جداسازی و شناسایی عوامل پژمردگی فوزاریومی به‌لیمو و کنترل بیولوژیکی آن توسط قارچ Trichoderma harzianum در شهرستان خرم‌آباد

مقدمه

به‌لیمو با نام علمی Lippia citridora Kunth. گیاهی دارویی از خانواده شاه‌پسندیان (Verbenaceae)، در اصل بومی آمریکای جنوبی است و درختچه‌ای چندساله است که در مناطق گرمسیر همیشه‌سبز است (1). بیماری پژمردگی فوزاریومی یکی از مهم‌ترین بیماری‌های گیاهی در جهان است و موجب کاهش کمیت، کیفیت و ارزش غذایی محصول می‌شود. علائم بیماری ابتدا در برگ‌های پایینی و معمولاً بعد از ظهور گل و تشکیل میوه ظاهر می‌شود. بر اثر فعالیت قارچ خاکزاد
F. oxysporum آوندهای چوبی قهوه‌ای و مسدودشده و علائم زردی و پژمردگی مشابه کمبود آب در گیاه مشاهده می‌شود (2). گونة F. redolens بیشتر همراه با پوسیدگی‌ ریشه گونه‌های مختلف گیاهی در مناطق معتدل و گرم مشاهده می‌شود. این گونه نیز همانند
F. oxysporum دارای فرم خاص است که اختصاصیت میزبانی دارند (4،3). کنترل بیولوژیک ازجمله روش‌های طبیعی مهار عوامل بیماری‌زای گیاهی و کاهش خسارت ناشی از آنها است. کنترل بیولوژیک عبارت است از کاهش اولیه بیماری یا کاهش فعالیت‌های منجر به ایجاد بیماری ازطریق به‌کارگیری یک یا چند موجود زنده به‌غیر از انسان (5).

گونه‌های Trichoderma spp. عمدتاً خاکزاد هستند و کنترل زیستی را علیه بیمارگرهای گیاهی به‌صورت غیرمستقیم ازطریق رقابت برای مواد غذایی و مکان، تغییر شرایط محیطی یا ارتقای رشد گیاه و مکانیسم‌های دفاعی گیاه و آنتی بیوز اعمال می‌کنند یا به‌صورت مستقیم با مکانیسم‌هایی از قبیل مایکوپارازیتیسم این کار را انجام می‌دهند (6). در میان گونه‌هایTrichoderma ، گونة T. harzianum به‌دلیل رشد سریع، قدرت تکثیر بالا، تحمل به شرایط نامطلوب، توانایی رشد و کلونی‌شدن در ارتباط با ریشه گیاه و القای رشد گیاه به‌طور گسترده استفاده می‌شود (7). T. harzianum یکی از عوامل بیوکنترل مؤثر بوده است که در زمان حاضر به‌صورت تجاری برای کنترل چندین قارچ بیمارگر خاکزاد به‌صورت موفق به کار می‌رود (8).

محمد و بنهمو درزمینة مبارزه بیولوژیک با قارچ
 F. oxysporum بررسی‌هایی انجام داده‌اند که نشان می‌دهد قارچ T. harzianum قادر به ایجاد ترکیبات فرار و ترشحات سلولی بوده است و باعث جلوگیری از رشد قارچ عامل بیماری و دیگر بیمارگر‌های خاکزی می‌شود (9). الاد و همکاران دربارة بررسی مکانیزم و نحوه تأثیر قارچ بیوکنترل T. harzianum بر قارچ‌های بیماری‌زای Rhizoctonia sp. و Sclorotinia sp. تحقیقاتی انجام دادند (10). سیوان و همکاران اثر کنترل‌کنندگی قارچ T. harzianum بر پژمردگی فوزاریومی طوقه گوجه‌فرنگی و برخی از قارچ‌های بیماری‌زای خاکزی را در شرایط مزرعه بررسی کردند (11). اکرمی و همکاران در یک پژوهش، تأثیر چند جدایة T. harzianum و
T. asperellum  را به‌طور جداگانه و مخلوط با هم علیه عامل بیماری فوزاریومی لوبیا در شرایط گلخانه مقایسه کردند و در این بررسی از مخلوط چند جدایه با هم نتایج خوبی به دست آمد (12).

با توجه به اهمیت گیاه به‌لیمو به‌عنوان یک گیاه دارویی که سطح زیرکشت حدود 100 هکتار را در استان لرستان و حدود 6 هزار هکتار را در کشور به خود اختصاص داده است و نقش مهمی در صادرات غیرنفتی دارد و عوامل بیماری‌زا نیز خسارت چشمگیری به این محصول می‌توانند وارد کنند، پژوهش حاضر به‌منظور جداسازی و شناسایی عوامل پژمردگی فوزاریومی در به‌لیمو و تأثیر عوامل بیوکنترل در جلوگیری از خسارت بیماری انجام گرفت.

مواد و روش‌ها

جداسازی، خالص‌سازی و شناسایی نمونه‌ها: در طول پاییز 1400، تعداد 45 نمونه از مزارع بخش رباط نمکی شهرستان خرم‌آباد از قسمت‌های ریشه، طوقه و ساقه گیاهان به‌لیمو دارای علائم بیماری مانند پژمردگی و زردی جمع‌آوری شدند. نمونه‌ها برای جداسازی و خالص‌سازی به آزمایشگاه، منتقل و در یخچال نگهداری شدند. پس از شستشوی بخش‌های آلودة اندام‌های گیاهی با جریان ملایم آب، با استفاده از اسکالپل سترون از حد واسط بافت آلوده و سالم برش داده شد و قطعات در محلول یک درصد هیپوکلریت سدیم^[1] به مدت یک تا سه دقیقه ضدعفونی سطحی و سه مرتبه با آب مقطر سترون شستشو داده شدند. سپس سه تا چهار قطعه از هر نمونه به تشتک حاوی محیط کشت PDA برای جداسازی و رشد و تکثیر قارچ،‌ منتقل و در دمای
25 درجة سانتی‌گراد به مدت هفت روز نگهداری شدند (13). پس از هفت روز نگهداری تشتک‌ها در انکوباتور و رشد پرگنه قارچی دارای ویژگی فوزاریوم، به روش تک اسپور و نوک ریسه کردن روی محیط WA
(آب-آگار) خالص شدند (14). جدایه‌های خالص‌سازی‌شده روی محیط SNA در دمای چهار درجة سانتی‌گراد نگهداری شدند. شناسایی جدایه‌ها براساس ویژگی‌های ساختاری غیرجنسی، مانند رنگ پرگنه، نرخ رشد، میسلیوم هوایی، وجود یا عدم وجود رنگدانه از روی و از پشت تشتک محیط کشت PDA و شکل ماکرو و میکروکنیدیوم‌ها، فیالیدها، کلامیدوسپور روی محیط کشت‌ PDA، CLA (برگ میخک-آگار) و SNA و در شرایط نوری و دمایی توصیه‌شده در منابع معتبر انجام گرفت (15- 17).

شناسایی مولکولی جدایه‌های قارچی: این بخش از پژوهش با هدف تأیید و تکمیل شناسایی ریخت‌شناختی و با استفاده از روش‌های تکثیر و توالی‌یابی ناحیه ژنی TEF-1α انجام شد. استخراج DNA ژنومی قارچ با استفاده از روش ژانگ و استفنسون با اعمال اندکی تغییرات انجام گرفت و بدین منظور از توده میسلیومی پنج تا هفت روزه قارچ استفاده شد (18). آزمون PCR در حجم نهایی 25 میکرولیتر به کمک یک جفت آغازگر اختصاصی رفت و برگشت مربوط به ناحیه ژنی TEF-1α (19) و با استفاده از کیت
PCR Master Mix شرکت PCR Bio System انگلیس و طبق دستورالعمل شرکت انجام شد. در نمونه شاهد منفی به‌جای DNA، آب مقطر استریل اضافه شد. برنامة حرارتی به‌منظور تکثیر ناحیه ژنی مذکور به‌صورت زیر انجام شد؛ یک چرخه واسرشت‌سازی اولیه به مدت
5 دقیقه در دمای 94 درجة سانتی‌گراد و سپس 35 چرخه شامل واسرشت‌سازی در دمای 94 درجة سانتی‌گراد به مدت 45 ثانیه، اتصال آغازگر در دمای 55 درجة سانتی‌گراد به مدت 35 ثانیه و بسط در دمای 72 درجة سانتی‌گراد به مدت 45 ثانیه و درنهایت، واکنش بسط نهایی در دمای 72 درجة سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه صورت گرفت.

به‌منظور ارزیابی کیفیت و کمیت، محصولات PCR روی ژل آگارز یک درصد بارگذاری و ارزیابی شدند. برای خالص‌سازی و تعیین ترادف نوکلئوتیدی، نمونه‌ها به شرکت ماکروژن کره جنوبی (Macrogen, South Korea) ارسال شدند. سپس ترادف‌های به‌‌دست‌‌آمده در پایگاه NCBI با کمک ابزار بلاست با ترادف‌های موجود مربوط به همین ناحیه ژنی مقایسه شدند. درخت فیلوژنتیکی این جدایه‌ها به کمک نرم‌افزار
MEGA 11.0 و با روش Neighbor-Joining و براساس 1000 تکرار در ارزیابی رسم شد (21،20).

بررسی تعاملات بیمارگر و بیوکنترل به روش کشت متقابل در شرایط آزمایشگاهی: قارچ بیوکنترل T. harzianum از کلکسیون قارچ آزمایشگاه بیماری‌شناسی دانشگاه لرستان به کد دسترسی OQ702632 به‌صورت خالص، تهیه و روی محیط کشت PDA کشت شد. اثر بیوکنترل Trichoderma روی عامل بیماری‌زای Fusarium با استفاده از روش کشت متقابل همزمان دنیس و وبستر (22) در تشتک‌های 9 سانتی‌متری حاوی PDA در قالب طرح کامل تصادفی و در سه تکرار انجام گرفت. تشتک‌ها روزانه بررسی شدند و با ثبت مشخصات ماکروسکوپی پرگنه قارچ‌های بیوکنترل و بیمارگر و اسپورزایی قارچ بیوکنترل روی پرگنه قارچ بیمارگر با مشاهدات میکروسکوپی، قدرت آنتاگونیستی جدایه‌ها ارزیابی و مقایسه شد. در ادامه، داده‌ها تجزیه و تحلیل آماری شدند و درصد بازدارندگی از رشد میسلیوم قارچ با استفاده از رابطه (1) محاسبه شد (23).

بررسی اثر متابولیت‌‌های فرار قارچ Trichoderma بر رشد قارچ بیمارگر به روش ساندویچ در شرایط آزمایشگاهی: ارزیابی بازدارندگی از رشد قارچ بیوکنترل علیه قارچ بیمارگر به‌وسیلة تولید متابولیت‌های فرار با استفاده از روش دنیس و وبستر (22) در تشتک‌های 9 سانتی‌متری حاوی PDA در قالب طرح کاملاً تصادفی و در سه تکرار طراحی شد و به‌صورت روزانه قطر پرگنه عامل بیماری و قارچ بیوکنترل اندازه‌گیری شد. درصد بازدارندگی از رشد میسلیوم قارچ بیمارگر بر اثر متابولیت‌های فرار با استفاده از رابطه (2) به دست آمد. که در این فرمول IP نشان دهنده درصد بازدارندگی، C و T به ترتیب قطر پرگنه‌ی بیمارگر در شاهد و تیمار است.

بررسی اثر بازدارندگی جدایة Trichoderma بر بیماری پژمردگی فوزاریومی به‌لیمو در شرایط گلخانه: به‌منظور مشاهدة اثر قارچ بیوکنترل
T. harzianum بر شاخص‌های رشدی گیاه به‌لیمو (ارتفاع گیاه، وزن تر و خشک) در شرایط آلوده و غیرآلوده به قارچ عامل بیمارگر و در مقایسه با شاهد آلوده و غیرآلوده و همچنین برای تهیه مایه تلقیح جدایة Trichoderma از روش محمدی (1389) (24) استفاده شد. پس از سترون‌کردن مقدار خاک مزرعه مورد نیاز برای کشت نهایی از گلدان‌های سه کیلوگرمی استفاده شد. سپس ریشه نهال‌های به‌لیمو با محلول سم زینب و آب مقطر سترون شدند و برای کشت به گلدان‌ها، منتقل و در دمای 25 درجة ‌سانتی‌گراد در گلخانه نگهداری شدند. بعد از خشک‌شدن بوته‌ها و جوانه‌زنی مجدد آنها، زمانی که به‌لیموها در مرحله رشدی مشخصی قرار گرفتند، مایه تلقیح Trichoderma پودری تهیه‌شده به میزان 10 گرم در هر کیلوگرم به خاک اضافه شد و همزمان سوسپانسیون قارچ بیمارگر به روش پاستور-کرل و همکاران (25) با غلظت 10⁶×1 اسپور در هر میلی‎لیتر آب، تهیه و با استفاده از روش فروبردن ریشه در سوسپانسیون اسپور قارچ مایه‌زنی انجام شد. همچنین در این بررسی برای کنترل عامل بیماری از روش شیمیایی استفاده شد و مقدار 5/0 گرم قارچ‌کش متیل تیوفانات⁶ در 5/0 لیتر آب مقطر، حل و این محلول به تیمار عامل بیمارگر اسپری‌پاشی شد. در شاهد سالم قارچ بیمارگر و در شاهد بیمار بیوکنترل مایه‌زنی انجام نشد. بعد از کشت به‌لیموها و اعمال تیمارها، روزانه از گلخانه بازدید شد و سلامت و بیماربودن گیاهان ازجمله زرد و خشک شدن و پژمردگی بوته‌ها بررسی شدند. در پایان آزمایش،
30 تا 40 روز پس از تلقیح، شاخص‌های گیاهی ازجمله وزن تر و خشک و ارتفاع گیاه یادداشت‌برداری شدند و برای تمام تیمارها، محاسبه و به‌طور آماری آنالیز شدند (26).

برای تعیین وقوع بیماری و شدت بیماری در بوته‌های آلوده از رابطه (3) و (4) استفاده می‌شود (28،27).

DI =  (درصد بیماری)                                                   (3)

در این رابطه DI بیان‌کنندة میزان وقوع بیماری،
X تعداد بوته‌های بیمار و N تعداد کل بوته‌های ارزیابی‌شده است. داده‌های مربوط به بروز بیماری (DI) (درصد بوته پوسیده) و شدت بیمار (DS) (قطر ناحیه آلوده) در اطراف زخم‌ها به‌‌عنوان میانگین هر تکرار محاسبه می‌شوند (29).

DS (درصد شدت بیماری) =

(4)

A: تعداد بوته‌های بدون علامت بیماری، B: تعداد بوته‌های آلوده در مقیاس 1، C: تعداد بوته‌های آلوده در مقیاس 2، D: تعداد بوته‌های آلوده در مقیاس 3،
E: تعداد بوته‌های آلوده در مقیاس 4

تجزیه و تحلیل داده‌های آماری: تمام آزمایش‌های آزمایشگاهی و گلخانه‌ای در قالب طرح کاملاً تصادفی اجرا شدند. تجزیه و تحلیل آماری توسط نرم‌افزار SAS ver 9.1 انجام شد و برای مقایسه میانگین‌ها از آزمون Tukey (در سطح احتمال 5 درصد) و از نرم‌افزار Excel برای مرتب‌کردن داده‌ها و رسم نمودار استفاده شد.

نتایج

نتایج جداسازی و شناسایی جدایه‌ها: درمجموع، 30 جدایة Fusarium از نمونه‌های جمع‌آوری‌شده جداسازی شدند. جدایه‌ها پس از شناسایی براساس مشخصات مورفولوژیکی، در دو گونة F. oxysporum و F. redolens به‌ترتیب با فراوانی 7/56 و 3/43 قرار گرفتند (شکل 1) و از 7 جدایة مشکوک بررسی‌شده در مطالعات مولکولی، 4 جدایة
F. oxysporum و 3 جدایة F. redolens شناسایی شدند.

شکل 1- الکتروفورز محصولات PCR به اندازه تقریبی 700 جفت‌باز از ناحیه ژن TEF در 7 جدایة‌ Fusarium از به‌لیمو (چاهک اول از سمت چپ مارکر مولکولی 100-3000bp مربوط به شرکت پیشگام، چاهک‌های A-G: قطعات تکثیرشده مربوط به ناحیه ژنی TEF از نمونه‌های آلوده به Fusarium و چاهک آخر: شاهد منفی)

Fig 1 – Electrophoresis of PCR products approximately 700 bp from the TEF gene region in seven Fusarium isolates from lemon verena (the first well from the left side of the 100-3000bp molecular marker belonging to Pishgam company, wells A-G: amplified fragments related to the TEF gene region from the samples Fusarium-infected plants and the last well: negative control)

توالی‌های ژن TEF جدایه‌های فوزاریوم برای رسم درخت فیلوژنی تجزیه و تحلیل شدند. در درخت رسم‌شده، جدایه‌های فوزاریوم به دو گروه کلی تقسیم شدند: گروه اول شامل جدایه‌های A، C،  Dو G به‌دست‌آمده در تحقیق حاضر و گونه‌های F.oxysporum سایر توالی‌های موجود در بانک ژن بود و گروه دوم شامل جدایه‌های B،  Eو F و نیز گونه‌های F.redolens دیگر توالی‌های ثبت‌شده در بانک ژن بود. این توالی‌ها از کشورهایی نظیر اسپانیا، آلمان، فنلاند، ایران و سایر کشورها از روی محصولات مختلف شامل کاهو، باقلا، اسطوخودوس، گندم و سایر محصولات، جداسازی و در پایگاه داده‌ای NCBI ثبت شده بودند؛ بنابراین، تجزیه و تحلیل‌های فیلوژنتیکی قادر به تمایز گونه‌های فوزاریوم براساس ژن TEF بود. در رسم درخت از Trichoderma sp. به‌عنوان گروه خارجی با خویشاوندی نزدیک استفاده شد (شکل 2).

شکل 2- درخت تبارزایی رسم‌شده با استفاده از روش NJ (Neighbor-joining) با 1000 تکرار در ارزیابی در نرم‌افزار MEGA 11.0 براساس توالی نوکلئوتیدی ژن TEF-1α برای 7 جدایة Fusarium از به‌لیمو (A-G). جدایه‌ای از گونة Trichoderma sp. به‌عنوان گروه خارجی در نظر گرفته شده است.

Fig 2 – Genealogical tree drawn using NJ (Neighbor-joining) method with 1000 repetitions in evaluation in MEGA 11.0 software based on nucleotide sequence of TEF-1α gene for seven isolates of Fusarium from lemon verena
(A-G). An isolate of Trichoderma sp. it is considered as an out group.

نتایج آزمون اثبات بیماری‌زایی: به‌منظور انجام آزمون اثبات بیماری‌زایی در شرایط گلخانه، هر دو گونه به روش آغشته‌سازی ریشة نهال‌ها در سوسپانسیون اسپور بوته‌ها مایه‌زنی شدند. علائم بیماری 14 روز پس از مایه‌زنی در اندام‌های هوایی نهال‌های به‌لیمو به‌صورت زردی، پژمردگی و خشکی برگ‌ها همراه با تیره‌شدن ساقه گیاه از نزدیک طوقه به سمت بالا ظاهر شد. چهار هفته پس از تلقیح، علائم بیماری در بافت آوندی ریشه و طوقه، پدیدار و به‌صورت پوسیدگی قهوه‌ای نمایان شد و برگ‌های اولیه خشک شدند و ریزش کردند و درنهایت، سبز خشکی و بوته‌میری عارض شد. پس از برآورد نمونه‌های گلخانه‌ای، هر دو گونه بیماری‌زا بودند؛ اما گونة F. oxysporum بیشتر در ساقه و گونة F. redolens بیشتر روی ریشه ایجاد بیماری کرده بود و شدت بیماری‌زایی گونة F. redolens (78 درصد) نسبت به گونة F. oxysporum (55 درصد) بیشتر بود (شکل 3).

شکل 3- شدت بیماری‌زایی چهار هفته پس از مایه‌زنی قارچ‌های (A F. redolens و (B F. oxysporum به نهال‌های به‌لیمو در گلخانه

Fig 3 – Pathogenic severity four weeks after inoculation of fungi (A Fusarium redolens and B F. oxysporum) to lemon verbena seedlings in the greenhouse.

 بررسی تأثیر بیوکنترل بر بیمارگرها به روش کشت متقابل: در این پژوهش قارچ بیوکنترل
T. harzianum، قادر به ممانعت از رشد رویشی قارچ‌های بیمارگر F. oxysporum و F. redolens به درجات مختلف بود؛ درنتیجه، پیشروی قارچ عامل مهار زیستی روی پرگنه قارچ عامل بیمارگر F. redolens مشاهده شد. در محل برخورد جدایة تریکودرما و عوامل بیماری‌زا رشد میسلیوم‌های آنها بسیار اندک و کم‌تراکم شده بود. همچنین، در این محل میزان اسپور عوامل بیماری‌زا کاهش یافته بود. براساس نتایج مقایسه میانگین، 96 ساعت پس از مایه‌زنی، جدایة T. harzianum ازنظر بازدارندگی رشد قارچ‌های عامل بیماری، در سطح احتمال 5 درصد با همدیگر تفاوت معنی‌داری داشتند و قارچ‌های عامل بیماری نسبت به شاهد به‌ترتیب در
F. oxysporum، 5/71 درصد و در F. redolens، 5/56 درصد کاهش رشد نشان دادند. نتایج تجزیه واریانس داده‌های آزمون کشت متقابل نشان دادند جدایة Trichoderma در برابر رشد قارچ‌های بیمارگر مؤثر بوده است و این عامل بیولوژی در سطح احتمال
5 درصد، از رشد میسلیوم‌ بیمارگرها ممانعت کرد و دارای اختلاف معنی‌داری است. با توجه به نتایج مقایسه‌های میانگین و درصد بازدارندگی می‌توان گفت قارچ بیوکنترل T. harzianum، قارچ‌ بیمارگر
F. oxysporum را نسبت به F. redolens بهتر کنترل می‌کند و بیشتر مانع رشد آن می‌شود (شکل 4 و 5).

شکل 4- تقابل ماکروسکوپی قارچ بیوکنترل T. harzianum و بیمارگرهای (A) F. oxysporum و (B) F. redolens در مقایسه با شاهد بیمارگر به روش Dual culture

Fig 4 – Macroscopic comparison of the biocontrol fungus Trichoderma harzianum and pathogens (A) Fusarium oxysporum and (B) F. redolens compared to the pathogen control by Dual culture method.

شکل 5- مقایسه درصد بازدارندگی جدایة T. harzianum از رشد میسلیوم قارچ‌های F. oxysporum و F. redolens در کشت متقابل همزمان به روش Dual culture

Fig 5 – Comparison of the inhibition percentage of Trichoderma harzianum isolates against the mycelium growth of Fusarium oxysporum and F. redolens in simultaneous mutual cultivation by dual culture method.

بررسی اثر متابولیت‌های فرار قارچ Trichoderma بر رشد بیمارگرها به روش ساندویچ: ازنظر ترکیبات فرار نیز نتایج مقایسه‌های میانگین نشان می‌دهند جدایة T. harzianum قادر به کاهش رشد قارچ‌های بیمارگر F. oxysporum و
F. redolens بوده است. در این مقایسه، 120 ساعت پس از مایه‌زنی، عامل بیوکنترل T. harzianum توانست از رشد میسلیوم‌های عوامل بیمارگر F. oxysporum و
F. redolens به‌ترتیب 5/61 و 5/50 درصد، جلوگیری و آنها را نیز کنترل کند (شکل 6 و 7).

شکل 6- تأثیر بازدارندگی متابولیت‌های فرار T. harzianum بر رشد بیمارگرهای F. oxysporum (ردیف A) و F. redolens (ردیف B) نسبت به شاهد بیمارگر به روش Exposure

Fig 6 – The inhibitory effect of volatile metabolites of Trichoderma harzianum on the growth of pathogens Fusarium oxysporum (row A) and F. redolens (row B) compared to the pathogen control by exposure method.

شکل 7- مقایسه درصد بازدارندگی جدایة T. harzianum از رشد میسلیوم قارچ‌های F. oxysporum و F. redolens به روش Exposure

Fig 7 – Comparison of inhibition percentage of Trichoderma harzianum isolate from the mycelium growth of Fsariumoxysporum and F. redolens by exposure method.

نتایج مطالعات مهار زیستی در محیط گلخانه: در آزمایش‌های گلخانه‌ای با مایه تلقیح اسپور قارچ‌های عامل بیمارگر F. oxysporum و F. redolens در غلظت تعیین‌شده، نتایج نشان دادند حجم و ارتفاع ریشه و اندام‌های هوایی تیمار T. harzianum نسبت به شاهد افزایش داشته است؛ بنابراین، افزایش فاکتور‌های رشدی تیمارهای تلقیح‌شده با T. harzianum نسبت به بیمارگرهای F. oxysporum و F. redolens دیده شد. کاهش بیماری توسط جدایة T. harzianum در سطح
5 درصد معنی‌دار بود (شکل 8).

شکل 8- مقایسه ریشه تیمارهای بررسی‌شده (A به‌ترتیب از چپ به راست شامل عامل بیوکنترل T. harzianum، شاهد سالم، عامل بیوکنترل به‌همراه عامل بیمارگر F. oxysporum، شاهد آلوده F. oxysporum و (B به‌ترتیب از چپ به راست عامل بیوکنترل T. harzianum، شاهد سالم،
عامل بیوکنترل به‌همراه عامل بیمارگر F. redolens، شاهد آلوده F. redolens

Fig 8 – Comparison of the root of the investigated treatments: A) from left to right including biocontrol agent Trichoderma harzianum, healthy control, biocontrol agent along with pathogenic agent Fusarium oxysporum, infected control F. oxysporum and B) from left to right, biocontrol agent T. harzianum, healthy control, biocontrol agent with F. redolens pathogenic agent, F. redolens infected control.

بررسی تأثیر تیمارها بر ارتفاع، وزن تر و وزن خشک نهال‌های به‌لیمو: در این آزمایش،
T. harzianum با میانگین چهار تکرار و سه زیرتکرار، 75/66 و 12/17 بلندترین ارتفاع اندام هوایی و ریشه را به خود اختصاص داده و پس از آن، F. redolens با میانگین چهار تکرار و سه زیرتکرار، 91/52 و 78/11 سانتی‌متر ارتفاع را به‌عنوان کمترین تیمار داشته است. همچنین، بیشترین وزن تر اندام هوایی و ریشه نسبت به شاهد در جدایة T. harzianum به‌ترتیب به میزان 57/7 و 64/1 گرم افزایش داشته است و بیشترین وزن خشک اندام هوایی و ریشه نیز در جدایة T. harzianum به میزان 27/6 و 68/0 گرم نسبت به شاهد افزایش یافته است که با کمک آزمون توکی در سطح 5 درصد با شاهد اختلاف معنی‌دار داشتند. مقایسه میانگین شاخص‌های رشدی در گیاهان سالم تیمارشده با عامل مهار زیستی نشان داد همه تیمارها نسبت به شاهد سالم باعث افزایش شاخص‌های رشدی شده‌‌اند و همچنین شاهد آلوده تیمارشده با قارچ‌کش متیل تیوفانات و عامل بیوکنترل بر فاکتورهای رشدی تأثیرگذار بوده و باعث ازدیاد آنها شده‌اند (شکل 9).

شکل 9- تأثیر تیمارها بر شاخص‌های رشدی اندام هوایی و ریشه نهال‌های به‌لیمو 30 روز پس از کاشت در شرایط آلوده و غیرآلوده

Fig 9 – The effect of treatments on growth indices of shoots and roots of lemon verbena seedlings 30 days after planting in infected and non-infected conditions.

 تأثیر عامل مهار زیستی بر شدت بیماری پژمردگی فوزاریومی به‌لیمو: در این بررسی مشاهده شد قارچ بیوکنترل T. harzianum و قارچ‌کش متیل تیوفانات^[2] تأثیر به‌سزایی بر شدت بیماری قارچ‌های بیمارگر F. oxysporum و F. redolens نشان دادند. مؤثرترین تیمار در کاهش شدت بیماری F.o+T M است. گیاه آلوده بر اثر این عامل شیمیایی به‌طور میانگین، 25 درصد نشانه‌ها را نشان داد. این تیمار باعث کاهش 5/64 درصدی شدت نشانه‌ها شد؛ بنابراین، کنترل بیماری به روش استفاده از عامل شیمیایی تأثیرگذارتر از استفاده از عامل بیوکنترل بوده است. تیمارهای
F.r+T M، F.o+T.h و F.s+T.h به‌ترتیب با میانگین 5/59، 5/41 و 30 درصد کاهش شدت بیماری در رتبه‌های بعدی قرار دارند. این 4 تیمار با تیمارهای شاهد آلوده (C+F.r, C+F.o) و تیمار شاهد غیرآلوده (C) ازنظر شدت بیماری در سطح 5 درصد اختلاف معنی‌داری را نشان دادند (شکل 10).

شکل 10- تأثیر عوامل کنترل بیولوژیک بر شدت بیماری پژمردگی فوزاریومی به‌لیمو 15 روز و 30 روز پس از کاشت

Fig 10 –10- The effect of biological control agents on the severity of fusarium wilt disease in lemon verbena
15 days and 30 days after planting.

 بحث و نتیجه‌گیری

پس از نمونه‌برداری گیاهان دارای علائم بیماری، جداسازی و خالص‌‌سازی قارچ‌های عامل بیماری، شناسایی 30 جدایه با خصوصیات مورفولوژیکی انجام و مشخص شد که 13 جدایه متعلق به F. oxysporum و 10 جدایه متعلق به F. redolens هستند و 7 جدایه مشکوک به گونة جدید و مجتمع ازنظر مولکولی بررسی‌ شدند و در نهایت، 4 جدایه در گونة F. oxysporum و 3 جدایه در گونة F. redolens طبقه بندی شدند. در مطالعات کوی‌کو و همکاران (30) نیز گونة
F. oxysporum از داخل رویان بذر پیاز جداسازی و شناسایی شده است. در گذشته نیز F. redolens و
F. oxysporum از علف‌های هرز Coix lacrymajobi (31) و علف‌باغ Dactylis glomerata (L.) D.C. (32) جداسازی و شناسایی شده‌اند که این گونه‌ها متعلق به تیره گندمیان هستند. جدایه‌های هر دو گونه با توصیف‌های صارمی (1377) (33) منطبق بودند. مشخصات قارچ F. redolens جداشده از گیاه دارویی به‌لیمو از لحاظ رنگ پرگنه، اندازه و شکل فیالید، ماکروکنیدیوم، میکروکنیدیوم با مشخصات ذکرشده توسط خداپرست و هجاروده (1375) (34) و کلیدهای (35) مشابه بود. همچنین، مشخصات قارچ
F. oxysporum با مشخصات مشاهده‌شده در تحقیق فریدی و کاوسی (1391) (36) مطابقت داشت. هر دو گونه در آزمون اثبات بیماری‌زایی در گلخانه به روش آغشته‌سازی ریشه نهال‌ها در سوسپانسیون اسپور قارچ‌های عامل بیماری به کار گرفته شدند و هر دو خسارت وارد کردند و بیماری‌زا بودند. در تحقیقات قبل، گزارش زیادی از F. oxysporum به‌عنوان بیمارگر در گیاهان مختلف گزارش شده است. همچنین، در ایران گونة F. oxysporum به‌عنوان عامل بیماری‌زا در گیاهان دارویی اسطوخودوس و رزماری گزارش شده است (37). اثبات بیماری‌زایی F. redolens روی گیاه دارویی به‌لیمو با نتایج اوجی اردبیلی و همکاران (38) روی گیاه دارویی رزماری در سمنان مطابقت داشت.

جدایة T. harzianum برای اثبات فعالیت آنتاگونیستی در برابر بیمارگرهای F. oxysporum و
F. redolens در شرایط آزمایشگاه و گلخانه بررسی شد. در بررسی ماکروسکوپی تقابل جدایة قارچ Trichoderma با گونه‌های قارچ فوزاریوم با استفاده از روش کشت متقابل همزمان (Dual culture) مشاهده شد که جدایة‌ T. harzianum رشد هر دو قارچ بیمارگر
F. oxysporum و F. redolens را محدود کرده است؛ بنابراین، پیشروی (نفوذ و پیچیدگی) قارچ عامل بیوکنترل روی پرگنه قارچ عامل بیمارگر F. redolens مشاهده شد؛ اما جدایة T. harzianum قادر به پیشروی روی پرگنه عامل بیمارگر F. oxysporum نبود و فقط از رشد میسلیوم ممانعت کرد. اشرفی‌زاده و همکاران (1383) نشان دادند Trichoderma sp. جدایة 96 مانع از رشد قارچ عامل بیمارگر F. oxysporum f. sp. melonis شدمی‌شود؛ اما روی پرگنه عامل بیماری پیشروی نمی‌کند (39). بیشترین درصد بازدارندگی از رشد به میزان 5/71 درصد در تقابل همزمان جدایة
 T. harzianumبا عامل بیمارگر F. oxysporum و کمترین درصد بازدارندگی از رشد به میزان 5/56 در تقابل همزمان جدایة T. harzianum با عامل بیمارگر F. redolens مشاهده و مشخص شد که قارچ بیوکنترل T. harzianum، قارچ‌ بیمارگر F. oxysporum را نسبت به F. redolens بهتر کنترل می‌کند و بیشتر مانع رشد آن می‌شود. نتایج بررسی اعتباریان و همکاران (1378) نشان‌دهندة قدرت تغذیه‌ای بالای Trichoderma است (40). در بررسی اثر متابولیت‌های فرار (گازی) حاصل از جدایة تریکودرما با روش ساندویچ مشخص شد جدایة تریکودرما در جلوگیری از رشد میسلیوم قارچ‌های عامل بیماری مؤثر است. ترکیبات فرار جدایة T. harzianum با 5/61 درصد بازداری از قارچ بیمارگر F. oxysporum و 5/50 درصد بازداری از قارچ بیمارگر F. redolens به‌ترتیب بیشترین و کمترین اثر را در جلوگیری از رشد و گسترش بیماری داشتند. درصد بازداری از رشد قارچ‌های عامل بیماری بر اثر این ترکیبات با گذشت زمان، افزایش و یک روند صعودی نسبت به زمان داشت که ممکن است به‌دلیل تجمع بیشتر ترکیبات فرار طی گذشت زمان در محیط بسته داخل تشتک باشد؛ چنین نتایجی با گزارش‌های دیگر محققان تطابق دارد (41). طبق مطالعات مختلف موجود، مشخص شده است گونه‌های تریکودرما با تولید متابولیت‌های فرار، رشد بیمارگر را مختل می‌کنند (42).

در پژوهش حاضر مشخص شد اضافه‌کردن جدایة‌ T. harzianum در شرایط گلخانه به خاک اطراف نهال، موجب افزایش شاخص‌های رشدی (ارتفاع، وزن تر و وزن خشک اندام‌ هوایی و ریشه) و نیز کاهش شدت بیماری و علائم زردی و پژمردگی در نهال‌های به‌لیمو آلوده به قارچ F. oxysporum و F. redolens می‌شود؛ اما تأثیر قارچ‌کش متیل تیوفانات به‌دلیل شیمیایی‌بودن به‌مراتب بیشتر از جدایة Trichoderma بود. این موفقیت جدایة Trichoderma می‌تواند حاصل استقرار سریع این جدایه روی ریشه و خاک اطراف آن باشد که اجازة استقرار را به قارچ‌های بیمارگر نداده است و درنتیجه، موجب کاهش بیماری شده‌اند. آزمون بیماری‌زایی در این تحقیق نشان داد قارچ بیوکنترل T. harzianum توانایی بازدارندگی از رشد هر دو بیمارگر را دارد؛ اما قارچ F. oxysporum در ایجاد بیماری نسبت به قارچ F. redolens از توسعه و شدت کمتری برخوردار است. نتایج نشان دادند داده‌ها اختلاف معنی‌داری در ارتفاع ساقه و طول ریشه، وزن تر و خشک ساقه و همچنین وزن تر و خشک ریشه در نهال‌های به‌لیمو نسبت به شاهد آلوده داشتند. با توجه به تحقیقات انجام‌شده، استفاده از عوامل مهار زیستی به‌ویژه گونه‌های Trichoderma در کنترل بیولوژیک بیماری پژمردگی فوزاریومی بسیار مؤثر است. در پژوهشی استفاده از دو جدایة
T. harzianum T22 و T. harzianum P1 باعث افزایش معناداری در وزن تر و خشک ریشه و اندام هوایی، طول گیاه، تعداد برگ و میوه گوجه فرنگی شدند (43). تأثیر گونه‌های جنس Trichoderma بر قارچ عامل پژمردگی فوزاریومی گوجه فرنگی توسط نیک‌نژاد و همکاران (44) بررسی شد و نتیجه گرفته‌اند که در شرایط گلخانه‌ای جدایة کرج T. harzianum به میزان
68 درصد، جدایة اهواز T. harzianum به میزان
63 درصد، جدایة شهریار T. viride به میزان 60 درصد و جدایة T. viride مؤسسه بررسی آفات و بیماری‌های گیاهی به میزان 57 درصد باعث کاهش میزان پژمردگی فوزاریومی گوجه فرنگی شده است (44).

آگاهی و شناخت کافی از عوامل تأثیرگذار در بهبود عملکرد عوامل زیستی تأثیر به‌سزایی دارد. بهترین روش در کنترل بیماری پژمردگی فوزاریومی به‌لیمو استفاده از سموم شیمیایی است؛ اما به دلایلی مانند افزایش مقاومت بیمارگر و حضور نژادهای جدید از بیمارگر، مقرون‌به‌صرفه نبودن روش شیمیایی و باقی‌ماندن سم در محیط زیست، استفاده از روش شیمیایی به تنهایی در کنترل بیماری مؤثر نیست. با استفاده از عوامل کنترل زیستی به‌منظور رفع کمبود و خطرات ناشی از سموم شیمیایی در طبیعت، برای مدیریت بیماری پژمردگی فوزاریومی به‌لیمو می‌توان اقدام کرد. نتایج نشان می‌دهند بیوکنترل قارچی T. harzianum پتانسیل رشد و جلوگیری از پیشرفت بیماری را در شرایط آزمایشگاهی و نیز در شرایط گلخانه افزایش می‌دهد. قارچ
T. harzianum از عوامل بیوکنترل، صفات محرک رشد گیاه و پتانسیل کنترل زیستی را در برابر قارچ‌های بیمارگر‌ F. oxysporum و F. redolens افزایش داد. چنین عامل محرکی علاوه بر بهبود رشد گیاه و افزایش فاکتورهای رشدی گیاه باعث کنترل بیمارگر نیز می‌شود؛ بنابراین، قارچ بیوکنترل Trichoderma می‌تواند به‌عنوان یک جزء در مدیریت کنترل زیستی بیماری پژمردگی فوزاریومی برای افزایش بهره‌وری محصول و برای تولید محصول ایمن و سازگار با محیط زیست استفاده شود.

[1] NaClO

[2] Topsin M