مقدمه

پروبیوتیک[1] میکروارگانیسم‌های زنده‌ای هستند که در صورت مصرف به میزان کافی اثرات سودمندی بر سلامت میزبان خواهند داشت و غالباً از جنس باکتری‌های لاکتیک شامل لاکتوباسیلوس و بیفیدوباکتریوم و مخمر‌هایی مانند ساکارومایسس هستند و ازطریق مکانیسم‌های مختلفی همچون تولید مواد ضدمیکروبی، تولید مهارکننده‌های مختلف و رقابت با پاتوژن‌ها عمل می‌کنند (1). اثرات پروبیوتیک بر سلامت انسان عبارت‌اند از کاهش مقاومت لاکتوز، جلوگیری از بروز سرطان کولون، روده باریک، کبد و پستان، کاهش کلسترول خون و میزان جذب آن از روده (با تجزیه صفرا در روده)، کاهش فشار خون، بهبود و تقویت سیستم ایمنی و جلوگیری از عفونت‌ها، درمان و پیشگیری از اسهال حاد، کاهش التهابات روده‌ای، کاهش آلرژی غذایی یا اگزما در کودکان، بهبود جذب مواد معدنی و ویتامین‌ها، بهبود علایم نشانگان روده تحریک‌پذیر و کولیت، جلوگیری از رشد و تکثیر باکتری‌های مضر، درمان و پیشگیری ازعفونت‌های مخمری مهبل، اسهال مرتبط با مصرف آنتی‌بیوتیک‌ها، آفت دهان، پوسیدگی دندان‌ها، واژینیت و عفونت‌های جلدی قارچی، برفک، بهبود عمل گوارش و جذب مواد غذایی و کمک به ساخت پست بیوتیک‌هایی مانند انواع ویتامین‌های گروه کا (2).

در تحقیقات اخیر اعلام شده است محصولات پروبیوتیک به‌عنوان یک مکمل درمانی طبیعی و جایگزین مناسب برای برخی از آنتی‌بیوتیک‌ها در سال‌های اخیر بوده‌اند (3).

به نظر می‌رسد یافتن میکروارگانیسم مناسب و مهندسی ژنتیک یا پوشش‌دهی آنها می‌توانند راهکارهای مناسبی برای رفع آن ارائه کنند (4).

 ریزپوشانی[2] یک فناوری مهم صنعتی برای به دام‌انداختن مایعات، جامدات و گازها در کپسول‌های بسیار کوچک است که برای مثال، پروبیوتیک‌ها، توسط ترکیبات دیواره پوشش داده می‌شوند تا محتویات داخل کپسول با سرعتی کنترل‌شده یا در شرایط خاص آزاد شوند و در عین حال، قدرت عملکردی میکروب ریزپوشانی‌شده نیز حفظ شود (5). در این تکنیک، انواع طعم‌ها، اسانس‌ها، روغن‌ها، آنزیم‌ها، میکروارگانیسم‌ها و ... می‌توانند توسط ترکیبات بیوپلیمر مانند کربوهیدرات‌ها، پروتئین‌ها، چربی‌ها پوشش داده شوند (6). آلژینات‌های سدیم و پتاسیم [3] ازجمله مواد زیستی هستند که به‌دلیل سازگاری سلولی، سازگاری زیستی، زیست تخریب‌پذیری، خصوصیات انتقال رسوب‌دهی محلول [4]و چندکاربردی‌بودن شیمیایی که امکان تغییرات بیشتری را برای سازگارکردن خواص آن ممکن می‌کند، برای انتقال دارو بررسی شده‌اند. آلژینات یک هتروپلی‌ساکارید خطی است که متشکل از -D مانورونیک‌اسید و L- گلورونیک‌اسید است که در دیواره سلولی جلبک قهوه‌ای یافت می‌شود. وزن مولکولی آلژینات در محدوده ۹۲ تا ۱۷۷ کیلوگرم بر مول به همراه نسبت‌های مختلف G/M متفاوت است. آرایه‌های زنجیره براساس منبع استخراج و سن جلبک، منجر به تجاری‌سازی‌شدن بیش از ۲۷۷ نوع آلژینات شده‌اند. ویژگی اصلی آلژینات، توانایی آن در افزایش ویسکوزیته محلول‌های آبی است. تویین ۸۰[5] به‌عنوان امولسیفایر معمولاً به همراه آلژینات استفاده می‌شود و با اضافه‌کردن کلرید کلسیم امولسیون شکسته می‌شود و با عمل سانتریفیوژ میکروکپسول به دست می‌آید (7). در این تکنیک، موادی مانند کاراگینان[6]، صمغ خرنوب، آلژینات، کیتوزان و ژلاتین، سلولزاستات، ژلاتین و زانتان[7] استفاده می‌شوند. در این تکنیک، اندازه دانه‌ها در مقایسه با اکستروژن کوچک‌تر است که از این تکنیک برای ریزپوشانی باکتری‌های اسیدلاکتیک[8] استفاده می‌شود و با این تکنیک می‌توان لاکتوباسیلوس دلبروکی، لاکتوباسیلوس بولگاریکوس را ریزپوشانی کرد (8). افزون بر آن، کارایی تحویل دارو توسط آلژینات تحت‌شرایط نسبت G/M، وزن مولکولی، غلظت و اسیدیته محیط است (9). آنچه اهمیت دارد این است که ریزپوشانی باعث حفظ فعالیت‌های پروبیوتیکی دردستگاه گوارش و آزادسازی ایمن آنها در نقاط خاص بدن می‌شود (10). ریزپوشانی با استفاده از آلژینات و کاراگینان از قبل استفاده می‌شد (11).

لاکتوباسیلوس‌ها باسیل گرم مثبت با اندازه ده میکرون، بدون اسپور و عمدتاً غیرمتحرک هستند که ازطریق تخمیر قندها تولید انرژی می‌کنند که دست‌کم نیمی از فرآورده‌های آن اسید لاکتیک است. لاکتوباسیل‌ها با تولید ترکیباتی سبب مهار برخی از میکروارگانیسم‌های بیماری‌زا مانند سالمونلا، شیگلا و هلیکوباکتر می‌شوند (12). این ترکیبات، سبب افزایش پاسخ ایمنی و کاهش عدم‌تحمل لاکتوز در انسان می‌شوند (13). بهترین شرایط رشد لاکتوباسیلوس‌ها pH ~۵ تا ۵/۶ است و غلظت ۵ درصد کربن دی اکسید است. لاکتوباسیلوس‌ها در محیط تیوگلیکولات[9] از کوکسی به باسیل تغییر شکل می‌دهند. گونه تیپ لاکتو باسیلوس دلبروکی[10] که در جاهای مختلفی، از جمله دستگاه تناسلی پستانداران تا روی سطح فراورده‌های گیاهی وجود دارد، نمونه بارزی از شرایط رشد مناسب برای لاکتوباسیلوس است (14). در روش رنگ‌آمیزی آلبرت، دانه‌های متاکروماتیک به رنگ آبی تا قهوه‌ای و لاکتوباسیلوس به رنگ سبز مشاهده می‌شوند. نتیجه تست‌های کاتالاز و اکسیداز لاکتوباسیلوس‌ها نیز منفی است (15). قارچ‌ها به چهار شکل مخمری، شبه‌مخمری، ساپروفیتی و کلاه‌دار دیده می‌شوند. مخمر‌ها قارچ‌های تک‌سلولی‌اند که متعلق به زیرشاخه آسکومیکوتینا هستند و تعداد کمی از آنها بازیدیومیست هستند. ساکارومایسس سروزیه مهم‌ترین مخمر صنعتی است که شامل دو گونه مشهور ساکارومایسس سرویزیه و ساکارومایسس بولاردی است که به‌عنوان مکمل دارویی- غذایی کاربرد دارد. ساکارومایسس سرویزیه مهم‌ترین مخمر برای تولید نان است که فرایند تبدیل قند به الکل و کربن دی اکسید را انجام می‌دهد (16). قارچ‌ها به‌دلیل داشتن ترکیبات مختلف ازجمله ویتامین‌های A، K، C، B1، B2، B6، بیوتین، پانتوتنیک اسید[11] و نیاسین برای سلامتی انسان مفید هستند و در درمان بیماری‌ها نیز استفاده می‌شوند (15). قارچ کلاه‌دار خوراکی - دارویی ازجمله لنتینولا ادودس¹² متعلق به رده بازیدیومایست‌ها است و حاوی ترکیبات مهمی ازجمله پلی‌ساکاریدهای لنتینان است که اثرات پری بیوتیکی و ضد سرطانی دارد. این قارچ نخستین‌بار در سال ۱۹۷۰ به‌وسیله کیهارا بررسی و مطالعه شد و پلی‌ساکارید ضدتومور موجود در آن جداسازی و مطالعه شد (16). اثر ضد سلول‌های سرطانی ازطریق فعال‌کردن سیستم ایمنی میزبان است که این نقش را توسط سلول‌های ایمنی مانند سلول‌های T، سلول‌های کشـنده طبیعی و ماکروفاژها ایفا می‌کند. همچنین، این قارچ می‌تواند ایمنی میزبان را در برابر عفونت‌های باکتریایی افزایش دهد (17). محققان از حلال‌هایی مانند کلروفرم و اتیل استات برای استخراج ترکیبات آنتی‌بیوتیکی از قارچ شیتاکه علیه باکتری‌ها استفاده کرده‌اند (14). لنتیونین یک ترکیب ارگانوسولفو از قارچ لنتینولا ادودس[12] است که حلقوی است که اثرات مهاری این ترکیب علیه باکتری‌هایی مانند استافیلوکوکوس اورئوس[13]، باسیلوس سوبتیلیس[14] و اشریشیا کلی[15] اثبات شده‌اند. این قارچ اثراتی مانند تنظیم سطح گلوکز خون، محافظت از کبد، کاهش کلسترول، بالابرنده سطح ایمنی بدن، کاهش لیپوپروتئین‌های با چگالی بسیارکم و لیپوپروتئین‌های با چگالی بالا را نشان داده است و می‌تواند از افزایش فشار‌خون جلوگیری کند. همچنین، این قارچ خطر ابتلا به بیماری‌های قلبی عروقی را کاهش می‌دهد. این عملکرد به‌دلیل فعالیت آنتی‌اکسیدانی و تعدیل سیستم ایمنی اعمال‌شده توسط این دسته از مکمل‌های غذایی است. اریتادنین ترکیب لیپیدی است و لیپوپروتئین‌های سرم خون را نیز در حیوانات و انسان کاهش می‌دهد. طبق گفته ایزودا و همکاران، تجویز خوراکی این ترکیب مؤثر است و سمیّت کمی دارد؛ اما متأسفانه تنها ۱۰ درصد آن در دستگاه گوارش جذب می‌شود و به‌عنوان تزریق داخل وریدی، کاملاً بی‌اثر است؛ زیرا به‌سرعت از گردش خون توسط کلیه‌ها خارج و دفع می‌شود (18). پلی‌ساکاریدهای لنتینولا ادودس¹⁶ فعالیت‌های زیستی متنوعی از خود نشان می‌دهند که بیشترین مورد در ارتباط با فعالیت‌های ضد تومور و سیستم ایمنی بدن است و تعیین شده است که بخش‌های پلی‌ساکاریدی این قارچ قادر به مهار طیف گسترده‌ای از سلول‌های سرطان‌زا و همچنین، القا آپپتوز در سلول‌های تومور هستند (19) .بااین‌حال، عصاره این قارچ به‌همراه شیمی درمانی اثر تقویت‌کننده درمانی دارد (20, 21). در این مطالعه، به جداسازی و شناسایی میکروب‌ها از پساب کارخانجات لبنیات، بررسی خصوصیات پروبیوتیکی این میکروب‌ها و ریزپوشانی آنها با استفاده از پلی‌ساکارید قارچ خوراکی دارویی لنتینولا ادودس و آلژینات پرداخته شده است و تأثیر پری‌بیوتیکی آن بر روی میزان محافظت و عملکرد پری‌بیوتیک‌ها سنجیده شده است.

روش کار

نمونه‌برداری از پساب کارخانجات لبنیات

به‌منظور نمونه‌برداری براساس فرمول کوکران، ۲۰ نمونه از پساب کارخانجات لبنیات اطراف شهر تهران با حجم ثابت یک لیتر در فالکون‌هایcc  ۲۰ از خروجی حوض متعادل‌ساز انجام شد (۳ بار نمونه‌برداری). سپس در لوله‌هایcc  ۵، سانتریفیوژ و کشت داده شد (22).

کشت نمونه‌ها بر روی محیط‌های کشت اختصاصی

 برای جداسازی باکتری‌های لاکتیک، نمونه‌های لبنیات بر روی محیط MRS آگار کشت داده شدند و به‌مدت ۴۸ ساعت در دما ۳۷ درجه سانتی‌گراد درون جار بی‌هوازی قرار داده شدند و برای جداسازی مخمرها از محیط کشت پتیتودکستروز آگار استفاده شد و پلیت‌ها به‌مدت ۷۲ ساعت در دمای ۳۰ درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شدند.

شناسایی مورفولوژی، میکروسکوپی و بیوشیمیایی باکتری‌های لاکتیک

 رنگ، مورفولوژی، شکل و حالت کلنی و خصوصیات میکروسکوپی با رنگ‌آمیزی گرم بررسی و ثبت شدند. نمونه استاندارد لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس ۴۷۶۸ برای انجام آزمون‌هایی تأییدی ایزوله‌ها و تست‌های پروبیوتیکی در طول آزمایشات استفاده شد. برای هر ایزوله خالص‌سازی‌شده تست جذب و تخمیر قند، تست جذب ازت، تست کاتالازو و تست اکسیداز انجام شد.

شناسایی مورفولوژی، میکروسکوپی و بیوشیمیایی مخمر

رنگ، مورفولوژی، شکل و حالت کلنی بر روی محیط کشت پتیتودکستروز آگار و کروم آگار کاندیدا بررسی شدند. لام‌ها با استفاده از لاکتوفنل کاتن بلو رنگ‌آمیزی و مشاهده شدند (23). تست‌های تکمیلی جذب و تخمیر قندها، تست جذب ازت، تست تولید آسکواسپور و تست لوله زایا انجام شد. تمام تست‌ها برای استانداردسازی با سویه استاندارد ساکارومایسس سرویزیه ۵۵۱GITA انجام شدند.

انجام تست‌های تخمین خصوصیت پروبیوتیکی

برای انجام تست‌های ذیل از سوسپانسیون استاندارد مطابق نیم مک فارلند (جذب ۱/۰ تا ۰۸/۰ در طول موج نانومتر ۶۲۵ معادله ۱.۵ × CFU/ml ۸۱۰) استفاده شد. همه تست‌ها سه بار تکرار شدند و درنهایت، منحنی رشد ایزوله‌ها رسم شد.

تست آنتی‌بیوگرام

 برای انجام این تست از محیط مولرهینتون آگار استفاده شد و براساس استاندارد CLSI2021، میزان حساسیت و مقاومت سویه‌های باکتریایی و مخمری نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های استاندارد براساس قطر هاله عدم‌رشد اندازه گرفته شد. ایزوله‌هایی که حساسیت بیشتری نسبت به آنتی‌بیوتیک‌ها داشتند برای تست‌های بعدی انتخاب شدند. دیسک‌های فلوکونازول، کتوکونازول، نیستاتین و آمفوتریپسین  Bبرای سویه‌های مخمر و دیسک‌های تتراسایکلین، کلیندامایسین، جنتامایسین، کلرامفنیکل، استرپتومایسین و ونکومایسین برای سویه‌های باکتری استفاده شدند.

 بررسی مقاومت به حرارت

سوسپانسیون استاندارد ایزوله‌های مخمر و باکتریایی به محیط کشت سابورو دکستروز براث و MRS براث اضافه شد و در دماهای ۲۵، ۳۰، ۳۷ و ۴۲ درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شد. سپس در ساعت‌های ۰، ۲، ۴، ۶، ۸، ۱۰، ۱۲، ۲۴، ۴۸ و ۷۲ میزان رشد آن با دستگاه اسپکتروفوتومتر در طول موج nm۶۲۵ خوانش انجام شد.

بررسی مقاومت به شرایط اسیدی و قلیایی

سوسپانسیون استاندارد ایزوله‌های مخمر و باکتریایی به محیط کشت سابورو دکستروز براث و MRS براث اضافه شد. با استفاده از هیدروکلریک اسید ۱ نرمال و سدیم هیدروکسید، اسیدیته ۵/۱، ۲، ۳ و ۵ برای هر دو محیط تنظیم شد. محیط‌‌ها بعد از تنظیم اسیدیته، اتوکلاو شد و بعد از اتمام آن و خنک‌شدن محیط‌ها، سوسپانسیون استاندارد ایزوله‌های باکتریایی و مخمری به آن اضافه شد. سپس در ساعت‌های ۰، ۲، ۴، ۶، ۸، ۱۰، ۱۲، ۲۴، ۴۸ و ۷۲ با دستگاه اسپکتروفوتومتر در طول موج nm۶۲۵ خوانش انجام شد (24).

بررسی مقاومت به نمک‌های صفراوی

سوسپانسیون استاندارد ایزوله‌های مخمر و باکتریایی به محیط کشت سابورو دکستروز براث و MRS براث اضافه شد. نمک‌های صفراوی (سدیم کولات و سدیم دزوکسیکولات) به مقدار ۳/۰ درصد به هر دو محیط اضافه شدند. سپس محیط‌ها اتوکلاو شد و سوسپانسیون استاندارد ایزوله‌های باکتریایی و مخمری به آن اضافه شد. سپس در ساعت‌های ۰، ۲، ۴، ۶، ۸، ۱۰، ۱۲، ۲۴، ۴۸ و ۷۲ با دستگاه اسپکتروفوتومتر در طول موج nm۶۲۵ خوانش انجام شد (24).

شناسایی مولکولی

سویه‌های برتر از نظر خصوصیات نسبی پروبیوتیکی برای شناسایی مولکولی انتخاب شدند. ابتدا استخراج  DNAبا استفاده از کیت شرکت ژنیران انجام شد. برای اطمینان از صحت استخراجDNA  با استفاده از سیستم الکتروفورز افقی بر روی ژل آگارز ۱ درصد درون TBE (بافرتریس بوراتاتیدیوم بروماید) الکتروفورز شد. سپس با استفاده از دستگاه ژل داک صحت نمونه‌ ژن استخراج‌شده تأیید شد. پرایمرهای استفاده‌شده در این پژوهش (با استفاده نرم‌افزار ژن رانر و سایت NCBI) بر طبق مقالات و توسط شرکت ژنیران طراحی شدند که در جدول 1 نشان داده شده‌اند.

جدول 1. توالی نوکلئوتیدی طراحی‌شده برای شناسایی مولکولی برای مخمر و باکتری

Table 1. Nucleotide sequence designed for molecular identification for yeast and bacteria

سپس بر طبق برنامه دمایی جدول 2 الف وب  Taq 2x MASTER MIX (شرکت امپلیکون دانمارک) را اضافه و داخل دستگاه ترموسایکلر قرار داده می‌شود. همچنین در شکل 1 تصویر مربوط به ژل الکتروفورز جدایه باکتری (L3) و جدایه مخمری ( C6) نشان داده شده است.

جدول 2. برنامه زمان‌بندی PCR برای الف) مخمر ب) باکتری

Table 2. PCR schedule for a) yeast b) bacteria

شکل 1. ژل الکتروفورز جدایه باکتری (L3) و جدایه مخمری ( C6)

Figure 1. Gel electrophoresis of bacterial isolates (L3) and yeast isolates (C6)

استخراج پلی‌ساکاریدهای قارچ لنتینولا ادودس

قارچ لنتینولا ادودس از شرکت ایران زمین تهیه شد. سپس بر روی محیط پتینودکستروز آگار و پتیتودکستروز براث کشت انجام شد و به‌مدت ۱۴ روز در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد در دستگاه شیکر انکوباتور با سرعت ۱۱۰ دور در دقیقه گرماگزاری شد که در شکل 2 مشاهده می شود. پس از آن به‌منظور تهیه بیومس از فرآیند لیوفیلزاسیون به‌مدت ۲۴ ساعت در فشار ۶۵ بار در دمای ۶۰ درجه سانتی‌گراد و دمای ۳۰ درجه سانتی‌گراد استفاده شد. به‌منظور استخراج پلی‌ساکارید از روش فنل سوافوریک اسید استفاده شد و با استفاده از معرف سویج تعیین حجم شد. در شکل 2 ج تشکیل سه لایه مختلف (لایه رسوبی میانی حاوی پروتئین) در حین استخراج به نمایش گذاشته شده است (25). برای خالص‌سازی بیشتر پلی‌ساکارید استخراج‌شده از ستون کروماتوگرافی تعویض یونی دی اتیل آمینو اتیل سفادکس ۲۵–A استفاده شد. ستون با یک شیب خطی از محلول ۰ تا ۲/۰ مولار نمک طعام با جریانی با سرعت ۴۴/۰ میلی‌لیتر در دقیقه شسته شد و ذره‌های کوچک خروجی با میکروتیوپ به‌مقدار ۲ میلی‌لیتر در هر یک، جمع‌آوری و به‌منظور تعیین غلظت بررسی شدند (26) (شکل 2د). نهایتاً شناسایی ساختار پلی‌ساکارید استخراج‌شده با روش تبدیل فوری مادون قرمز از cm۱۴۰۰۰ تا cm۱۶۵۰ با قدرت تفکیک cm۱۱ ثبت و محل پیوندها بر روی پیک‌ها تعیین شد.

شکل 2.الف) و ب) میسلیوم قارچ بر روی محیط مایع و جامد PDA، ج) تشکیل سه لایه مختلف در حین استخراج، د) ستون کروماتوگرافی تعویض یونی دی اتیل آمینو اتیل سفادکس 25A

Figure 2. a) and b) mushroom mycelium on liquid and solid PDA media, c) formation of three different layers during extraction, d) diethylaminoethyl sephadex 25A ion exchange chromatography column

آماده‌سازی ترکیب ریزپوشانی‌کننده‌ آلژینات و پلی‌ساکارید‌های لنتینولا ادودس

جدایه‌های شناسایی‌شده شامل باکتری لاکتوباسیلوس برویس ۲۰-۱۲۳ و گونه مخمر کلایورومایسس لاکتیس ۶۸۳CBS  است که برای ریزپوشانی استفاده شدند و با گونه استاندارد مخمر ساکارومایسس سرویزیه ۵۵۱GITA و گونه استاندارد باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس ۴۷۶۸ مقایسه شدند.

پس از خالص‌سازی پلی‌ساکارید‌های لنتینولا ادودس، پودر آلژینات سدیم برای ریزپوشانی از شرکت سیگما - آلدریچ آمریکا تهیه شد. ابتدا ۳ گرم آلژینات سدیم (شرکت سیگما - آلدریچ آمریکا) و ۲ گرم پلی‌ساکاریدهای لنتینولا ادودس به‌آرامی به ۱۰۰ میلی‌لیتر آب‌مقطر اضافه شدند. پس از حل‌شدن در اتوکلاو استریل شدند. پس از آنکه محلول با محیط هم‌دما شد، محلول آلژینات با سوسپانسیون (۱/۰ درصد) میکروبی به‌مدت ۵ دقیقه مخلوط شد تا همگن شود. برای تشکیل امولسیون، مخلوط حاصل به ۲۵۰ میلی‌لیتر روغن زیتون حاوی ۲/۰ درصد امولسیفایر توئین ۸۰ (شرکت مرک، آلمان) ریخته شد. با استفاده از همزن مغناطیسی (سرعت rpm ۵۰۰) به‌مدت ۳۰ دقیقه امولسیون یکنواختی تشکیل شد. به‌منظور تشکیل کپسول‌ها به محلول مدنظر، کلرید‌کلسیم ۱/۰ مولار اضافه شد و پس از ۳۰ دقیقه که کپسول‌ها ته‌نشین شدند، به‌منظور جداسازی کپسول‌ها از سانتریفوژ (rpm1770) به‌مدت ۱۰ دقیقه استفاده شد. کپسول‌های جداشده با محلول آب پپتونه ۱/۰ درصد، شسته و در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.

 شمارش باکتری‌ها و مخمرهای به‌دام‌افتاده در کپسول

۱ گرم از کپسول‌های تهیه‌شده با ۹ میلی‌لیتر محلول ۱/۰ مولار استریل بافر فسفات به‌مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق هم‌زده شد تا کپسول‌ها به‌طور کامل حل و آزاد شوند. سپس باکتری‌ها در محیط MRS و مخمرها در محیط پتینودکستروز آگار کشت داده شدند. باکتری‌ها در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد و مخمرها در دمای ۳۰ درجه سانتی‌گراد به‌مدت ۴۸ ساعت گرمخانه‌گذاری شدند. شمارش باکتری‌ها در ۳ تکرار انجام شد.

بررسی شکل و اندازه‌ کپسول‌ها

شکل ذرات به‌وسیله میکروسکوپ نوری مدل (Motic BA300) با بزرگنمایی ۴۰ بررسی شد. برای تعیین اندازه ذرات از میکروسکوپ اینورت استفاده شد.

بررسی مقاومت به حرارت نمونه‌های ریزپوشانی

ابتدا از سوسپانسیون استاندارد ایزوله‌های مخمر و باکتریایی ریزپوشانی‌شده به محیط کشت سابورو دکستروز براث و MRS براث اضافه شد؛ به‌طوری‌که کدورت محیط بعد از اضافه‌شدن سوسپانسیون استاندارد برابر با نیم مک فارلند باشد. محیط کشت‌های مدنظر در دماهای ۲۵، ۳۰، ۳۷ و ۴۲ سانتی‌گراد گرماگذاری شد. سپس در ساعت‌های ۰، ۲، ۴، ۶، ۸، ۱۰، ۱۲، ۲۴، ۴۸ و ۷۲ با دستگاه اسپکتروفوتومتر در طول موج ۶۲۵ نانومتر خوانش انجام شد.

بررسی مقاومت به شرایط اسیدی و قلیایی نمونه‌های ریزپوشانی

برای انجام این تست، محیط کشت سابورو دکستروز براث و MRS براث ساخته شد. با استفاده از هیدروکلریک اسید ۱ نرمال و سدیم هیدروکسید، اسیدیته ۵/۱، ۲، ۳ و ۵ برای هر دو محیط تنظیم شد. محیط‌ها بعد از تنظیم اسیدیته، اتوکلاو شدند و بعد از اتمام آن و خنک‌شدن محیط‌ها، هر یک از ایزوله‌های باکتریایی و مخمری به آن اضافه شدند. سپس در ساعت‌های ۰، ۲، ۴، ۶، ۸، ۱۰، ۱۲، ۲۴، ۴۸ و ۷۲ با دستگاه اسپکتروفوتومتر در طول موج ۶۲۵ نانومتر خوانش انجام شد.

بررسی تولید اسیدلاکتیک (یک پست بیوتیک)

 برای سنجش لاکتات از کیت‌ آنزیمی تشخیصی، طبق رقت‌های موجود در دستورالعمل شرکت سازنده استفاده شد و در جذب نوری ۵۴۶ نانومتر و در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد نیز با گذشت زمان ارزیابی شدند. آنزیم لاکتات اکسیداز لاکتات را به پیروات و پراکسید هیدروژن در حضور پراکسیداز با ٤-آمینوآنتی‌پیرین و ترت - بوتیل هیدروپراکسید (TBh) واکنش داده و ترکیب قرمز‌رنگ چینونیمین تولید می‌شود. افزایش رنگ تولید‌شده با غلظت لاکتات موجود در نمونه متناسب است. نحوه محاسبه غلظت لاکتات از فرمول زیر به‌ دست می‌آید:

غلظت لاکتات = (تفاوت جذب نمونه) / (تفاوت جذب استاندارد) × غلظت استاندارد

لاکتات  × 0.11(mg/dl) = لاکتات (mmol/l)

آماده‌سازی نوشیدنی آب پرتقال، آب سیب و نوشیدنی کامبوچا

 آبمیوه‌های صنعتی پرتقال، آب سیب تجاری و طبیعی تهیه شدند و نوشیدنی طبیعی کامبوچا از آزمایشگاه قارچ‌شناسی دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال تهیه شد. سپس آنها با استفاده از شکر و آب از بریکس ۷۰ به بریکس ۱۲، رسانده و به‌مدت ۲۰ دقیقه در ۸۰ درجه سانتی‌گراد پاستوریزه شدند. روند تغییرات اسیدیته در طول مدت نگهداری آب میوه‌ها با پروبیوتیک توسط دستگاه سنجش اسیدیته اندازه‌گیری شد. میزان مواد جامد محلول در آب یا بریکس توسط دستگاه رفراکتومتر اندازه‌گیری شد. سپس نمونه‌های نوشیدنی از لحاظ طعم، عطر، بافت و رنگ به‌صورت مقایسه‌ای بررسی شدند. برای شست‌وشوی ذائقه و طعم بین نمونه‌ها از آب استفاده شد. براساس مقیاس هدونیک، 1 برای نمونه ضعیف و 10 برای نمونه عالی اختصاص داده شد.

نتایج

نتایج نمونه‌برداری، خالص‌سازی و مشاهده میکروسکوپی

پس از نمونه‌برداری و خالص‌سازی، ۱۰ جدایه‌ باکتری (L1-L10 ) و ۱۰ جدایه مخمری (C1-C10) جدا شدند که کشت خالص و شکل میکروسکوپی برخی از آنها در شکل 3 الف و ب مشاهده می‌شوند. همچنین، شکل میکروسکوپی مخمر (شکل 3ج) و جدایه باکتری (3د) با رنگ‌آمیزی گرم مشاهده می‌شوند. نتیجه مثبت تست آسکوسپور (شکل 3ذ) که در آن آسکواسپور به رنگ آبی مایل به سبز و سلول‌های زایا به رنگ قرمز مشاهده می‌شوند. همچنین، در شکل3ر نیز تشکیل لوله زایا در جدایه‌های کاندیدا آلبیکنس مشاهده می‌شود.

نتایج تست‌های بیوشیمیایی

تست‌های تخمیر قند، احیا نیترات، کاتالاز و اکسیداز برای جدایه‌های باکتری و قارچ انجام شدند.

نتایج تست آنتی‌بیوگرام جدایه‌ها در مقایسه با نتایج تست آنتی‌بیوگرام جدایه‌های انتخابی ریزپوشانی

اندازه قطر هاله‌ها در جدایه‌های قارچی و باکتریایی بررسی شد. جدایه L3 در برابر ونکومایسین بدون هاله عدم‌رشد، تتراسایکلین mm۲۰، استرپتومایسین بدون هاله، کلرامفنیکل mm۳۵ (حساس)، کلیندامایسین mm۳۰ (حساس) و جنتامایسین mm۹ (نیمه حساس) بود. در جدایه C6، قطر هاله کتوکونازول mm۳۵ (حساس)، آمفوتریسین B mm۹ (نیمه‌حساس)، نیستاتین mm۳۰ (حساس)، فلوکونازول mm۴۰ (حساس) و ایتراکونازول بدون هاله عدم‌رشد بود. در نمونه ریزپوشانی، اندازه قطر هاله‌ها در جدایه C6 قطرهاله کتوکونازول mm۳۷(حساس)، آمفوتریسین B mm۲۱ (حساس)، نیستاتین بدون هاله (مقاوم) و فلوکونازول بدون هاله (مقاوم) بود و نسبت به نمونه غیرریزپوشانی تغییر خاصی اتفاق نیفتاده است. در جدایه L3، قطر هاله ونکومایسین، استرپتومایسین، تتراسایکلین، جنتامایسین و کلیندامایسین هر 5 آنتی‌بیوتیک بدون هاله (مقاوم) بود که نمونه در وضعیت ریزپوشانی مقاوم شده بود. تست آنتی‌بیوگرام در شکل 4 مشاهده می‌شود.

شکل 3. الف) مورفولوژی بعضی از جدایه‌های باکتری و ب) قارچ جداشده از لبنیات، ج) مخمر به‌صورت میکروسکوپی با لنز 100، د) باکتری لاکتیک به‌صورت میکروسکوپی با لنز 100، ذ) تست مثبت آسکوسپور، ر) تست مثبت لوله زایا

Figure 3. a) Morphology of some isolates of web bacteria) fungus isolated from dairy, c) yeast microscopically with 100 lens, d) lactic bacteria microscopically with 100 lens, g) ascospore positive test, d) germ tube positive test

شکل 4. الف) تست آنتی‌بیوگرام نمونه L3 باکتری، ب) تست آنتی‌بیوگرام نمونه C6  مخمر (بالا) و نمونه‌های ریزپوشانی (پایین)، الف) نمونه ریزپوشانی L3 باکتری، ب) نمونه ریزپوشانی C6 مخمر

Figure 4. a) Antibiogram test of bacterial L3 sample, b) Antibiogram test of yeast C6 sample (top) and microencapsulation samples (bottom), a) bacterial L3 microencapsulation sample, b) yeast C6 microencapsulation sample

نتایج تست‌های پروبیوتیکی

منحنی رشد لاکتوباسیلوس استاندارد در محدوده دما، نمک صفراوی و اسیدیته رسم شد. نمونه استاندارد در ۵pH~ و دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد بهترین میزان رشد را داشت و در حضور نمک صفراوی کاهش چشمگیری در رشد ایجاد شد. جدایه L3 در ۵ pH~و دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد بهترین رشد را داشت و در حضور نمک صفراوی توانایی رشد داشت. این نمودارها با منحنی رشد جدایه باکتری برای مشخص‌کردن خصوصیات نسبی پروبیوتیک مقایسه شدند که در شکل 5 مشاهده می‌شوند.

شکل 5. منحنی رشد لاکتوباسیلوس استاندارد (بالا) و جدایه باکتری L3 ( پایین) در محدوده دما، نمک صفراوی و اسیدیته

Figure 5. The growth curve of Lactobacillus standard (top) and bacterial isolate L3 (bottom) in the range of temperature, bile salt and acidity

نمونه استاندارد مخمری در pH و دما‌های متفاوت در حضور نمک صفراوی با دستگاه اسپکتروفتومتر بررسی شد. نمونه استاندارد در ۵pH~ و دمای ۳۰ درجه سانتی‌گراد، ۲۵ درجه سانتی‌گراد که رشد نسبتاً نزدیکی به هم داشتند، بهترین رشد و سازگاری را نسبت به دما‌های دیگر داشت. رشد درحضور نمک صفراوی نشان داد سویه استاندارد مدنظر توانایی رشد با حضور این نمک را دارد. جدایه C6 در ۵pH~ بهترین رشد را داشت و همچنین، ۳pH~ رشد بهتری نسبت به ۲pH~، ۵/۱pH~ داشت و در دمای ۳۰ درجه سانتی‌گراد، ۲۵ درجه سانتی‌گراد که رشد نسبتاً نزدیکی به هم داشتند، بهترین رشد و سازگاری را نسبت به دما‌های دیگر داشت. رشد در حضور نمک صفراوی نشان داد جدایه C6 مدنظر توانایی رشد با حضور این نمک را دارد. نتایج در شکل 6 مشاهده می شوند.

شکل 6. منحنی رشد مخمر استاندارد (بالا) و جدایه مخمریC6  (پایین) در محدوده دما، نمک صفراوی و اسیدیته

Figure 6. The growth curve of standard yeast (top) and C6 yeast isolate (bottom) in the range of temperature, bile salt and acidity

نتایج شناسایی مولکولی

نتایج بلاست توالی در پایگاه داده NCBI نشان دادند ایزوله باکتری با درصد تشابه ۰۳/۹۴ درصد به‌عنوان لاکتوباسیلوس برویس[16] سویه ۲۰–۱۲۳ و ایزوله مخمر با درصد تشابه ۹۷ درصد به‌عنوان کلایورومایسس لاکتیس[17] سویه ۶۸۳CBS  شناسایی شدند. همچنین، درخت فیلوژنی این سویه‌ها با استفاده از روش ماکزیمم لایک لیهود رسم شد.

درخت فیلوژنتیکی با استفاده از نرم‌افزار مگا ۷ رسم شد .بوت استرپ باکتری و مخمری و فاصله تکاملی با استفاده از روش ماکزیمم لایک لیهود در نمونه باکتری ۰۲/۰ و در نمونه مخمری ۰۰۲/۰ محاسبه شده‌اند. براساس آنالیز توالی‌ها به‌صورت ۱۰ نوکلئوتیدی، گونه‌های زیر شناسایی شدند:

Lactobacillus brevis strain 123-20 (L3)

Lactobacillus acidophilus strain 4768 (standard)

شکل 7. درخت فیلوژنی جدایه باکتریL3  و مخمرC6  ( Maximum likelihood method )

Figure 7. Phylogeny tree of bacteria isolate L3 and yeast C6 (Maximum likelihood method)

با توجه به درخت فیلوژنتیکی رسم‌شده، طول شاخه‌های داخلی با توجه به مقیاس ۰۱/۰ بسیار کوتاه است. با توجه به جایگاه باکتری‌های جداشده در درخت فیلوژنتیکی، گونه‌های لاکتوباسیلوس برویس سویه ۲۰–۱۲۳ و لاکتوباسیلوس برویس سویه ۷۸۷۲ قرابت بیشتری نسبت به هم دارند و دارای جد مشترک هستند .پس از بلاست در سایت NCBI، گونه‌های مخمری جداشده از نوع:

Kluyveromyces lactis strain CBS 683(C6)

Saccharomyces cerevisiae strain GITA551(Standard)

جایگاه هر دو مخمر با رسم درخت فیلوژنتیکی مقایسه شد. با توجه به درخت فیلوژنتیکی رسم‌شده، طول شاخه‌های داخلی با توجه به مقیاس ۰۰۲/۰ بسیار کوتاه است. جایگاه مخمرهای جداشده در درخت فیلوژنتیکی، گونه‌های کلایورومایسس لاکتیس سویه ۶۸۳ و کلایورومایسس لاکتیس سویه 17S قرابت بیشتری نسبت به هم دارند و دارای جد مشترک هستند. نتایج در شکل 7 نشان داده شده‌اند.

نتایج ریزپوشانی نمونه‌های جداسازی‌شده

همان‌طور که در شکل 8 مشاهده می‌شود، نمونه ریزپوشانی بر روی محیط اختصاصی کشت داده شد و پس از ۴۸ ساعت کلنی‌ها رشد کرد و این نشان از زندمانی جدایه‌ها بود. در شکل 8، عکس میکروسکوپ اینورت نشان از تشکیل کپسول اطراف نمونه باکتریایی است.

شکل 8. نمونه‌های ریزپوشانی باکتری (بالا) روی محیط MRS و مخمر ( وسط) بر روی محیط YGCپس از گذشت 48 ساعت، الف) استاندارد باکتری و مخمر، ب) نمونه باکتریL3 و نمونه مخمر C6، ت) تصویر میکروسکوپ نوری از کپسول باکتری، ث) تصویر میکروسکوپ اینورت از کپسول باکتری لاکتوباسیلوس با بزرگنمایی ×۴۰

Figure 8. Bacteria (top) on MRS medium and yeast (middle) on YGC medium after 48 hours. Invert of Lactobacillus bacteria capsule with ×40 magnification

شکل 9. بررسی نمودار میزان رشد نمونه باکتری L3k (بالا) دردمای C° 37 و مخمر  C6k (پایین) ریزپوشانی در دمای C°30 در قیاس با نمونه استاندارد

Figure 9. Examining the graph of the growth rate of bacteria sample L3k (top) at 37°C and yeast C6k (bottom) microencapsulated at 30°C in comparison with the standard sample

نتایج رشد باکتری به‌دام‌افتاده در کپسول در مقایسه با نمونه استاندارد

همان‌طور که در شکل 9 نشان داده شده است، میزان رشد جدایه‌های باکتری و مخمری نسبت به سوش استاندارد تفاوت شایانی ندارد؛ اما جدایه‌ها در حالت ریزپوشانی رشد مناسب‌تری دارند.

شکل 10. نمودار مقاومت به اسید و حرارت و نمک صفراوی نمونه ریزپوشانی استاندارد باکتری (بالا) در قیاس با جدایه L3 (پایین)

Figure 10. Diagram of resistance to acid, heat, and bile salt of the standard microencapsulation sample of bacteria (top) in comparison with isolate L3 (bottom).

نتایج بررسی میزان رشد جدایه‌های باکتریایی و مخمری در شرایط ریزپوشانی در شرایط استاندارد

جدایه L3 ریزپوشانی در ۵pH~ در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد، بهترین رشد را پس از ۴۸ ساعت داشت و در حضور نمک صفراوی مقاومت نشان داد. نمونه ریزپوشانی L3 در مقایسه با جدایه L3 آزاد رشد کمتری داشت؛ اما بعد از گذشت ۴۸ ساعت از تست‌های پروبیوتیکی توانایی رشد خود را حفظ کرده بود که علت آن تشکیل لایه کپسول است. نتایج در شکل 10 مشاهده می شوند.

 نتایج رشد مخمر به دام‌افتاده در کپسول در مقایسه با نمونه استاندارد

جدایه مخمری و همچنین، نمونه استاندارد نسبت به صفرا در شرایط ریزپوشانی وآزاد مقاومت نشان دادند. ریزپوشانی تأثیر معنی‌داری بر روی میزان رشد در شرایط اسیدی و دما نداشت؛ بنابراین، همان‌طور که در نمودار  شکل 11 دیده می‌شود، بهترین میزان رشد در اسیدیته ۵ و حرارت ۳۰ درجه سانتی‌گراد اتفاق افتاد.

نتایج طیف‌سنجی تبدیل فوریه فروسرخ قارچ لنتینولا ادودس

شکل 12، نتایج طیف‌سنجی تبدیل فوریه فروسرخ استخراج پلی‌ساکاریدهای قارچ لنتینولا ادودس و همچنین، پیک‌هایی در نواحی cm^-1 ۳۴۵۸،  cm ^-1۲۰۸۴، cm^-1 ۱۶۳۳ و  cm^-1 ۶۹۵ را  نشان می‌دهد. پیک در ناحیه cm^-1 ۳۴۵۸ نشان‌دهنده‌ گروه‌های N-H کششی آمین‌های نوع اول است. پیک در نواحی  cm^-1۲۰۸۴ C=O  کششی اسید هالید است. پیک در ناحیه  cm^-1۶۹۵ نشان‌دهنده‌ گروه‌های C=C است. نتایج به‌دست‌آمده نشان دادند نمونه تولیدشده مطابقت فراوانی با نمونه‌های به‌دست‌آمده از سایر تحقیقات مربوط به طیف‌سنجی تبدیل فوریه فروسرخ داشت.

شکل 11. مقاومت به اسید و حرارت و نمک صفراوی نمونه ریزپوشانی استاندارد مخمری (بالا) در قیاس با جدایه C6k (پایین)

Figure 11. Resistance to acid, heat and bile salt standard yeast microencapsulation sample (top) in comparison with C6k isolate (bottom)

شکل 12. نتایج FTIR پلی‌ساکارید‌های قارچ لنتینولا ادودس

Figure 12. FTIR results of Lentinola edodes mushroom polysaccharides

شکل 13. میزان تولید اسیدلاکتیک در نمونه آزاد و ریزپوشانی باکتری و مخمر استاندارد در مقایسه با جدایه‌ها L3 و C6 با نرم‌افزار Graph pad

Figure 13. The amount of lactic acid production in the free sample of bacteria and standard yeast in comparison with isolates L3 and C6 with Graph pad software

نتایج تست اسیدلاکتیک

در شکل 13 L3 (تیمار حاوی باکتری پروبیوتیک آزاد لاکتوباسیلوس برویس)، L3k (تیمار حاوی باکتری پروبیوتیک ریزپوشانی‌شده لاکتوباسیلوس برویس با (آلژینات سدیم، پلی‌ساکارید‌های لنتینولا ادودس)، C6 (تیمار حاوی مخمر پروبیوتیک آزاد کلایورومایسس لاکتیس)،  C6k(تیمار حاوی مخمر پروبیوتیک ریزپوشانی‌شده کلایورومایسس لاکتیس با (آلژینات سدیم، پلی‌ساکارید‌های لنتینولا ادودس) می باشند. با توجه به شکل 13، میزان تولید اسید لاکتیک توسط لاکتوباسیلوس استاندارد ریزپوشانی و جدایه ریزپوشانی بیشترین تولید را داشت. مخمر ریزپوشانی نیز میزان تولید اسیدلاکتیک بیشتری داشت؛ اما اختلاف معنی‌داری در میزان تولید وجود نداشت. ریزپوشانی از تولید پست بیوتیک اسید لاکتیک ممانعت نکرده بود.

نتایج ماندگاری جدایه‌ها درآبمیوه‌ها

با توجه به نتایج شکل 14، مشاهده شد در آبمیوه صنعتی‌ پرتقال، تمامی تیمارهای حاوی باکتری و مخمر آزاد و ریزپوشانی‌شده با گذشت زمان اسیدیته کاهش یافتند (۰۵/۰>p). همچنین، نتایج مقایسه میانگین داده‌ها به روش دانکن نشان دادند بالاترین کاهش اسیدیته در تیمار حاوی باکتری (L3) و مخمر (C6) به‌صورت آزاد از ۴ به ۳.۶ پس از نگهداری طی‌ ۶۰ روز و همچنین، بیشترین کاهش اسیدیته در تیمارهای ریزپوشانی مربوط به تیمار C6k که از ۴ به ۳.۷۵ پس از نگهداری طی‌ ۶۰ روز در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد است. همچنین، در آبمیوه طبیعی پرتقال،‌ تمامی تیما‌رهای حاوی باکتری و مخمر آزاد و ریزپوشانی‌شده با گذشت زمان اسیدیته کاهش یافتند (۰۵/۰>p). همچنین، نتایج مقایسه میانگین داده‌ها به روش دانکن نشان دادند بالاترین کاهش اسیدیته در تیمار حاوی مخمر (C6) به‌صورت آزاد از ۴ به ۳.۵۶ پس از نگهداری طی‌ ۶۰ روز و همچنین، بیشترین کاهش اسیدیته در تیمارهای ریزپوشانی مربوط به تیمار C6k که از ۴ به ۳.۶۷ پس از نگهداری طی‌ ۶۰ روز در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد است. در آبمیوه صنعتی سیب‌، تمامی تیمارهای حاوی باکتری و مخمر آزاد و ریزپوشانی‌شده با گذشت زمان اسیدیته کاهش یافتند (۰۵/۰>p). همچنین، نتایج مقایسه میانگین داده‌ها به روش دانکن نشان دادند بالاترین کاهش اسیدیته در تیمار حاوی باکتری (L3) و مخمر (C6) به‌صورت آزاد از ۴.۱ به ۳.۸ پس از نگهداری طی‌ ۶۰ روز و همچنین، بیشترین کاهش اسیدیته در تیمارهای ریزپوشانی مربوط به تیمار C6k که از ۴.۱ به ۳.۸۵ پس از نگهداری طی‌ ۶۰ روز در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد است.

شکل 14. تغییرات pH تیمارهای مختلف در آبمیوه‌های مختلف در طول ۶۰ روز نگهداری در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد

Figure 14. Changes in pH of different treatments in different juices during 60 days of storage at 4°C

در آبمیوه طبیعی سیب،‌ تمامی تیمارهای حاوی باکتری و مخمر آزاد و ریزپوشانی‌شده با گذشت زمان اسیدیته کاهش یافتند (۰۵/۰>p). همچنین، نتایج مقایسه میانگین داده‌ها به روش دانکن نشان دادند بالاترین کاهش اسیدیته در تیمار حاوی مخمر (C6) به‌صورت آزاد از ۴.۵ به ۴ پس از نگهداری طی‌ ۶۰ روز و همچنین، بیشترین کاهش اسیدیته در تیمارهای ریزپوشانی مربوط به تیمار C6k که از ۴.۵ به ۴ پس از نگهداری طی‌ ۶۰ روز در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد است. در نوشیدنی طبیعی کامبوچا تمامی تیمارهای حاوی باکتری و مخمر آزاد و ریزپوشانی‌شده با گذشت زمان اسیدیته کاهش یافتند (۰۵/۰>p). همچنین، نتایج مقایسه میانگین داده‌ها به روش دانکن نشان دادند بالاترین کاهش اسیدیته در تیمار حاوی باکتری (L3) و مخمر (C6) به‌صورت آزاد از ۳.۵ به ۳.۲ پس از نگهداری طی‌ ۶۰ روز و همچنین، بیشترین کاهش اسیدیته در تیمارهای ریزپوشانی مربوط به تیمار C6k که از ۳.۵ به ۳.۲ پس از نگهداری طی‌ ۶۰ روز در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد است. دلیل کاهش اسیدیته در آب میوه‌ها می‌تواند ناشی از تولید اسید باشد.

شکل 15. تغییرات مواد جامد محلول تیمارهای مختلف در آبمیوه‌های مختلف در طول ۶۰ روز نگهداری در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد

Figure 15. Changes in soluble solids of different treatments in different juices during 60 days of storage at 4°C

نتایج تغییرات مواد جامد محلول

با توجه به شکل 15 نتایج تجزیه تحلیل آماری داده‌ها نشان دادند اثر تیمار و زمان و اثر متقابل تیمار و زمان بر میزان مواد جامد محلول معنی‌دار بودند (۰۵/۰>p) در مقایسه، تیمارهای ریزپوشانی‌شده نسبت به تیمارهای آزاد افزایش معنی‌داری داشتند. مقدار مواد جامد محلول در آبمیوه‌های صنعتی و طبیعی ریزپوشانی‌شده با باکتری (L3k) در پایان دوره نگهداری بریکس آبمیوه‌های صنعتی پرتقال و سیب به‌ترتیب ۶/۱۲، ۱۳ افزایش یافت. مقدار مواد جامد محلول در آبمیوه‌های صنعتی و طبیعی ریزپوشانی‌شده با مخمر (C6k) در پایان دوره نگهداری بریکس آبمیوه‌های صنعتی پرتقال و سیب به‌ترتیب ۴/۱۲، ۷/۱۲ افزایش یافت. مقدار مواد جامد محلول در نوشیدنی کامبوچا ریزپوشانی‌شده با باکتری (L3k) و مخمر (C6k) در پایان دوره نگهداری بریکس کاهش معنی‌داری داشت. علت افزایش مقدار مواد جامد محلول در نوشیدنی می‌تواند وجود ترکیبات قندی در این پروبیوتیک باشد.

شکل 16. ارزیابی حسی عطر تیمار آبمیوه‌های طبیعی و صنعتی در طول ۶۰ روز نگهداری در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد

Figure 16. Sensory evaluation of the aroma treatment of natural and industrial juices during 60 days of storage at 4 degrees Celsius

نتایج ارزیابی حسی عطر، طعم و بافت

ارزیابی حسی عطر در تیمارهای مختلف آبمیوه‌های صنعتی و طبیعی پروبیوتیک در مدت ۶۰ روز نگهداری در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد انجام شد. نتایج تجزیه‌وتحلیل آماری داده‌ها نشان دادند اثر زمان در تیمارهای L3k و C6k بر امتیاز عطر معنی‌دار بود. بالاترین امتیاز عطر بعد از نمونه کنترل مربوط به تیمار L3k + آبمیوه صنعتی سیب در روز ۱۰ بود. کمترین امتیاز عطر مربوط به تیمار L3 در روز ۶۰ نوشیدنی کامبوچا است. نتایج در شکل 16  نشان داده شده‌اند.

ارزیابی حسی طعم در تیمارهای آبمیوه صنعتی و طبیعی پروبیوتیک در مدت ۶۰ روز نگهداری در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد انجام شد. نتایج تجزیه‌وتحلیل آماری داده‌ها نشان دادند اثر زمان در تیمارهای L3k و C6k بر امتیاز طعم معنی‌دار بود. بالاترین امتیاز طعم بعد از نمونه کنترل مربوط L3k و C6k آبمیوه صنعتی پرتقال در روز ۱۰ بود. کمترین امتیاز طعم مربوط به تیمار  C6نوشیدنی کامبوچا در روز ۶۰ است. نتایج در شکل 17  نشان داده شده‌اند.

ارزیابی حسی بافت در تیمارهای آبمیوه صنعتی و طبیعی پروبیوتیک در مدت ۶۰ روز نگهداری در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد انجام شد. نتایج تجزیه‌وتحلیل آماری داده‌ها نشان دادند اثر زمان در تیمارهای L3k و C6k بر امتیاز طعم معنی‌دار بود. بالاترین امتیاز طعم بعد از نمونه کنترل مربوط L3k آبمیوه صنعتی پرتقال در روز ۶۰ بود. کمترین امتیاز طمع مربوط به تیمار  L3نوشیدنی کامبوچا در روز ۶۰ است. نتایج در شکل 18 نشان داده شده‌اند.

شکل 17. ارزیابی حسی طعم تیمار آبمیوه صنعتی پرتقال در طول ۶۰ روز نگهداری در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد

Figure 17. Sensory evaluation of the taste of industrial orange juice treatment during 60 days of storage at 4 degrees Celsius

شکل 18. ارزیابی حسی بافت تیمار آبمیوه صنعتی و طبیعی در طول ۶۰ روز نگهداری در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد

Figure 18. Sensory evaluation of industrial and natural juice treatment texture during 60 days of storage at 4 degrees Celsius

ارزیابی حسی رنگ در تیمارهای آبمیوه صنعتی و طبیعی پروبیوتیک در مدت ۶۰ روز نگهداری در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد انجام شد. نتایج تجزیه‌وتحلیل آماری داده‌ها نشان دادند اثر زمان در تیمارهای L3k و C6k بر امتیاز طعم معنی‌دار بود. بالاترین امتیاز رنگ بعد از نمونه کنترل مربوط L3k و C6k آبمیوه صنعتی پرتقال در روز ۶۰ بود. کمترین امتیاز طمع مربوط به تیمار L3 نوشیدنی کامبوچا در روز ۶۰ بود. در میان تمامی نمونه‌های تیمار حاوی L3 و C6 آزاد در آبمیوه‌های صنعتی، طبیعی و نوشیدنی، کامبوچا از کمترین مقبولیت برخوردار بود که به‌دلیل افزایش اسیدیته در اثر فعالیت باکتری و طعم ترش آن است. برای هر دو باکتری و مخمر، تیمارهای حاوی پروبیوتیک‌های ریزپوشینه از مقبولیت نسبی کمتری برخوردار بودند. علت این امر نیز مربوط به احساس زبانی ریزپوشینه‌ها در موقع مصرف آبمیوه است. نتایج در شکل 19 دیده می‌شوند.

شکل 19. ارزیابی حسی رنگ تیمار آبمیوه صنعتی و طبیعی در طول ۶۰ روز نگهداری در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد

Figure 19. Color sensory evaluation of industrial and natural fruit juice treatment during 60 days of storage at 4 degrees Celsius

بحث و نتیجه‌گیری

به نظر می‌رسد یافتن میکروارگانیسم مناسب از منابع لبنی، مهندسی ژنتیک و پوشش‌دهی آنها می‌تواند راهکار مناسبی برای ارائه پروبیوتیک‌ها به صنعت غذا باشد (4). مقاله حاضر، با مروری بر مکانیسم اثر پروبیوتیک و کاربردهای آن، به پیشرفت‌های اخیر در بهبود کارایی این میکروارگانیسم‌ها می‌پردازد. ریزپوشانی می‌تواند خصوصیات حسی محصولات غذایی و همچنین، تعداد و عملکرد پروبیوتیک‌ها را حفظ کند. در زیست‌فناوری غذایی، دامنه وسیعی از مواد هسته‌ای (انکپسولانت)، مواد تشکیل‌دهنده دیواره مواد ریزپوشانی‌کننده و تکنولوژی‌های مرتبط وجود دارد که امکان تولید ریزکپسول‌هایی با اندازه‌ها و اشکال و خصوصیات مورفولوژیکی مختلف را امکان پذیر می‌کند (6). ازطرفی، پروبیوتیک‌ها اثرات مفیدی بر میزبان دارند و متابولیت‌های پروبیوتیک مانند اسیدهای چرب با زنجیره کوتاه و اسید لاکتیک نیز نقش مهمی در سلامتی مصرف‌کننده ایفا می‌کنند. قارچ لنتینولا ادودس حاوی ترکیباتی است که به‌عنوان مکمل غذایی - دارویی مطرح است و ترکیبات پلی‌ساکاریدی آن به‌عنوان کپسول می‌توانند نقش نگهدارنده خصوصیات باکتری پروبیوتیک را داشته باشند و همچنین، به‌عنوان پری‌بیوتیک به بهبود عملکرد پروبیوتیک کمک شایانی کنند (17). محققان از حلّال‌هایی مانند کلروفرم و اتیل استات برای استخراج ترکیبات آنتی‌بیوتیکی از قارچ خشک‌شده شیتاکه علیه باکتری‌ها استفاده کرده‌اند (14).

در این تحقیق، ۲۰ نمونه‌ مختلف از پساب کارخانجات لبنیات براساس فرمول کوکران از مناطق مختلف تهران جداسازی شدند که تعداد دو جدایه (۱ جدایه مخمر و ۱ جدایه باکتری) از بین ۱۰ با توان نسبی پروبیوتیکی جدا شدند.

1. Arevalo و همکاران در سال ۲۰۱۷ در تحقیقی با توجه به اینکه باکتری‌ها تنها میکروب‌های پروبیوتیک نیستند به بررسی خواص پروبیوتیکی مخمرها و چگونگی استفاده از آنها در محصولات غذایی پرداختند (27). در تحقیق حاضر نیز هم راستا با تحقیق ذکرشده به جداسازی مخمر ساکارومایسس و کلایورومایسس لاکتیس پرداخته شد. عدالتیان و همکاران (۲۰۱۲) در مطالعه‌ای نشان دادند محیط MRS آگار برای باکتری‌های جنس لاکتوباسیلوس مناسب است و این جنس در این محیط غالب است (28). تعیین تحمل به اسیدیته برای ۲ سویه، با اسیدیته‌های مختلف در ساعت‌های مختلف انجام شد که نتایج گزارش شد‌ه‌اند. براساس درصد بقاء، جدایه‌ها مقاومت خوبی را دارا بودند. تحقیقات مشابه انجام‌شده برای انتخاب جدایه‌های مقاوم به اسید با استفاده از محتوی معده گزارش شده‌اند (29). یانگ یونگ و همکاران (۲۰۰۴) آب گوجه‌فرنگی پروبیوتیک توسط لاکتیک اسید باکتری‌ها تولید کردند. باکتری‌های پروبیوتیک شامل لاکتوباسیلوس‌ها بودند که به آب گوجه‌فرنگی پاستوریزه اضافه شدند و تخمیر انجام شد. آب گوجه‌فرنگی می‌تواند یک ماده خام مفید برای تخمیر باکتری‌های اسیدلاکتیک باشد و همچنین، به‌عنوان یک نوشیدنی پروبیوتیک از خانواده سبزیجات مورد توجه قرار گیرد (30).

 مقاومت جدایه‌ها به نمک‌های صفراوی بررسی شد. در دستگاه گوارشی انسان، میانگین غلظت نمک‌های صفراوی ۰/۳ درصد وزنی حجمی است و برای غربال سویه‌های مقاوم به صفرا بحرانی و کافی تلقی می‌شود. در این پژوهش، این غلظت برای ارزیابی قابلیت رشد ٤ سویه انتخاب‌شده در حضور نمک‌های صفراوی انتخاب شد. رشد کمتر سویه‌ها با نمک‌های صفراوی در نتایج براساس پیشنهاد ارائه‌شده توسط Chateau و همکاران (۱۹۹۴) و Guo و همکاران (۲۰۰۹) که گروه‌های متمایز را براساس تأخیر رشد و عدم‌رشد ایجادشده به‌وسیله نمک‌های صفراوی تشخیص داده بودند، تحلیل شد (31). جدایه‌های مطالعه حاضر در حضور نمک‌های صفراوی رشد کمتری داشتند. یافته‌های در آزمایش جدایه‌های انتخاب‌شده نسبت به نمک‌های صفراوی با یافته‌های موجود در مطالعات قبلی مطابقت داشتند. در خصوص سویه‌های آزمایش‌شده، رشد کمتر جدایه‌ها با نمک‌های صفراوی نسبت به کشت کنترل مشهود بود. تعیین تحمل به اسیدیته برای ۲ سویه، با اسیدیته‌های مختلف در ساعت‌های مختلف انجام شد که نتایج گزارش شده‌اند. براساس درصد بقاء، جدایه‌ها مقاومت خوبی داشتند. تحقیقات مشابه انجام‌شده توسط Conway  و همکاران نشان داد تحمل محیط اسیدی معده از ویژگی‌های میکروارگانیسم‌های پروبیوتیک است و برای اثبات پروبیوتیک‌بودن  سویه‌ها، مقاومت بالا در برابر نمک‌های صفراوی و حرارت، توانایی اتصال به سلول‌های مخاط روده‌ می‌تواند از مهم‌ترین خصوصیات پروبیوتیکی یک سویه باشد. در این مطالعه، بعد از یافتن شرایط بهینه ذکرشده در بالا، اسیدیته محیط معادل ۵/۵ و دما معادل 25 درجه سانتی‌گراد تعیین شد و محیط کشت پتیتودکستروز آگار و پتیتودکستروز براث برای آزمایشات بعدی، تهیه و بانک کشت میسلیوم قارچ لنتینولا ادودس تهیه شد و سپس استخراج پلی‌ساکارید با استفاده از روش استخراج آب گرم و رسوب‌گیری با اتانول از انجام شد. سپس خالص‌سازی با استفاده از ستون کروماتوگرافی تعویض یونی انجام شد. در مطالعه‌ای مشابه، Lee HH و همکاران با استفاده از روش استخراج آب گرم و رسوب به‌وسیله اتانول از میسلیوم و جسم بارده خارج لنتینولا ادودس استخراج پلی‌ساکارید را انجام دادند که نتایج حاکی بر مقدار بیشتر این پلی‌ساکارید در میسلیوم این قارچ بودند که با نتایج به‌دست‌آمده از تحقیقات در این مطالعه مطابقت دارند (32). محمودی در سال ۱۳۹۶ در مطالعه‌ای، الگوی مقاومت آنتی‌بیوتیکی - پروبیوتیکی را نشان داد. او بیان کرد حدود ۵۱ درصد باکتری‌ها به آنتی‌بیوتیک کوتریموکسازول مقاوم بودند. موثرترین آنتی‌بیوتیک، سیپروفلوکساسین با حساسیت ۸۲ درصد بود. لاکتوباسیل‌ها به غلظت بالای ونکومایسین مقاوم هستند.

در این مطالعه، سویه‌های لاکتوباسیل مقاوم به استرپتومایسین ونکومایسین و نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های تتراسایکلین، کلیندامایسین و کلرامفنیکل حساس و نسبت به آنتی‌بیوتیک جنتامایسین نیمه‌حساس بودند. سویه‌های مخمر به فلوکونازول، کتوکونازول و نیستاتین حساس‌اند و به ایتراکونازول مقاوم هستند. سویه‌های لاکتوباسیل ریزپوشانی مقاوم به استرپتومایسین، ونکومایسین، تتراسایکلین، کلیندامایسین بودند. سویه‌های ریزپوشانی کلایورومایسس به فلوکونازول و نیستاتین مقاوم‌اند و به کتوکونازول و آمفوتریسین B حساس‌ هستند. علت مقاومت آنتی‌بیوتیک‌های باکتری ریزپوشانی‌شده می‌تواند ناشی از لایه ریزپوشانی باشد که دور باکتری را گرفته است و باعث عدم‌تشکیل هاله می‌شود.

اضافه‌کردن پروبیوتیک به نوشیدنی‌ها به‌مراتب پیچیده‌تر از لبنیات است و این امر به‌دلیل محیط اسیدی شربت‌هاست که از محدوده تحمل‌پذیر این باکتری‌ها پایین‌تر است. فناوری ریزپوشانی می‌تواند تا حد زیادی در حل این مشکل موثر باشد که به‌طور موفقیت‌آمیزی در قالب شبکه‌ها و کپسول‌های مختلف در محافظت از سلول‌های باکتری از آثار مخرب محیط نوشیدنی به کار برده شده است. ریزپوشانی به‌وسیله پوشش اطراف باکتری‌های پروبیوتیک، آنها را از محیط نوشیدنی جدا نگه می‌دارد (33). در این مطالعه، تغییرات مقدار مواد جامد محلول محاسبه‌شده در آبمیوه‌های صنعتی و طبیعی پروبیوتیک در مدت ۶۰ روز نگهداری در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد انجام شد. بر طبق نتایج آماری اثر تیمار، زمان و اثر متقابل تیمار و زمان بر میزان مواد جامد محلول معنی‌دار بود (۰۵/۰>p). در مقایسه، تیمارهای ریزپوشانی‌شده نسبت به تیمارهای آزاد افزایش معنی‌داری داشتند. مقدار مواد جامد محلول در آبمیوه‌‌های صنعتی و طبیعی ریزپوشانی‌شده با باکتری (L3k) در پایان دوره نگهداری بریکس آبمیوه‌های صنعتی پرتقال و سیب به‌ترتیب ۶/۱۲، ۱۳ افزایش یافت. مقدار مواد جامد محلول در آبمیوه‌های صنعتی و طبیعی ریزپوشانی‌شده با مخمر (C6k) در پایان دوره نگهداری بریکس آبمیوه‌های صنعتی پرتقال و سیب به‌ترتیب ۴/۱۲، ۷/۱۲ افزایش یافت. مقدار مواد جامد محلول در نوشیدنی کامبوچا ریزپوشانی‌شده با باکتری (L3k) و مخمر (C6k) در پایان دوره نگهداری بریکس کاهش معنی‌داری داشت. علت افزایش مقدار مواد جامد محلول در نوشیدنی می‌تواند وجود ترکیبات قندی در این پروبیوتیک باشد. دینگ و شاه ( ۲۰۰۸) گزارش کردند بریکس نهایی آب پرتقال و آب سیب حاوی لاکتوباسیلوس آسیدوفیلوس ریزپوشانی‌شده در پایان ۴۹ روز نگهداری بالاتر از آب‌میوه‌های حاوی همین باکتری در حالت آزاد بود. تایتانا و همکاران (۲۰۱۵) نیز در آب سیب حاوی باکتری پلانتاروم گزارش کردند که مقدار مواد جامد محلول در طول ۲۸ روز نگهداری از بریکس ۷۹/۱۲ به ۰۴/۱۲ کاهش یافت که با نتایج این بررسی مطابقت داشت.

نتایج مشابهی در آب هویج با باکتری‌های پروبیوتیک آزاد و ریزپوشانی‌شده توسط نازارو و همکاران (۲۰۰۹) گزارش شده‌اند. در تحقیق دیگر توسط گندمی و همکاران (۲۰۱۶) گزارش شد که کاهش اسیدیته در آب سیب با باکتری آزاد لاکتوباسیلوس رامنوس GG بیشتر از باکتری ریزپوشانی‌شده با آلژینات کیتوزان و اینولین بود. نتایج این تحقیق با نتایج پژوهش دیمیتروفسکی و همکاران (۲۰۱۵) که منجر به «تولید نوشیدنی غیرلبنی حاوی پروبیوتیک» شده بود، همخوانی دارد (34). در این تحقیق، از لاکتوباسیلوس پلانتاروم به‌صورت ریزپوشانی در آب سیب استفاده شد. این باکتری به دو صورت بدون کپسول و دارای کپسول با آلژینات و در مقادیر مختلف اسیدیته تهیه شد. در طول مدت تخمیر، میزان قند، اسیدیته سنتیک رشد، تولید لاکتیک اسید و میزان زنده‌مانی در مدت نگهداری اندازه‌گیری شدند و بهترین نتایج در محدوده اسیدیته ۲/۴ به دست آمد و حداکثر تراکم سلولی بهCFU/mL  ۱۰^۹×۵/۲ رسید. همچنین، طبق نتایج به‌دست‌آمده، قابلیت زنده‌مانی باکتری‌ها در دمای ۷–۴ درجه سانتی‌گراد به کمک فرآیند ریزپوشانی بهبود یافته است. نتایج مطالعه حاضر نشان دادند ماندگاری ویژگی‌های حسی آبمیوه پرتقال، سیب نوشیدنی کامبوچا با استفاده از باکتری، آلژینات سدیم و پلی‌ساکارید و مخمرریزپوشانی‌شده نسبت به باکتری و مخمر آزاد بعد از گذشت ۶۰ روز نگهداری در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد حفظ شد و زنده‌مانی باکتری به‌صورت مطلوبی افزایش داشت و مشخص شد بهترین عملکرد را در محافظت از باکتری‌ها در کپسول با ترکیب باکتری لاکتوباسیلوس برویس سویه ۲۰–۱۲۳آلژینات سدیم و پلی‌ساکارید های لنتینولا ادودس در آبمیوه پرتقال و سیب داشت. مقدار اسیدیته از مسائل مهم در تولید یک فرآورده پروبیوتیکی است؛ زیرا اسیدیته در مدت زمان نگهداری محصول کاهش می‌یابد که نشان‌دهنده رشد پروبیوتیک است. تغییرات سایر فاکتورهای اندازه‌گیری‌شده ازقبیل کاهش بریکس و افزایش اسیدیته تأییدکننده تکثیر و فعالیت پروبیوتیک با محتوای قندی بالا را به اثبات رسانده‌اند. در این تحقیق مشخص شد که فرآیند ریزپوشانی باکتری و مخمر پروبیوتیک می‌تواند ازجمله راهکارهای افزایش زنده‌مانی این باکتری‌ها در محصولات غذایی باشد. ازطرفی، آلژینات مستخرج از جلبک و پلی‌ساکارید قارچ کلاهدار خوراکی - دارویی که از منابع مهم بیولوژیک هستند، می‌توانند انتخاب مناسبی برای این فرایند باشند. با توجه به اینکه هر دو پلی‌ساکارید سمی نیستند، زیست‌سازگار، در دسترس و بومی هستند و می‌توانند یک پوشش مناسب در اطراف میکروب مدنظر ایجاد کنند که روی ساختار میکروب تأثیر بد نداشته باشد و عملکرد میکروب‌ها را حفظ و تقویت کند. همچنین، پلی‌ساکارید قارچ می‌تواند خواص پری‌بیوتیکی داشته باشد و دیدگاه این تحقیق را محقق کند که ارائه یک محصول دو جانبه است. روش ریزپوشانی برای حفظ خصوصیات عملکردی میکروب پروبیوتیک بسیار مؤثر است. همچنین نقش پری‌بیوتیکی پلی‌ساکارید بسیار حائز اهمیت است که پس از مصرف آن توسط انسان باعث عملکرد بهینه میکروارگانیسم‌ها و تولید پست‌بیوتیک‌ها و ارتقای سلامت انسان می‌شود. با انجام تحقیقات بیشتر، می‌توان نوشیدنی‌های فراویژه و سودمند را تولید کرد که حاوی ترکیبات سودمند مانند مواد معدنی، ترکیبات آنتی‌اکسیدان، فیبرهای رژیمی و ویتامین‌ها باشد و به ارتقای سلامت انسان کمک کند.

تشکر

نویسندگان از کادر آزمایشگاه دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال تشکر می‌کنند. در این مطالعه هیچ‌گونه تضاد منافعی وجود ندارد.

[1] Probiotic

[2] Microencapsulationn

[3]Alginate

[4] Chemical Solution Deposition

[5] Tween80

[6] Caraginan

[7] Gelatinn and xanthan

[8] Latic acid

[9] Thioglycollate

[10] Lactobacillus delbrucki

[11] Pantothenic acid

[12] Lentinula edodes

[13] Staphylococcus aureus

[14] Bacillus subtilis

[15] Escherichia coli

[16] Lactobacillus brevis

[17] Kluyveromyces lactis