تأثیر اسید سالیسیلیک و اسید آبسیزیک بر شاخص‌های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی مرتبط با سازگاری به سرما در زیتون تلخ (.Melia azedarach L

مقدمه

زیتون تلخ (.Melia azedarach L) درختی خزان­پذیر از تیره زیتون­تلخیان است. این گونه بومی نواحی نیمه­گرمسیری استرالیا و آسیای جنوب­شرقی می­باشد که تا دمای حدود °C40 بدون مشکل خاصی رشد می­کند. در دمای گرم­تر نیز از بین نمی­رود، امّا از رشد و شادابی آن کاسته می­شود. با این حال، این گونه یک گیاه نیمه گرمسیری و حساس به سرما می­باشد. این درخت تحمّل به سرمای کمی داشته و در مناطقی با دمای هوای کمتر از °C10- ممکن است به طور کامل دچار یخ­زدگی شده و یا شاخساره درخت آسیب جدی ببیند (Batcher, 2008). با این حال عادت رشدی، رشد سریع، جنبه­های زینتی برگ، گل و میوه و نیز تحمّل به خشکی و آفت این درخت (Han et al., 2022) سبب توسعه کاشت آن در نقاط سردسیر کشور شده است. تاکنون بیشتر پژوهش­های انجام شده روی زیتون تلخ شامل بررسی فنولوژی، کشت و تولید بذر، تحمّل به تنش­های محیطی (شوری، خشکی، فلزات سنگین)، کارکرد دارویی، استفاده همه جانبه و ترکیبات شیمیایی موجود در پوست، برگ و میوه بوده است (Sultana et al., 2014; Han et al., 2022; Liao et al., 2022) و تحمّل به سرمای این درخت کمتر مورد بررسی قرار گرفته است. به این دلیل بهبود تحمّل به سرما و یخ­زدگی زیتون تلخ از اولویت­های کاشت این گونه چوبی در نقاط سردسیری می­باشد. تحمّل به سرما فرایندی پویا بوده و بافت­های مختلف گیاهان با دو سازوکار

اجتناب (فراسردی) و تحمّل یخ­زدگی به دمای­های پائین سازگار می­شوند. فرایند سازگاری به سرما با کاهش محتوای­ آب بافت­ها، تجمع تنظیم‌کننده‌های اسمزی از قبیل کربوهیدرات‌های محلول، اسیدهای آمینه، تغییر در محتوای تنظیم­کننده‌های رشد شامل افزایش اسید آبسیزیک و کاهش جیبرلین و رسوب بیشتر ترکیبات فنولی از قبیل چوب­پنبه و لیگنین در اپیدرم و فلس‌های جوانه همراه است(Karimi, 2017; Yang et al., 2018) . همچنین تنش سرما با تغییر سیالیت غشاء، پتانسیل آب کم، ترکیب لیپیدی، کاهش عرضه ATP، تجمع ترکیبات سمی، عدم تعادل عرضه یون و نشت املاح به غشای سلولی در گیاهان آسیب می رساند (Adhikari et al., 2022). از طرفی تحت تنش سرما، افزایش آنزیم‌های آنتی‌اُکسیدان (از قبیل سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گایاکول­پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز) سبب خنثی‌کردن فعالیت گونه‌های واکنش­پذیر اکسیژن (ROS) شده و از سامانه فتوسنتزی در برابر صدمات ایجاد شده در اثر تنش اکسایشی در بیشتر گونه‌های گیاهی محافظت می­کند (Pagter et al., 2008; Karimi et al., 2016).

 روش‌های مختلفی برای کاهش یا کنترل خسارت سرمازدگی در درختان وجود دارد. یکی از روش­های افزایش تحمّل به سرمازدگی، استفاده از تنظیم­کننده­های رشد از جمله اسید سالیسیلیک و اسید آبسیزیک است. اسید سالیسیلیک ضمن افزایش فعالیت آنتی­اکسیدانی، سبب کاهش سمیت رادیکال­های آزاد می­شود که بر اثر خسارت سرمازدگی تجمع یافته­اند و به این طریق خسارت ناشی از تنش سرمایی را کاهش می­دهد. همچنین، کاربرد اسید سالیسیلیک سبب افزایش محتوای پلی­آمین­ها می­شود که نقش مهمی در ایجاد تحمّل به سرما دارند (Jalili et al., 2023). محلول­پاشی قلمه­های انگور با اسید سالیسیلیک با افزایش پایداری غشاء، کاهش نشت­یونی و پراکسیداسیون لیپیدهای غشای سلولی سبب افزایش تحمّل به تنش­ سرما شده است (Ershadi & Taheri, 2013).

اسید آبسیزیک نقش مهمی در پاسخ گیاهان به تنش­های غیرزنده از جمله سرما دارد. تغییر محتوای این هورمون گیاهی طی دوره رکود در جوانه­های بسیاری از گونه‌های گیاهی به خوبی اثبات شده است. پیشنهاد شده که اسید آبسیزیک با تنظیم رکود جوانه در ارتباط است؛ زیرا با ورود گیاه به دوره رکود معمولاً محتوای آن افزایش یافته و در مرحله رکود عمیق در زمستان به حداکثر می­رسد (Pagter et al., 2008). مصرف خارجی اسید آبسیزیک روی برگ­ها منجر به افزایش اسید آبسیزیک درونی شده و فعالیت آنزیم­های آنتی‌اکسیدانی را بالا می­برد (Karimi et al., 2016). کاربرد خارجی اسید آبسیزیک می­تواند گونه­های واکنش­پذیر اکسیژن را حذف کرده و با افزایش پایداری غشای سلولی، آسیب تنش­ها به گیاه را کاهش دهد (Karimi et al., 2016). اسید آبسیزیک با تنظیم بیان یک سری ژن‌های کلیدی طی دوره سازگاری به سرما نقش مهمی در تحمّل به سرما و یخ­زدگی درختان دارد (Zhang et al., 2008; Karimi et al., 2016). پژوهش­های متعددی حاکی از توانایی کاربرد خارجی اسید آبسیزیک در افزایش تحمّل یخ­زدگی گیاهان هستند. برای مثال، کاربرد برگی اسید آبسیزیک با افزایش تجمع کربوهیدرات­های محلول، پروتئین­های محلول، پرولین و کاهش نشت یونی به افزایش تحمّل سرما در انگور منجر می­شود (Karimi & Ershadi, 2015). تیمار اسید آبسیزیک با کاهش محتوای آب و صدمات اکسایشی به غشاء (پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء و تولید پراکسید هیدروژن) و افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی‌اکسیدان سبب افزایش تحمّل به سرمای انگور شده است (Karimi et al., 2016). کنش جغرافیایی و رشد و نمو درختان زینتی به میزان زیادی تحت تأثیر دماهای پائین زمستان قرار می‌گیرد. بنابراین، ارزیابی تحمّل به سرمای زمستان و شناخت سازوکار­های درگیر در آن با هدف انتخاب گونه‌های مناسب برای اقلیم‌های مختلف یکی از اولویت­های مهم در برنامه­های مدیریت پایدار درختان در پارک­ها و فضاهای سبز شهری به­ویژه در مناطق معتدل و سردسیر می­باشد. از طرفی کاربرد تنظیم­کننده­های رشد گیاهی برای افزایش سازگاری به سرما و بهبود تحمّل به سرمای آنها یکی از روش­های کاهش اثرات سرمازدگی است. همچنین تاکنون اثر اسید سالیسیلیک و اسید آبسیزیک بر تحمّل به سرمای درخت زیتون تلخ گزارش نشده است. بنابراین، در این پژوهش تحمّل به سرمای زمستانه درخت زیتون تلخ با روش نشت یونی ارزیابی و ارتباط بین تحمّل به سرما و غلظت کربوهیدرات‌ها و پروتئین‌های محلول و پرولین جوانه این درخت در پاسخ به کاربرد آخر فصل این تنظیم‌کننده­های رشد بررسی شد.

مواد و روش­ها

مواد گیاهی و تیمارها

این پژوهش در پائیز و زمستان 1400 روی درختان 5 ساله زیتون تلخ واقع در محوطه دانشگاه ملایر (ملایر، ایران) و در قالب طرح بلوک­های کامل تصادفی با سه تکرار (سه درخت) انجام شد. درختان با فواصل منظم در ردیف­های شرقی-غربی تحت سیستم آبیاری قطره­ای در بستری از خاک لومی­رسی کاشته شده­ و دارای شرایط رشد، تغذیه و هرس یکسانی بودند. در این آزمایش، اثر کاربرد برگی اسید آبسیزیک و اسید سالیسیلیک بر شاخص­های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی مرتبط با سازگاری به سرما (اوایل تا اواخر آبان ماه) در درختان زیتون تلخ بررسی شد. تیمارهای محلول‌پاشی شامل 1- آب مقطر (شاهد)، 2- اسید آبسیزیک 100 میکرومولار، 3- اسید سالیسیلیک 2 میلی­مولار و 4- اسید آبسیزیک 100 میکرومولار + اسید سالیسیلیک 2 میلی­مولار بود (Karimi & Ershadi, 2015). محلول­پاشی تاج درخت با یک سمپاش 6 لیتری تا مرحله آب­چک انجام شد. این کار طی دو مرحله با فاصله زمانی 12 ساعت در اواسط پاییز (15 آبان­ماه) انجام شد. نمونه برداری یک هفته پس از اتمام محلول­پاشی در دهه سوم آبان ماه (23 آبان ماه) از برگ­ها و جوانه­های شاخه­های یکساله واقع در میانه بیرونی هر سمت تاج انجام و برای اندازه­گیری سایر صفات استفاده شد. دمای حداقل، میانگین و حداکثر مکان آزمایش در شکل 1 آورده شده است.

شکل 1- دمای حداقل، میانگین و حداکثر در بازه زمانی دهم مهر (Oct.1) تا 10 آذر ماه (Nov.30) در منطقه مورد بررسی (دانشگاه ملایر)

Figure 1- Minimum, average and maximum temperature in the period from October 1 (Oct. 1) to November 30 (Nov. 30) in the study area (Malayer University)

سنجش شاخص­های مورد بررسی در مرحله آبان­ماه

غلظت کلروفیل­های a، b و کل و کاروتنوئید کل به روش اسپکتروفتومتری اندازه­گیری و بر حسب میلی­گرم در گرم وزن­تر بیان شد (Dere et al., 1998). درصد خزان برگ با شمارش تعداد برگ­های ریزش یافته از تعداد مشخصی شاخه (5 شاخه در درخت) به کل برگ­های شاخه در بازه زمانی مشخص (آخرین مرحله محلول­پاشی تا 50 درصد خزان کل برگ­های تاج درخت) تعیین شد. درصد تشکیل پریدرم با امتیاز­دهی رنگ پوست اپیدرم خارجی (پریدرم) شاخه­های یکساله (5 شاخه از میانه بیرونی هر سمت تاج، مجموع 20 شاخه) به کل شاخه­های شمارش یافته از 1 تا 5 (رنگ سبز تا قهوه­ای) مشخص شد (Karimi & Ershadi, 2015). اندازه­گیری محتوای آب جوانه با توزین جوانه‌ها قبل و بعد از قرار دادن در آون (مدت سه روز در دمای °C70) تعیین شد (Webster & Ebdon, 2005).

نشت­یونی جوانه در مرحله آبان ماه بدون اعمال تیمار سرمادهی مصنوعی و با نمونه­گیری از شاخه­ها در 23 آبان­ماه (بر اساس سرمای محیط) اندازه­گیری شد. از شاخه­های نمونه­برداری شده مربوط به هر تیمار، تعداد پنج جوانه جدا و در قوطی­های حاوی40 میلی‌لیتر آب مقطر غوطه­ور شد. قوطی­ها به مدّت 15 ساعت روی شیکر در دمای اتاق قرار داده شدند (Karimi & Ershadi, 2015). همچنین هدایت الکتریکی (EC₁) آنها با دستگاه هدایت سنج (آتاگو، ژاپن) اندازه­گیری شد. سپس قوطی­ها به مدت 20 دقیقه اتوکلاو (ºC 121) و هدایت الکتریکی مجدد اندازه­گیری (EC₂) و نشت یونی (EL) از رابطه (EL= (EC₁/EC₂)×100) محاسبه شد (Campos et al., 2001).

پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء بر اساس غلظت مالون‌د‌ی‌آلدهید (MDA) تولید شده در اثر آسیب به غشاء و واکنش آن با تیوباربیتوریک اسید اندازه­گیری شد. پس از استخراج با تری­کلرواستیک­اسید، جذب نمونه­ها در دو طول موج 600 و 532 نانومتر خوانده و بر اساس میکرومول بر گرم وزن­تر بیان شد (Health & Packer, 1968). اندازه­گیری محتوای پراکسید هیدروژن (H₂O₂) به روش Loreto & Velikova (2001) انجام شد. غلظت پراکسید­هیدروژن نمونه­ها توسط مقایسه­ جذب آن‌ها در طول موج 390 نانومتر و منحنی استاندارد آن در طیفی از 100 تا 1000 میکرومول بر میلی­لیتر محاسبه و بر اساس میکرومول بر گرم وزن تر بیان شد. سنجش غلظت پروتئین محلول با معرف رنگی بریلینت­بلو (G-250) در طول موج 595 نانومتر انجام شد (Bradford, 1976). توسط منحنی استاندارد تهیه شده از غلظت­های مختلف آلبومین­گاوی، غلظت پروتئین محلول برحسب میلی­گرم بر گرم وزن­تر بیان شد. برای سنجش پرولین عمل استخراج با کمک اسید سولفوسالیسیلیک و اندازه­گیری با حضور اسید استیک و معرف نین­هیدرین انجام شد. میزان جذب نمونه­ها در طول موج 518 نانومتر قرائت و غلظت پرولین جوانه بر حسب میکرومول بر گرم وزن­تر تعیین شد (Bates et al., 1973).

استخراج و اندازه‌گیری فنول کل به روش معرف فولین- سیوکالتیو در حضور کربنات­سدیم انجام شد و جذب نوری نمونه‌ها در طول موج 765 نانومتر قرائت و بر اساس میلی­گرم اسید گالیک بر گرم وزن­تر بیان شد (Velioglu et al., 1998). اندازه‌گیری قند محلول­کل با روش رنگ­سنجی به کمک آنترون در حضور اسید سولفوریک و در طول موج 625 نانومتر خوانده شد (Yemm & Willis, 1954). غلظت قند محلول بر اساس منحنی استاندارد گلوکز تعیین و به صورت میلی­گرم بر گرم وزن­تر بیان شد. برای اندازه­گیری فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان، نمونه­های بافت تازه جوانه (100 میلی­گرم) در ازت مایع کوبیده شده و تا زمان مصرف در دمای  ºC80- نگهداری شدند. فعالیت آنزیم­های آسکوربات­پراکسیداز (Nakano & Asada, 1981)، کاتالاز (Bergmeyer, 1970) و گایاکول­پراکسیداز (Herzog & Fahimi, 1973) به ترتیب در طول موج­های 290، 240 و 465 نانومتر اندازه­گیری شدند. هر یک واحد از فعالیت آنزیم‌های کاتالاز و گایاکول­پراکسیداز به عنوان مقداری از این آنزیم­ها به صورت جداگانه در نظر گرفته شد که به کاهش یک میکرو­مول H₂O₂ در هر دقیقه منجر می­شود. هر واحد فعالیت آنزیم آسکوربات­پراکسیداز به عنوان مقداری از آنزیم در نظر گرفته شد که سبب اکسیده شدن یک میکرومول آسکوربات در هر دقیقه می­شود. میزان فعالیت هر سه آنزیم بر حسب واحد در میلی­گرم پروتئین جوانه بیان شد. خواندن مربوط به تمامی شاخص­های اندازه­گیری شده در پژوهش حاضر با دستگاه اسپکتروفوتومتر UV-VIS مدل SPEKOL 2000 شرکت AnalytikJena آلمان انجام شد.

برای استخراج قندهای محلول ابتدا جوانه‌ها از شاخه یکساله جدا و در ازت مایع منجمد و در مرحله بعد بافت‌ها با کمک ازت مایع کاملاً پودر شدند. سپس نیم­گرم از بافت پودرشده توزین و در 10 میلی‌لیتر اتانول 80% محلول و به مدت 15 دقیقه با دور 8000 سانتریفوژ شد. این محلول از صافی 2/0 میکرومتر عبور داده شد تا برای تفکیک قندها به دستگاه HPLC تزریق شود. برای جداسازی قندها از دستگاه HPLC مدل Unicam-Crystal-200 ساخت کشور انگلیس که مجهز به آشکارساز UV-Vis SPD MLOAD از نوع Photodiod array بود استفاده شد. مقدار تزریق 10 میکرولیتر و ستون به کار گرفته شده Spherisorb C8-ODS₂ به ابعاد طول 150 میلی­متر و قطر 6/4 میلی­متر و قطر ذرات 3/0 میکرون بود. فاز متحرک شامل بافر سیترات­سدیم 5/5 pH= و استونیتریل فوق خالص با نسبت 99: 1 و با سرعت عبور 1/0 میلی‌لیتر بر دقیقه بود. بر اساس زمان باز­داری و توسط استاندادهای گلوکز، فروکتوز و ساکاروز، نوع و مقدار قندهای محلول در نمونه‌های مجهول مشخص و به صورت میکرومول بر گرم وزن­تر بیان شد (Comis et al., 2001). برای استخراج و اندازه­گیری پلی­آمین­ها مقدار250 میلی­گرم از بافت گیاهی (جوانه‌) در 2 میلی­لیتر محلول 4 درصد CLO₄H حاوی 1 و7 دی­آمینوهپتان (5 میلی­گرم در لیتر از اسید کلریدریک 2 نرمال) هموژن شد. پس از یک ساعت ماندن در دمای °C 4 از فیلتر 45/0 میکرون عبور داده شد. سپس روی 2/0 میلی لیتر از این محلول، مقدار 1 میلی­لیتر بافر کربنات با 9pH= و یک میلی‌لیتر دانسیل کلراید (10 میلی­گرم در 1 میلی­لیتر استون) اضافه و به‌خوبی به هم زده شد. این مخلوط به مدّت یک ساعت در دمای °C60 و در تاریکی قرار داده شد و سپس تا زمان تزریق به دستگاه HPLC در یخچال نگهداری شد. پس از این مراحل پلی­آمین­ها به فرم دانسیله در می­آیند که توسط 3 میلی لیتر تولوئن از مواد دیگر جدا شده و سپس به دستگاه HPLC تزریق شد. برای اندازه‌گیری غلظت پلی­آمین­ها 10 میکرولیتر از محلول پایانی مرحله جداسازی، به ستون کوچک با طول 10 سانتی متر و قطر داخلی 3 میلی­متر فاز معکوس از نوع Chorompack-Nederland متصل به دستگاه HPLC مدل Unickam-crystal 200 ساخت انگلستان، تزریق شد. فاز متحرک شامل مخلوط استو نیتریل فوق خالص و آب دیونیزه به ترتیب با نسبت 72 به 28 حجم به حجم می­باشد که با سرعت 2 میلی لیتر بر دقیقه حرکت آن با سیستم ایزوکرایک انجام می­شود. آشکارساز دستگاه از نوع UV و در طول موج 337 نانومتر تنظیم شد. اندازه­گیری پلی­آمین­های پوترسین، اسپرمیدین و اسپرمین به روش Walter & Geuns, (1987) انجام شد.

استخراج و اندازه‌گیری هورمون‏های درون‏زا گیاهی شامل اسید آبسیزیک و اسیدجیبرلیک به شرح ذیل انجام شد (Li et al., 2010). برای استخراج، یک گرم پودر منجمد شده بافت جوانه‌ها به 10 میلی‌لیتر متانول 80%، 01/0 گرم پلی وینیل -پیرولیدون (PVP) و 01/0 گرم ویتامین ث اضافه و به مدت یک شب در دمای ºC۴ روی شیکر با دور 120 دور در دقیقه تکان داده شد تا عمل انحلال هورمون اسید آبسیزیک به خوبی صورت شود. سپس مخلوط هموژن شده به مدّت 15 دقیقه با دور 4000 سانتریفیوژ و محلول رویی آن جدا شده و pH آن به 8 رسانده شد. عمل استخراج از رسوبات باقیمانده دو بار تکرار شد. بعد از صاف کردن عصاره با کاغذ صافی (واتمن شماره 1)، متانول اضافی تبخیر داده شد و سپس pH بخش باقیمانده با اسید هیدروکلریک 2/0 نرمال در حدود 5/2 تنظیم شده و به آن 10 میلی‌لیتر اتیل­استات اضافه شد. سپس اتیل­استات تبخیر شده و به رسوب باقیمانده یک میلی‌لیتر محلول متانول 3% و اسیداستیک 1/0 مولار اضافه شد تا به صورت محلول درآید. مخلوط حاصل توسط صافی 45/0 میکرونی پالایش و از آن 20 میکرولیتر برای مرحله ارزیابی برداشت شد.

ارزیابی با دستگاه HPLC: مقدار 20 میکرولیتر محلول استخراج شده به ستون Diamonsic-C18 با قطر ذرات 5 میکرومتر، طول 25 سانتی‏متر، قطر داخلی 6/4 میلی‏متر با سیستم فاز معکوس در دستگاه HPLC مدل Unicam-Crystal-200 ساخت کشور انگلیس تزریق شد. فاز متحرک از متانول 20 تا 75% در اسید استیک 1% با نرخ جریان 1/0 میلی‏لیتر در دقیقه شده برای جیبرلین و 2/1 میلی‏لیتر در دقیقه برای اسید آبسیزیک تشکیل شده بود. از آشکارساز UV-Vis SPD MLOAD از نوع Photodiod array در طول موج 260 نانومتر استفاده شد. بر اساس زمان بازداری طبق نمونه استاندارد اسید آبسیزیک و اسید جیبرلیک و سطح زیر منحنی، مقدار اسید آبسیزیک و جیبرلین نمونه‌ها مشخص و به صورت نانوگرم در گرم وزن‏تر بیان شد.

سنجش تحمّل به سرمای زمستانه

در این مرحله به ازای هر تیمار دمایی از اطراف درختان پنج شاخه به طول 20-15 سانتی­متر از گره‌های میانی شاخه­های یکساله واقع در میانه بیرونی هر سمت تاج نمونه­گیری شد. برای حذف آلودگی­های سطحی، شاخه­های یکساله با آب­مقطر شستشو شدند. پس از حذف رطوبت اضافی با دستمال حوله­ای، 5 شاخه از هر تیمار درون کیسه‌های فریزر مجزا گذاشته و در معرض تیمارهای سرمایی مختلف (6-، 12- و 18- درجه سانتی­گراد) در یک اتاقک سرماساز ترموگرادیان (رادالکترونیک، تهران) قرار داده شد. تیمارهای سرمایی بر اساس دمای پیش تیمار، سه روز قبل از شروع آزمایش اصلی تعیین شد. دمای شروع تیمار سرمایی بر اساس دمای محیط در روز نمونه‌برداری تعیین و روند کاهش دمای اتاقک سرماساز ºC 2 در هر ساعت بود. نمونه‌های شاخه به مدّت دو ساعت در تیمار نهایی سرما نگه داشته شد. بعد از اعمال تیمارهای سرمایی، شاخه­ها از اتاقک سرماساز خارج و به منظور ذوب شدن تدریجی ابتدا 2 ساعت در دمای ºC 4 و سپس 1 ساعت در دمای اتاق قرار داده شدند (Karimi & Ershadi, 2015). سپس از شاخه­های اختصاص یافته به هر تیمار دمایی (سه تکرار)، پنج جوانه جدا و در قوطی­های حاوی40 میلی‌لیتر آب مقطر غوطه­ور و نشت­یونی آنها اندازه­گیری شد (Campos et al., 2001; Karimi & Ershadi, 2015).

تجزیه آماری داده­ها

تجزیه و تحلیل آماری اطلاعات به ­دست آمده، با نرم افزار SAS (9.1.3) انجام شد. اثر تیمارها و اثر متقابل بین آن­ها با آزمون چند دامنه­ای دانکن بررسی و نمودارها با نرم افزار Excel 2013 رسم شد.

نتایج و بحث

رنگیزه­های فتوسنتزی

کاربرد تنطیم­کننده­های رشد در مرحله سازگاری به سرما سبب کاهش غلظت کلروفیل­های a، b و کلروفیل­کل برگ زیتون­تلخ شد، به­ طوری ­که این اثر وابسته به نوع تنظیم­کننده رشد بوده و در پاسخ به کاربرد اسید آبسیزیک کاهش بیشتری در غلظت این رنگیزه­ها ایجاد شد (جدول 1). در پژوهشی بر روی زیتون­تلخ همزمان با اعمال تنش خشکی به علّت افزایش محتوای اسید آبسیزیک برگ، محتوای کلروفیل برگ و سرعت فتوسنتز کاهش پیدا کرد (Han et al., 2022). این نتایج با یافته­های قبلی از اثر اسید آبسیزیک بر محتوای کلروفیل انگور طی مرحله سازگاری به سرما مطابقت دارد (Karimi et al., 2016). با این حال، در آزمایشی بر روی برگ­نوی درخشان که یک گیاه زینتی همیشه­سبز است، مصرف اسید سالیسیلیک برون­زاد به افزایش محتوای کلروفیل برگ منجر شد (Yang et al., 2018) که با نتایج پژوهش حاضر همخوانی ندارد. این نتیجه ممکن است با عادت رشدی درخت برگ­نو که همیشه­سبز است در مقایسه با درخت زیتون­تلخ که خزان­پذیر است مرتبط باشد. زیرا در مرحله سازگاری به سرما در درختان خزان­پذیر تسریع در تجزیه کلروفیل و زرد شدن برگ­ها یکی از سازوکارهای سازگاری به سرماست که در پژوهش حاضر توسط اسید سالیسیلیک و اسید آبسیزیک تحریک شده است (Liu et al., 2019).

جدول 1- اثر کاربرد برگی اسید سالیسیلیک (SA) و اسید آبسیزیک (ABA) بر محتوای کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و کاروتنوئیدهای برگ زیتون تلخ در مرحله سازگاری به سرما (آبان ماه)

Table 1- The effect of foliar application of salicylic acid (SA) and abscisic acid (ABA) on Chlorophyll a, chlorophyll b, total chlorophyll and carotenoids content of chinaberry leaf during cold acclimation stage (November)

*میانگین­های دارای حروف مشترک در هر ستون از لحاظ آماری (سطح 5 درصد) اختلاف معنی‌داری ندارند.

*Means with common letters in each column do not have a statistically significant difference (5% level).

به­طور کلی، کاهش کلروفیل در پاسخ به کاربرد آخر فصل اسید آبسیزیک می­تواند به علّت افزایش فعالیّت آنزیم­های کلروفیلاز باشد. همچنین، تسریع در روند سازگاری به سرما از طریق تغییر در تعادل هورمون­ها، مانع از فعالیت آنزیمی و سنتز کلروفیل در سلول می­شود که این نقصان با کاربرد خارجی اسید آبسیزیک و اسید سالیسیلیک تقویت شده و سبب کاهش پایداری کلروفیل برگ در پژوهش حاضر شده است. کاروتنوئیدها یکی از رنگیزه­های فتوسنتزی هستند که میزان آن­ها تحت تأثیر تنش سرما به شدّت کم می­شود. افزایش میزان کارتنوئیدها در پاسخ به تیمار اسید آبسیزیک نشان دادند این هورمون اثر معنی­داری بر میزان کاروتنوئید داشته و سبب افزایش این ترکیب در برگ زیتون­تلخ در مرحله سازگاری به سرما کمی قبل از شروع خزان شد (جدول 1) که با نتایج پژوهش­های کاربرد اسید آبسیزیک در انگور (Karimi et al., 2016) مطابقت دارد.

تشکیل پریدرم و ریزش برگ

بیشترین و کمترین درصد تشکیل پریدرم شاخه به ترتیب مربوط به تیمار کاربرد اسید آبسیزیک به تنهایی و شاهد بود. همچنین، بیشترین و کمترین درصد ریزش برگ به ترتیب مربوط به تیمار کاربرد اسید آبسیزیک و تیمار کاربرد سالیسیلیک اسید به تنهایی بود (جدول 2). سازگاری به سرما در درختان با کاهش و توقف کامل رشد و به دنبال آن پیری و ریزش برگ و توسعه پریدرم همراه است. بنابراین، توسعه پریدرم که بلوغ چوب نیز نامیده می‌شود، یکی از تغییرهای ریخت شناسی مهم است که نشان‌ دهنده سازگاری به سرما در بافت‌های جوانه و شاخه است. علاوه بر این، اسید آبسیزیک یکی از هورمون‌‌هایی است که در مهار رشد شاخساره‌ها، رشد برگ و رشد پریدرم مؤثر است (Karimi & Ershadi, 2015). همچنین، چوبی شدن (افزودن لیگنین) یک فرایند فیزیولوژیکی پویا است که در طی رشد عادی گیاه در پاسخ به چندین تنش محیطی در سطوح مختلف رخ می‌دهد. افزودن لیگنین به دیواره‌‌های سلولی به سفتی ساختاری و دوام بافت‌‌های گیاهی منجر می‌‌شود (Lee et al., 2007). قابل ذکر است که محتوای لیگنین و ترکیب چوب به شدت در درون و بین گونه‌‌ها، بین مراحل رشد و در پاسخ به نشانه‌‌های محیطی متفاوت می‌‌باشد. برای مثال، در اکالیپتوس، ساختار و محتوای لیگنین تحت تأثیر وضعیت نیتروژن گیاه است به گونه‌‌ای که به علّت تأخیر در توقف رشد آخر فصل و رقیق شدن ترکیب‌های فنولی پیچیده (لیگنین و سوبرین)، میزان تشکیل پریدرم و خشبی شدن چوب در این درختان کم می­شود (Ployet et al., 2018). در پژوهشی بر روی نهال‌‌های 6 ماهه اکالیپتوس، کاربرد طولانی مدّت تنش سرما سبب رسوب بیشتر و ضخیم‌تر لیگنین در دیواره‌ آوندهای چوبی و نیز، تنظیم ژن‌های سازنده دیواره یاخته‌ای به­ویژه ژن‌های دخیل در بیوسنتز لیگنین در سطح رونویسی شده است (Ployet et al., 2018) که تأئیدی بر یافته‌‌های پژوهش حاضر است. علاوه بر این، در پژوهش حاضر تشکیل پریدرم در درختان تیمار شده با اسید آبسیزیک بیش از دیگر تیمارها بود که این تأثیر می­تواند در اثر تغییر مورفوفیزیولوژیکی و نیز، رسوب محتوای لیگنین بیشتر در درختان زیتون­تلخ تیمارشده با این هورمون ‌‌باشد. از سوی دیگر، کاربرد اسید سالیسیلیک از راه تأثیر بر بیوسنتز ترکیبات فنولی نیز ممکن است بیوسنتز لیگنین در جوانه‌‌ها در مرحله شروع سازگاری به سرما را تحت تأثیر قرار دهد که در پژوهش حاضر با تشکیل پریدرم بیشتر در درختان تیمارشده با این تنظیم کننده رشد در مقایسه با درختان شاهد تأئید شد.

جدول 2- اثر کاربرد برگی اسید سالیسیلیک (SA) و اسید آبسیزیک (ABA) بر ریزش برگ، تشکیل پریدرم شاخه، محتوای آب، فنول کل و پروتئین محلول جوانه زیتون تلخ در مرحله سازگاری به سرما (آبان ماه)

Table 2- The effect of foliar application of salicylic acid (SA) and abscisic acid (ABA) on leaf abscission, shoot periderm formation, bud water content, bud total phenolic contents and bud soluble proteins content of chinaberry during cold adaptation stage (November)

*میانگین­های دارای حروف مشترک در هر ستون از لحاظ آماری (سطح 5 درصد) اختلاف معنی‌داری ندارند.

*Means with common letters in each column do not have a statistically significant difference (5% level).

محتوای­آب جوانه

کمترین محتوای­آب در جوانه درختان تیمارشده با اسید آبسیزیک به تنهایی مشاهده شد که البته با تیمار ترکیب اسید سالیسیلیک و اسید آبسیزیک اختلاف معنی­داری نداشت و بیشترین محتوای­آب جوانه مربوط به درختان شاهد بود (جدول 2). افزایش سازگاری به سرما در جوانه‌های درختان خزان­دار با خروج تدریجی آب جوانه‌ها، کاهش آب قابل انجماد و در نتیجه، افزایش تحمّل به یخ‌زدگی همراه است. کاهش محتوای­آب جوانه‌ها در مرحله سازگاری به سرما اغلب با هدف تغلیظ شیره سلولی (افزایش قندهای محلول‌ و پرولین) در راستای فرایند سازگاری به سرما تفسیر می‌شود که می­تواند تحت تأثیر کاربرد تنظیم کننده­های رشد از جمله اسید آبسیزیک باشد که در پژوهش­های دیگر روی انگور نیز گزارش شده است (Karimi & Ershadi, 2015).

فنول­کل

بیشترین محتوای فنول­کل جوانه مربوط به تیمار کاربرد ترکیبی اسید سالیسیلیک و اسید آبسیزیک و کمترین آن مربوط به شاهد بود (جدول 2). بیشترین محتوای فنول­کل مربوط به درختان تیمار شده با ترکیب اسید سالیسیلیک و اسید آبسیزیک بود که در مقایسه با شاهد تا 43/42 درصد افزایش داشت. این تغییر ممکن است ناشی از افزایش لیگنین و سوبرین به عنوان دو ترکیب فنولی پلیمری ساختاری برای افزایش چوبی­شدن و چوب­پنبه­ای شدن جوانه جهت افزایش تحمّل به سرما باشد (Karimi, 2017). افزایش ترکیبات فنولی در این گیاهان ممکن است به­ عنوان یک سازوکار برای غلبه بر تنش اکسایشی ناشی از تنش سرما عمل کند. کاربرد برگی اسید آبسیزیک در انگور، تحمّل به تنش سرما را از طریق افزایش ترکیبات ‌فنولی افزایش داده است که نشانه دخالت این هورمون در مسیرهای ساخت ترکیبات فنولی به­ویژه در گیاهان تحت تنش هستند (Karimi et al., 2016). همچنین، تجمع ترکیبات فنولی در اثر کاربرد برون­زاد اسید سالیسیلیک توسط عباسی کاشانی و همکاران (Abbasi Kashani et al., 2020) در نهال­های انگور گزارش شده است که نتایج حاصل از پژوهش حاضر را تأیید می­نماید.

پروتئین­های­محلول

در درختان تیمار شده با اسید آبسیزیک و اسید سالیسیلیک محتوای پروتئین­های­محلول در مقایسه با شاهد افزایش یافت (جدول 2) که با نقش تعدیل کنندگی هورمون اسید آبسیزیک در تحمّل به سرمای پائیزه در انگور (Karimi & Ershadi, 2015) و اسید سالیسیلیک در تحمل به سرمای بهاره در انگور (Ershadi & Taheri, 2013) و برگ­نوی درخشان (Yang et al., 2018) توسط تولید پروتئین­های محلول مطابقت دارد. افزایش پروتئینهای­محلول یکی از معمول­ترین تغییرات بیوشیمیایی است که می‌تواند سبب محافظت گیاه از صدمات کشنده آب کشیدگی تحت تأثیر دمای پائین شود. پروتئین­های­محلول نیز همانند پرولین از محلول­های سازگار هستند که از عوامل ارتقای مقاومت گیاه در برابر تنش سرما محسوب می­شود. بنابراین، با سرد شدن هوا، گیاه از طریق تولید این درشت­مولکول­ها می­تواند تا حدودی بر شرایط تنش چیره شود (Adhikari et al., 2022). اثرات محافظتی پروتئین‌ها در غشاءهای سلولی و ساختارهای مختلف سلولی به خوبی مشخص شده است. اسید آبسیزیک قادر به افزایش ساخت اسیدهای آمینه در شرایط محیطی نامساعد است (Yang et al., 2018). افزایش پروتئین‌های محلول در اثر کاربرد اسید آبسیزیک و اسید سالیسیلیک یکی از سازوکارهای حفاظتی برای متعادل کردن غلظت اسمزی درون سلولی است و می‌تواند سبب افزایش تحمّل به سرما شود. مشخص شده است که اسید سالیسیلیک برون­زاد از راه تأثیر بر مسیرهای بیوسنتزی اسید آبسیزیک و اسید جیبرلیک و نیز، تحریک تجمع پرولین، قندهای محلول و پروتئین‌های محلول سبب بهبود تحمّل در برابر دماهای پائین زمستان می­شود (Yang et al., 2018).

نشت یونی

میزان نشت­یونی جوانه در مرحله آبان­ماه در پاسخ به تیمارهای اسید سالیسیلیک، اسید آبسیزیک و ترکیب آنها کاهش چشمگیری نشان داد (جدول 3). کمترین میزان نشت یونی مربوط به تیمار کاربرد ترکیبی اسید سالیسیلیک و اسید آبسیزیک بود که در مقایسه با شاهد تا 6/42 کمتر بود. این مشاهدات نشاندهنده کارایی این ترکیب هورمونی در پایداری غشاء و حفظ نفوذپذیری انتخابی آن از راه کاهش نشت­یون­ها و مواد محلول از داخل به فضای بین سلولی است. افزایش نشت­ یونی تحت تنش سرما به دلیل تنش اکسایشی است. این امر به ایجاد تغییراتی در نفوذپذیری انتخابی غشاهای زیستی، نشت مواد از غشاء و تغییر در فعالیت آنزیم­های متصل به غشاء منجر خواهد شد (Campos et al., 2003). بنابراین، اندازه­گیری نشت ­یونی شاخصی از میزان آسیب اکسایشی وارد شده به غشاء و سلول است (Yu & Lee, 2020). کاهش دما سبب افزایش درصد نشت­­یونی در نمونه­های ساقه و برگ انگور شد و کاربرد اسید سالیسیلیک با غلظت­های 5/0 و 1 میلی­مولار اثر چشمگیری بر کاهش نشت­یونی و حفظ سلامت بافت­ها در دامنه تنش سرمایی صفر تا ºC8- داشت (Ershadi & Taheri, 2013). یکی از اثرات عمده تنش سرما بر غشاء، پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی است که در اثر ایجاد مالون‌دی‌آلدئید به عنوان محصول نهایی پراکسیداسیون اسیدهای­چرب غیراشباع ایجاد می­شود (Campos et al., 2003). بدین ترتیب، با تغییر در ساختار غشاء و پروتئین­ها و افزایش مواد محلول سمی، نفوذپذیری و انعطاف‌پذیری غشاء افزایش یافته و خروج یون­ها از غشاء و در نتیجه، ایجاد خسارت به گیاهان تسریع می‌شود(Yu & Lee, 2020)  .

جدول 3- اثر کاربرد برگی اسید سالیسیلیک (SA) و اسید آبسیزیک (ABA) بر نشت یونی، مالون دی­آلدئید، پراکسید هیدروژن و پرولین جوانه­ زیتون تلخ در مرحله سازگاری به سرما (آبان ماه)

Table 3- The effect of foliar application of salicylic acid (SA) and abscisic acid (ABA) on electrolyte leakage, malondialdehyde, hydrogen peroxide and proline content of chinaberry buds during cold acclimation stage (November)

*میانگین­های دارای حروف مشترک در هر ستون از لحاظ آماری (سطح 5 درصد) اختلاف معنی‌داری ندارند.

*Means with common letters in each column do not have a statistically significant difference (5% level).

پژوهش­های گذشته روی چمن برمودا (Zhang et al., 2008)، خیار (Zhang et al., 2012) و انگور(Karimi & Ershadi, 2015)  نشان دادند کاربرد اسید آبسیزیک برون­زاد به کاهش نشت‌یونی برگ گیاهان تحت تنش سرما و شوری منجر می­شود که تأییدی بر یافته­های پژوهش حاضر است. همچنین، کاهش آسیب ناشی از سرما در اثر مصرف برون‌زاد اسید سالیسیلیک در گیاهان مختلف گزارش شده است. در پژوهشی (Abbasi Kashani et al., 2020) گزارش کردند کاربرد برگی اسید سالیسیلیک با غلظت 1 میلی­مولار بر روی نهال­های دوساله چند رقم انگور سبب کاهش صدمه به شاخه و افزایش قدرت بازیابی نهال­ها شد. در آزمایش مذکور، کمترین میزان نشت الکترولیتی و مالون دی­آلدئید نیز در این غلظت مشاهده شد. همچنین، کاربرد اسید سالیسیلیک منجر به کاهش معنی­داری در نشت­یونی برگ تاک انگور تحت تنش سرما شده است که نشان دهنده تأثیر این ترکیبات بر پایداری غشاء است (Ershadi & Taheri, 2013).

پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء

میزان مالون­دی­آلدئید جوانه در پاسخ به تیمارهای اسید سالیسیلیک، اسید آبسیزیک و ترکیب آنها کاهش چشمگیری نشان داد (جدول 3). کمترین میزان مالون­دی­آلدئید مربوط به تیمار کاربرد ترکیبی اسید سالیسیلیک و اسید آبسیزیک بود که در مقایسه با شاهد تا 1/36 درصد میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء کاهش یافت. سرمازدگی منجر به از هم پاشیدگی مواد پکتیکی در دیواره سلولی، جامد شدن بخش لیپیدی و ایجاد شکاف­هایی در غشاء و اختلال در فعالیت آنزیم­های کنترل کننده ورود و خروج مواد از سلول می­شود. اعمال دیگر تنش­های محیطی از قبیل خشکی بسته به مدّت و شدت تنش به افزایش تولید مالون‌دی‌آلدئید در درختان زیتون­تلخ منجر شدند (Han et al., 2022). بررسی غلظت مالون دی‌آلدئید بافت گیاهی می­تواند بیانگر میزان تخریب غشاء سلولی باشد؛ زیرا این ترکیب تحت تأثیر تخریب و پراکسیده شدن غشاء سلولی آزاد می­شود (Adhikari et al., 2022). کاهش تولید مالون­د‌ی‌آلدئید در درختان تیمار شده نشاندهنده نقش حفاظتی این هورمون­ها در پایداری غشاء است. تنش سرما ضمن افزایش پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء و برهم­زدن نفوذپذیری آن سبب نشت مواد ­محلول و خسارت به گیاه شد. در واقع کاهش دما به افزایش شاخص­های تنش اکسایشی از قبیل نشت­­یونی، پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء و تولید گونه­های فعال اکسیژن منجر می­شود (Karimi et al., 2016). جالب توجه است که کاربرد برگی اسید سالیسیلیک + اسید آبسیزیک سبب کاهش 36 درصدی غلظت مالون­دی­آلدئید در درختان تیمار شده در مقایسه با شاهد شدند که نشاندهنده نقش کلیدی این تنظیم­کننده­های رشد در تحریک فعالیت آنتی­اکسیدان‌های آنزیمی و کاهش تنش اکسایشی و افزایش تجمع اُسمولیت­های سازگاری از قبیل قندها و پرولین است (Karimi et al., 2016). اسمولیت­های مذکور ضمن تنظیم اسمزی سبب افزایش پایداری غشای پلاسمایی و حفظ نفوذپذیری آن می­شوند. کاهش تولید مالون‌دی­آلدئید به دنبال مصرف برگی اسید سالیسیلیک بر روی دانهال­های دو گونه انگور توسط عباسی کاشانی و همکاران (Abbasi Kashani et al., 2020) نیز گزارش شده است که با نتایج پژوهش حاضر همخوانی دارد. به نظر می‌رسد اسید سالیسیلیک برون­زاد با فعال کردن آنزیم­های آنتی­اکسیدان سبب کاهش مقادیر مالون دی­آلدئید حاصل از تخریب غشاء می­شود. در پژوهشی بر روی زردآلو کاربرد خارجی 10 میلی‌گرم بر لیتر اسید سالیسیلیک سبب کاهش نشت یونی و محتوای مالون دی­آلدئید جوانه­های گل در شرایط تنش یخ­زدگی شد (Guo et al., 2007) که تائیدی بر یافته­های پژوهش حاضر است.

پراکسید هیدروژن

کاربرد ترکیبی اسید سالیسیلیک و اسید آبسیزیک سبب کاهش محتوای پراکسید­هیدروژن جوانه تا 37 درصد در مقایسه با شاهد شد. بین مقدار پراکسید هیدروژن جوانه در درختان تیمار شده با ترکیب اسید آبسیزیک + اسید سالیسیلیک و مقدار این شاخص در درختان محلول­پاشی شده با اسید آبسیزیک به تنهایی اختلاف معنی­داری وجود نداشت (جدول 3). یکی از اثرات سوء تنش سرما تجمع گونه­های فعال اکسیژن در غشاءها و ایجاد پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء است که با توجه به نتایج این تحقیق در درختان زیتون­تلخ تحت تنش سرما میزان پراکسید هیدروژن افزایش یافت. در پژوهشی بر روی انگور اعمال تیمار سرما ضمن ایجاد تنش اکسایشی به افزایش تدریجی غلظت پراکسید­هیدروژن در برگ گیاهان تحت تنش منجر شد (Karimi & Ershadi, 2015). در پژوهش حاضر، در درختان تیمار شده با اسید آبسیزیک میزان کمتری پراکسید ­هیدروژن مشاهده شد که با نتایج دیگر مطالعات روی تنش­های محیطی از قبیل سرما روی انگور (Karimi & Ershadi, 2015) و خیار (Zhang et al., 2012) همخوانی دارد. یکی از نقش­های مهم اسید آبسیزیک فعال­سازی آنزیم‌های آنتی­اکسیدان از قبیل پراکسیداز، کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز است که در این تحقیق اثبات شد، به طوری که در نتیجه افزایش فعالیت این آنزیم­ها در درختان تیمار شده با این تنظیم کننده رشد میزان تجمع گونه­های فعال اکسیژن از قبیل پراکسید هیدروژن و به دنبال آن میزان آسیب وارده به غشاء کاهش پیدا کرد.

پرولین

بین محتوای محتوای اسیدآمینه پرولین اندازه‌گیری شده در جوانه درختان زیتون­تلخ تیمار شده با اسید سالیسیلیک، اسید آبسیزیک و یا ترکیب این دو تنظیم­کننده رشد از لحاظ آماری تفاوتی مشاهده نشد (جدول 3). از سوی دیگر، بین مقدار پرولین این تیمارها و درختان شاهد تفاوت معنی­داری مشاهده شد، به طوری که مقدار پرولین در درختان تیمار شده با ترکیب اسید سالیسیلیک و اسید آبسیزیک تا 4/21 درصد بیشتر از مقدار این شاخص در درختان شاهد بود که نشاندهنده تأثیر این تنظیم­کننده­های رشد در بیوسنتز پرولین در راستای افزایش تحمّل به سرما در زیتون­تلخ است. این مشاهدات با نتایج پژوهش­های قبلی در مورد دیگر درختان مطابقت دارد. برای مثال، تجمع پرولین در اثر کاربرد برون­زاد اسید سالیسیلیک در درختچه همیشه­سبز برگ­نو (Yang et al., 2018) و دانهال­های دوساله دو گونه انگور (Abbasi Kashani et al., 2020) گزارش شده است که نتایج حاصل از پژوهش حاضر را تأیید می­کنند. همچنین، هم­راستا با نتایج پژوهش حاضر، در دانهال‌های انگور تحت تنش سرما کاربرد برگی اسید آبسیزیک سبب افزایش معنی­دار غلظت پرولین برگ شد (Karimi et al., 2016). با استفاده خارجی اسید آبسیزیک، غلظت درونی اسید آبسیزیک در برگ­ها افزایش یافته و ضمن تنظیم­ اسمزی سبب تجمع بیشتر محلول­های سازگاری سلول­ها در شرایط تنش می­شود (Karimi, 2017).

تولید رادیکال­های آزاد در شرایط تنش­های محیطی نظیر سرما افزایش یافته و در انتقال الکترون‌ها در کلروپلاست­ها و میتوکندری اختلال ایجاد می­کند. همچنین، تجمع رادیکال­های آزاد در شرایط تنش موجب تخریب و فروپاشی غشاءها می­شود (Adhikari et al., 2022). پرولین نقش آنتی­اکسیدانی دارد و در از بین بردن رادیکال­های آزاد مؤثر است و از این راه پروتئین­ها و غشاءها را در برابر آسیب­های اکسیداتیو محافظت می­کند (Cao et al., 2020). پرولین از جمله محلول­های سازگار است که گیاه در هنگام تنش سرما با تولید و ذخیره آن، سبب افزایش مقاومت خود در این شرایط شده و از اثرات سرمازدگی کم می­کند. پرولین انباشته شده در داخل سلول نه تنها منجر به تحمّل تنش می­شود، بلکه به ­عنوان یک نیتروژن آلی در طی دوران بهبودی از تنش ذخیره می­شود (Cao et al., 2020). از بین نقش­های متعدد پرولین در گیاهان که برای مقابله با تنش سرما ذکر شد، ممکن است در آزمایش حاضر، نقش پرولین به عنوان تنظیم­کننده اسمزی از اهمیّت بیشتری برخوردار بوده و منجر به حفظ ساختار غشاء شده است. افزایش میزان پرولین تحت تیمار اسید سالیسیلیک در برگ­نو (Yang et al., 2018) و انگور (Abbasi Kashani et al., 2020) گزارش شده است. بر اساس نتایج پژوهش­های عباسی کاشانی و همکاران (Abbasi Kashani et al., 2020)، کاربرد خارجی اسید سالیسیلیک تحت تنش سرما، محتوای اسید آبسیزیک درون سلولی را افزایش داده و به این ترتیب، منجر به تجمع پرولین در شرایط سرما و افزایش مقاومت به سرما می­شود. با توجه به نقش اسید آبسیزیک در فعال­سازی آنزیم­ها از جمله آنزیم دلتاپرولین­کربوکسیلات سینتتاز که نقش کلیدی در بیوسنتز پرولین دارد (Cao et al., 2020)، این احتمال می­رود که کاربرد برگی این هورمون در پژوهش حاضر با تأثیر بر فعالیت این آنزیم منجر به افزایش غلظت پرولین در جوانه بوته­های تیمار شده با این تنظیم کننده رشد شده باشد که البته نیاز به پژوهش­های بیشتری دارد.

قندهای محلول

محتوای قندهای محلول کل در جوانه درختان تیمار شده با اسید آبسیزیک و اسید سالیسیلیک و به­ویژه ترکیب آنها در مقایسه با گیاهان شاهد افزایش معنی­داری پیدا کرد (جدول 4). بیشترین محتوای قند محلول مربوط به تیمار اسید آبسیزیک به تنهایی بود که البته از لحاظ آماری با درختان تیمارشده با ترکیب اسید آبسیزیک و اسید سالیسیلیک اختلاف معنی­داری نداشت. اسید آبسیزیک سبب افزایش قندهای محلول تا 20 درصد در مقایسه با شاهد شد. بیوسنتز و تجمع محلول­های سازگاری از جمله قندها یکی از واکنش­های تنظیمی مهم گیاهان در پاسخ به تنش‌های محیطی است (Adhikari et al., 2022). بیشترین محتوای هر یک از قندهای ساده گلوکز، فروکتوز و ساکارز مربوط به تیمار کاربرد ترکیبی اسید سالیسیلیک و اسید آبسیزیک و کمترین آنها مربوط به شاهد بود (جدول 4).

جدول 4- اثر کاربرد برگی اسید سالیسیلیک (SA) و اسید آبسیزیک (ABA) بر محتوای کربوهیدرات کل و قندهای محلول (گلوکز، فروکتوز و سوکروز) جوانه­ زیتون تلخ در مرحله سازگاری به سرما (آبان ماه)

Table 4- The effect of foliar application of salicylic acid (SA) and abscisic acid (ABA) on soluble sugars and total carbohydrate content of chinaberry buds during cold acclimation stage (November)

*میانگین­های دارای حروف مشترک در هر ستون از لحاظ آماری (سطح 5 درصد) اختلاف معنی‌داری ندارند.

*Means with common letters in each column do not have a statistically significant difference (5% level).

در پژوهشی کاربرد برگی اسید سالیسیلیک در دانهال­های انگور منجر به افزایش کربوهیدرات­های محلول برگ شد (Abbasi Kashani et al., 2020) که نتایج حاصل از پژوهش حاضر را تأیید می­نماید. به نظر می­رسد تجمع قندهای محلول توسط تنظیم اسمزی به کاهش صدمه سرمازدگی منجر شده که این مسئله با نتایج گزارش شده در انگور (Ershadi & Taheri, 2013) و برگ­نوی درخشان (Yang et al., 2018) هم­خوانی دارد.

در پژوهش حاضر، غلظت کربوهیدرات‌های محلول در جوانه درختان تیمار شده افزایش یافت. افزایش غلظت قند‌های محلول در درختان تحت تنش سرما یکی از واکنش‌های سازگاری به این شرایط است که با تنظیم اسمزی به پایداری غشاء و بهبود تحمّل به سرما منجر می شود (Karimi et al., 2016). در درختچه هیدرانجیا، دمای پائین سبب تجمع مقادیر بالای قندهای محلول از قبیل گلوکز، فروکتوز، ساکاروز و رافینوز شد (Pagter et al., 2008). کربوهیدرات‌های محلول به عنوان ترکیبات محافظ ساختار سلول­ها در برابر یخ‌زدگی عمل کرده و با کاهش نقطه انجماد مایع سلولی از تشکیل یخ درون سلولی جلوگیری می‌کنند. به طور ویژه این قندها از طریق برهم­کنش با سر قطبی فسفولیپیدها باعث پایداری غشاء­ها می‌شوند (Karimi, 2017).

در پژوهش حاضر، کاربرد اسید آبسیزیک به­ویژه در ترکیب با اسید سالیسیلیک سبب افزایش چشمگیری در غلظت قندهای‌های محلول شد که نشاندهنده نقش این هورمون در ارتباط با تجمع قندهای محلول و افزایش سازگاری به سرما است. در پژوهش Meng et al., 2008 بر روی دانهال‌های خیار تحت تنش سرما، تیمار اسید آبسیزیک (غلظت 150 میکرومولار) سبب افزایش غلظت کربوهیدرات‌های محلول شد. کاربرد خارجی اسید آبسیزیک ضمن افزایش مولکول‌های پیام‌رسان از قبیل گونه‌های فعال اکسیژن و افزایش اسید آبسیزیک درون‌زاد ممکن است واکنش‌های دفاعی گیاه از قبیل سامانه آنتی‌اکسیدانی را تقویت و تجمع کربوهیدرات‌های غیرساختاری و اسیدهای­آمینه را در شرایط تنش بیشتر کند (Zhang et al., 2008). همچنین، به دلیل نقش شبه­هورمونی کربوهیدرات‌های محلول، ممکن است بین مسیر پیام‌رسانی اسید آبسیزیک و قندها و ویژگی تحمّل به سرما در گیاهان ارتباط وجود داشته باشد (Karimi, 2017).

فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی

بیشترین فعالیت آنزیم کاتالاز مربوط به درختان تیمار‌شده با اسید آبسیزیک بود که در مقایسه با شاهد 3/44 درصد بیشتر بود. همچنین، بیشترین فعالیت گایاکول­پراکسیداز مربوط به کاربرد ترکیبی اسید سالیسیلیک و اسید آبسیزیک و کمترین فعالیت آن مربوط به شاهد بود (جدول 5). بیشترین فعالیت آسکوربات پراکسیداز مربوط به تیمار اسید آبسیزیک به تنهایی بود که البته از این لحاظ با تیمار ترکیبی اسید سالیسیلیک و اسید آبسیزیک اختلاف معنی­داری نشان نداد. کمترین فعالیت این آنزیم مربوط به شاهد بود (جدول 5). سازگاری گیاه به سرما با افزایش میزان آنتی­اکسیدان­ها برای از بین بردن گونه­های فعال اکسیژن صورت می­گیرد. از جمله آنتی­اکسیدان­های مهم گیاهی که در این راستا نقش مهمی دارد کاتالاز است. بنابراین، میزان آن با افزایش تنش سرما بالا رفته و این اثر در تیمارهایی که از اسید آبسیزیک استفاده شده، به‌‌دلیل نقش آن در تعدیل­کنندگی سرما بسیار واضح­تر است. گزارش‌ها نشاندهنده این است که در انگور (Karimi et al., 2016) و چمن (Zhang et al., 2008) نیز کاربرد اسید آبسیزیک سبب افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز شده است که هم‌راستا با نتایج پژوهش حاضر می­باشد.

جدول 5- اثر کاربرد برگی اسید سالیسیلیک (SA) و اسید آبسیزیک (ABA) بر فعالیت آنزیم‌های آنتی­اکسیدانی کاتالاز، گایاکول پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز جوانه­ زیتون تلخ در مرحله سازگاری به سرما (آبان ماه)

Table 5- The effect of salicylic acid (SA) and abscisic acid (ABA) on activity of catalase, guaiacol peroxidase and ascorbate peroxidase antioxidant enzymes of chinaberry buds during cold acclimation stage (November)

*میانگین­های دارای حروف مشترک در هر ستون از لحاظ آماری (سطح 5 درصد) اختلاف معنی‌داری ندارند.

*Means with common letters in each column do not have a statistically significant difference (5% level).

فعالیت بیشتر گایاکول­ پراکسیداز در جوانه درختان تیمار شده با تنظیم کننده­های رشد از این جهت است که به ­عنوان آنزیم ضد رادیکال‌های آزاد اکسیژن، ضمن محافظت از درشت­مولکول‌ها و غشاهای سلول، آسیب‌های ناشی از رادیکال‌های آزاد اکسیژن به ­وجود آمده در اثر سرما را خنثی کند. پژوهش­ها نشان می­دهد اسید آبسیزیک می‌تواند به­ طور چشمگیری فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز را در انگورهای تحت تنش سرما (Karimi et al., 2016) افزایش دهد. همچنین، افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان بعد از تیمار اسید آبسیزیک در خیار (Zhang et al., 2012) و فلفل (Guo et al., 2012) تحت تنش سرما گزارش شده است که تأئیدی بر یافته­های این پژوهش است. تغییرات متابولیکی ایجاد شده با اسید آبسیزیک منجر به تغییر در سطوح رادیکال­های آزاد اکسیژن می‌شود. این تغییرات زمینه­ساز القاء سیستم دفاعی آنتی‌اکسیدانی می‌شود. به ­نظر می­رسد که اسید آبسیزیک و گونه‌های فعال اکسیژن به­ویژه پراکسید هیدروژن در سیستم پیام­رسانی سلولی دخالت داشته و به­ عنوان پیام­رسان ثانویه سبب القاء دفاع آنتی‌اکسیدانی تحت شرایط تنش سرما می­‌شود (Cao et al, 2020). فعالیت آنزیم آسکوربات­پراکسیداز نیز در پاسخ به تیمارهای مورد استفاده افزایش یافت. در واقع روند تغییرات آسکوربات پراکسیداز بسیار شبیه کاتالاز بود؛ زیرا این ترکیب نیز همانند کاتالاز یکی از آنتی­اکسیدان­های اصلی و مهم گیاهی بوده و در شرایط تنش، سلول­های گیاهی برای حفاظت در مقابل آسیب­های اکسیداتیو به تولید این ترکیب که نقش سیستم جاروب کننده رادیکال­های آزاد را دارد، می­پردازند (Karimi et al, 2016). اسید آبسیزیک با فعال کردن آنزیم­های درگیر در بیوسنتز آنزیم­های آنتی­اکسیدان به حذف و غیرفعال ­کردن گونه‌های فعال اکسیژن منجر می‌‌شود. در نتیجه با القاء سطح آنتی‌اکسیدان‌‌های آنزیمی و غیرآنزیمی، پراکسید هیدروژن را به­ طور بالقوه از سلول‌های گیاهی توسط آسکوربات به­ عنوان یک بستر بسیار مهم سم­زدایی پراکسید هیدروژن در دستگاه فتوسنتزی کاهش می‌دهد(Zhang et al., 2012) . در پژوهش حاضر، فعالیت هر سه آنزیم‌ در درختان تحت تأثیر تنش در مقایسه با درختان بدون تنش بیشتر بود. افزایش فعالیت آنتی‌اکسیدانی یکی از سازوکارهای مهم گیاهان برای افزایش تحمّل به تنش های محیطی از جمله سرما است. در پژوهشی بر روی دانهال­های زیتون تلخ، کاربرد تنش خشکی ملایم و متوسط سبب افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدان شد ولی کاربرد تنش خشکی شدید فعالیت آنزیم­ها را در برگ این دانهال­ها کاهش داد (Han et al., 2022). کاربرد خارجی اسید آبسیزیک به میزان زیادی سبب کاهش مالون ‌د‌ی‌آلدئید تولید شده در انگورهای تحت تنش­سرما شده است (Karimi et al., 2016). در پژوهشی کاربرد اسید آبسیزیک به کاهش تولید مالون­ د‌ی‌آلدئید منجر شد که نشاندهنده توانایی این تنظیم­کننده رشد گیاهی در خنثی­سازی رادیکال‌های فعال اکسیژن و جلوگیری از افزایش آن­ها است (Yang et al., 2011). احتمالاً اسید آبسیزیک با تأثیر بر روی فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اُکسیدان سبب کاهش محتوای رادیکال­های سوپراکسید و پراکسید هیدروژن شده و مانع فعالیت آنزیم لیپوکسیژناز و تجزیه اسید­های چرب غشاء شده و در نهایت، منجر به کاهش صدمات اکسیداتیو وارده به لیپیدهای غشاء طی دمای پائین شده است. یافته­های فوق با نتایج پژوهش حاضر همخوانی دارد.

در آزمایشی بر روی انگور، کاربرد پوتریسین، اسید سالیسیلیک و اسید آسکوربیک برون­زاد به افزایش معنی­دار فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی کاتالاز، گایاکول پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز تحت شرایط تنش­سرمایی منجر شدند (Jalili et al., 2023) که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد. پژوهش­ها نشان دادند پیش­تیمار اسید سالیسیلیک به عنوان یک فرایند مقاوم­سازی عمل نموده و با افزایش توان آنتی­اکسیدانی سلول سبب حفاظت بیشتر غشاءهای­ سلولی و کاهش مقدار پراکسیداسیون لیپیدها و جلوگیری از اکسیداسیون پروتئین­ها می­شود (Luo et al., 2014). در آزمایشی بر روی گیلاس، پس از کاربرد اسید سالیسیلیک به دنبال افزایش فعالیت آنزیم فنیل­آلانین آمونیالیاز ترکیبات فنولی تجمع پیدا کرد (Chan & Tian, 2006). بنابراین، اسید سالیسیلیک نقش مهمی در بیوسنتز ترکیبات فنولی و بیان ژن­های دفاعی گیاه دارد.

اسید آبسیزیک و اسید جیبرلیک 

بیشترین محتوای اسید آبسیزیک درون­زاد مربوط به تیمار کاربرد ترکیبی اسید سالیسیلیک و اسید آبسیزیک و کمترین آن مربوط به شاهد بود (شکل2). از سوی دیگر، کمترین محتوای اسید جیبرلیک مربوط به تیمار کاربرد ترکیبی اسید سالیسیلیک و اسید آبسیزیک و بیشترین مقدار آن مربوط به شاهد بود (شکل2). طی مرحله سازگاری به سرما محتوای اسید آبسیزیک در جوانه­ها افزایش و اسید جیبرلیک کاهش نشان دادند (Liu & Sherif, 2019). در تأئید یافته­های پژوهش حاضر، کیم و همکاران (Kim et al., 2016) نشان دادند که کاربرد اسید آبسیزیک برون­زاد سطوح درون­زاد جیبرلین­ها را تحت تأثیر قرار داده و مقاومت گیاه خربزه شرقی در برابر دمای پائین را افزایش می­دهد. اسید آبسیزیک یک عامل مهم پیام­رسانی برای دماهای پائین تنش­زا و دارای کارکرد محافظتی برای ساختار میکروتوبول سلول­ها می­باشد و گیاهان تحت تنش دمای پائین اسید آبسیزیک را در مقادیر زیاد و به سرعت برای انجام یک عملکرد محافظتی انباشته می­کنند (Pagter et al., 2008).

شکل 2- اثر کاربرد برگی اسید سالیسیلیک (SA) و اسید آبسیزیک (ABA) بر محتوای اسیدآبسیزیک (نمودار A ) و اسید جیبرلیک (نمودار B ) درون­زاد جوانه زیتون تلخ در مرحله سازگاری به سرما (آبان ماه). میانگین­های دارای حروف مشترک در هر ستون اختلاف معنی‌داری با هم ندارند (در سطح 5 درصد).

Figure 2- The effect of foliar application of salicylic acid (SA) and abscisic acid (ABA) on endogenous abscisic acid (Fig. A) and gibberellic acid (Fig. B) content of chinaberry bud during cold acclimation stage (November). Means with common letters in each column do not have a statistically significant difference (5% level).

در پژوهش حاضر، کاربرد خارجی اسید آبسیزیک به­ویژه در ترکیب با اسید سالیسیلیک سبب افزایش محتوای اسید آبسیزیک و کاهش محتوای اسید جیبرلیک درون­زاد شد که این تغییرات در راستای افزایش سازگاری به سرما و تحمّل یخ­زدگی در درختان انجام می­شود. تغییر میزان درون­زاد هورمون­های اسید آبسیزیک و اسید جیبرلیک پس از مصرف برون­زاد اسید سالیسیلیک در گیاه زینتی برگ­نوی درخشان نیز گزارش شده است (Yang et al., 2018) که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد. در تأیید یافته­های پژوهش حاضر، محلول­پاشی اسید آبسیزیک برون­زاد به افزایش محتوای اسید آبسیزیک درونزاد در برگ­ها و بهبود تحمّل بوته­های خیار به دماهای پائین منجر شد (Zhang et al., 2012). همچنین، افزایش محتوای اسید آبسیزیک درونزاد به همراه پلی­آمین‌‌ها در جوانه تاک در مرحله سازگاری به سرما افزایش چشم­گیری نشان داد که نشاندهنده نقش این ترکیبات در افزایش تحمّل به سرما در گیاهان چوبی است(Karimi, 2017) .

پوتریسین، اسپرمین و اسپرمین

بر اساس یافته­های پژوهش حاضر، بیشترین محتوای هر سه نوع پلی‌آمین‌ مربوط به درختانی بود که با ترکیب اسید سالیسیلیک و اسید آبسیزیک تیمار شده بودند. محتوای پوتریسین، اسپرمیدین و اسپرمین درون­زاد درختان تیمار شده با اسید سالیسیلیک + اسید آبسیزیک به ترتیب 3/33، 37/9 و 9/16 درصد بیشتر از درختان شاهد بود (جدول 6).

جدول 6- اثرکاربرد برگی اسید سالیسیلیک (SA) و اسید آبسیزیک (ABA) بر محتوای پلی­آمین­های پوترسین، اسپرمیدین و اسپرمین جوانه­ زیتون تلخ در مرحله سازگاری به سرما (آبان ماه)

Table 6- The effect of foliar application of salicylic acid (SA) and abscisic acid (ABA) on putrescine, spermidine and spermine content of chinaberry bud during cold acclimation stage (November)

*میانگین­های دارای حروف مشترک در هر ستون از لحاظ آماری اختلاف معنی‌داری در سطح پنج درصد ندارند.

*Means with common letters in each column do not have a statistically significant difference at probability level of 5%.

گیاهان برای زنده ماندن در شرایط نامساعد محیطی، راهبردهای سازگاری مختلفی را ایجاد کرده­اند که از جمله آنها می­توان به تجمع متابولیت­هایی با نقش محافظتی اشاره کرد. یکی از این متابولیت­ها که در پاسخ به تنش یا تحمّل تنش دخیل هستند، پلی­آمین­های آلیفاتیک با وزن مولکولی کم از جمله پوتریسین، اسپرمیدین و اسپرمین هستند. پژوهش­های قبلی نشان داده­اند که پلی­آمین­ها به علّت نقش مستقیم یا غیرمستقیم آنها در تنظیم سیستم­های آنتی­اکسیدانی یا جلوگیری از تولید گونه­های فعال اکسیژن، نقش مهمی در تحمّل به سرمای گیاهان دارند (Shi & Chan, 2014). محلول­پاشی پوتریسین، اسید سالیسیلیک و اسید آسکوربیک خسارت تنش یخ­زدگی (دمایCº 3-) در بوته­های انگور را کاهش داد (Jalili et al., 2023) که تائیدی بر نقش مثبت پلی­آمین­ها در سازگاری به سرما در گیاهان است.

تحمّل به سرمای زمستانه

تحمّل به سرمای زمستانه درختان زیتون­تلخ با روش نشت یونی طی دو مرحله دی و بهمن ماه مورد ارزیابی قرار گرفت. میزان نشت­یونی جوانه در هر مرحله از نمونه­برداری (دی و بهمن ماه) در دمای 6-، 12- و 18- درجه­سانتی­گراد  اندازه­گیری شد. در هر سه تیمار دمایی ذکر شده در دی­ و بهمن­ماه، کمترین میزان نشت­یونی مربوط به درختان محلول‌پاشی شده با اسید سالیسیلیک در ترکیب با اسید آبسیزیک بود. همچنین، بیشترین میزان نشت‌یونی در این سه تیمار دمایی مربوط به جوانه درختان شاهد بود (جدول 7). بیشترین و کمترین محتوای نشت­یونی در دمای °C6- درجه به ترتیب مربوط به شاهد و تیمار ترکیبی اسید سالیسیلیک و اسید آبسیزیک بود. بیشترین محتوای نشت­یونی در دمای °C12- مربوط به تیمار شاهد و کمترین آن مربوط به تیمار اسید سالیسیلیک + اسید آبسیزیک بود. همچنین، بیشترین محتوای نشت­یونی در دمای °C18- مربوط به شاهد و کمترین آن مربوط به ترکیب اسید سالیسیلیک و اسید آبسیزیک بود.

جدول 7- اثر کاربرد برگی اسید سالیسیلیک (SA) و اسید آبسیزیک (ABA) بر نشت یونی جوانه (درصد) به عنوان شاخصی از تحمل به سرمای زمستانه زیتون تلخ در دو مرحله دی و بهمن ماه تحت دماهای مختلف

Table 7- The effect of foliar application of salicylic acid (SA) and abscisic acid (ABA) on bud ion leakage (%) as an indicator of winter cold hardiness of chinaberry buds in January and February stages under different temperatures

میانگین­های دارای حروف مشترک در هر ستون از لحاظ آماری (سطح 5 درصد) اختلاف معنی‌داری ندارند.

Means with common letters in each column do not have a statistically significant difference (5% level).

تنش سرما منجر به افزایش نشت­‌یونی جوانه درختان زیتون­تلخ به­ویژه در گیاهان شاهد شد که نشاندهنده صدمات وارده به غشای سلول‌ها در این شرایط است. این نتایج با افزایش نشت ‌یونی مشاهده شده تحت تنش سرما در خیار (Zhang et al., 2012) و انگور (Ershadi & Taheri, 2013) مطابقت دارد. یکی از دلایلی که سبب ایجاد صدمات غشایی می‌شود، تنش اکسایشی است که در نتیجه افزایش تولید گونه‌های فعال اکسیژن ایجاد می‌شود. تنش سرما با کاهش سیالیت فسفولیپیدهای غشاء‌های زیستی یا غیرفعال کردن آنها و یا دست کم کاهش سرعت پمپ­های یونی متصل به غشاء، ضمن کاهش یا اختلال در عملکرد غشاء، نشت‌‌یونی را افزایش می‌دهد (Adhikari et al., 2022). در پژوهش حاضر، کاربرد برگی اسید آبسیزیک به طور معنی‌داری نشت­‌یونی را به عنوان یک شاخص آسیب‌دیدگی غشاء در درختان زیتون­تلخ سرما دیده کاهش داد، به طوری که با افزایش غلظت اسید آبسیزیک درصد نشت­‌یونی کاهش یافت. در مرکبات (Yang et al., 2011) و انگور (Karimi & Ershadi, 2015) نیز کاربرد برگی اسید آبسیزیک سبب کاهش نشت­یونی تحت تنش سرما شده است. اسید آبسیزیک از راه ساخت پروتئین‌های جدید، تعدیل پلی‌آمین­ها، تغییر در کربوهیدرات‌های محلول و تغییر در پایداری و عملکرد غشاء زمینه­ساز افزایش تحمّل به سرما در گیاهان می‌شود (Lim & Lee, 2020). این عملکرد اسید آبسیزیک می­تواند کاهش نشت­‌یونی در درختان تیمار شده در پژوهش حاضر را توضیح دهد. اسید آبسیزیک یک هورمون گیاهی است که نقش مهمی در سازگاری به سرمای گیاهان دارد (Zhang et al., 2012; Karimi et al., 2016). اسید آبسیزیک سبب تنظیم بیان یک سری ژن‌های کلیدی مرتبط با تحمّل به یخ­زدگی در گیاهان طی دوره سازگاری به سرما می­شود (Lim & Lee, 2020). کاربرد اسید سالیسیلیک برون­زاد روی گیاه همیشه­سبز برگ­نوی درخشان به بهبود تحمّل این گیاه طی مرحله مقاوم­سازی طبیعی منجر شد (Yang et al., 2018) که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد. بهبود مقاومت این گیاه در برابر دمای پائین به انباشت پرولین، پروتئین محلول و قندهای محلول و نیز تنظیم بیوسنتز اسید جیبرلیک و اسید آبسیزیک نسبت داده شد. به نظر می­رسد اسید سالیسیلیک با تأثیر بر روی فعالیت آنزیم­های آنتی‌اکسیدان و متابولیسم پراکسید هیدروژن، به کاهش خسارت سرما و افزایش تحمّل گیاه به سرما منجر می­شود. نقش حفاظتی اسید سالیسیلیک در برابر آسیب سرمایی در گیاهان مختلف مانند زردآلو (Guo et al., 2007; Alirezaie Noghondar et al., 2013) گزارش شده است. علیرضایی نوقوندر و همکاران (Alirezaie Noghondar et al., 2013) نیز بیان نمودند محلول‌پاشی اسید سالیسیلیک روی جوانه­های گل زردآلو سبب کاهش آسیب به مادگی و نشت یونی تحت تأثیر تنش یخ­زدگی مصنوعی (چهار ساعت در دمای °C4-) نسبت به شاهد شد. به نظر می­رسد اسید سالیسیلیک آنزیم­های متابولیسم پرولین و نیز تجمع پرولین را افزایش می­دهد. در پژوهشی Luo et al., 2014 بیان کردند محلول­پاشی اسید سالیسیلیک روی نشاهای بادام زمینی منجر به افزایش میزان پرولین و قندهای محلول شدند و به نظر می­رسد سبب بهبود تحمّل به سرما شدند. استفاده غلظت­های مختلف اسید سالیسیلیک در مرحله گلدهی روی زردآلوی شاهرودی نشان دادند غلظت دو میلی­مولار این تنظیم کننده رشد توانست خسارت ظاهری سرمازدگی گل­ها را کاهش دهد (Alirezaie Noghondar et al., 2013). نتایج پژوهش حاضر نشان دادند کاربرد اسید آبسیزیک و اسید سالیسیلیک منجر به یک سری تغییرات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی می‌شود که تا حد زیادی مشابه با وقایعی است که در مرحله سازگاری به سرما (به واسطه کاهش دما یا کوتاه شدن طول روز) در درخت اتفاق می­افتد. این تغییرات درختان را قادر می­سازند تا بتوانند دماهای پائین را بدون خسارت یا با خسارت کمتری تحمّل کنند. نقش اسید آبسیزیک در تحمّل یخ‌زدگی گیاهان از وقتی مشخص شد که کاربرد خارجی اسید آبسیزیک سبب جایگزین شدن واکنش‌های سازگاری به سرما شد. در‌واقع اسید آبسیزیک با القاء و تقویت برخی از مسیرهای متابولیکی مرتبط با سازگاری به سرما منجر‌به افزایش تحمّل درختان به دمای پائین شده است .(Cutler et al., 2010) 

جمع­بندی

کاربرد اسید آبسیزیک به­ویژه در ترکیب با اسید سالیسیلیک با تأثیر بر شاخص­های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی مرتبط با سازگاری به سرما منجر به کاهش آسیب و نشت یونی غشاء شد.کاهش تولید گونه های فعال اکسیژن در اثر کاربرد این تنظیم کننده های رشد نشاندهنده تقویت سیستم آنتی اکسیدانی گیاهان تیمار شده بود که با افزایش فعالیت آنزیم­های کاتالاز، پراکسیداز و آسکوربات­پراکسیداز و تجمع بیشتر ترکیبات فنولی خود را نشان داد. از سوی دیگر، کاربرد ترکیب اسید آبسیزیک و اسید سالیسیلیک با تغییر اسمولیت­های سازگار، تجمع بیشتر قندهای محلول، پلی­آمین­ها و هورمون­های گیاهی میزان تحمّل به سرما در درختان زیتون­تلخ تیمار شده را در مقایسه با شاهد افزایش داد که می­تواند به عنوان یک راهکار برای افزایش تحمّل به سرمای زمستانه زیتون تلخ در نقاط سردسیر استفاده شود.

 سپاسگزاری

هزینه این پژوهش (پایان­نامه) از محل اعتبار ویژه پژوهشی نویسنده مسئول (گرنت سال 1402 شماره 148-9/84) و دانشگاه ملایر تأمین شده است که به این وسیله قدردانی می گردد.