروفیل (Fm) و کارایی فتوسیستم II در ارقام بهاره چغندرقند را علّت افزایش شدت خسارت یخ-زدگی در گیاهان ذکر نمودند. در پژوهشی بر روی گیاه دارویی سرخارگل نشان داده شده که مقدار Fv/Fm در دمای 4- درجه سانتی‌گراد کاهش محسوسی نشان داده است (Asadi-Sanam et al., 2014). Habibi et al. (2017) در گندم کاهش نسبت Fv/Fm را در اثر سرما گزارش دادند. همچنین آنها اظهار داشتند با افزایش مؤثر سازوکارهای حفاظت نوری شامل فعالیت آنزیم کاتالاز و مقدار آنتوسیانین برگ‌ها فتوسیستم‌ها حفاظت می‌شوند و از کاهش Fv/Fm ممانعت می‌شود.
  
جدول 1- میانگین مربعات منابع تغییر برای صفات اندازه‌گیری شده در مرحله رسیدگی چغندر قند

.
Table 1. Mean squares of the source of variation for the measured traits at the maturity stage of sugar beet

Table 1. Continued

، * و ** به ترتیب غیرمعنی‌دار و معنی‌دار در سطوح پنج و یک درصد را نشان می‌دهند.ns
ns ,* and ** indicated not significant and significant at 5 and 1% probability levels, respectively.

 
کاهش Fv/Fm در شرایط تنش سرما می‌تواند از طرفی به علت تخریب و غیر فعالسازی پروتئین  D1مراکز واکنش فتوسیستم ∏ تحت تنش سرما و از سوی دیگر، آشفتگی در کلروپلاست و پدیده بازدارندگی نوری باشد (Asadi-Sanam et al., 2014). اختلال در فعالیت‌های غشای سلولی تحت تأثیر تنش سرما، سبب نشت الکترولیت‌ها از سلول شده و اندازه‌گیری نشت از بافت‌ها می‌تواند معیار قابل قبولی برای سنجش مقاومت به تنش سرما باشد. 
بررسی میانگین دو صفت مهم در چغندرقند شامل عیار قند و وزن قند نیز نشان دادند تحت تنش نسبت به حالت عدم تنش به میزان 18 درصد افزایش در میزان عیار را داشته است درصد بالای عیار قند بر اثر تنش را می‌توان به از دست دادن آب ریشه یا کوچک بودن ریشه در شرایط تنش نسبت داد در حالی‌که وزن قند در اثر سرما 20 درصد نسبت به عدم تنش سرما کاهش نشان داد که ناشی از کاهش شدید وزن ریشه در اثر تنش سرما است. در زمان تنش، عرضه هیدروکربن‌ها از برگ‌ها به ریشه به عنوان عامل اصلی تعیین کننده رشد ریشه محسوب می‌شود. زمانی‌که تنش میزان هیدروکربن‌ها را کاهش دهد، ناگزیر رشد ریشه کم می‌شود (Cook & Scott, 1993).
ضرایب تنوع فنوتیپی و ژنتیکی و وراثت‌پذیری مربوط به صفات اندازه‌گیری شده در 10 رقم مورد بررسی در جدول 2 آورده شده است. بیش‌ترین و کم‌ترین ضریب تنوع ژنوتیپی در شرایط تنش سرما به ترتیب مربوط به قندهای محلول کل (82/26) و Fv/Fm (09/0) و در شرایط عدم تنش سرما مربوط به پرولین (07/47) مشاهده شد. در بین صفات اندازه‌گیری شده در شرایط عدم تنش سرما صفات پرولین (02/54) و Fv/Fm (16/1) به ترتیب بیش‌ترین و کم‌ترین میزان ضریب تنوع فنوتیپی را به خود اختصاص دادند و در شرایط تنش سرما صفات پرولین (34/29) و Fv/Fm (46/0) به ترتیب بیش‌ترین و کم‌ترین مقدار ضریب تنوع فنوتیپی را دارا بودند. این موضوع نشان دهنده این است که دو صفت پرولین و قندهای محلول کل به ترتیب در شرایط عدم تنش و تنش از تنوع بالایی برخوردار بودند که نشان از تنوع بین واریته‌ها در مورد این صفات است. از ضرایب تنوع ژنتیکی و فنوتیپی برای تعیین وجود یا عدم وجود تنوع استفاده می‌شود. بنابراین، بر اساس نتایج Dwivedi et al. (2017)، ارزیابی تنوع بر تصمیم‌گیری در مورد اینکه اهداف و بهترین روش انتخاب کدام است کمک می‌کنند. همچنین این منابع ژنتیکی را می‌توان برای ارزیابی آلل‌های مطلوب موجود در مجموعه‌های ژرم‌پلاسم در نظر گرفت. مقایسه این ضرایب تأثیر عوامل محیطی را بر روی همه صفات نشان می‌دهد. در اینجا نیز در مورد همه صفات (بجز صفت قندهای محلول کل در شرایط تنش) ضریب تنوع فنوتیپی از ضریب تنوع ژنتیکی بیشتر بود که نشان دهنده تأثیر عوامل محیطی بر صفات مورد بررسی است.
بیش‌ترین میزان وراثت‌پذیری عمومی (جدول 2) برآورد شده مربوط به صفات قطر ریشه و نشت الکترولیت به ترتیب با میزان 48/56 و 64/52 بود و کم‌ترین میزان وراثت‌پذیری عمومی مربوط به شاخص کلروفیل (82/13) بود. اگر وارث پذیری صفتی بیشتر از 5/0 باشد، صفت دارای توارث پذیری بالا و اگر بین 2/0 تا 5/0 باشد، صفت دارای توارث پذیری متوسط و اگر کمتر از 2/0 باشد، صفت دارای وراثت پذیری پائینی است(Stansfield, 1991) . بر اساس نتایج مشاهده شده، دو صفت قطر ریشه و نشت الکترولیت از وراثت پذیری بالا و صفت شاخص کلروفیل از وراثت پذیری پائینی برخوردار بودند. همان‌طور که در جدول 2 نشان داده شد، اکثر صفات ریخت شناسی از وراثت‌پذیری کم تا متوسطی برخوردارند که می‌توان گفت این صفات توسط ژن‌های زیاد با اثرات کم که به شدت تحت تأثیر محیط قرار می‌گیرند، کنترل می‌شوند. بنابراین، با توجه به توارث‌پذیری پایین و متوسط، برای بهبود این صفات باید از روش‌های گزینش که براساس ژنوتیپ صورت می‌گیرد همراه با روش‌های به‌زراعی، استفاده کرد (Sharma, 1998).
 

جدول 2- میانگین، ضرایب تنوع ژنتیکی و فنوتیپی صفات اندازه‌گیری شده چغندرقند در شرایط صفر درجه و بدون تنش سرما (C˚25).

   Table 2. Average, genetic, and phenotypic variation coefficients of the measured traits under cold stress (0^°C) and  non-cold-stress (25 ^°C) conditions.

 
همبستگی‌های ژنوتیپی میان صفات مورد ارزیابی 

 همبستگی ژنوتیپی وزن ریشه با طول ریشه 98/0=rg، وزن ریشه با قطر ریشه97/0=rg، وزن ریشه با وزن قند 59/0=rg مثبت و معنی‌دار بودند (مشاهدات نشان داده نشده‌اند). همبستگی صفت عیار قند نیز با صفات وزن قند (88/0=rg) مثبت و معنی‌دار بود. همبستگی ژنوتیپی صفت وزن تر اندام هوایی نیز با صفات فیزیولوژیکی پرولین، نشت الکترولیت و قندهای محلول کل (40/0-) منفی و معنی‌دار بود و همچنین این رابطه منفی و معنی‌دار بین صفت ارتفاع اندام هوایی با نشت الکترولیت و پرولین برقرار بود. همبستگی ژنوتیپی مثبت و معنی‌داری (49/0=rg) بین صفات طول ریشه و عیار قند مشاهده شد. همبستگی مثبت و معنی‌داری بین طول ریشه و عیار قند گزارش شده و علت این امر را به بزرگ‌تر بودن سلول‌ها در حلقه‌های آوندی و در نتیجه تجمع بیشتر قند در ریشه‌های گرد نسبت دادند (Rajabi et al., 2002). در یک مقایسه همبستگی ژنتیکی صفات وزن قند و وزن ریشه با صفات فیزیولوژیکی قندهای محلول، نشت الکترولیت و پرولین در شرایط سرما به‌طور قابل ملاحظه‌ای نسبت به شاهد افزایش پیدا کرد که این نشان از نقش موثر این صفات در حفظ عملکرد چغندرقند در شرایط تنش سرما است. متناسب با پژوهش حاضر، (Campbell & Kern (1983 با بررسی صفات ریخت شناسی در 35 ژنوتیپ چغندرقند همبستگی منفی و معنی‌داری بین عملکرد ریشه و درصد قند (67/0-) مشاهده کردند. وجود این رابطه منفی بین وزن ریشه و درصد قند مانع از اصلاح همزمان عملکرد و درصد قند چغندرقند می‌شود (Campbell & Kern, 1983). با این وجود، هر دو صفت عملکرد ریشه و درصد قند بایستی در برنامه‌های اصلاحی چغندرقند مد نظر قرار گیرند، زیرا بهنژادگر دست کم سعی می‌کند سطح یکی از این دو صفت را به هنگام اصلاح صفت دیگر ثابت نگه دارد (Doney, 1988). Rajabi et al. (2002) نشان دادند همبستگی مثبت و معنی‌داری در چغندرقند بین صفات عملکرد ریشه و عملکرد قند وجود داشت. این پژوهشگران همبستگی مثبت و معنی‌داری بین وزن ریشه با قطر ریشه و ارتفاع طوقه گزارش کردند که نشان می‌دهد ریشه‌های بزرگ‌تر دارای قطر بزرگ‌تر و ارتفاع طوقه بلندتری هستند. به‌عبارت دیگرغده‌های دارای ارتفاع طوقه بلندتر، برای گزینش مناسب نیستند.Mohammadian et al. (2009)  در بررسی بر روی چغندرقند، نشان دادند همبستگی قسمت هوایی با صفات ریشه ذخیره‌ای منفی و معنی‌دار بود. یعنی هرچه مقدار نسبت اندام هوایی به ریشه ذخیره‌ای کمتر، میزان تولید شکر افزایش می‌یابد که این مشاهدات با نتایج پژوهش ما هم‌خوانی دارد. 

تجزیه به عامل‌ها  
نتایج تجزیه به عامل‌ها به روش مؤلفه‌های اصلی روی 11 صفت (در شرایط صفر درجه سانتی‌گراد) در جدول 3 ارائه شده است. همان‌طور که مشاهده می‌شود 6 عامل اول به ترتیب 17/29، 18/18، 82/13، 87/10، 5/9 و 3/5 درصد و در مجموع 86 درصد از تغییرات کل را نشان دادند. با مشاهده جدول 3 مشخص شد در عامل اول صفات وزن تر اندام هوایی و ارتفاع اندام هوایی در مقابل صفات ارتفاع طوقه و نشت الکترولیت در جهت عکس قرار داشتند. از آنجایی که ارتفاع و وزن تر اندام هوایی در مقابل صفات ارتفاع طوقه و نشت الکترولیت قرار گرفتند، بنابراین می‌توان این عامل را مرتبط با تحمل به سرمای ریخت شناسی نامگذاری کرد. این عامل به تنهایی 1/29 درصد از تنوع کل را توجیه نمود. در عامل دوم، شاخص‌های مقاومتی STI برای صفات وزن ریشه و عملکرد قند به‌طور مثبت و در مقابل صفت قطر ریشه در جهت عکس واقع شدند. بنابراین این عامل را نیز می‌توان مرتبط با تحمل به سرما دانست. 18/18 درصد از تغییرات کل داده‌ها توسط این عامل توجیه شد. در عامل سوم، دو صفت فیزیولوژیکی نشت الکترولیت و قندهای محلول هر دو در جهت مثبت قرار گرفتند. بنابراین این عامل را که 82/13 درصد تنوع را نشان داد، می‌توان مرتبط با حساسیت به سرما و عامل حساسیت فیزیولوژیکی دانست. در عامل چهارم، 87/10 درصد تغییرات را توجیه کرد که در این عامل نشت الکترولیت و عیار قند در جهت مقابل یکدیگر قرار گرفتند. به‌عبارت دیگر با افزایش این عامل میزان نشت الکترولیت کم و عیار قند زیاد می‌شود. در عامل پنجم که توانایی توجیه 5/9 درصد تغییرات را داشت، شاخص کلروفیل در جهت مثبت نقش اصلی را داشت. بنابراین، این عامل را می‌توان مرتبط با فتوسنتز دانست. عامل ششم که در آن کارایی فتوسیستم II در جهت مثبت قرار داشت توانست 6/5 درصد از تغییرات را توجیه کند.
نمودار سه بعدی حاصل از امتیاز 3 عامل اول برای 10 رقم مورد بررسی در شکل 1 ارائه شده است. برای شناسایی محل هر یک از ارقام نمودار به چهار ناحیه  A، B، C و D تقسیم شد که بر این اساس ناحیه A در صورتی که از نظر عامل اول مقدار بالایی داشته باشد. ناحیه مقاومت، با توجه به کم بودن فاکتور دوم ناحیه B مقاومت متوسط، ناحیه C نیز با توجه به زیاد بودن فاکتور سوم که همان حساسیت است از مقاومت متوسط و ناحیه D نیز حساسیت را نشان می‌دهد. رقم SBSI-005 که در ناحیه A واقع شده از لحاظ عوامل اول مقدار ناچیزی دارد، بنابراین با وجود اینکه از نظر عوامل دوم و سوم در شرایط مطلوبی برخوردار است، نمی‌توان آن را متحمل‌تر از سایر ارقام دانست. دو رقم پرشیا و آنتیک نیز در ناحیه B واقع شدند که می‌توان گفت که این ارقام نسبت به سایر ارقام متحمل‌تر بودند، اما زیرا از نظر عامل سوم مقدار بالایی نداشتند، در مجموع از مقاومت متوسطی برخوردار بودند. سایر ارقام نیز در ناحیه D قرار گرفتند که می‌توان گفت که نسبت به ارقام گفته شده در سایر نواحی از مقاومت کمتری برخوردار بوده و حساس‌تر هستند. در ناحیه C نیز هیچ رقمی واقع نشد. این روش برای گزینش ارقام متحمل به انواع تنش‌ها بکار رفته است (Fernandez, 1992; Bagheri et al., 2020). ژنوتیپ‌های منتخب در این پژوهش، همچنین می‌توانند جهت بررسی دقیق ژنتیکی، فیزیولوژیکی و مولکولی صفات تحمل به سرما توسط نشانگرهای DNA و سایر ابزارهای اومیک و نحوه کنترل ژنتیکی صفت و نواحی ژنومی درگیر در پاسخ به انتخاب، بکار گرفته شوند.
 

 
شکل1 - پراکنش ژنوتیپ‌ها بر اساس نمودار سه‌بعدی حاصل از امتیازهای سه عامل اول در دمای صفر درجه سانتی‌گراد. شماره ها ژنوتیپ‌ها را نشان می دهد. 1- کرجی ، 2- SBSI- 005، 3- شیرین ، 4- راستاد ، 5- آناکوندا،  6- دروتی ، 7- مراک، 8- آنتیک، 9- زرقان، 10- پرشیا

Figure 1. Scater three-dimensional plot of sugar beet genotypes based on the first three factors. Numbers show genotypes as: 1. Karaji, 2. SBSI- 005, 3. Shirin, 4. Rastad, 5. Anaconda, 6. Drothy, 7. Merac, 8. Antic, 9. Zarghan and 10. Persia.
 
در مقایسه با اعمال تنش سرما در مرحله رویشی (Jalilian et al., 2017)، به طور کلی می‌توان گفت که در این آزمایش ارتباط بین تحمل به سرما در مرحله رویشی و مرحله رسیدگی در بیشتر ارقام وجود دارد، اگر چه در برخی ارقام این رابطه وجود نداشت. به‌عنوان مثال در مرحله رویشی و نیز در مرحله رسیدگی رقم آنتیک تحمل به سرما نشان داد این تطابق در سایر ارقام بجز مراک و پرشیا مشاهده شدند. این نتیجه به انتخاب ارقام متحمل به سرما در مرحله اولیه رشد کمک می‌کند. به طورکلی صفات در مرحله رسیدگی در مقایسه با صفات در مرحله رویشی (Jalilian et al., 2017) کمتر تحت تاثیر سرما قرار گرفتند. صفات فیزیولوژیکی مثل پرولین، قندهای محلول و نشت الکترولیتی در هر دو مرحله بیشترین مقدار شدت تنش را نشان دادند. همچنین وزن خشک اندام هوایی در هر دو مرحله و وزن ریشه (غده) در مرحله رسیدگی هم شدت تنش زیادی داشتند. رقم پرشیا که در مرحله رسیدگی تحمّل بالایی نسبت به سرما داشت، از نظر صفات ارتفاع بوته، وزن خشک اندام هوایی، قطر ریشه (غده)، طول ریشه (غده) و وزن ریشه (غده) بالاترین مقادیر را داشت. در حالی که در ارقام حساس این صفات مقادیر کمّی داشتند. بنابراین می‌توان آنها را به‌عنوان معیار انتخاب برای تحمل به سرما در مرحله رسیدگی در نظر گرفت.
 

جدول 3 - بار عامل‌های دوران‌یافته و واریانس‌های جزء و تجمعی چهار عامل اول برای صفات اندازه‌گیری شده چغندرقند در دمای صفر درجه سانتی‌گراد

Table 3. Load of rotated factors by varimax method, component and cumulative variances for the first fourth factors related to the measured traits on sugar beet at cold stress (0°C) conditions.
       

 
نتیجه‌گیری
بر اساس نتایج این پژوهش، تنوع ژنتیکی بالایی برای صفات مربوط به تحمل سرما در چغندرقند مشاهده شد. علاوه بر این، روابط ژنتیکی بین صفات مهم چغندرقند در شرایط سرد نشان می دهد که می توان از برخی صفات در انتخاب غیرمستقیم برای بهبود تحمل به سرما در چغندرقند استفاده کرد. برخی از صفات بیش از 50 درصد وراثت‌پذیری داشتند که می‌توان آن را در برنامه‌های اصلاحی چغندرقند در نظر گرفت. برخی از ارقام تحمل به سرمای بالا نشان دادند و بین تحمل به سرما در مرحله رویشی و مرحله بلوغ رابطه وجود داشت. بنابراین می توان در مراحل اولیه رشد جهت به‌نژادی در راستای تحمل به سرما اقدام نمود.