بررسی تأثیر نانوذره اکسید آهن مغناطیسی سنتز شده و سالیسیلیک اسید بر تغییر ویژگی‌های ریخت شناسی و فیزیولوژیکی گیاهچه‌های استبرق (Calotropis procera)

استبرق با نام علمی Calotropis procera Aiton. درختچه‌ای چندساله‌ و همیشه­سبز از خانواده­ی خرزهره­ایان (Apocynaceae) است که عمدتاً در مناطق خشک و نیمه­خشک رشد می­کند. استبرق، یک گیاه چندمنظوره است که به علّت داشتن سطوح بالایی از متابولیت‌های ثانویه خاص در پزشکی، تولید سوخت­های زیستی، تهیه الیاف، علوفه و الوار و همچنین در گیاه­پالایی و برای سنتز انواع نانوذرات مورد توجه بسیار قرار گرفته است (Kaur et al., 2021). این گیاه در طب سنتی نیز به­عنوان داروی ضداسهال، ضدالتهاب، ضدمیکروب، ضدآسم و ضددرد استفاده می­شود (Choedon et al., 2006). بنابراین با توجه به اهمیّت دارویی و صنعتی استبرق، حفاظت از گیاه و ایجاد دستورالعمل­های قابل تکرار و دائمی برای تولید هرچه بیشتر متابولیت‌های ثانویه آن ضروری به نظر می‌رسد.

امروزه، استفاده از محرک­های زیستی و غیرزیستی در محیط­های کشت به­عنوان یکی از مهم­ترین راهکارهای افزایش تولید و تجمع متابولیت­های ثانویه اتخاذ شده­است. آهن، به­عنوان یکی از ریزمغذی­های ضروری برای سلامت گیاهان و عنصری غیرقابل جایگزین تقریباً در همه­ی موجودات زنده می­باشد که در بررسی­های اخیر مشخص شده است اعمال آن به­صورت برون‌زا در محیط‌های کشت می­تواند از طریق تولید بیش از حد گونه‌های فعال اکسیژن و با ایجاد تنش اکسیداتیو، به‌عنوان یک محرک قوی در افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه عمل کند (Sharma et al., 2012). با این­حال، پژوهش­های پیشین به­خوبی نشان داده است که نانوذرات اکسید آهن نسبت به فرم اولیه فلز، به­ علّت اندازه کوچک، سطح ویژه بزرگ، واکنش­پذیری بالا، حمل و نقل درون سلولی زیاد و قابلیت جذب می­توانند به­سرعت و به‌طور کامل توسط گیاهان جذب شوند و ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی متفاوتی را نشان دهند که در شکل معمول آن­ها وجود ندارد (Sun et al., 2015). پژوهش­های قبلی نشان می­دهد نانوذرات اکسید آهن در فعال کردن متابولیسم ثانویه و فعالیت­های آنتی اکسیدانی و افزایش مقاومت در برابر تنش­ها تاثیر دارد (Khan et al., 2021؛Moharrami et al., 2017). همچنین، نانوذرات سبب افزایش رشد و محتوای کلروفیل در گیاهان می­شود (Tawfik et al., 2021). با پتانسیل امیدوارکننده نانوذرات اکسید آهن، به نظر می‌رسد می­تواند جایگزین آهن معمولی در محیط‌های کشت گیاهی شوند. با وجود این، در استفاده از این نانوذرات چندین چالش مهم وجود دارد. خاصیت مغناطیسی بالا، غلظت و اندازه نانوذرات، چگونگی افزودن نانوذرات، زمان افزودن آن به محیط کشت و مدت زمان مواجهه نمونه با آن از جمله این چالش­ها و از مهم­ترین عوامل تعیین کننده­ی اثرات الیسیتور بر میزان تولید متابولیت­های ثانویه است که باید مورد توجه قرار گیرند (Ma et al., 2010؛Kornarzyński et al., 2020 ). سالیسیلیک اسید نیز یک ترکیب فنول طبیعی و از تنظیم کننده‌های رشد درون­زا است که بسیاری از پژوهش­ها نشان داده‌اند اعمال برون­زای آن، آنتی‌اکسیدان‌های آنزیمی و غیرآنزیمی را افزایش می‌دهد و با حفظ گونه‌های فعال اکسیژن در سطح بهینه می­تواند تولید متابولیت­های ثانویه را افزایش دهد (Koo et al., 2020). از این­رو، تصور می‌شود که غلظت مناسب سالیسیلیک اسید می­تواند به­عنوان نمونه­ای از محرک­های طبیعی بی­خطر در جهت تقویت بیوسنتز متابولیت‌های ثانویه خاص و همچنین به حداقل رساندن اثرات نامطلوب احتمالی نانوذرات اکسید آهن عمل کند.

بنابراین، با توجه به اهمیّت گیاه دارویی استبرق از نظر دارویی و صنعتی، در پژوهش حاضر، اثرات نانوذرات اکسید آهن به­همراه سالیسیلیک اسید برای بهبود رشد و فیزیولوژی گیاهچه­های استبرق در شرایط هیدروپونیک مورد بررسی قرار گرفت. در این پژوهش، برای جلوگیری از هرگونه سمیّت احتمالی نانوذرات مصنوعی، از نانوذرات اکسید آهن سنتز شده با عصاره برگ استبرق استفاده شد.

موادها و روش­ها

برای بررسی واکنش گیاه استبرق به نانوذره اکسید آهن و سالیسیلیک اسید، آزمایشی به­صورت فاکتوریل در قالب طرح کامل تصادفی با سه تکرار انجام شد. بذرهای گیاه استبرق در مهرماه از گیاه وحشی در منطقه شهداد، یکی از رویشگاه­های طبیعی استبرق در استان کرمان جمع­آوری شد. منطقه شهداد در ۸۷ کیلومتری شمال­شرق شهر کرمان (طول و عرض جغرافیایی: ۵۷٫۷۰۶۱۳۴۶۷° و ۳۰٫۴۱۷۰۹۳۶۷°) با ارتفاع 400 متر از سطح دریا واقع می­باشد. تعدادی بذر پس شست­وشو و استریل کردن با الکل 70% به­مدت یک دقیقه و آب ژاول 20%  (v/v) به­مدت 12 دقیقه، برای جوانه­زنی در ظروف پتری­دیش قرار داده و در اتاق کشت با دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی، شدت نور μmol m⁻² s⁻¹90، دمای C˚25±2 و رطوبت 98-95% نگهداری شد. 10 روز پس از جوانه­زنی و رشد گیاهچه­ها، گیاهچه­های یک­شکل به فالکون­های حاوی 50 میلی­لیتر محلول غذایی½ هوگلند منتقل و در اتاق کشت با شرایط گفته شده نگهداری شدند. گیاهچه­های 21 روزه که به مرحله شش برگی رسیدند به فالکون­های حاوی محلول غذایی½ هوگلند همراه با غلظت­های مختلف سالیسیلیک اسید (0، 05/0 و 1/0 میلی­مولار) منتقل شدند. همزمان غلظت­های مختلف نانوذرات اکسید آهن (0، 50، 100، 150 و 200 میلی­گرم بر لیتر) بر روی برگ­ها اسپری شد؛ برای جلوگیری از آسیب برگ­ها، اسپری در طول دو هفته به­صورت یک روز در میان انجام شد (Bastani et al., 2018). در پژوهش حاضر، از نانوذرات مغناطیسی اکسید آهن سنتز شده به روش هم­رسوبی با عصاره برگ گیاه استبرق، کلرید آهن (III) و آهن (II) به­عنوان پیش­ساز در اندازه ذرات 11 نانومتر استفاده شد (Adabavazeh et al., 2022). پس از دو هفته تیماردهی، پارامترهای ریخت شناسی و فیزیولوژیکی مورد بررسی قرار گرفت.

سنجش مقدار رنگیزه­های فتوسنتزی

برای سنجش مقدار کلروفیل و کاروتنوئید از روش Lichtenthaler (1987) استفاده شد. 2/0 گرم بافت برگ با 5 میلی­لیتر استون 80% سائیده و با کاغذ صافی، صاف شد. حجم محلول با استون 80% به 15 میلی­لیتر رسانده و شدت جذب در طول موج‌های 2/663، 8/646 و 470 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر UV-Visible (مدل JENWAY 6305، انگلیس) خوانده شد. برای اندازه­گیری پیش­سازهای کلروفیل، شدت جذب در طول موج‌های 590، 628، 667 و 650 که بالاترین جذب پروتوپورفیرین، منیزیم^_پروتوپورفیرین، پروتوکلروفیلید می­باشد، خوانده شد (Yang et al., 1998). نتایج حاصل از اندازه‌گیری بر اساس رابطه 1 محاسبه و بر حسب میلی­گرم بر ­گرم وزن تر ارائه شد.

رابطه 1:

Chl a (mg g⁻¹ FW) = (12.25 A_663.2) - (2.79 A_646.8)  

Chl b (mg g⁻¹ FW) = (21.51 A_646.8) - (5.1 A_663.2)

Chl. T (mg g⁻¹ FW) = Chl. a + Chl. b

Car (mg g⁻¹ FW) = [(1000 A₄₇₀) – (1.8 Chl. a) - (85.02 Chl. b)] ÷ 198

PPIX (mg g⁻¹ FW) = 196.25 A₅₇₅ - 46.6 A₅₉₀ - 58.68 A₆₂₈  

MGPP (mg g⁻¹ FW) = 61.81 A₅₉₀ - 23.77 A₅₇₅ - 3.55 A₆₂₈

Pchlide (mg g⁻¹ FW) = 42.59 A₆₂₈ - 34.22 A₅₇₅ - 7.25 A₅₉₀

Chlide a (mg g⁻¹ FW) = A₆₆₇ /74.9

Chlide b (mg g⁻¹ FW) = A₆₅₀ /47.2

در روابط فوق Chl a، Chl b، Chl T، Car، PPIX، MGPP، Pchlide و Chlide به­ترتیب کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل، کاروتنوئید، پروتوپورفیرین، منیزیم- پروتوپورفیرین، پروتوکلروفیلید و کلروفیلید هستند.

سنجش عناصر

در پژوهش حاضر، میزان عناصر آهن، پتاسیم، کلسیم و منیزیم در برگ در سطح 0 و 200 میلی­گرم بر لیتر تیمار نانوذره آهن و سطح 0 و 1/0 میلی­مولار سالیسیلیک اسید مورد بررسی قرار گرفت و برای سنجش آن­ها از دستگاه طیف­سنج نشر اتمی پلاسمایی جفت شده القایی (ICP-OES) با حد تشخیص ppm 02/0 ( مدل Spectro ARCOS System760095555، آلمان) استفاده شد (Sagner et al., 1998).

درصد نشت الکترولیتی غشاء

شاخص پایداری غشاء با اندازه­گیری میزان نشت الکترولیتی برگ ارزیابی شد (Ben Hamed et al., 2007). برای این منظور 2/0 گرم از بافت سالم و تازه برگ گیاه را بعد از شست­وشو با آب مقطر برای شست­وشوی یون­های احتمالی از سطح گیاه درون لوله­ی آزمایش درپیچدار قرار داده و 10 میلی­لیتر آب به آن اضافه شد. لوله­های آزمایش به‌مدّت 2 ساعت در دمای C˚32 قرار داده و میزان هدایت الکتریکی نمونه­ها (EC₁) با Ec­متر (مدل HI9811، شرکت HANNA، آمریکا) اندازه­گیری شد. سپس لوله­های آزمایش در دمای C˚121 به‌مدّت 20 دقیقه اتوکلاو شده و بعد از خنک شدن لوله­ها تا C˚25، میزان هدایت الکتریکی نمونه­ها (EC₂) مجدداً اندازه­گیری و طبق رابطه 2 درصد نشت یونی (EL) محاسبه شد.

رابطه 2:

(EC₁ / EC₂) × 100= EL%

سنجش مقدار پراکسیدهیدروژن (H₂O₂)

مقدار H₂O₂ در بافت­های برگ بر اساس روش Oktay و همکاران (2003) اندازه‌گیری شد. ابتدا 2/0 گرم از بافت­ تر بر روی یخ با 3 میلی­لیتر تری کلرواستیک اسید 1/0% هموژنه و سپس به­مدّت 20 دقیقه در xg 10000 در دمای C˚4 سانتریفیوژ شد. پس از سانتریفیوژ، 5/0 میلی­لیتر مایع رویی با 5/0 میلی­لیتر بافر فسفات 10 میلی­مولار (7pH=) و یک میلی­لیتر محلول یدیدپتاسیم یک مولار مخلوط شد. پس از انکوباسیون نمونه­ها در دمای C˚25 به­مدّت ­15 دقیقه، شدت جذب آن­ها در طول­موج 390 نانومتر خوانده شد و با منحنی استاندارد، محتوای H₂O₂ محاسبه شد.

سنجش مقدار مالون­دی­آلدهید (MDA)

محتوای MDA، به­عنوان شاخصی از میزان آسیب ناشی از گونه­های فعال اکسیژن به گیاه، براساس روش Heath & Packer (1968) اندازه‌گیری شد. ابتدا 2/0 گرم از بافت­های مورد نظر بر روی یخ با 3 میلی­لیتر تری­کلرواستیک اسید 1/0% هموژنه و سپس به­مدت 20 دقیقه با سرعت xg 10000 در دمای C˚­4 سانتریفیوژ شد. سپس به 5/0 میلی­لیتر مایع رویی 2 میلی­لیتر تری­کلرواستیک اسید 20% حاوی 5/0% تیوباربیتوریک اسید اضافه شد. نمونه‌ها ابتدا در دمای C˚­95 به­مدّت 30 دقیقه انکوبه و سپس به­سرعت در حمام یخ خنک شدند. جذب نمونه­ها در طول­موج­های 532 و 600 نانومتر خوانده شد. میزان MDA از رابطه 3 محاسبه و به‌صورت نانومول بر گرم وزن تر بیان شد؛ در این رابطه ضریب خاموشی M⁻¹cm⁻¹ 155000ε= می‌باشد.

رابطه 3:

MDA (nmol g^-1 FW) = [(A₅₃₂-A₆₀₀)/ ε] × 10⁶

سنجش قند محلول

محتوای قند محلول در برگ توسط معرف آنترون براساس روش اصلاح شدهFales  (1951) مورد سنجش قرار گرفت. بر این اساس، 1/0 گرم نمونه با 5/2 میلی­لیتر اتانول 80­% سائیده و به­مدّت 60 دقیقه در دمای C˚­95 قرار داده شد. عصاره حاصل با سرعت xg 3000 به­مدّت 10 دقیقه سانتریفیوژ و مایع رویی جمع­آوری شد. سپس برای حذف حلال استخراج­کننده، فالکون­های حاوی عصاره درون آون در دمای C˚­50 قرار داده شدند. مقدار 5/2 میلی­لیتر آب به رسوب حاصل اضافه شد. سپس 5/0 میلی­لیتر از محلول به­دست آمده با 5 میلی­لیتر معرف آنترون مخلوط و به­مدت 17 دقیقه در دمای C˚90 گرم شد. شدت جذب در طول­موج 625 نانومتر خوانده شد. غلظت قند با منحنی استاندارد به­دست آمد و نتایج براساس میلی­گرم بر گرم وزن تر گزارش شد.

سنجش پروتئین محلول و آنزیم­های آنتی‌اکسیدان

برای تهیه عصاره­ی پروتئینی و آنزیمی، ابتدا 1/0 گرم بافت برگ روی یخ و توسط 2 میلی­لیتر بافر فسفات 25 میلی­مولار (8/7pH=) هموژنیز شد. سپس عصاره‌ها به­مدّت 15 دقیقه با سرعت xg 10000 و در دمای C˚4 سانتریفیوژ شدند. پس از انجام این مرحله، محلول رویی به­آرامی به میکروتیوب‌های جدید انتقال داده شد و برای بررسی پروتئین کل و آنزیم­های آنتی­اکسیدان استفاده شد. اندازه­گیری پروتئین طبق روش برادفورد (Bradford, 1976) با اندکی تغییر انجام شد.

فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (SOD) با سنجش مهار احیای نوری نیترو بلو تترازولیوم (NBT) طبق روش Giannotolitis & Ries (1997) انجام شد. در این روش، بعد از افزودن 100 میکرولیتر عصاره­ی آنزیمی به بافر واکنش شامل بافر فسفات 50 میلی­مولار (8/7pH=) حاوی EDTA 1/0 میلی­مولار، کربنات­سدیم 50 میلی‌مولار، ال^_متیونین 12 میلی­مولار، ریبوفلاوین یک میکرومولار و NBT 75 میکرومولار، نمونه­ها به­مدّت 10 دقیقه در معرض نور فلورسنت (μmol m⁻²s⁻¹ 45) قرار گرفتند. برای اندازه­گیری فعالیت آنزیمی، نمونه­های شاهد و بلانک تهیه شد که حاوی مخلوط واکنش به­جز عصاره­ی آنزیمی بودند. سپس نمونه­ی شاهد مانند سایر نمونه­ها در معرض نور قرار گرفت. میزان جذب در نمونه­های آنزیمی و شاهد به­واسطه تشکیل فورمازان در طول موج 560 نانومتر خوانده شد. اختلاف جذب نمونه‌ها و شاهد، مهار احیای نوری NBT را در حضور آنزیم SOD موجود در نمونه­ها نشان می‌دهد. فعالیت آنزیم بر حسب واحد آنزیم به ازای هر میلی­گرم پروتئین بیان شد.

فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) با بررسی کاهش جذب H₂O₂ در طول­موج 240 نانومتر در دو دقیقه طبق روش Aebi (1974) اندازه‌گیری شد. در این روش، مخلوط واکنش شامل 800 میکرولیتر فسفات سدیم بافر 50 میلی­مولار (7pH=) و 100 میکرولیتر آب ‌اکسیژنه 37%  و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. میزان فعالیت آنزیم توسط ضریب خاموشی معادل mM^-1cm^-1 36 محاسبه و بر حسب واحد آنزیم به ازای هر میلی­گرم پروتئین بیان شد.

فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX) با آسکوربیک اسید و میزان کاهش جذب آن طبق روش Asada & Nakano (1981) انجام شد. مخلوط واکنش شامل 675 میکرولیتر محلول EDTA 2/0 مولار، 175 میکرولیتر محلول اسید آسکوربیک 5/0 میلی­مولار، 50 میکرولیتر H₂O₂ 250 میلی­مولار و 100 میکرولیتر عصاره گیاهی بود. به­دنبال اکسید شدن آسکوربیک اسید با آغاز واکنش آنزیمی، کاهش جذب در 290 نانومتر، 2 دقیقه پس از آغاز واکنش نسبت به زمان آغاز واکنش محاسبه شد. میزان فـعالیت آنزیم با استفاده از ضریب خاموشی معادل mM^-1cm^-1 8/2 محاسبه و بر حسب واحد آنزیم به ازای هر میلی­گرم پروتئین بیان شد.

فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز (GPX) توسط گایاکول و اندازه‌گیری میزان جذب تتراگایاکول براساس روش Kao & Lin (1999) اندازه­گیری شد. مخلوط واکنش شامل 800 میکرولیتر بافر فسفات 50 میلی­مولار (7=pH)، 10 میکرولیتر H₂O₂ 19 میلی­مولار، 150 میکرولیتر گایاکول 9 میلی­مولار و 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. میزان جذب تتراگایاکول در 470 نانومتر در لحظه آغاز واکنش پس از افزودن عصاره آنزیمی و پس از یک دقیقه خوانده شد. میزان فـعالیت آنزیم با استفاده از ضریب خاموشی معادل mM^-1cm^-1 6/26 محاسبه و بر حسب واحد آنزیم به ازای هر میلی­گرم پروتئین بیان شد.

ارزیابی مواد مؤثره اسانس

در این پژوهش، جهت استخراج اسانس از متانول 80% به­عنوان حلال و دستگاه اسانس­گیری سوکسله استفاده شد (Mokhtassi Bidgoli et al., 2013). برای شناسایی مواد مؤثره اسانس از دستگاه گاز کروماتوگراف جرم سنجی (GC/MS) مدل Hewlett-Packard-589 (شرکت Agilent، آمریکا) دارای سیستم تله یونی استفاده شد که در آن انرژی یونیزاسیون 70 الکترون­ولت و درجه حرارت C˚250، برای تولید منبع یون تنظیم شد (Davies, 1990). شناسائی هر ترکیب براساس زمان بازداری و جرم ثبت شده آن­ها انجام شد.

محاسبات آماری

تمام آزمایش­ها به صورت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کامل تصادفی با سه تکرار انجام شد. داده­ها با نرم­افزار SPSS به روش آنالیز واریانس یک­طرفه (TWO-Way ANOVA) مورد تجزیه آماری قرار گرفتند. مقایسه میانگین داده­ها براساس آزمون چنددامنه­ای دانکن و سطوح معنی­دار بودن تیمارها در سطح P≤0/05 انجام شد.

نتایج

اثرات نانوذرات مغناطیسی و سالیسیلیک اسید بر پارامترهای رشد

نتایج محاسبات آماری نشان دادند بین سطوح مختلف تیمارهای اعمال شده از لحاظ صفات، طول و وزن تر و خشک اندام­هوایی و ریشه اختلاف معنی­داری وجود دارد. همان­طور که در شکل A1 نشان داده شده است، تمام غلظت­های نانوذرات مغناطیسی (MNPs) به­استثنای بالاترین غلظت آن (200  میلی­گرم بر لیتر)، به­طور معنی­داری سبب کاهش طول اندام­هوایی نسبت به شاهد شد (Adabavazeh et al., 2022). کاربرد سالیسیلیک اسید (SA) به­تنهایی در سطح 05/0 میلی­مولار بیشترین تأثیر را در افزایش طول اندام­هوایی داشت (5/40%)، با وجود اینکه در سطح 1/0 میلی­مولار تفاوت معنی­داری با شاهد مشاهده نشد. علاوه­بر این، MNPs در ترکیب با SA در تمامی سطوح در مقایسه با شاهد طول اندام­هوایی را به­طور معنی­داری افزایش داد. طول ریشه نیز با قرار گرفتن در معرض تمام غلظت­های MNPs به­طور معنی­داری نسبت به شاهد کاهش نشان داد، به­طوری­که در غلظت 100 میلی­گرم بر لیتر آن بیشترین کاهش ارتفاع ریشه (حدوداً 47% کاهش)، مشاهده شد (شکل B1) (Adabavazeh et al., 2022). تیمار SA در سطح 05/0 میلی­مولار به­تنهایی و در ترکیب با MNPs سبب بهبود رشد ریشه نشد، به­جز در غلظت 50 میلی­گرم بر لیتر که منجر به افزایش 33درصدی طول ریشه در مقایسه با سطح بدون تیمار شد. سطح 1/0 میلی­مولار SA نیز به­تنهایی و در ترکیب با دو سطح 50 و 100 میلی­گرم بر لیتر MNPs به­ترتیب 6/28، 5/38 و 4/30% طول ریشه را نسبت به شاهد افزایش داد.

شکل 1- اثر نانوذرات مغناطیسی (MNPs) و سالیسیلیک اسید (SA) بر طول اندام­هوایی(A)  و طول ریشه(B)  در گیاهچه­های استبرق. مقادیر، میانگین سه تکرار ±SE  است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار براساس آزمون دانکن (P ≤ 0.05) است.

Figure 1- Effect of magnetic nanoparticles and salicylic acid on shoot length (A) and root length in C. procera seedlings. Values represent the mean of three replicates ± standard errors, and similar letters are significantly different according to Duncan's test (P ≤ 0.05).

نتایج نشان دادند نسبت به شاهد، تمامی سطوح تیمار موجب افزایش معنی­داری در وزن تر و خشک اندام­هوایی و ریشه شد. بیشترین میزان وزن تر اندام هوایی تحت تیمار 200 میلی­گرم بر لیتر MNPs تا حدود 62% و ریشه تحت تیمار 05/0 میلی­مولار SA تا 116% مشاهده شد (شکل A-B2). تأثیر تیمارهای اعمال شده بر وزن خشک اندام­هوایی و ریشه از لحاظ آماری تقریباً یکسان بود. کمترین میزان وزن خشک ریشه در سطح 05/0 میلی­مولار SA همراه با 50 میلی­گرم بر لیتر MNPs (22% کاهش) و بیشترین میزان تحت تیمار 05/0 میلی­مولار SA به­تنهایی (5/55% در ریشه و 8/99% در اندام­هوایی) نسبت به شاهد مشاهده شد (شکل C-D2).

شکل 2- اثر نانوذرات مغناطیسی (MNPs) و سالیسیلیک اسید (SA) بر وزن تر اندام­هوایی(A) ، وزن تر ریشه(B) ، وزن خشک اندام­هوایی(C)  و وزن خشک ریشه(D)  در گیاهچه­های استبرق. مقادیر، میانگین سه تکرار ±SE  است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار براساس آزمون دانکن (P ≤ 0.05) است.

Figure 2- Effect of magnetic nanoparticles (MNPS) and salicylic acid (SA) on shoot fresh weight (A), root fresh weight (B), shoot dry weight (C), and root dry weight (D) in C. procera seedlings. Values represent the mean of three replicates ± standard errors, and similar letters are significantly different according to Duncan's test (P ≤ 0.05).

اثرات نانوذرات مغناطیسی و سالیسیلیک اسید بر میزان رنگیزه­های فتوسنتزی

براساس نتایج به­دست آمده، میزان کلروفیل و کاروتنوئید در گیاهچه­های استبرق به­طور قابل ‌توجهی تحت تأثیر تیمارهای MNPs و SA قرار گرفت. همان­طور که در شکل A3 مشخص است تمامی سطوح تیمار سبب افزایش معنی­داری در میزان کلروفیل a شد. بیشترین میزان کلروفیل a (%151 نسبت به شاهد) تحت تیمار 1/0 میلی­مولار SA حاصل شد. میزان کلروفیل b تحت تأثیر MNPs به­طور معنی­داری کاهش یافت، به­استثنای غلظت 200 میلی­گرم بر لیتر، که در آن میزان کلروفیل b 2/1 برابر شاهد بود (شکل B3) (Adabavazeh et al., 2022). در بررسی اثر تیمار SA نیز مشخص شد که هیچ­کدام از غلظت­های SA تأثیر معنی­داری بر میزان کلروفیل b نداشتند. همچنین، میزان کلروفیل b در ترکیب 200 میلی‌گرم بر لیتر MNPs همراه با 1/0 میلی­مولار SA  نسبت به شاهد کاهش یافت. غلظت 1/0 میلی­مولار SA به­تنهایی و همچنین در ترکیب با MNPs بیشترین تأثیر را در افزایش کلروفیل کل و کاروتنوئید داشت (شکل C-D3).

شکل 3- اثر نانوذرات مغناطیسی (MNPs) و سالیسیلیک اسید (SA) بر میزان کلروفیلa  (A)، کلروفیل(B) b ، کلروفیل کل(C)  و کاروتنوئید(D)  در گیاهچه­های استبرق. مقادیر، میانگین سه تکرار ±SE  است. حروف یکسان  بیانگر عدم اختلاف معنی­دار براساس آزمون دانکن (P ≤ 0.05) است.

Figure 3- Effect of magnetic nanoparticles (MNPS) and salicylic acid (SA) on the amount of chlorophyll a (A), chlorophyll b (B), total chlorophyll (C), and carotenoids (D) in C. procera seedlings. Values represent the mean of three replicates ± standard errors, and similar letters are significantly different according to Duncan's test (P ≤ 0.05).

اثرات نانوذرات مغناطیسی و سالیسیلیک اسید بر پیش­سازهای کلروفیل

یافته­ها نشان دادند تیمار 100 میلی­گرم بر لیتر MNPs همراه با 05/0 میلی­مولار SA منجر به افزایش قابل­توجهی در میزان پیش­سازهای مسیر بیوسنتزی کلروفیل از جمله پروتوپورفیرین (83%)، منیزیم پروتوپورفیرین (9%) و کلروفیلید b (23%) در مقایسه با شاهد شد (شکل A-B-E4). علاوه­بر ­این، پروتوکلروفیلید نیز تحت تیمار 150 میلی­گرم بر لیتر MNPs همراه با 05/0 میلی­مولار SA تا 80% نسبت به شاهد افزایش نشان داد (شکل C4). همچنین در تمامی سطوح تیمار افزایش معنی­داری در مقدار کلروفیلید a نسبت به شاهد مشاهده شد و بیشترین میزان آن در سطح 1/0 میلی­مولار SA حاصل شد، که مقدار آن تقریباً 4 برابر شاهد بود (شکل D4). در مقدار کلروفیلید b نسبت به شاهد تفاوت معنی‌داری مشاهده نشد (شکل E4).

شکل 4- اثر نانوذرات مغناطیسی (MNPs) و سالیسیلیک اسید (SA) بر میزان پروتوپورفیرین (A)، منیزیم پروتوپورفیرین(B) ، پروتوکلروفیلید(C) ، کلروفیلید(D) a  و کلروفیلید b (E) در گیاهچه­های استبرق. مقادیر، میانگین سه تکرار ±SE  است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار براساس آزمون دانکن (P ≤ 0.05) است.

Figure 4- Effect of magnetic nanoparticles (MNPS) and salicylic acid (SA) on the amount of protoporphyrin IX (A), magnesium protoporphyrin (B), protochlorophyllide (C), chlorophyllide a (D), and chlorophyllide b (E) in C. procera seedlings. Values represent the mean of three replicates ± standard errors, and similar letters are significantly different according to Duncan's test (P ≤ 0.05).

اثرات نانوذرات مغناطیسی و سالیسیلیک اسید بر میزان عناصر آهن، پتاسیم، کلسیم و منیزیم

تغییرات میزان آهن، منیزیم، پتاسیم و کلسیم گیاهچه­ها در پاسخ به بالاترین سطح MNPs و SA در جدول 1 ارائه شده است. در مقایسه با شاهد، محتوای آهن به­طور قابل توجهی در پاسخ به تیمارهای اعمال شده افزایش یافت. همچنین روند مشابهی در محتوای منیزیم و کلسیم مشاهده شد. در حالی­که میزان پتاسیم در 1/0 میلی­مولار SA با شاهد اختلاف معنی­داری نداشت و در ترکیب با MNPs افزایش یافته و به حداکثر میزان رسید. با توجه به داده­های ارائه شده در جدول 1، تیمار 1/0 میلی­مولار SA در ترکیب با 200 میلی­گرم بر لیتر MNPs نسبت به SA و MNPs به­صورت مجزا بهترین اثر را بر میزان عناصر داشت.

جدول 1- اثر نانوذرات آهن مغناطیسی (MNPs) و سالیسیلیک اسید (SA) بر عناصر غذایی گیاهچه­های استبرق

Table 1- Effect of magnetic nanoparticles (MNPS) and salicylic acid (SA) on nutritional elements of C. procera seedlings

مقادیر، میانگین سه تکرا ر و حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار براساس آزمون دانکن (P ≤ 0.05) است.

Values represent the mean of three replicates and similar letters denote significant differences according to Duncan’s test (P ≤ 0.05).

اثرات نانوذرات مغناطیسی و سالیسیلیک اسید بر درصد نشت الکترولیتی غشاء

همان­طور که در شکل 5 نشان داده شده است، میزان درصد نشت الکترولیتی غشاء در گیاهچه­های استبرق به­طور قابل ­توجهی تحت تأثیر تیمارهای اعمال شده نسبت به شاهد کاهش یافت. در مقایسه با شاهد، در گیاهچه­های تیمار شده با 50 میلی­گرم بر لیتر MNPs و گیاهچه­های رشدیافته در 05/0 میلی­مولار SA همراه با 200 میلی­گرم بر لیتر MNPs کمترین نشت یونی (حدوداً 30%) مشاهده شد.

شکل 5- اثر نانوذرات مغناطیسی (MNPs) و سالیسیلیک اسید (SA) بر میزان نشت الکترولیتی در گیاهچه­های استبرق. مقادیر، میانگین سه تکرار ±SE  است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار براساس آزمون دانکن (P ≤ 0.05) است.

Figure 5- Effect of magnetic nanoparticles (MNPS) and salicylic acid (SA) on the amount of electrolyte leakage in C. procera seedlings. Values represent the mean of three replicates ± standard errors, and similar letters are significantly different according to Duncan's test (P ≤ 0.05).

اثرات نانوذرات مغناطیسی و سالیسیلیک اسید بر مقدار H₂O₂، MDA،  قند محلول و پروتئین محلول

مقایسه نتایج داده­ها نشان دادند محتوای H₂O₂ در برگ تیمار شده با 100 میلی­گرم بر لیتر MNPs افزایش یافته و به حداکثر مقدار (18/14 میکرومول در گرم وزن تر) رسیده است. در مقابل، سطح H₂O₂ زمانی­که گیاه در معرض 150 و 200 میلی‌گرم بر لیتر MNPs در مقایسه با شاهد قرار داشت، به­طور معنی‌داری کاهش یافت (شکل A6) (Adabavazeh et al., 2022). علاوه­بر این، در میزان H₂O₂ در تمامی سطوح حاوی 05/0 میلی­مولار SA نسبت به شاهد کاهش معنی­داری مشاهده شد، در حالی­که SA به‌تنهایی در سطح 1/0 میلی­مولار سبب %7 افزایش و در ترکیب با تمام غلظت­های MNPs موجب کاهش معنی­دار میزان H₂O₂ شد.

داده‌های ارائه ‌شده در شکل B6 نشان می‌دهند در بین غلظت­های MNPs زمانی که به­تنهایی اعمال شد، فقط غلظت 150 میلی‌گرم بر لیتر آن به‌طور معنی­داری مقدار MDA را در برگ‌ها نسبت به شاهد افزایش داد (61%) و در سایر سطوح نسبت به شاهد از نظر آماری تفاوت معنی­داری مشاهده نشد (Adabavazeh et al., 2022). در بررسی اثر متقابل MNPs و SA نیز تنها سطح 1/0 میلی­مولار SA با تمام غلظت­های MNPs به­استثنای کمترین غلظت آن به کاهش MDA منجر می­شود. به­طوری­که در مقایسه با شاهد، میزان MDA در سطح 1/0 میلی­مولار SA با دو غلظت 150 و 200 میلی­گرم بر لیتر MNPs به‌ترتیب 64 و 40% کاهش نشان داد.

محتوای قندهای محلول به­تدریج با افزایش غلظت MNPs افزایش یافت، در حالی­که بین دو غلظت SA تفاوت معنی­داری مشاهده نشد و هر دو منجر به افزایش مقدار قند محلول شدند (حدوداً 4/1 برابر شاهد) (شکل C6). تأثیر متقابل MNPs و SA بر مقدار قند محلول برگ­ها نیز معنی­دار بود و اعمال دو نوع تیمار با هم منجر به افزایش معنی­داری در مقدار قند محلول شد. کمترین و بیشترین مقدار قند محلول در برگ به­ترتیب در شاهد و نمونه تیمار شده با 200 میلی­گرم بر لیتر MNPs مشاهده شد.

محتوای پروتئین به­طور قابل­توجهی با تیمار MNPs در مقایسه با شاهد افزایش نشان داد. بالاترین مقدار در 100 میلی­گرم بر لیتر MNPs، در حدود دو برابر بیشتر از شاهد مشاهده شد (شکل D6). با این­حال، کاهش مشاهده شده در محتوای پروتئین در 150 و 200 میلی‌گرم بر لیتر به‌طور محسوسی نسبت به شاهد افزایش یافته است (تقریباً 2/1 برابر). در مقایسه دو غلظت SA بر مقدار پروتئین، 1/0 میلی­مولار سبب 6/45% افزایش و 05/0 میلی­مولار منجر به 2/15% افزایش نسبت به شاهد شد. در سایر غلظت­ها نیز در مقایسه با شاهد افزایش مشاهده شد.

شکل 6- اثر نانوذرات مغناطیسی (MNPs) و سالیسیلیک اسید (SA) بر میزانH₂O₂  (A)، (B) MDA، قند محلول(C)  و پروتئین محلول (D) در گیاهچه­های استبرق. مقادیر، میانگین سه تکرار ±SE  است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار براساس آزمون دانکن (P ≤ 0.05) است.

Figure 6- Effect of magnetic nanoparticles (MNPS) and salicylic acid (SA) on H₂O₂ (A), MDA (B), total protein (C), and soluble sugar (D) contents in C. procera seedlings. Values represent the mean of three replicates ± standard errors, and similar letters are significantly different according to Duncan's test (P ≤ 0.05).

اثرات نانوذرات مغناطیسی و سالیسیلیک اسید بر فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان

در بررسی تأثیر MNPs و SA بر میزان فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان (SOD، CAT، APX و GPX)، تفاوت­های معنی­داری در فعالیت آنزیمی در گیاهان تیمار شده مشاهده شد. با توجه به نتایج نشان داده شده در شکل A7، فعالیت آنزیم SOD با غلظت­های مختلف MNPs در مقایسه با شاهد به‌طور قابل­ توجهی کاهش داشت، در حالی­که تحت تیمار  توأم در سطح 100 و 150 میلی­گرم بر لیتر MNPs با 1/0 میلی­مولار SA، فعالیت آنزیم به­ترتیب 54 و 61% افزایش یافت. بیشترین فعالیت آنزیم CAT در سطح 50 میلی­گرم بر لیتر MNPs مشاهده شد که 3 برابر فعالیت آنزیم در نمونه شاهد بود (شکل B7). همچنین در بررسی تأثیر متقابل SA و MNPs بر میزان فعالیت آنزیم CAT مشخص شد غلظت 1/0 میلی­مولار SA همراه با غلظت­های مختلف MNPs سبب افزایش فعالیت آنزیم شد، در حالی­که 05/0 میلی­مولار SA در ترکیب با غلظت‌های مختلف MNPs به­استثنای 200 میلی­گرم بر لیتر، تفاوت معنی­داری در فعالیت آنزیم با شاهد ایجاد نکرد. در بررسی اثر تیمار MNPs به­تنهایی بر فعالیت آنزیم APX، همان­طور که شکل C7 نشان می­دهد، غلظت 200 میلی­گرم بر لیتر MNPs منجر به افزایش فعالیت آنزیم (3/1 برابر بیشتر از شاهد) شد و در سایر غلظت­های آن تفاوت معنی­داری با شاهد مشاهده نشد (Adabavazeh et al., 2022). در بین نمونه­های تیمار شده با غلظت­های مختلف MNPs و SA نیز برگ­های تیمار شده با 100 میلی‌گرم بر لیتر MNPs همراه با 05/0 میلی­مولار SA بیشترین فعالیت آنزیم APX را نشان دادند و مقدار آن­ 203% افزایش نسبت به شاهد بود.

با توجه به شکل D7، با افزایش غلظت  MNPsتا 150 میلی­گرم بر لیتر فعالیت آنزیم GPX به­تدریج افزایش یافت و سپس در بالاترین غلظت MNPs (200 میلی­گرم بر لیتر) فعالیت آنزیم به­طور قابل­توجهی کاهش پیدا کرد. بیشترین فعالیت آنزیم GPX نیز در گیاهان رشدیافته تحت تیمار 05/0 میلی­مولار SA مشاهده شد که فعالیت آنزیم را تا 176% نسبت به شاهد افزایش داد.

شکل 7- اثر نانوذرات مغناطیسی (MNPs) و سالیسیلیک اسید (SA) بر فعالیت آنزیم SOD (A)،(B) CAT ،APX  (C) و GPX (D) در گیاهچه­های استبرق. مقادیر، میانگین سه تکرار ±SE  است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار براساس آزمون دانکن (P ≤ 0.05) است.

Figure 7- Effect of magnetic nanoparticles (MNPS) and salicylic acid (SA) on SOD (A), CAT (B), APX (C), and GPX (D) activityies in C. procera seedlings. Values represent the mean of three replicates ± standard errors, and similar letters are significantly different according to Duncan's test (P ≤ 0.05).

اثرات نانوذرات مغناطیسی و سالیسیلیک اسید بر ترکیبات اصلی اسانس

در بررسی تأثیر MNPs و SA بر ترکیبات اسانس برگ گیاهچه­های رشدیافته تحت شرایط هیدروپونیک مشخص شد تیمار توأم MNPs با SA بیشترین اثر را بر روی ترکیبات اصلی اسانس داشت (جدول 2). برای مثال، میزان سیترونلال و کافور که از ترکیبات اصلی اسانس برگ هستند، تحت تیمار 1/0 میلی­مولار SA همراه با 50 و 100 میلی­گرم بر لیتر MNPs به­ترتیب 71/435% و 6/391% افزایش یافت. به­همین­ترتیب، 8/1_- سینئول، ژرانیال، A_- فلاندرن و آلفا_- پینن ترکیبات مهم دیگری هستند که به­ترتیب 8/5، 5/5، 5 و 8/3 برابر بیشتر از شاهد تحت تیمار 200 میلی­گرم بر لیتر MNPs و 1/0 میلی­مولار SA افزایش نشان دادند.

جدول2- اثر نانوذرات مغناطیسی (MNPs) و سالیسیلیک اسید (SA) بر ترکیبات اصلی اسانس گیاهچه­های استبرق با GC/MS

Table 2- Effect of magnetic nanoparticles (MNPS) and salicylic acid (SA) on the main essential oil constituents of C. procera seedlings using GC/MS

مقادیر، میانگین سه تکرار و حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار براساس آزمون دانکن (P ≤ 0.05) است.

Values represent the mean of three replicates and similar letters denote significant differences according to Duncan’s test (P ≤ 0.05).

بحث

در بررسی تأثیر MNPs سنتزشده در گیاهچه‌های استبرق رشدیافته در شرایط هیدروپونیک، نتایج نشان دادند افزودن MNPs در غلظت معین (200 میلی­گرم بر لیتر) منجر به افزایش فاکتورهای ریخت شناسی از جمله طول اندام هوایی، وزن تر و خشک اندام­هوایی و ریشه شدند (Adabavazeh et al., 2022). این نتایج با پژوهش­های قبلی انجام شده توسط Ngan و همکاران (2020) همخوانی داشت؛ آن­ها گزارش کردند آهن در بهبود رشد و بازده ریشه­زایی در گیاهان نقش دارد. در گیاه سویا، محلول­پاشی برگی و خاکی نانوذرات مغناطیسی تأثیر مثبت بر فاکتورهای رشد گیاه داشت و در پژوهش حاضر مشخص شد محلول­پاشی برگی مؤثرتر از روش خاکی بود (Alidoust & Isoda, 2013). یکی از دلایل احتمالی افزایش رشد تحت تأثیر تیمار MNPs افزایش غلظت کلروفیل و سرعت فتوسنتز است. پژوهش­های قبلی نشان دادند تیمار نانوذرات آهن به­طور قابل­ توجهی پتانسیل افزایش کلروفیل و فاکتورهای رشد را دارند و ارتباط مثبت بین محتوای کلروفیل و محتوای آهن را تأیید می­کنند (Sheykhbaglou et al., 2018 Iannone et al., 2016;) و با نتایج ما همخوانی دارد.آهن یک واسطه­ی مهم برای زنجیره انتقال الکترون، سنتز ⁺NADP در طی فتوسنتز، بیوسنتز سیتوکروم­ها، کمک به سنتز 5-آمینو لوولینیک اسید (پیش­ساز کلروفیل) است که ممکن است از این روش، تأثیر مثبتی بر رشد و بهره­وری گیاه داشته باشد (Ngan et al., 2020). همچنین در پژوهش حاضر، افزایش مقدار پروتوپورفیرین با افزایش کلروفیلید a نیز نشانه­ی اثر احتمالی MNPs و SA بر مسیر بیوسنتزی کلروفیل a است و شامل سلسله واکنش­های آنزیمی از تبدیل شدن آمینواسید گلوتامیک به پروتوپورفیرینوژن، پروتوپورفیرین و سپس کلاته شدن با منیزیم و تولید مولکول منیزیم پروتوپورفیرین است که در نهایت پس از تبدیل شدن به پروتوکلروفیلید، کلروفیلید a بوجود می­آید که می­تواند به کلروفیل a تبدیل شود (Taiz et al., 2015).

یکی دیگر از دلایل احتمالی افزایش رشد تحت تأثیر تیمار MNPs ممکن است به­دلیل افزایش جذب عناصر معدنی به­ویژه آهن باشد. طی بررسی انجام شده تأثیر نانواکسید و اکسید آهن معمولی بر غلظت آهن در گیاه گندم، مشخص شد که نانواکسید آهن نسبت به اکسید آهن معمولی در افزایش غلظت آهن در گیاه مؤثرتر بود (Mazaherinia et al., 2010). پژوهش Abdi و همکاران (2008) نیز پتانسیل نانوذرات آهن در جذب و انتقال مواد مغذی محلول، به­ویژه منیزیم، یکی دیگر از مواد معدنی مهم دخیل در سنتز کلروفیل و نیز کلسیم و پتاسیم، به­عنوان مواد معدنی ضروری با بیشترین تقاضا در رشد و نمو گیاه را تأیید نمود. Ngan و همکاران (2020) نشان دادند نانوذرات آهن در غلظت معین سبب بهبود جذب کلسیم، پتاسیم و منیزیم و در نتیجه رشد گیاهچه‌های میخک (Dianthus caryophyllus) شده که با نتایج ما همخوانی دارد.  Wei & Wang (2013) نیز گزارش نمودند نانوذرات مغناطیسی با فعالیت شبه­پراکسیدازی ذاتی و کاهش H₂O₂ و نیز به­واسطه آزادسازی آهن آزاد در اثر تجزیه لیزوزومی نانوذرات آهن در سلول و در نتیجه تشدید پیشرفت چرخه­های سلولی می­توانند سبب افزایش رشد سلول شوند.

با وجود این در پژوهش حاضر، تأثیر متقابل MNPs و SA تأثیر بیشتری بر بهبود فاکتورهای رشد در گیاه استبرق نسبت به هر کدام از تیمارها به­صورت جداگانه داشت که با نتایج گزارش شده توسط Mozafari و همکاران (2018) همخوانی داشت. همچنین پژوهش­های متعدد نشان دادند SA با تأثیر بر ساختار کلروپلاست، میزان فتوسنتز، فعالیت آنزیم روبیسکو، مقدار رنگیزه­های فتوسنتزی و کاهش نشت یونی گیاه منجر به بهبود فاکتورهای رشد در گیاهان می­شود (Popova et al., 2009؛ Korkmaz et al., 2007).

در این پژوهش، برای ارزیابی سمیّت MNPs سنتز شده در غلظت­های بالا در گیاه علاه­بر رشد، نشت الکترولیتی غشاء، میزان پراکسیدهیدروژن و پراکسیداسیون لیپیدها نیز بررسی شدند؛ به علّت آن­که، لیپیدهای غشای پلاسمایی یکی از اولین ساختارهای سلول گیاهی هستند که در شرایط تنشی به­دنبال افزایش ترکیبات فعال اکسیژن (ROS) آسیب می­بینند. افزایش ROS به بسیاری از ساختارها و اجزای سلول نظیر پروتئین­ها، کربوهیدرات­ها و اسیدهای نوکلئیک آسیب زده و با تغییر ساختار غشاء در اثر پراکسیداسیون چربی­ها و پروتئین­ها، سبب افزایش تراوایی غشای سلولی شده و منجر به نشت الکترولیت­های داخل سلولی به سمت بیرون می­شود و رشد گیاه را تحت تأثیر قرار می­دهد. در پژوهش حاضر، با کاربرد MNPs میزان نشت یونی گیاه استبرق نسبت به گروه شاهد کمتر شد و با نتایج Banijamali (2019) در گل داوودی تحت تأثیر نانوذرات سوپرپارامغناطیس اکسید آهن با پوشش اسیدهیومیک همخوانی داشت. Rawat و همکاران (2017) نیز گزارش نمودند محلول­پاشی نانوذرات سولفیدآهن در غلظت بهینه 4 میلی­گرم بر لیتر موجب کاهش نشت یونی و پراکسیداسیون غشای سلولی در گیاه خردل شد. در این پژوهش، میزان H₂O₂، علی­رغم پژوهش­های قبلی مبنی بر افزایش سطوح H₂O₂ با کاربرد نانوذرات فلزی (Hashemi et al., 2019؛ Ma et al., 2015)، با بالاترین غلظت­های MNPs (150 و 200 میلی­گرم بر لیتر) در مقایسه با شاهد کاهش نشان داد. پژوهش­ها نشان دادند MNPs در غلظت مناسب فعالیت شبه­پراکسیدازی در سلول داشته که می­تواند سبب کاهش H₂O₂ و کاهش تنش اکسیداتیو در سلول شود و از دلایل افزایش مقاومت سلول در برابر تنش­های اکسیداتیو هستند (Pariona et al., 2016). با این­حال، کاربرد SA همراه با MNPs تأثیر مثبت و بهبوددهنده­تری در کاهش میزان نشت مواد محلول از غشاء، همچنین میزان H₂O₂ و MDA در گیاهچه­های استبرق داشت و این یافته­ها با نتایج Dedejani (2016) همخوانی دارد. تأثیر مثبت SA در افزایش پایداری غشاء می­تواند به علّت افزایش میزان پلی­آمین­های پوترسین، اسپرمیدین و اسپرمین باشد که از این طریق به یک­پارچگی و حفظ غشاء کمک می­کند (Nemeth et al., 2002). علاوه­بر این، حضور کارتنوئیدها در فاز چربی غشاء نیز به حفظ غشاء در شرایط نامناسب محیطی کمک می­کند. از این­رو افزایش کارتنوئید با تیمار MNPs و SA در گیاه استبرق می­تواند در کاهش نشت یونی نقش مؤثری داشته باشد. مشابه این نتایج، تیمار همزمان FeNPs و SA، میزان کارتنوئید را در توت­فرنگی افزایش و در مقابل میزان نشت یونی، H₂O₂ و MDA را کاهش داده است (Dedejani, 2016).

از یافته­های دیگر پژوهش حاضر، افزایش محتوای قندهای محلول و پروتئین محلول تحت تأثیرMNPs  و SA بود. پژوهش­های قبلی نشان دادند آهن به­عنوان کوفاکتور تنظیمی آنزیم­های مختلف می‌تواند بر تمام متابولیسم‌های گیاه تأثیر بگذارد. اگرچه، نانوذرات آهن در مقایسه با فلز آهن می­تواند سریعتر و کاملتر توسط گیاهان جذب شود، که سبب می شود گیاهان بتوانند از مواد مغذی موجود در آن­ استفاده کنند و رشد پربارتری داشته باشند (Askary et al., 2017). بر این اساس، به نظر می‌رسد که نانوذرات اکسید آهن می‌توانند ⁺Fe² مورد نیاز را برای واکنش‌های آنزیمی درگیر در متابولیسم قندها و نیتروژن در دسترس گیاه قرار دهند و متابولیسم قند و پروتئین را افزایش دهند. به‌طور مشابه، افزایش قند و محتوای پروتئین در پاسخ به نانوذرات اکسید آهن نیز توسط پژوهشگران مختلف گزارش شده است (Sheykhbaglou et al., 2018؛ Vadivel et al., 2012). با وجود این، در این پژوهش، نانوذرات زمانی که با SA استفاده شد به­طور قابل‌توجهی مؤثرتر بود. تعدادی از پژوهش­ها نشان دادند تیمار SA با فعالیت افزایش ساکارز فسفات سنتاز، آنزیم اصلی در سنتز ساکارز (Dong et al., 2011) و نیترات ردوکتاز، آنزیم کلیدی برای جذب نیتروژن (Fariduddin et al., 2003) بر متابولیسم کربوهیدرات و پروتئین تأثیر می­گذارد.

یکی دیگر از فاکتورهایی که جهت بررسی آسیب اکسیداتیو احتمالی ناشی از تیمار MNPs در گیاه بررسی شد، سیستم آنتی­اکسیدانت آنزیمی بود؛ در این پژوهش، فعالیت SOD در گیاهچه­های استبرق کاهش قابل توجهی در تمام تیمارهای MNPs اعمال شده نشان داد، اما CAT در 50 میلی‌گرم بر لیتر و APX در بالاترین غلظت MNPs (200 میلی­گرم بر لیتر) به­طور قابل توجهی افزایش داشت. فعالیت GPX نیز با افزایش غلظت MNPs تا 150 میلی­گرم بر لیتر افزایش و در بالاترین غلظت MNPs کاهش یافت. با توجه به این نتایج، احتمالاً منابع دیگری برای تولید H₂O₂ در گیاه، به غیر از تولید H₂O₂ ناشی از فعالیت SOD وجود داشته است، از جمله برخی از واکنش‌های درگیر در فتوسنتز و تنفس، که ROS از محصولات جانبی اجتناب‌ناپذیر آن‌ها است. نتایج این پژوهش با یافته‌های Wang و همکاران (2011) که فعالیت‌­های مختلف SOD و CAT را در مواجهه با نانوذرات Fe₃O₄ نشان می‌داد همخوانی داشت. در مقایسه با پژوهش­های قبلی که اثر نانوذرات آهن را بر آسیب اکسیداتیو، تولید ROS و فعالیت­های آنتی‌اکسیدان‌ها گزارش کرده­اند، تفاوت در فعالیت آنزیمی گیاهان می­تواند به علّت تفاوت در شرایط سنجش، نوع و اندازه نانوذرات، غلظت و مدت زمان قرار گرفتن در معرض نانوذرات و مرحله رشد و نمو گیاه، گونه گیاه و نیز بافت مورد سنجش گیاه باشد (Ma et al., 2015). در پژوهش حاضر برای تقویت سیستم آنزیمی و غیرآنزیمی آنتی­اکسیدان و جهت کاهش آسیب­های اکسیداتیو احتمالی ناشی از MNPs در گیاه از SA استفاده شد. همان­طور که پژوهش­های قبلی نشان دادند، هنگامی­که SA در غلظت و زمان مناسب به­کار برده شود با تغییر فعالیت آنزیم­هایی نظیرSOD ، CAT، APX و POD یا NAD(P)H  اکسیداز متصل به غشای سیتوپلاسمی (آنزیم­های دخیل در تولید یا تجزیهH₂O₂ ) موجب افزایش موقت و جزیی در مقدار H₂O₂ (به­عنوان پیامبر ثانویه) شده که منجر به القای ظرفیت آنتی­اکسیدانی سلول می­شود (Horváth et al., 2007؛ Hayat et al., 2007). در پژوهش حاضر مشاهده شد تیمار SA در بالاترین غلظت همراه با 200 میلی­گرم بر لیترMNPs  سبب افزایش فعالیت آنزیم­های CAT و  APXشد، در مقابل تأثیر معنی­داری بر فعالیت SOD نداشت.

نتایج ما نشان دادند ترپن‌ها با طیف وسیعی از کاربردهای صنعتی و دارویی، ترکیبات اصلی اسانس گیاهچه­ها استبرق را تشکیل داده و MNPs و SA به­ویژه تأثیر متقابل آن­ها محرک‌های قوی برای القا آن­ها هستند. تغییر در متابولیت­های ثانویه و محتویات اسانس می­تواند به علّت تولید ROS، فعال شدن آنزیم­های آنتی­اکسیدانی و تنظیم یا تحریک بیان ژن­های خاص در مسیر بیوسنتزی آن­ها باشد و نشان‌­هنده سازوکار تطبیقی دیگری برای از بین بردن ROS تولید شده تحت تیمار غیرزیستی هستند. گزارش­های قبلی نشان داد که افزایش مشاهده­شده در غلظت ترپن­ها تحت تیمارهای غیرزیستی با تخصیص اسکلت کربن بین رشد و دفاع همبستگی دارد، در حقیقت در این شرایط، گیاه کربن کمتری را صرف رشد کرده و بخش بیشتر آن را به ساخت ترپن­ها، هیدروکربن­های موجود در اسانس، اختصاص می­دهد (Turtola et al., 2003). پژوهش Dubey و همکاران (2003) نیز نشان داد افزایش قندهای محلول، مهمترین محصول مستقیم فتوسنتز، در بیوسنتز اسانس مورد استفاده قرار می­گیرد که منجر به افزایش تولید اسانس می­شود و با یافته­های ما همخوانی داشت. براساس پژوهش­های قبلی در مورد پتانسیل Fe-NPs و SA در افزایش رنگدانه­های فتوسنتزی (Mozafari et al., 2018)، پیشنهاد می­شود هر دو تیمار با افزایش فرآیندهای فتوسنتز و متعاقب آن افزایش محتوای کربوهیدرات ممکن است سبب افزایش تولید متابولیت­های ثانویه شوند. احتمالاً برای ایجاد تعادل کربوهیدرات بین منبع و مخزن، گیاه کربوهیدرات‌های اضافی را به سمت تولید این متابولیت‌ها سوق داده است. یافته‌های پژوهش ما نیز نشان دادند محتوای قند محلول در برگ­ها به­طور قابل‌ توجهی با شدت MNPs و SA افزایش نشان داد و بیانگر این است که افزایش قند محلول ممکن است مسئول افزایش تولید اسانس باشد. این نتایج با یافته­های Ghasemzadeh  و همکاران (2010) وGuo  و همکاران (2011) همخوانی دارد.

جمع­بندی

به­طور کلی، نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد نانوذره سوپرپارامغناطیس اکسید آهن سنتز شده تا غلظت 200 میلی­گرم بر لیتر نه­تنها سبب تنش اکسیداتیو در گیاه استبرق نشد، بلکه به­عنوان یک الیسیتور مؤثر ضمن تأمین آهن مورد نیاز گیاه و افزایش محتویات کلروفیل و کارتنوئید، جذب عناصر غذایی و کاهش فعالیت آنزیم­های آنتی‌اکسیدانی با فعالیت شبه­پراکسیدازی خود، موجب افزایش معنی­دار صفات کمی و کیفی استبرق از جمله افزایش متابولیت­های دارویی شد. با وجود این، تأثیر متقابل نانوذرات اکسید آهن و سالیسیلیک اسید در افزایش زیست توده، محتویات کلروفیل، قندهای محلول، مواد مغذی، متابولیت­های ثانویه و اجزای اسانس و کاهش محتوای H₂O₂ و MDA در گیاهچه­های تیمار شده چشمگیرتر بود.

سپاسگزاری

نویسندگان مقاله از همکاری و مساعدت دانشکده علوم دانشگاه شهید باهنر کرمان و همه عزیزانی که در این پژوهش یاری نموده اند، سپاسگزاری می نمایند.