مطالعه اثر تنش شوری بر جذب فلزات سنگین توسط دو سویه سیانوباکتری خاکزی و آبزی Alborzia kermanshahica و Desmonostoc alborizicum

مقدمه

آلودگی منابع آب آشامیدنی با فلزات سنگین یکی از مهم‌ترین مسائل زیست‌محیطی و بهداشتی در جهان امروز است. روش‌های مختلفی برای حذف و بازیافت فلزات سنگین از آب پیشنهاد شده‌اند؛ ازجمله جذب، رسوب‌زدایی شیمیایی، اکسایش و کاهش شیمیایی، تبادل یونی و بازیابی ازطریق تبخیر. با این حال، این روش‌ها اغلب هزینه‌بر و نیازمند تجهیزات و مواد شیمیایی پیشرفته هستند که باعث شده است استفاده از روش‌های بیولوژیکی به‌عنوان جایگزینی مقرون‌به‌صرفه و سازگار با محیط زیست درخور توجه قرار گیرد (1).

در میان سیانوباکتری‌ها، گونه‌هایی که اگزوپلی‌ساکارید خارجی تولید می‌کنند، کاندیدای مناسبی برای حذف و بازیابی فلزات از آب آلوده هستند. آلودگی فلزی یک مشکل بزرگ است؛ به‌ویژه در مناطقی که درحال توسعه هستند و راه‌های معمول برخورد با آن خیلی پرهزینه است یا فقط مشکلات بیشتری ایجاد می‌کنند (2). به همین دلیل، استفاده از تکنیک‌های بیولوژیکی به‌عنوان یک روش زیست‌محیطی امن توصیه می‌شود. جذب بیولوژیکی فلزات به دو مرحله تقسیم می‌شود؛ جذب غیرفعال که عموماً جذب سریع در سطح سلول است و جذب فعال که وابسته به انرژی است (3). مواد پلیمری خارج سلولی این موجودات شامل ترکیبات پیچیده‌ای از بیوپلیمرها هستند که قادر به جذب یون‌های مثبت فلزات سنگین هستند. این بیوپلیمرها شامل پروتئین‌ها، پلی‌ساکاریدها، اسید یوورنیک و چربی‌ها هستند که ویژگی‌های فیزیولوژیکی، رئولوژیکی و شیمیایی منحصربه‌فردی دارند و به جذب مؤثر فلزات کمک می‌کنند (4).

چالش مهم این است که عوامل مهمی ازجمله پارامترهای فیزیکی مانند pH، دما، نور، هوادهی و شرایط کشت (میکسوتروفی/ هتروتروفی) بر تولید اگزوپلی‌ساکاریدها توسط سیانوباکتری‌ها تأثیرگزار هستند. سیانوباکتری‌ها، توانایی بالایی برای مقابله با شوری دارند؛ زیرا از استراتژی‌های متعددی برای سازگاری با این شرایط سخت استفاده می‌کنند؛ ازجمله تجمع اسمولیت‌های آلی مانند گلیسین بتائین، سوکروز، گلوکوزیل گلیسرول و ترهالوز برای محافظت در برابر تغییرات فشار اسمزی و شوری که این ترکیبات می‌توانند از تخریب آنزیم‌ها در شرایط شوری جلوگیری کنند (5) و سلول را در برابر تأثیرات مخرب نمک‌ها، مانند کاهش فعالیت سنتز CO₂ محافظت کنند (6). عوامل محیطی شامل فلزات سنگین، منابع (فسفات ـ نیتروژن و سولفات) هستند که هرکدام می‌توانند به‌طور مستقیم یا غیرمستقیم بر فرایند تولید اگزوپلی‌ساکاریدها تأثیر بگذارند و برای سازگاری با محیط‌های شور بررسی شوند. این شرایط محیطی در تولید اگزوپلی‌ساکاریدها توسط سیانوباکتری‌ها بهبود ایجاد می‌کند که می‌تواند در برنامه‌های کاربردی مختلف مانند تصفیه آب، تولید انرژی، فناوری‌های پزشکی و نقش حفاظتی سیانوباکتری استفاده شود (7) و علاوه بر آن، شرایط میکسوتروفی و هتروتروفی تولید اگزوپلی‌ساکاریدها را افزایش می‌دهد (8).

تحقیقات نشان داده است جذب فلز توسط سیانوباکتری‌های زنده و مرده تفاوت چندانی ندارد که این امر نشان می‌دهد متابولیسم سلولی در این فرایند نقش ندارد. جذب یون‌های فلزی توسط سیانوباکتری‌های کپسول‌دار به‌دلیل حضور گروه‌های کربوکسیل و هیدروکسیل در پلی‌ساکاریدهای کپسولی آنها است. این پلی‌ساکاریدها می‌توانند فلزاتی مانند مس، کادمیوم و روی را جذب کنند (9). پیش‌تیمار توده زنده سیانوباکتری‌ها با قلیا نیز منجر به افزایش ظرفیت جذب فلزات کروم، سرب و مس می‌شود و امکان استفاده مجدد از توده زنده پس از تجزیه فلزات فراهم می‌آید. برخی سیانوباکترها توانایی جذب فلزات بالایی دارند که این امر تولید زیست‌توده بالا را پراهمیت می‌کند (10). جذب فلز توسط سیانوباکتری‌ها به گونه و نوع خاص فلز بستگی دارد؛ برای مثال، نتایج مطالعات نشان داده‌اند پلی‌ساکاریدهای حاصل از سیانوباکتریوم سمی Microcystis توانایی بالایی در جذب فلزات دارد. این گونه ظرفیت بالایی در حذف فلزات از محیط‌های آبی دارد و تمایل بیشتری به جذب کادمیوم نسبت به نیکل و جذب آهن نسبت به مس نشان داده است. جذب فلزات توسط Microcystis به‌شدت وابسته به pH محیط است و این گونه تمایل بیشتری به جذب مس، نیکل و روی دارد (11).

-دو نوع متفاوت سویه سیانوباکتری استفاده شده‌اند. Alborzia kermanshahica، یک نوع سیانوباکتری تک‌سلولی است که از مزارع کشاورزی استان کرمانشاه جداسازی شد (12). سیانوباکتری Desmonostoc alborizicum از آب قنات در گرگان، استان مازندران شناسایی شده است (13). هدف از این مطالعه کشت دو سویه سیانوباکتری A. kermanshahica و D. alborizicum در محیط‌های حاوی نمک کلرید سدیم و سنجش میزان بیومس سلولی، پلی‌ساکاریدهای خارج سلولی و شناسایی ترکیبات فرار با استفاده از GC-MS و توانایی آنها را در حذف فلزات سنگین است.

کشت سویه‌های سیانوباکتری‌ها

کشت سویه‌های سیانوباکتریایی A. kermanshahica و D. alborizicum از مجموعه کشت سیانوباکتری‌های دانشگاه آزاد واحد علوم و تحقیقات هرباریوم البرز دریافت شد و در محیط‌های کشت مایع BG110 و Z8 به‌ترتیب کشت داده شدند. kermanshahica    A.متعلق به تیره Chroococcaceae و راسته Chroococcales است و D. alborizicum متعلق به تیره Nostocaceae و راسته Nostocales است. نمونه‌های خالص‌شده در اتاقک رشد با دمای 28 درجه سانتی‌گراد و روشنایی ممتد فلورسنت با شدت  μe/m²/s 300 به مدت 30 روز نگهداری شدند. بعد از کشت به مدت 30 روز، تلقیح از نمونه کشت مادر به محیط کشت‌های حاوی غلظت‌های مختلف نمک کلرید سدیم (5/0، 1 و 5/1 درصد)، انجام و یک محیط کشت نیز به‌عنوان کنترل استفاده شد. پس از آماده‌سازی و سترون‌سازی محیط کشت‌ها،pH  آنها به حدود 2/7 تنظیم شد و کشت‌ها به مدت 48 ساعت در دمای 28 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند (14).

اندازه‌گیری پارامترهای فیزیولوژیکی

تعیین وزن خشک

برای تعیین وزن خشک سلول، بیومس سلولی در زمان‌های 6، 12، 25 و 48 ساعت جمع‌آوری شد و بعد از فیلتراسیون ازطریق فیلتر نیترات سلولزی (45/0 میکرومتر) به مدت 2 ساعت در دمای 100 درجه سانتی‌گراد خشک شد (15, 16).

اندازه‌گیری اگزوپلی‌ساکاریدها

استخراج پلی‌ساکاریدهای خارج سلولی (EPS) با استفاده از روش نوروزی و همکاران در سال 2013 (16) انجام شد. کشت‌های 30 روزه برای جداسازی EPS استفاده شدند. سلول‌ها در دمای اتاق با سانتریفیوژ ´ g 10700 به مدت 10 دقیقه جدا شدند. بخش رویی در مرحله بعد برای جداسازی پلی‌ساکاریدهای محلول استفاده شد. رسوب حاصله با مقدار مناسبی از آب مقطر، به مدت 15 دقیقه در 100 درجه سانتی‌گراد جوشیده شد. محلول حاصل به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد و دوباره در 05/0 درصد TCA، حل و سپس در 100 درجه سانتی‌گراد به مدت 2 ساعت جوشیده شد. بعد از سردشدن محلول حاصل، مخلوط در ´ g 10700 به مدت 30 دقیقه سانتریفیوژ شد. بخش رویی شامل EPS، جدا و هم حجم آن، اتانول اضافه شد. مخلوط در 4 درجه سانتی‌گراد به‌صورت شبانه قرار گرفت و در ´ g 10700 به مدت 30 دقیقه دوباره سانتریفیوژ شد. رسوب حاصل، دوبار با اتانول 96 درصد، شسته و در ´ g 10700 به مدت 30 دقیقه سانتریفیوژ شد. رسوب نهایی در 1 میلی‌لیتر آب دوبار تقطیر، حل و در 4- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.

 اندازه‌گیری میزان کربوهیدرات و پروتئین

میزان کربوهیدرات‌ها به روش فنل / اسید سولفوریک و با استفاده از گلوکز به‌عنوان منبع استاندارد برحسب میلی‌گرم بر لیتر اندازه‌گیری شد. در این روش، 200 میکرولیتر از محلول پلی‌ساکاریدی با 200 میکرولیتر فنل و 1 میلی‌لیتر اسید سولفوریک، مخلوط و پس از 15 دقیقه در دمای 25 درجه سانتی‌گراد، میزان جذب نمونه‌ها در 490 نانومتر اندازه‌گیری شد (17) و اندازه‌گیری میزان پروتئین به روش lowry در طول موج 750 نانومتر با استفاده از بیوفتومتر اندازه‌گیری شد. نتایج از داده‌های سه تکرار به دست آمدند (18).

تخمین میزان حذف فلزات سنگین

برای تخمین میزان حذف فلزات سنگین، کیسه‌های دیالیز حاوی محیط کشت درون محلول 1/0 مولار HCL قرار گرفتند تا یون‌های فلزی باندشده با گروه‌های با بار منفی حذف شوند. سپس کشت‌ها با آب دیالیز شدند و 50 میلی‌لیتر از کشت‌های تیمارشده درون 490 میلی‌لیتر از محلول فلزی  (Cu(ii), Cr(iii), Ni(ii))با غلظت 001/0 گرم بر لیتر قرار گرفتند و به مدت 24 ساعت با چرخش مداوم در دمای 30 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. در پایان آزمایش، بیومس از محلول فلزی با سانتریفیوژ در ´ g 3000 برای 7 دقیقه جدا شد؛ این کار با فیلتراسیون با کاغذ واتمن 7/0 میکرومتری نیز انجام گرفت. محتوای نهایی فلزات در سوپرناتانت با جذب اتمی در طول موج 232 نانومتر برای مس، 9/359 نانومتر برای کروم و 7/324 نانومتر برای نیکل با استفاده از جذب اتمی، اندازه‌گیری و میزان حذف فلزات از محلول با تفاوت در غلظت فلز در قبل و بعد از تماس با کشت سیانوباکتری محاسبه شد. تمام آزمایشات سه بار انجام شدند و اطلاعات به‌صورت میانگین ± انحراف معیار ارزیابی شد. میزان حذف فلزات طبق معادله 1 به‌صورت میلی‌گرم حذف فلزات به‌ازای هر گرم وزن خشک بیان شد.

معادله 1:                         q (mg g^-1)= v (C1-C2) m^-1

V: حجم نمونه (در لیتر)، Ci: غلظت ابتدایی فلز و C2 غلظت نهایی فلز (میلی‌گرم بر لیتر)، m: مقدار وزن خشک (گرم)

وزن خشک بیومس نیز با فیلتراسیون کشت‌های دیالیزشده و خشک‌کردن فیلترها در 100 درجه سانتی‌گراد تعیین شد (19, 20).

 شناسایی ترکیبات فرار سویه A. kermanshahica

50 میلی‌لیتر از کشت حاوی سویه سیانوباکتری، سانتریفوژ و محلول متانولی با 2 مولار  HClبه مدت 4 ساعت در دمای 100 درجه سانتی‌گراد ترکیب شد. سپس محلول حاصل با سرعت rpm 8000 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شد. محلول رویی جمع‌آوری شد و به بالن، منتقل و به دستگاه روتاری وصل شد. پس از اتمام کار با روتاری، 2 میلی‌لیتر هگزان به محتویات داخل بالن، اضافه و سپس محتویات بالن از فیلتر PTEF با اندازه منافذ 45/0 میکرومتر داده شد. محلول حاصل دوباره با سرعت 8000 به مدت 10 دقیقه، سانتریفوژ و محلول رویی برای آنالیز با دستگاه GC-MS (مدل 8050-TQ شیمادزو ژاپن) جمع‌آوری شد (14).

 تجزیه و تحلیل آماری

 تجزیه و تحلیل داده‌ها با استفاده از آزمون واریانس یک‌طرفه (one-way anova) و آزمون تعقیبی چنددامنه‌ای دانکن با نرم‌افزار SPSS  نسخه 26 تحلیل شد. سطح معناداری 05/0 p ≤  در نظر گرفته شد.

نتایج

نتایج حاصل از مورفولوژی سویه سیانوباکتری A. kermanshahica

کشت هر دو سویه در محیط کشت‌های حاوی غلظت‌های مختلف نمک کلرید سدیم (5/0، 1 و 5/1 درصد) در شکل (1-a و b) نشان داده شده است. بعد از 48 ساعت از کشت، مورفولوژی سویه سیانوباکتری A. kermanshahica در غلظت‌های مختلف نمک کلرید سدیم (5/0، 1 و 5/1 درصد) در شکل (2-a، b، c، d، e، f و g) نشان داده شده است. در محیط کشت کنترل، سلول‌ها به‌صورت منفرد یا به‌صورت کلونی‌های 2 تا 4 سلولی دیده شدند که توسط یک غلاف ضخیم احاطه شده بودند و به‌مرور به شکل نیم‌کره و در مجموعه‌های 16-4 سلولی با غلاف نازک و بی‌رنگ مرتب شدند. رنگ سلول‌ها از زرد مایل به سبز تا سبز زیتونی متغیر بود و تقسیم سلولی به روش شکافت دوتایی انجام می‌شد که در شکل (2-d) مشخص است. در 5/0 درصد کلرید سدیم سلول‌ها به تجمعات 8 سلولی با غلاف تیره تبدیل شدند و در شکل (2-e) رنگ آنها کمی تیره‌تر شد؛ اما در غلظت 1 درصد کلرید سدیم تجمعات دو سلولی افزایش یافت، غلاف‌ها بی‌رنگ شدند و سلول‌ها به رنگ سبز لجنی مات درآمدند. تراکم سلولی به‌طور چشمگیری کاهش یافت و در شکل (2-f) رنگدانه‌های سلولی محو شدند. در محیط کشت‌های مایع، با افزایش کلرید سدیم تا 5/1 درصد، پس از 48 ساعت رنگ محیط از سبز زیتونی به زرد تغییر کرد در شکل (2-g) که نشان‌دهندة تخریب سلول‌ها و نشت رنگدانه‌ها به محیط کشت بود.

شکل 1. کشت دو سویه A. kermanshahica و D. alborizicum به مدت 30 روز به‌ترتیب در محیط کشت‌های 110 BG و Z8کشت شدند (a). کشت در محیط کشت‌هایی حاوی نمک کلرید سدیم در غلظت‌های مختلف نمک کلرید سدیم (5/0، 1 و 5/1 درصد) مشاهده می‌شوند (b).

Figure 1. Cultivation of strains A. kermanshahica and D. alborizicum for thirty days in BG110 and Z8 culture media, respectively (a). Cultures in media containing sodium chloride at different concentrations (0.5%, 1%, and 1.5%) are observed (b).

شکل 2. تصویر میکروسکوپ نوری سویه سیانوباکتری A. kermanshahica در محیط کشت‌های حاوی 5/0 درصد نمک (a)، 1 درصد نمک (b) 5/1 درصد نمک (c) مشاهده می‌شوند. تصویر میکروسکوپ نوری سویه A. kermanshahica در محیط کشت‌های کنترل (d)، 5/0 درصد نمک (e)، 1 درصد نمک (f) و 5/1 درصد نمک (g) مشاهده می‌شود.

Figure 2. Light microscopy images of the cyanobacterium strain A. kermanshahica in culture media containing 0.5% salt (a), 1% salt (b), and 1.5% salt (c) are shown. Light microscopy images of strain A. kermanshahica in control media (d), 0.5% salt (e), 1% salt (f), and 1.5% salt (g) are also observed.

نتایج حاصل از مورفولوژی سویه سیانوباکتری D. aborizicum

شکل 3 کشت سویه‌ سیانوباکتری D. alborizicum را در محیط حاوی نمک با غلظت‌های 5/0، 1 و 5/1 درصد در قسمت‌های (a)، (b) و (c) نشان می‌دهد. همان‌طور که در شکل مشاهده می‌شود، هورموگونیا با طول‌های مختلف غالب هستند. سلول‌های هورموگونیا که معمولاً کوچک‌تر و طویل‌تر از سلول‌های چهارگوش فیلامنت‌های رویشی هستند، درنهایت به هتروسیست تمایز می‌یابند و فیلامنت وارد مرحله رشد رویشی می‌شود که در شکل (3-d) مشخص است. آکینت‌ها به‌صورت سلول‌های متراکم و زنجیره‌وار مشاهده می‌شوند. در تنش شوری با غلظت 5/0 درصد تخریب کمتر بوده است و سلول‌ها سعی در حفظ حالت ریسه‌ای دارند؛ اما در برخی مناطق جدا می‌شوند و هتروسیست‌ها همچنان وجود دارند. تغییر رنگ محیط کشت تا قهوه‌ای مایل به قرمز با افزایش شوری مشهود است که به ترشح پیگمان‌های فرعی فتوسنتزی هیدروفیلیک مانند سایتونمین مرتبط است و در شکل (3-e) مشخص است و این نتایج حساسیت بالای این سویه به شوری را نشان می‌دهند. در غلظت‌های نمک 1 و 5/1 درصد، به‌ترتیب در شکل (3-f و g)، فیلامنت‌ها تخریب شده و سلول‌ها از درون تریکوم و ریسه خارج شده‌اند و به‌صورت منفرد یافت می‌شوند. این درهم‌گسیختگی ناشی از تنش شوری بوده است و موجب تخریب هتروسیست‌ها و قطعه‌قطعه‌شدن فیلامنت می‌شود.

شکل 3. کشت سویه سیانوباکتری D. alborizicum در محیط کشت‌های حاوی 5/0 درصد نمک (a)، 1 درصد نمک (b) و 5/1 درصد نمک (c) مشاهده می‌شوند. علاوه بر آن، مورفولوژی سویه‌های سیانوباکتری D. alborizicum در محیط کشت کنترل (d)، 5/0 درصد نمک (e)، 1 درصد نمک (f) و 5/1 درصد نمک (g) مشاهده می‌شود.

Figure 3. The cultivation of the cyanobacterium strain D. alborizicum in culture media containing 0.5% salt (a), 1% salt (b), and 1.5% salt (c) is shown. Additionally, the morphology of the cyanobacterium strain D. alborizicum in control media (d), 0.5% salt (e), 1% salt (f), and 1.5% salt (g) is observed.

نتایج حاصل از تعیین وزن خشک سلولی

در محیط کشت کنترل، تفاوت معناداری در وزن خشک سلولی تا 24 ساعت اول در کشت کنترل سویه  A. kermanshahica مشاهده نشد (شکل 4-a)؛ اما با گذشت زمان تا 48 ساعت، با افزایش معنادار، وزن خشک سلولی به‌طور چشمگیری افزایش یافت (شکل 4-b). محیط کشت‌های حاوی 5/0 درصد نمک کلرید سدیم A. kermanshahica بعد از 48 ساعت بیشترین میزان وزن خشک سلولی را داشتند (شکل 4-c). در محیط کشت‌های حاوی 1 درصد نمک کلرید سدیم، وزن خشک سلولی در هر دو سویه در شکل (4-e و f) پس از 48 ساعت به‌طور معناداری افزایش یافتند؛ اما در پایان 48 ساعت، میزان وزن خشک سلولی A. kermanshahica به‌طور معناداری بیشتر از D. alborizicum بود.

شکل 4. وزن خشک سلول A. kermanshahica (a، c، e، g) و D. alborizicum (b، d، f، h) در محیط کشت‌های با غلظت‌های مختلف نمک کلرید سدیم. بارهای عمودی نشان‌دهندة انحراف از میانگین داده‌های حاصل از سه تکرار هستند و حروف متفاوت نشان‌دهندة تفاوت معنادار در میزان وزن خشک سلول در زمان‌های مختلف‌اند.

Figure 4. Dry weight of cells A. kermanshahica (a, c, e, g) and D. alborizicum (b, d, f, h) in culture media with different concentrations of sodium chloride salt. Vertical bars indicate the deviation from the mean of data obtained from three replicates, and different letters represent significant differences in cell dry weight at different times.

شکل 5. محاسبه اگزوپلی‌ساکاریدهای A. kermanshahica (a، c، e، g) و D. alborizicum (b، d، f، h) در محیط کشت‌های با غلظت‌های مختلف نمک کلرید سدیم. بارهای عمودی نشان‌دهندة انحراف از میانگین داده‌های حاصل از سه تکرار هستند و حروف متفاوت نشان‌دهندة تفاوت معنادار در میزان اگزوپلی‌ساکاریدها در زمان‌های مختلف‌اند.

Figure 5. Quantification of exopolysaccharides in A. kermanshahica (a, c, e, g) and D. alborizicum (b, d, f, h) in culture media with different concentrations of sodium chloride. Vertical bars indicate the deviation from the mean of data obtained from three replicates, and different letters represent significant differences in exopolysaccharide levels at different times.

شکل 6. محاسبه پروتئین‌های A. kermanshahica (a، c، e، g) و D. alborizicum (b، d، f، h) در محیط کشت‌های با غلظت‌های مختلف نمک کلرید سدیم. بارهای عمودی نشان‌دهندة انحراف از میانگین داده‌های حاصل از سه تکرار هستند و حروف متفاوت نشان‌دهندة تفاوت معنادار در میزان پروتئین در زمان‌های مختلف‌اند.

Figure 6. Quantification of proteins in A. kermanshahica (a, c, e, g) and D. alborizicum (b, d, f, h) in culture media with different concentrations of sodium chloride. Vertical bars indicate the deviation from the mean of data obtained from three replicates, and different letters represent significant differences in protein levels at different times.

نتایج حاصل از میزان پلی‌ساکاریدهای خارج سلولی (EPS)

بیشترین میزان اگزوپلی‌ساکارید را سویه  A. kermanshahica در 48 ساعت کشت در محیط کشت کنترل داشت. میزان تولید اگزوپلی‌ساکاریدها با افزایش معناداری به‌سرعت افزایش یافتند (شکل 5- a، b). در مقابل، D. alborizicum حساسیت نشان داد و میزان اگزوپلی‌ساکاریدهای آن به‌طور معناداری کاهش یافت. محیط کشت‌های حاوی 1 درصد نمک کلرید سدیم، A. kermanshahica در 24 ساعت اول بیشترین میزان اگزوپلی‌ساکارید را در شکل (5-e) تولید کرد. سپس میزان آن به‌طور معناداری کاهش یافت و در سویه D. alborizicum، در شکل (5-f) میزان اگزوپلی‌ساکاریدها کمتر از A. kermanshahica بود؛ اما به‌طور معناداری در طول 48 ساعت افزایش یافت.

نتایج حاصل از محاسبه میزان پروتئین

بیشترین میزان پروتئین در 48 ساعت کشت را سویه A. kermanshahica داشت. میزان پروتئین‌ها با گذشت زمان به میزان 3/0 برابر نسبت به کنترل افزایش معناداری یافت (شکل 6- a، b). در محیط کشت‌های حاوی 5/0 درصد نمک کلرید سدیم، سویه تک‌سلولی A. kermanshahica در ابتدای کشت بیشترین میزان پروتئین را داشت؛ اما با گذر زمان، میزان پروتئین با افزایش معناداری کاهش یافت. در مقایسه با محیط کشت کنترل، کاهش معناداری در میزان پروتئین در هر دو سویه A. kermanshahica و D. alborizicum به‌ترتیب در شکل (6 -c و d) تا انتهای دوره کشت نشان داده شد. در محیط کشت حاوی غلظت 1 درصد نمک کلرید سدیم، سویه A. kermanshahica در ابتدای کشت دارای بیشترین میزان پروتئین بود و با گذشت زمان، این میزان به‌طور معناداری کاهش یافت. هر دو سویه A. kermanshahica و D. alborizicum به‌ترتیب در شکل (6 -e و f) نسبت به محیط کشت کنترل، در طول دوره کشت، کاهش معناداری در میزان پروتئین داشتند.

 نتایج حاصل از تخمین میزان حذف فلزات سنگین

میزان حذف فلز کروم در محیط کشت کنترل در 10 دقیقه اول، توسط A. kermanshahica  (155 میلی‌گرم حذف فلزات به‌ازای هر گرم وزن خشک) در شکل (7-a) به‌طور معناداری بیشتر از D. alborizicum در شکل (7-b) بود. در محیط کشت با غلظت 5/0 درصد نمک در 10 دقیقه اول، میزان حذف کروم توسط A. kermanshahica (100 میلی‌گرم حذف فلزات به‌ازای هر گرم وزن خشک) در شکل (7-c) بیشتر از D. alborizicum در شکل (7-d) بود. سپس با تفاوت معناداری میزان جذب کاهش یافت و در پایان دوره جذب، میزان جذب در سویه D. alborizicum بیشتر بود. در محیط کشت با غلظت 1 درصد نمک، در 10 دقیقه اول تفاوت معناداری بین دو سویه A. kermanshahica و D. alborizicum به‌ترتیب در شکل (7-e و f) گزارش نشد؛ اما در پایان 90 دقیقه، میزان جذب در A. kermanshahica (80 میلی‌گرم حذف فلزات به‌ازای هر گرم وزن خشک) به‌طور معناداری بیشتر بود. در محیط کشت با غلظت 5/1 درصد نمک در 10 دقیقه اول و 90 دقیقه آخر، حذف کروم A. kermanshahica (60 میلی‌گرم حذف فلزات به‌ازای هر گرم وزن خشک) در شکل (7-g) به‌طور معناداری بیشتر از D. alborizicum در شکل (7-h) بود. سپس میزان جذب کاهش یافت و در پایان دوره جذب، میزان جذب در A. kermanshahica به‌طور معناداری بیشتر بود.

میزان جذب نیکل در محیط کشت کنترل در 10 دقیقه اول توسط A. kermanshahica (200 میلی‌لیتر حذف فلزات به‌ازای هر گرم وزن خشک) در شکل (8-a) کمتر از D. alborizicum در شکل (8-b) بود. در محیط کشت با غلظت 5/0 درصد نمک، میزان جذب نیکل در دو سویه a. kermanshahica و D. alborizicum در شکل (8-c و d) به‌ترتیب در ابتدا و انتهای دوره جذب (200 میلی‌لیتر حذف فلزات به‌ازای هر گرم وزن خشک) تفاوت معناداری نداشتند. در محیط کشت با غلظت 1 درصد نمک، میزان جذب نیکل در 10 دقیقه اول در سویه A. kermanshahica (150 میلی‌لیتر حذف فلزات به‌ازای هر گرم وزن خشک) در شکل (8-e) به‌طور معناداری بیشتر از D. alborizicum در شکل (8-f) گزارش شد. در محیط کشت با غلظت 5/1 درصد نمک، میزان جذب نیکل در دو سویه A. kermanshahica و D. alborizicum در شکل (8-g و h) به‌ترتیب در ابتدا و انتهای دوره جذب (100 میلی‌لیتر حذف فلزات به‌ازای هر گرم وزن خشک) تفاوت معناداری نداشتند.

شکل 7. میزان حذف کروم A. kermanshahica (a، c، e، g) و D. alborizicum (b، d، f، h) در محیط کشت‌های با غلظت‌های مختلف نمک کلرید سدیم. بارهای عمودی نشان‌دهندة انحراف از میانگین داده‌های حاصل از سه تکرار هستند و حروف متفاوت نشان‌دهندة تفاوت معنادار در میزان حذف کروم در زمان‌های مختلف‌اند.

Figure 7. Chromium removal efficiency of A. kermanshahica (a, c, e, g) and D. alborizicum (b, d, f, h) in culture media with different concentrations of sodium chloride. Vertical bars indicate the deviation from the mean of data obtained from three replicates, and different letters represent significant differences in chromium removal at different times.

حذف یون مس در محیط کشت کنترل در هر دو سویه A. kermanshahica و D. alborizicum به‌ترتیب در شکل (9-a و b) (150 میلی‌لیتر حذف فلزات به‌ازای هر گرم وزن خشک) تفاوت معناداری نداشتند. در محیط کشت با غلظت 5/0 درصد نمک، در 10 دقیقه اول، حذف یون مس در A. kermanshahica (140 میلی‌لیتر حذف فلزات به‌ازای هر گرم وزن خشک) در شکل (9-c) به‌طور معناداری بیشتر از D. alborizicum در شکل (9-d) بود؛ اما سپس میزان جذب کاهش یافت. در پایان دوره جذب، میزان حذف یون مس در A. kermanshahica به‌طور معناداری بیشتر از D. alborizicum بود. در محیط کشت با غلظت 1 درصد نمک در 10 دقیقه اول و 90 دقیقه آخر، حذف یون مس در شکل (9-e) A. kermanshahica (100 میلی‌لیتر حذف فلزات به‌ازای هر گرم وزن خشک) بیشتر از D. alborizicum در شکل (9-f) بود و سپس میزان جذب کاهش یافت. در پایان دوره جذب تفاوت معنادار بیشتر در سویه D. alborizicum مشاهده شد. در محیط کشت با غلظت 5/1 درصد نمک نیز در 10 دقیقه اول، حذف یون مس در A. kermanshahica (80 میلی‌لیتر حذف فلزات به‌ازای هر گرم وزن خشک) در شکل (9-g) بیشتر از D. alborizicum در شکل (9-h) بود و سپس با تفاوت معناداری میزان جذب کاهش یافت. در پایان دوره جذب تفاوت معنادار بیشتر در سویه D. alborizicum مشاهده شد.

شکل 8. میزان حذف نیکل A. kermanshahica (a، c، e، g) و D. alborizicum (b، d، f، h) در محیط کشت‌های با غلظت‌های مختلف نمک کلرید سدیم. بارهای عمودی نشان‌دهندة انحراف از میانگین داده‌های حاصل از سه تکرار هستند و حروف متفاوت نشان‌دهندة تفاوت معنادار در میزان حذف نیکل در زمان‌های مختلف‌اند.

Figure 8. Nickel removal efficiency of A. kermanshahica (a, c, e, g) and D. alborizicum (b, d, f, h) in culture media with different concentrations of sodium chloride. Vertical bars indicate the deviation from the mean of data obtained from three replicates, and different letters represent significant differences in nickel removal at different times.

شکل 9. میزان حذف مس A. kermanshahica (a، c، e، g) و D. alborizicum (b، d، f، h) در محیط کشت‌های با غلظت‌های مختلف نمک کلرید سدیم. بارهای عمودی نشان‌دهندة انحراف از میانگین داده‌های حاصل از سه تکرار هستند و حروف متفاوت نشان‌دهندة تفاوت معنادار در میزان حذف مس در زمان‌های مختلف‌اند.

Figure 9. Copper removal efficiency of A. kermanshahica (a, c, e, g) and D. alborizicum (b, d, f, h) in culture media with different concentrations of sodium chloride. Vertical bars indicate the deviation from the mean of data obtained from three replicates, and different letters represent significant differences in copper removal at different times.

نتایج حاصل از مقایسه میزان پلی‌ساکاریدهای خارج سلولی (EPS) در حضور فلزات سنگین و غلظت‌های مختلف نمک کلرید سدیم

محیط حاوی 5/0 درصد نمک کلرید سدیم دو سویه A. kermanshahica و D. alborizicum به‌ترتیب در شکل (10-a و b) در مـقابل فـلزات سنـگـین، به‌ویژه نـیکل، A. kermanshahica بیشترین میزان اگزوپلی ساکاریدها (EPS) را نشان داد. در غلظت‌های بالاتر نمک 1 درصد در دو سویه A. kermanshahica و D. alborizicum در شکل (10-c و d) و 5/1 درصد نمک در شکل (10-e و f) به‌ترتیب سویه‌ها، تفاوت معناداری بین فلزات کروم و مس را گزارش می‌دهند. میزان اگزوپلی‌ساکاریدها در سویه D alborizicum در غلظت‌های مختلف نمک کلرید سدیم در مواجهه با فـلزات سنـگین مخـتلف، تفاوت معنادار کمتری را در A. kermanshahica نشان داد. با این حال، در غلظت‌های مختلف نمک کلرید سدیم، بیشترین میزان به‌ترتیب متعلق به نیکل، مس و سپس کروم بود و کمترین میزان متعلق به کشت‌های کنترل گزارش شد.

شکل 10. نتایج حاصل از مقایسه میزان (EPS) A. kermanshahica (a، c، e، g) و D. alborizicum (b، d، f، h) در محیط کشت‌های با غلظت‌های مختلف نمک کلرید سدیم. بارهای عمودی نشان‌دهندة انحراف از میانگین داده‌های حاصل از سه تکرار هستند و حروف متفاوت نشان‌دهندة تفاوت معنادار در میزان EPS در زمان‌های مختلف‌اند.

Figure 10. Results of comparing exopolysaccharide (EPS) levels in A. kermanshahica (a, c, e, g) and D. alborizicum (b, d, f, h) in culture media with different concentrations of sodium chloride. Vertical bars indicate the deviation from the mean of data obtained from three replicates, and different letters represent significant differences in EPS levels at different times.

نتایج حاصل از مقایسه میزان پروتئین در حضور فلزات سنگین و شوری

شکل 11 نتـایج مـقایـسه میزان پروتـئین دو سـویه‌ A. kermanshahica و D alborizicum را نشان می‌دهد. در هر دو سویه بیشترین میزان پروتئین در مواجهه با فلز سنگین نیکل یافت شد.

در همه غلظت‌های مختلف نمک کلرید سدیم، بیشترین حذف فلزات سنگین با تفاوت معناداری متعلق به فلز نیکل بود؛ درحالی‌که تفاوت معناداری در غلظت‌های 1 و 5/1 درصد نمک در دو سویه در میزان پروتئین بین فلزات مس، کروم و کنترل مشاهده نشد.

شکل 11. نتایج حاصل از مقایسه میزان پروتئین A. kermanshahica (a، c، e، g) و D. alborizicum (b، d، f، h) در محیط کشت‌های با غلظت‌های مختلف نمک کلرید سدیم. بارهای عمودی نشان‌دهندة انحراف از میانگین داده‌های حاصل از سه تکرار هستند و حروف متفاوت نشان‌دهندة تفاوت معنادار در میزان پروتئین در زمان‌های مختلف‌اند.

Figure 11. Results of comparing protein levels in A. kermanshahica (a, c, e, g) and D. alborizicum (b, d, f, h) in culture media with different concentrations of sodium chloride. Vertical bars indicate the deviation from the mean of data obtained from three replicates, and different letters represent significant differences in protein levels at different times.

نتایج حاصل از مقایسه میزان کربوهیدرات‌ها در حضور فلزات سنگین و شوری

همان‌طور که از نتایج حاصل از آنالیز آماری مشخص است، در سویه‌های A. kermanshahica و D. alborizicum در حضور فلزات سنگین و در غلظت 5/0 درصد نمک کلرید سدیم، A. kermanshahica بیشترین توانایی را در حذف فلز نیکل دارد (شکل 12-a)؛ درحالی‌که تفاوت معناداری در مورد فلزات مس و کروم وجود ندارد. سویه D. alborizicum در شکل (12-b) در غلظت 5/0 درصد نمک کلرید سدیم در مواجهه با فلزات سنگین مختلف گزارش می‌شود که این میزان در حذف فلز نیکل بیشترین میزان را دارد و میزان کربوهیدرات با افزایش میزان نمک کاهش معناداری می‌یابد.

شناسایی ترکیبات فرار با استفاده از روش طیف‌سنجی جرمی-کروماتوگرافی گازی GC-MS

نتایج حاصل از آنالیزهای آماری در مراحل قبل نشان دادند سویه A. kermanshahica در مقایسه با سویه D. alborizicum هم در مقابله با حذف فلزات سنگین توانایی بیشتری دارد و هم قابلیت رشد بیشتر در غلظت‌های مختلف نمک را داشت. درواقع، افزایش معنادار اگزوپلی‌ساکاریدها و وزن خشک سلولی در غلظت 5/0 درصد نمک در محیط کشت‌های حاوی نیکل در مقایسه با کشت کنترل صحت این موضوع را ثابت می‌کند؛ به همین دلیل، شناسایی ترکیبات فرار تنها در این سویه آنالیز شد.

آنالیز ترکیبات فرار به کمک دستگاه GC-MS افزایش ترکیبات استری، کتونی، الکلی، بنزنی و آلدئیدی را نشان داد که می‌توانند نقش مهمی در مواجهه با تنش شوری و حذف فلزات سنگین داشته باشند. آنالیز ترکیبات فرار سویه A. kermanshahica با استفاده از روش طیف‌سنجی جرمی-کروماتوگرافی گازی در شرایط کنترل و در حضور 5/0 درصد نمک کلرید سدیم و فلز سنگین نیکل، درمجموع 19 ترکیب فرار (شامل آلدئیدها، کتون‌ها، ترکیبات بنزنی، اسیدی، استری و الکلی) را شناسایی کرد در جدول 1 در محیط کشت کنترل که شامل (2-متیل فوران، 3-متیل بوتانال، 2-متیل بوتانال، متیل استر اسید استیک، اتیل استر اسید استیک، 2-بوتانون، 2-پنتانون، اتانول، اسید استیک، 3-متیل بوتیل استر، 1-بوتانول، 1، 3-دی‌متیل بنزن، 2-متیل-1-پروپانول، 3-متیل-1-بوتانول، 3-هیدروکسی-2-بوتانون، استیک اسید، بنزالدئید، 2-فنیل اتانول، 1-اکتن-3-ال، 3-اکتن-2-ال، 4-اکتن-3-اون) بود (شکل 13).

شکل 12. نتایج حاصل از مقایسه میزان کربوهیدرات‌ها A. kermanshahica (a، c، e، g) و D. alborizicum (b، d، f، h) در محیط کشت‌های با غلظت‌های مختلف نمک کلرید سدیم. بارهای عمودی نشان‌دهندة انحراف از میانگین داده‌های حاصل از سه تکرار هستند و حروف متفاوت نشان‌دهندة تفاوت معنادار در میزان کربوهیدرات‌ها در زمان‌های مختلف‌اند.

Figure 12. Results of comparing carbohydrate levels in A. kermanshahica (a, c, e, g) and D. alborizicum (b, d, f, h) in culture media with different concentrations of sodium chloride. Vertical bars indicate the deviation from the mean of data obtained from three replicates, and different letters represent significant differences in carbohydrate levels at different times.

شکل 13. نتایج حاصل از مطالعات GC-Mass A. kermanshahica در مواجهه با 5/0 درصد نمک کلرید سدیم و فلز سنگین نیکل

Figure 13. Results of GC-MS analysis of A. kermanshahica exposed to 0.5% sodium chloride and nickel heavy metal.

جدول 1. مقایسه ترکیبات فرار سویه A. kermanshahica در مواجهه با 5/0 درصد نمک کلرید سدیم و فلز سنگین نیکل

Table 1. Comparison of volatile compounds in A. kermanshahica exposed to 0.5% sodium chloride and nickel heavy metal.

بحث

در این تحقیق تأثیر شرایط مختلف محیطی بر سنتز پلی‌ساکاریدها در سویه‌های مختلف سیانوباکتری بررسی شد. نتایج نشان دادند در شرایط شوری بالا، تولید پلی‌ساکاریدها به‌طور چشمگیری افزایش می‌یابد. این افزایش علاوه بر اینکه به محافظت از سلول‌ها در برابر شوری کمک می‌کند، مقاومت در برابر دهیدراسیون و حملات ویروسی را نیز بهبود می‌بخشد. همچنین، مشاهده شد سیانوباکتری‌هایی که پلی‌ساکاریدهای بیشتری تولید می‌کنند، در محیط‌های خشک و شسته‌شدن توسط جریان‌های آب، بقای بیشتری دارند. این یافته‌ها اهمیت پلی‌ساکاریدهای خارج سلولی را به‌عنوان مکانیسم دفاعی چندگانه در سیانوباکتری‌ها تأیید می‌کند و نشان می‌دهد این ترکیبات می‌توانند نقش حیاتی در بقا و سازگاری این موجودات با شرایط محیطی نامساعد داشته باشند (21).

 تحقیق Roncero-Ramos و همکاران (2019) روی گونه‌ای از نوستوک به نام N. commune نشان می‌دهد پلی‌ساکاریدهای این سلول با تشکیل ماتریکس خارج سلولی، رنگدانه جذب‌کنندة UV (سایتونمین)، ترکیب‌های اسید آمینه‌ای مایکوسپورین مانند (MMAs) و سوپراکسید دیسموتازها شامل آهن فعال را به سلول‌ها القا می‌کنند و از تابش‌های مضر UV نیز محافظت می‌کنند تا سلول در شرایط خشکی زنده بماند (22).

Carpine و همکاران (2020) نشان دادند پلی‌ساکاریدها نقش مهمی در حفاظت از سیانوباکتری‌ها در شرایط خشکی دارند (23). در تحقیق نوروزی و همکاران (2022) از این پلیمرها به‌عنوان ترکیب بافری استفاده شد و به جمع‌آوری و آزادسازی آرام آب کمک کرد. تراکم موسیلاژ احاطه‌کنندة تریکوم‌های سویه نوستوک N. commune باعث حفاظت آنها در محیط‌های خشک می‌شود. علاوه بر این، خاصیت هیدروفوبیک اگزوپلی‌ساکاریدها در سیانوباکتری‌ها منجر به محافظت آنها در برابر شسته‌شدن توسط جریان‌های آب می‌شود (24). در تحقیق نوروزی و همکاران (2021) پوشش لایه لزج احاطه‌کنندة تریکوم‌ها در گونه‌های نوستوک N. commune نشان داد نقش مهمی در جذب ریسه‌ها به داخل محیط مایع، حرکت، جذب نور و مواد غذایی دارد. به‌طور کلی، پلی‌ساکاریدهای سیانوباکتریایی می‌توانند به‌عنوان منابع قابل قبولی برای تولید صنعتی در زمینه‌های مختلف ازجمله کشاورزی، غذا، دارویی و بیوشیمیایی و در ثبات کیفیت مواد به‌طور مؤثر استفاده شوند (25). در مقایسه، تحقیقات  Carpineو همکاران و نوروزی و همکاران بیشتر بر نقش پلی‌ساکاریدها در حفاظت سیانوباکتری‌ها در شرایط خشکی و کاربردهای صنعتی این ترکیبات تمرکز داشتند. در این تحقیق توانایی دو سویه سیانوباکتری Alborzia kermanshahica و Desmonostoc alborizicum در حذف فلزات سنگین و مقاومت به شوری بررسی شد. این مطالعه نشان داد سویه تک‌سلولی A. kermanshahica در شرایط شوری و برای حذف فلزات سنگین عملکرد بهتری نسبت به سویه ریسه‌ای دارد. تحقیقات پیشین بر اهمیت پلی‌ساکاریدها در حفاظت از سیانوباکتری‌ها در شرایط خشکی تأکید داشتند؛ درحالی‌که این تحقیق به کاربردهای عملی سویه‌های خاص سیانوباکتری در شرایط شوری و آلودگی به فلزات سنگین پرداخته است.

در تحقیق Borah و همکاران (2018) روی سیانوباکتری‌‌ها، به‌ویژه در شرایط شوری نشان داد با افزایش تولید اگزوپلی‌ساکاریدها تحمل نمک و متابولیسم کربوهیدرات نیز بهبود می‌یابد. برخی نمونه‌های استثنا مانندCyanothece sp. و C. capsulate دارای کپسول‌های ضخیمی هستند که حفاظت مؤثری در برابر تنش‌های اسمزی فراهم می‌کنند و با افزایش غلظت نمک کلرید سدیم، هیچ تأثیری بر تولید اگزوپلی‌ساکارید نمی‌گذارد یا کمتر اثرگذار هستند (26). در تحقیقات دیگر توسط Simonazzi و همکاران (2021)، سویه‌های استثنای دیگری مانند Synechococcus sp. و  33047 Anabaena sp. تنها در شرایط خاص مانند فاز ثابت رشد به‌علت محدودیت مواد غذایی ضروری یا دیازوتروفی، تولید اگزوپلی‌ساکاریدها را افزایش می‌دهند (27). همچنین در تحقیق دیگر توسط Hasegawa و همکاران (2019)، سیانوباکتری‌ هالوفیلیک Aphanothece halophytica GR02 نیز در مقابل تغییرات غلظت نمک، تنوعی در مواد آلی مانند رامنوز و گالاکتوز نشان می‌دهند در ساخت پلی‌ساکاریدهای محلول نقش دارند. شوری به‌عنوان مانعی برای رشد ریزجلبک‌ها، از سمیت داخلی یون‌های غیرآلی، جلوگیری و سنتز ترکیبات محافظت‌کنندة اسمزی را تحریک می‌کند. سیانوباکتری‌ها با ساخت و تجمع سوکروز، گلیکوزیل گلیسرول و گلوتامات بتائین به‌عنوان حل‌شونده‌های سازشی اسمزی، در برابر تنش شوری مقاومت می‌کنند و نقش مهمی در تبدیل ذخایر قندی به گلیکوژن پس از برطرف‌شدن تنش شوری دارند (28). در مقایسه، این تحقیق به‌طور خاص به بررسی توانایی دو سویه سیانوباکتری Alborzia kermanshahica و Desmonostoc alborizicum در حذف فلزات سنگین و مقاومت به شوری پرداخته است. تحقیقات Simonazzi و Hasegawa بیشتر به شرایط خاص تولید اگزوپلی‌ساکاریدها و پاسخ‌های سیانوباکتری‌ها به شوری پرداخته‌اند؛ درحالی‌که تحقیق ما بر ویژگی‌های عملکردی و کاربردهای عملی سویه‌های خاص سیانوباکتری در شرایط شوری و آلودگی به فلزات سنگین تمرکز دارد؛ به‌ویژه سویه A. kermanshahica در شرایط شوری و برای حذف فلزات سنگین عملکرد بهتری نسبت به سویه ریسه‌ای دارد و می‌تواند به‌عنوان یک کاندیدای مناسب برای کاربردهای محیطی در شرایط سخت معرفی شود.

تحقیقات اخیر Singh و همکاران (2019) در زمینة سیانوباکتریولوژی نشان می‌دهد مورفوتیپ‌های فاقد کپسول از سیانوباکتری‌ها در تحقیقات بیوتکنولوژیک نقش مهمی دارند. عدم وجود لایه کپسول می‌تواند فرایندهای جداسازی ترکیبات فعال زیستی و تحلیل‌های زیست‌شناسی مولکولی را آسان‌تر کند (29). همچنین، تحقیق Moore و همکاران (2020) نشان داد مورفوتیپ‌های کپسول‌دار در حمایت از رشد سیانوباکتری‌ها در برابر تنش‌های محیطی اهمیت دارند. برای مقابله با تنش‌های مختلف محیطی، سیانوباکتری‌ها استراتژی‌هایی مانند افزایش محتوی کلروفیل، افزایش نرخ فتوسنتز، افزایش قدرت جذب روشنایی و بی‌کربنات، اشباع‌شدن دستگاه فتوسنتزی از  CO₂و افزایش واکنش تنفسی را به کار می‌گیرند (30).

تحقیقات اخیر توسط  Romeu و همکاران (2022) در زمینة پروتئومیکس سیانوباکتری‌ها نشان می‌دهد علاوه بر پویایی فرایندهای داخل سلولی، شناخت نقش دینامیک ایفاشده توسط پروتین‌های خارج سلولی نیز برای درک بهتر از تکامل، پیدایش دیواره سلولی، چسبندگی و تشکیل بیوفیلم در این میکروب‌ها بسیار اساسی است. یافته‌های این تحقیقات منجر به شناسایی تعداد زیادی از اگزوپروتئین‌ها با عملکردهای مختلف و پروتئین‌های فرضی با عملکرد نامشخص شد (33).

نقش عملکردی اگزوپروتئوم‌ها در مقاومت به فلزات توسط Zappa و Bauer (2017) نشان داد پروتین‌های متصل به فلز در فضای خارج سلولی، به‌ویژه متالوتیونین‌‌ها، پروتین‌های متصل به متالوتیونین‌ها، فریتین، پروتئین‌های تثبیت‌کنندة منگنز در فتوسیستم II، پلاستوسیانین و و پروتئین‌های متصل به فلزات در Synechococcus دریازی، FutA2 در Synechocystis و همولوگ آنها در Synechococcus دریازی، CopM در Synechocystis و هومولوگ All7633 در Anabaena و پروتئین‌های فریتین مانند در Anabaena نقش مهمی در مقاومت به فلزات دارند. این پروتئین‌ها نه‌تنها در فضای خارج سلولی، بلکه در داخل سلول نیز می‌توانند نقش‌های مختلفی داشته باشند؛ مانند عملکرد متالوتیونین‌ها که علاوه بر اتصال به فلزات، ممکن است نقشی مشابه اگزوپروتئین‌ها در فضای خارج سلولی داشته باشند (34).

تحقیقات جدید Singh و همکاران (2019) نشان می‌دهد کاهش دسترسی زیستی و کاهش تحرک یون‌های فلزات سنگین اهمیت زیادی دارد تا خطرات جذب و انباشت آنها در محیط کاهش یابد. روش‌های بیولوژیکی، میکروب‌ها، جذب یون‌های فلزی را با استفاده از مکانیزم‌های مقاومتی مانند تبادل یونی و کمپلکس‌سازی کمپلکس‌سازی، رسوب‌گیری^[1] و شلاته‌کردن^[2] انجام می‌دهند؛ درنتیجه، استفاده از میکروب‌ها به‌عنوان راهکاری کارآمد و کم‌هزینه‌تر برای کاهش آلاینده‌های فلزی در محیط‌های صنعتی و فاضلاب‌ها شناخته شده است (35). مطالعات  Tiwari و همکاران (2020) نشان می‌دهد سلول‌های زنده و مرده از مکانیسم‌های مختلفی برای جذب یون‌های فلزی استفاده می‌کنند. سلول‌های زنده برای حفظ حیات خود به شرایط محیطی خاصی نیاز دارند؛ درحالی‌که سلول‌های مرده به شرایط خاص کمتری نیاز دارند و به همین دلیل بهتر می‌توانند یون‌های فلزی را جذب کنند. اگزوپلی‌ساکاریدها یا همان مواد خارج سلولی میکروبی، ازطریق تعامل با یون‌های فلزی با بار مثبت و سطوح منفی خود، امکان حذف این یون‌ها را از محیط با استفاده از مکانیسم‌هایی مانند تبادل یونی، کمپلکس‌سازی و رسوب‌دهی فراهم می‌آورند (18).

اگزوپلی‌ساکاریدهای زیست‌توده مرده که از باکتری‌های مانند Ochrobactrum anthropi ازطریق تحقیق Rath و همکاران (2022) جدا شده‌اند، در شرایط خاصی از pH و غلظت یون فلزی، مانند کادمیوم، اگزوپلی‌ساکاریدهای زیست‌توده مرده قابلیت جذب و حذف بالایی دارند؛ برای مثال، در pH اسیدی حدود 2، می‌توانند تا 26 میلی‌گرم بر لیتر از یون‌های مس را از غلظت اولیه ppm 91/6 جذب کنند. همچنین، باکتری‌های مختلف مانند Bacillus cereus، Bacillus pumilus  و Pantoea agglomerans  در شرایط اسیدی با 3-2pH ، بیش از 85 درصد از کروم موجود در محیط را حذف می‌کنند؛ با این حال، تجزیه و تحلیل جذب یونی فلزات نشان می‌دهد اگزوپلی‌ساکاریدهای جداشده از زیست‌توده مرده نسبت به زیست‌توده نامتحرک (مقاوم در برابر فلزات سنگین)، یون‌های مس، کادمیوم و سرب کمتری را جذب می‌کنند (36). در مقابل، تحقیق ما به بررسی توانایی دو سویه سیانوباکتری Alborzia kermanshahica و Desmonostoc alborizicum در حذف فلزات سنگین و مقاومت به شوری پرداخته است. نتایج نشان دادند سویه تک‌سلولی A. kermanshahica نسبت به سویه ریسه‌ای، توانایی بیشتری در حذف فلزات سنگین و رشد در شرایط شوری دارد. در کشت‌های کنترل، سویه تک‌سلولی میزان وزن خشک سلولی، اگزوپلی‌ساکاریدها و پروتئین بیشتری نسبت به سویه ریسه‌ای داشت و در شرایط فاقد کلرید سدیم نیز توانایی بیشتری در حذف فلزات نشان داد. میزان پروتئین‌ها در هر دو سویه در مواجهه با فلزات سنگین کاهش یافت؛ اما سویه تک‌سلولی A. kermanshahica افزایش معناداری در اگزوپلی‌ساکاریدها و وزن خشک سلولی در غلظت 5/0 درصد نمک کلرید سدیم نشان داد. همچنین، بیشترین میزان حذف فلزات سنگین در هر دو سویه مربوط به نیکل، مس و سرب بود. تحلیل ترکیبات فرار به کمک GC-MS نیز نشان داد ترکیبات استری، کتونی، الکلی، بنزنی و آلدئیدی در مواجهه با تنش شوری و حذف فلزات سنگین افزایش یافتند. تحقیق Rath و همکاران بر کارایی اگزوپلی‌ساکاریدهای زیست‌توده مرده در جذب فلزات سنگین در شرایط اسیدی متمرکز است؛ درحالی‌که تحقیق ما بر کارایی سویه‌های خاص سیانوباکتری در حذف فلزات سنگین و مقاومت به شوری تأکید دارد و نشان می‌دهد A. kermanshahica کاندیدای مناسبی برای حذف فلزات سنگین در شرایط شوری است.

تحقیقات اخیر Van و همکاران (2022) نشان داده است سیانوباکتری Calothrix marchica با تولید پلی‌ساکاریدهای کپسولی با محتوای قند اسیدی بالا، به‌طور مؤثری یون‌های فلزی را جذب می‌کند. این سیانوباکتری به‌ویژه قادر است یون‌های سرب را با میزان جذب تا حدود 65 میلی‌گرم بر گرم جذب کند (mg/g 65Pb2+/g ). علاوه بر آن، گونه‌های دیگری مانند Nostoc و Cyanospira capsulata نشان داده‌اند در شرایط مختلف، قادر به جذب بیشتر یون‌های مس نسبت به یون‌های نیکل و روی هستند؛ هرچند راندمان حذف آنها بین این گونه‌ها متفاوت است (37).

تحقیقات جدید Gupta و Diwan (2017) نشان می‌دهد تکنیک‌های بی‌حرکت‌سازی سینتیک، مانند اتصال سلول‌های باکتری به سطوح جامد، تولید اگزوپلی‌ساکارید را بدون تغییر سرعت رشد افزایش می‌دهند؛ برای مثال، Chryseomonas luteola در بستر آلژینات توانسته است جذب یون‌های کادمیوم و کبالت را به‌ترتیب به میزان 10/64 و 25/55 میلی‌گرم بر لیتر افزایش دهد. تغییرات شیمیایی مانند استیله‌شدن و فسفوریلاسیون، فعالیت‌های بیولوژیکی اگزوپلی‌ساکاریدها را اصلاح می‌کنند. پلیمرهای اصلاح‌شده با فسفوریلاسیون بالا، ظرفیت جذب یون‌های فلزی را به‌طور چشمگیری افزایش می‌دهند (38). نتایج مطالعات اخیر می‌توانند الگویی کارساز در آینده‌ای نزدیک برای افزایش جذب فلزات سنگین باشند. در مقابل، تحقیق ما روی سیانوباکتری‌های Alborzia kermanshahica و Desmonostoc alborizicum متمرکز بود و نشان داد سویه تک‌سلولی A. kermanshahica نسبت به سویه ریسه‌ای توانایی بهتری در حذف فلزات سنگین و رشد در شرایط شوری دارد. Gupta و Diwan به بهبود جذب فلزات ازطریق اصلاح شیمیایی پرداختند؛ درحالی‌که تحقیق ما بر کاربرد خاص سیانوباکتری‌ها در محیط‌های شور تأکید دارد.

 نتیجه‌گیری کلی

در این مطالعه توانایی دو سویه مختلف تک‌سلولی و ریسه‌ای در مواجهه با حذف فلزات سنگین و غلظت‌های مختلف نمک کلرید سدیم بررسی شد. نتایج نشان دادند سویه تک‌سلولی خاکزی در مقایسه با سویه ریسه‌ای آبزی توانایی بیشتری هم در حذف فلزات سنگین و هم قابلیت رشد بیشتر در غلظت‌های مختلف نمک داشت. در کشت‌های کنترل میزان وزن خشک سلولی، اگزوپلی‌ساکاریدها و پروتئین در سویه تک‌سلولی به‌ترتیب 70/1، 32/1 و 5/1 برابر بیشتر از سویه ریسه‌ای گزارش شد. همین امر باعث شد در کشت‌های کنترل فاقد شوری نیز سویه تک‌سلولی در 10 دقیقه اول، توانایی بیشتری در حذف هر سه فلز داشته باشد. افزایش معنادار اگزوپلی‌ساکاریدها و وزن خشک سلولی در غلظت 5/0 درصد نمک در سویه تک‌سلولی نشان‌دهندة مقاومت این سویه به شوری است. در هر دو سویه بیشترین میزان حذف فلزات سنگین به‌ترتیب متعلق به نیکل، مس و سرب است و بیشترین میزان اگزوپلی‌ساکارید، پروتئین و کربوهیدرات در محیط کشت‌های حاوی نیکل در هر دو سویه گواه این ادعا است. نتایج حاصل از آنالیز ترکیبات فرار به کمک دستگاه GC-MS، افزایش ترکیبات استری، کتونی، الکلی، بنزنی و آلدئیدی را نشان دادند که می‌توانند نقش مهمی در مواجهه با تنش شوری و حذف فلزات سنگین داشته باشند.

[1] Precipitation

[2] Chelation