مطالعۀ تکوین اندام زایشی نر و ماده در گیاه بادرشبو ‏Dracocephalum moldavica L.‎‏ (تیرۀ نعنائیان) ‏

مقدمه.

تیرۀ نعنائیان (Lamiaceae) با 59 سرده و 537 گونه، یکی از بزرگ‌ترین تیره‌های گیاهان گل‌دار است و اعضای آن در محدودۀ فلات ایران رویش دارند (Rechinger, 1982). سردۀ Dracocephalum L. که لینه آن را در سال 1753 معرفی کرد، به زیرقبیلۀ Nepetinae، قبیلۀ Mentheae و زیرتیرۀ Nepetoideae تعلق دارد (Jamzad, 2012). حدود 40 گونۀ پذیرفته‌شده در سردۀ بادرشبو که با نام فارسی زرین‌گیاه نیز شناخته می‌شود، وجود دارند که منشأ بسیاری از آنها، کوهستان‌های آسیای مرکزی است؛ بیشترین تعداد گونه‌های این سرده در چین یافت می‌شوند (Botanica, 2009). این گیاهان اغلب چندساله، به‌ندرت یک‌ساله یا نیمه‌درختچه‌ای هستند (Dastmalchi et al., 2007). سردۀ بادرشبو در ایران به‌طور عمده در بخش‌های شمالی و مرکزی کشور پراکنده شده است و به ناحیۀ ایرانی-تورانی تعلق دارد (Jamzad, 2012). گونۀ بادرشبو که در اروپا، سیبری و آسیای مرکزی به‌طور طبیعی پراکنش دارد، در ایران به‌‌‌شکل کاشته‌شده در استان‌های غربی و شرقی، مازندران، یزد و تهران وجود دارد (Dastmalchi et al., 2007; Mozaffarian, 2013)؛ گونۀ گیاهی یادشده به‌شکل علفی، یک‌ساله، بسیار معطر با عطر لیموی مطبوع به ارتفاع 30 تا 60 متر است. برگ‌های پایینی دمبرگ‌دار با حاشیۀ سینوسی- کنگره‌ای و برگ‌های بالایی بدون دمبرگ با لبه‌های دندانه اره‌ای- سیخک‌دار هستند. گل‌ها بزرگ با تاج گل به طول 20 تا 25 میلی‌متر، اغلب به رنگ آبی- ارغوانی و بسیار به‌ندرت آبی کم‌رنگ یا سفید هستند (Dmitruk et al., 2018). از ویژگی‌‌های این گیاه دارویی ارزشمند که اهمیت زینتی نیز دارد، می‌توان به کاهش تب و سرماخوردگی، مسکن و آرام‌بخش‌، ضددردهای روماتیسمی، بادشکن و مقوی، رفع اسپاسم‌های معدی و کلیوی، قابض و التیام‌دهندۀ زخم و جراحت‌ها، سردرد، ضدتومور و آنتی‌اکسیدان، استفاده برای شستشوی دهان و در دندان‌دردها اشاره کرد. اسانس این گیاه در صنایع داروسازی، آرایشی و بهداشتی و عطرسازی کاربردهای فراوانی دارد (Dastmalchi et al., 2007; Mozaffarian, 2013). گیاهان تیرۀ نعنائیان (Lamiaceae) به دلیل داشتن اهمیت دارویی فراوان همواره مدنظر پژوهشگران قرار گرفته‌اند و پژوهشگران مختلف تکوین ساختار زایشی نر و ماده، تکوین دانۀ گرده و مراحل مختلف تشکیل جنین گیاهان این تیره را بررسی کرده‌اند (Daskalova, 2004; Tajadod et al., 2015; Jafari Marandi et al., 2017; Kameli et al., 2018). اگرچه پژوهشگران مختلف ساختار تشریحی اندام‌های رویشی، ساختار بافت ترشحی و کرک‌ها و همچنین ساختار تشریحی بافت شهدزای گیاه بادرشبو را مطالعه کرده‌اند (Liapunova, 1975; Dmitruk, 2018; 2019)، تاکنون اطلاعاتی در زمینۀ ساختار زایشی مادگی و اندام نر گیاه و تکوین آنها ارائه نشده است. با‌توجه‌به اهمیت مطالعه‌های تکوینی در علوم زیستی، کشاورزی، زراعی و باغبانی، مطالعۀ تکوین این گیاه دارویی بسیار ارزشمند می‌تواند به توسعۀ دانش زیست‌شناسی و افزایش بهره‌‌وری درست از آن کمک کند.

مواد و روش‌ها

بذر گیاه بادرشبو از شرکت پاکان‌بذر اصفهان (ایران) تهیه و تا رسیدن به مرحلۀ گل‌دهی در گلدان‌های پلاستیکی پرورش داده شد. غنچه و گل در سن‌های مختلف و در زمان مساعد گل‌دهی جمع‌آوری شدند و از محلول FAA70 به‌مدت 16 ساعت برای تثبیت غنچه‌ها و گل‌ها استفاده شد؛ محلول یادشده از فرمالین، استیک‌اسید گلاسیال و اتانول 70 درصد با نسبت حجمی 5:5:90 تهیه شد. پس از مرحلۀ تثبیت، نمونه‌ها در اتانول 70 درصد نگهداری شدند. آب‌گیری نمونه‌ها با قرار‌دادن آنها در رقت‌های مختلف اتانول انجام شد. نمونه‌ها در پارافین قالب‌گیری و سپس از میکروتوم DC (Cut 4040, Co., Mainz, Germany) به‌منظور تهیۀ برش‌هایی به ضخامت 8 میکرومتر برای مطالعۀ مراحل تکوینی استفاده شد. رنگ‌آمیزی با هماتوکسیلین- ائوزین و بر اساس روش Yeung (1984) انجام شد. بیش از 10 نمونه برای هر مرحلۀ تکاملی مطالعه شد. میکروسکوپ نوری نیکون (Nikon, Tokyo, Japan) برای بررسی و تهیۀ عکس از نمونه‌ها استفاده شد.

نتایج.

تشکیل گل: گذر از مریستم رویشی به مریستم زایشی به‌طور تدریجی اتفاق می‌افتد که مرحلۀ پیش‌گل‌دهی نامیده می‌شود و با کاهش شدید فعالیت حلقۀ بنیادی، تمایز مریستم منتظر و تکثیر سلولی فراوان همراه است؛ در این مرحله، مریستم حجیم‌تر و گنبدی‌شکل می‌شود و سلول‌ها رنگ‌پذیری بیشتری نشان می‌دهند (شکل D1). فعالیت محدود حلقۀ بنیادی سبب تشکیل غلاف‌های پوشانندۀ گل می‌شود. پیش‌مریستم هاگ‌زا و نهنج‌زا درنهایت مسئول ایجاد اندام‌های گل هستند (شکل‌های A1 و B1). شکل A-C1، ایجاد مریستم‌های هاگ‌زا، شکل‌گیری پریموردیوم‌های کاسبرگی، گلبرگی، پرچمی و مادگی در مراحل مختلف تا تشکیل پرچم‌ها و بساک‌ها را نشان می‌دهد. افزایش رنگ‌پذیری در نواحی جانبی رأس گنبدی‌شکل و زیر پریموردیوم کاسبرگ، شکل‌گیری پریموردیوم گلبرگی را نشان می‌دهد. دو جفت پرچم در این گیاه مشاهده می‌شود که جفت بالایی کمی بلندتر از جفت پایینی است (شکل C1). پریموردیوم مادگی در مراحل آخر تکوین مریستم زایشی ایجاد می‌شود. تکوین تدریجی اندام‌های گلی در شکل A-F1 مشاهده می‌شود. در برش طولی غنچه (شکل‌های E1 وF1)، تخمدان، خامه و پریموردیوم تخمک مشاهده می‌شود. کاسبرگ‌ها و گلبرگ‌ها اطراف اندام‌های گل را محصور کرده‌اند. پرچم‌ها حجیم شده‌اند و بساک‌ها مراحل آخر تکوین خود را سپری می‌کنند، اما آزادسازی گرده‌های بالغ هنوز رخ نداده است. درون تخمدان‌ها، تخمک‌های درحال بلوغ به چشم می‌خورند و خامه به‌شکل ستونی در بخش میانی جوانه دیده می‌شود (شکل A1)، تخمدان برجسته می‌شود و تخمک‌ها درون آن ایجاد می‌شوند. در شکل F1، دانه‌های گردۀ بالغ درحال شکل‌گیری هستند.

تکوین پرچم و دانۀ گرده: بساک‌ها به‌شکل چهارکیسه‌گرده‌ای (تتراسپورانژی) مجزا از هم و بساک‌های نابالغ تخم‌مرغی‌شکل هستند (شکل C1). تقسیم‌های مماسی آرکئوسپورها، بافت هاگ‌زا (به‌سمت درون) و لایه‌های جداری (به‌سمت بیرون) را ایجاد می‌کنند. شکل A2، مراحل اولیۀ تمایز بساک و ایجاد لایه‌های جداری و بافت هاگ‌زا را نشان می‌دهد. لایۀ جداری با تقسیم‌های خود سبب تشکیل دیوارۀ بساک می‌شود. همان‌طور که در شکل‌های B2 و D2 مشاهده می‌شود، چهار لایۀ دیوارۀ بساک جوان به‌ترتیب از بیرون به درون عبارتند از: لایه‌های اپیدرم، لایۀ آندوتسیوم (مکانیکی)، میانی (موقت) و مغذی (تاپی)؛ هریک از لایه‌های یادشده از یک ردیف سلول تشکیل شده‌اند که طی فرایند بلوغ کیسۀ گرده و شکوفایی، سرنوشت متفاوتی خواهد داشت. اپیدرم که در ابتدا شامل یک ردیف سلول‌های منظم مستطیلی است، طی فرایند بلوغ به‌تدریج چروکیده می‌شود و شکل نامنظمی پیدا می‌کند (شکل‌های D2 و F2). لایۀ مکانیکی زیر لایۀ اپیدرم قرار دارد و شامل یک ردیف سلول‌های مستطیلی‌شکل است. دیوارۀ سلول‌های این لایه طی بلوغ بساک و تکوین دانۀ گرده ضخیم‌تر می‌شوند (شکل A3). لایۀ میانی با سلول‌های بسیار باریک و کشیده زیر لایۀ مکانیکی قرار گرفته است و همانند لایۀ تاپی در فرایند تغذیه نقش دارد و در بساک بالغ ناپدید می‌شود (شکل D2 و شکل A3). لایۀ تاپی که بافت‌ هاگ‌زای بساک را احاطه می‌کند، سلول‌های حجیم با سیتوپلاسم غلیظ و هسته‌های بزرگ با رنگ‌پذیری زیاد دارد که به شکل‌های مختلفی ازجمله مستطیلی، دوکی‌شکل، تک‌هسته‌ای یا بیشتر دیده می‌شوند (شکل D-F2). در برخی سلول‌ها، انجام تقسیم میتوز بدون سیتوکینز سبب ایجاد سلول‌های دوهسته‌ای یا بیشتر می‌شود (شکل D-F2)؛ این سلول‌ها ابتدا به‌شکل ترشحی و در مراحل انتهایی به‌طور پلاسمودیومی وجود دارند. هم‌زمان با تقسیم میوز در سلول‌های مادر گرده، این سلول‌ها به‌طور شعاعی گسترش می‌یابند. سلول‌های هاگ‌زا که در نتیجۀ تقسیم‌های آرکئوسپور به‌سمت درون تشکیل می‌شوند، با تقسیم‌های میتوزی خود به سلول‌های مادر گرده (PMC) یا میکروسپورسیت تمایز می‌یابند (شکل B2)؛ این سلول‌ها که در چند ردیف وجود دارند، با اندازۀ بزرگ و حجیم، سیتوپلاسم متراکم و هستۀ درشت و رنگ‌پذیری زیاد تشخیص داده می‌شوند و درون کیسه‌های گرده با دیواره‌ها احاطه می‌شوند. با شروع میوز، کالوز به‌شکل لایه‌ای ضخیم و درخور توجه در اطراف میکروسپوروسیت‌ها و تترادها دیده می‌شود (شکل E-G2).

سلول‌های مادر گرده طی فرایند میکروسپورزایی پس از تقسیم میوز I و II (شکل E-G2)، ابتدا سبب تشکیل دیاد (شکل D2) و سپس تتراد می‌شوند و درنهایت، میکروسپورهای آزاد را تشکیل می‌دهند. در شکل G2، دانۀ گردۀ درحال تغذیه از سلول‌های تاپی به‌وضوح دیده می‌شود. سلول‌های لایۀ تاپی تا ایجاد تتراد و کمی پس ‌از آن نیز مشاهده می‌شوند، اما پس از ظاهر‌شدن دانۀ گردۀ بالغ به‌طور کامل مصرف می‌شوند یا اثر ناچیزی از آنها باقی می‌ماند (شکل B-G3). هنگام شکوفایی کیسۀ گرده در بساک بالغ، تنها لایه‌های اپیدرم و مکانیکی باقی می‌مانند (شکل C-F3). این میکروسپورهای جوان رهاشده، سیتوپلاسم متراکم و شکل منظم دارند و به‌تدریج با مصرف سلول‌های تاپی به‌عنوان منبع مغذی، واکوئل مرکزی گسترش می‌یابد و هستۀ دانۀ گرده به کنار سلول رانده می‌شود.

شکل 1- مراحل تکوین مریستم زایشی بادرشبو (رنگ آمیزی با هماتوکسیلین- ائوزین). A) برش طولی مریستم زایشی در مراحل ابتدایی (10×)، طناب پروکامبیومی مشهود است، B) برجستگی‌های پریموردیوم کاسبرگی، گلبرگی، پرچمی و مادگی (40×)، C) تشکیل گلبرگ و کاسبرگ، پرچم‌ها و بساک‌های نابالغ (10×)، D) برش طولی غنچۀ جوان، میله‌های پرچم، بساک نابالغ، پیوستگی گلبرگ‌ها و کاسبرگ‌ها (40‌×‌)، E وF) برش طولی غنچه (10×)، بساک‌ها و گرده‌ها و مراحل ابتدایی شکل‌گیری مادگی. se: کاسبرگ، pe: گلبرگ، st: پرچم، p.pi: پریموردیوم مادگی، p.st: پریموردیوم پرچمی، p.se: پریموردیوم کاسبرگی، p.pe: پریموردیوم گلبرگی، sp.m: مریستم هاگ‌زا، R,M: مریستم نهنجی، an: بساک، fi: میلۀ پرچم، p.o.: پریموردیوم تخمک، re: نهنج، sty: خامه، ov: تخمدان، o: تخمک، ar: آرکئوسپور، gt: کرک غده‌ای، nt: کرک غیرغده‌ای

Figure 1- Developmental stages of reproductive meristem in Moldavian dragonhead stained with hematoxylin-eosin. (A) Longitudinal incision of reproductive meristem at initial formation stage (×10). Procambial strands are observable. (B) sepal, petal, stamen and pistil projections (×40). (C) forming of sepal, petal, stamen, and immature anthers (×10). (D) Longitudinal incision of young bud. filaments, immature anthers, and fusion of petals and sepals  (×40). (E, F) Longitudinal incision of bud (×10). Anthers and pollens in associating with initiation steps of pistil forming. Se: sepal; pe: petal; st: stamen; p.pi: primordium of pistil; p.st: primordium of stamen; p.se; primordium of sepal; p.pe: primordium of petal; sp.m: sporophyte meristem; R.M: receptacle meristem; an: Anther; fi: filament; p.o: primordium of ovule; re: receptacle; sty: style; ov: ovary; o: ovule; ar: archespores;  gt: glandular trichome;  nt: nonglandular tichome

شکل 2- مراحل تکوین بساک گیاه بادرشبو (رنگ‌آمیزی با هماتوکسیلین- ائوزین). A) برش طولی غنچۀ جوان، شکل‌گیری مراحل اولیۀ بساک، تشکیل لایه‌های جداری و هاگ‌زا (10×‌)، B) برش طولی بساک جوان، دیواره‌های بساک، سلول‌های مادر گرده (40×)، C) برش عرضی غنچۀ جوان، بساک‌های چهارکیسه‌گرده‌ای (40×)، D تا F) برش عرضی غنچۀ جوان (40×)، تقسیم‌های سلول مادر گرده و شکل‌گیری دیاد، تتراد تتراهدرال، G) دانۀ گرده درحال بلوغ (100×). se: کاسبرگ، pe: گلبرگ، p.pi: پریموردیوم مادگی، an: بساک، fi: میلۀ پرچم، ep: اپیدرم، en: اندوتسویم، ml: لایۀ میانی، ta: لایۀ تاپی، PMC: سلول مادر گرده، ps: کیسۀ گرده، co: رابط

Figure 2- Developmental stages of anther in Moldavian dragonhead stained with hematoxylin-eosin. (A) Longitudinal incision of young bud, initial formation stage of anther, parietal layers (×10) (B) Longitudinal incision of young anther with anther walls, pollen mother cells (×40). (C) cross section of young bud with obvious four pollen (×40). (D-F) cross section of young bud (×40), pollen mother cell divisions and formation of dyad, tetrahydral tetrad (×40). (G) Pollen grain maturation (×100). Se: sepal; pe: petal; st: stamen; p.pi: primordium of pistil; an: Anther; fi: filament; ep: epiderm; en: endothecium; ml: middle layer; ta: tapetum; PMC: pollen mother cells; ps: pollen sac; co: connective

پس از آن، میکروسپور با انجام‌شدن یک تقسیم میتوز نامساوی دارای دو هستۀ رویشی (بزرگ) و زایشی (کوچک) می‌شود که از نظر عملکردی با یکدیگر تفاوت دارند (شکل‌های C3، D3). هستۀ رویشی در رشد لولۀ گرده و هستۀ زایشی در ایجاد دو آنتروزوئید دانۀ گردۀ بالغ نقش دارند. میکروسپورها به‌شکل کروی تا بیضی هستند (شکل C-G3). بلوغ دانه‌های گرده با احاطۀ میکروسپورها توسط دیوارۀ اگزین و ایجاد تزئینات روی سطح آن کامل می‌شود و از سمت داخلی نیز دیوارۀ پکتوسلولزی انتین در مجاورت سیتوپلاسم تشکیل می‌شود (شکل‌های C3، F3 و G3). دانه‌های گرده در نماهای مختلف قطبی و استوایی به اشکال کروی و بیضوی مشاهده می‌شوند. دانۀ گردۀ بالغ شش‌شیاره است و در محل شیارها، دیواره‌های انتین ضخیم‌تر هستند (G3).

تکوین تخمک و کیسۀ رویانی: تخمدان در گیاه بادرشبو از نوع فوقانی است و برچه‌ها دو عدد و چهارخانه‌ای هستند. در این گیاه همانند دیگر اعضای تیرۀ نعنائیان (Lamiaceae)، پیدایش پرچم‌ها سریع‌تر از مادگی رخ می‌دهد (شکل‌های A4 و B4). پس از پدیدارشدن آثار پرچم‌ها و خارج‌شدن آنها از تودۀ مریستمی هاگ‌زا، بخش باقیماندۀ تودۀ مریستمی، پریموردیوم مادگی و طرح اولیۀ آن را تشکیل می‌دهد (شکل A4). پریموردیوم برچه‌ای تا پیش از پایان‌یافتن تکوین پرچم ‌به‌شکل توده‌ای کوچک دیده می‌شود (شکل A4)؛ این پریموردیوم با رشد و طویل‌شدن سریع، سه بخش تخمدان، خامه و کلاله را ایجاد می‌کند (شکل D1). با رشد تخمدان، نخستین آثار تشکیل تخمک‌ها پدیدار می‌شوند. همان‌طور که در شکل B4 دیده می‌شود، ایجاد پریموردیوم تخمک تقریباً با رشد گرده‌های نابالغ و تمایز آنها منطبق است. پریموردیوم تخمک‌ها در جدار تخمدان و به‌شکل برآمدگی‌های کوچک کروی- بیضوی ایجاد می‌شود. تخمک‌ها در این گونه از نوع واژگون هستند (شکل C4). در تخمک‌های نابالغ، سلول‌های پارانشیمی بافتی مغذی به نام بافت خورش را ایجاد می‌کنند که با رشد سریع یکی از آنها در مراحل بعدی تکوین، سلول مادر مگاسپور تمایز می‌یابد (شکل C-E4)؛ پس از انجام تقسیم میوز در این سلول و حذف سلول‌های غیرعملکردی، یکی از سلول‌ها (سلول مادر کیسه رویانی) باقی می‌ماند و با رشد سریع سبب تشکیل کیسۀ رویانی می‌شود (شکل‌های D4 و E4). این سلول به اندازۀ چندین برابر سلول‌های بافت خورش، حجیم شده است و هستۀ آن به‌خوبی تشخیص داده می‌شود. در ادامۀ فرایند یادشده، فضایی روشن بین سلول مادر کیسۀ رویانی و سایر بخش‌ها ایجاد می‌شود که همچنان آثار بخش‌های تحلیل‌رفته از سلول‌های خورش را می‌توان در آن دید (شکل A-C5). سلول مادر کیسۀ رویانی با تقسیم‌های میتوز متوالی (شکل‌های B5 و C5)، کیسۀ رویانی هشت‌هسته‌ای را ایجاد می‌کند که در شکل D-H5 مشاهده می‌شود؛ ابتدا هشت هسته به‌طور متراکم و نامنظم قرار دارند و با بقایای سلول‌های درحال تخریب بافت خورش احاطه می‌شوند (شکل‌های D5 و E5)؛ هشت هستۀ ایجادشده به‌مرور در دو دستۀ سه‌تایی و یک دستۀ دوتایی قرار می‌گیرند و پس از جداربندی در فواصل معینی از هم واقع می‌شوند (شکل F-H5)؛ به این شکل در کیسۀ رویانی بالغ، سه‌ هسته‌ای که در قطب مقابل میکروپیل یا سُفت (mi) قرار می‌گیرند، سریع‌تر از سایر سلول‌های کیسۀ رویانی، ساختمان سلولی می‌یابند و سلول‌های پابُنی یا آنتی‌پودال (ant) را می‌سازند (شکل‌های F5 و H5). مجموعۀ سه‌تایی که در مجاورت سُفت قرار دارد، از دو سلول همسان یا سینرژید (syn) و یک سلول بزرگ‌تر تخم‌زا (Oo) تشکیل شده است؛ یک سلول دوهسته‌ای نیز در فضای میانی این دو سلول قرار گرفته است (شکل‌های F5 و H5). پس از رشد لولۀ گرده درون خامه و انجام لقاح، یکی از سلول‌های نر با سلول تخم‌زا آمیخته می‌شود و سلول تخم‌ را ایجاد می‌کند و سلول دیگر با سلول ثانویه ترکیب می‌شود و آندوسپرم تریپلوئید را تشکیل می‌دهد که در مراحل رشد رویان به‌عنوان مادۀ مغذی آن عمل می‌کند (شکل H4). بافت هدایت‌کنندۀ لولۀ گرده در قطب سُفت مشاهده می‌شود. همان‌طور که در شکل E4 مشاهده می‌شود، محفظۀ یکی از خانه‌های تخمدان بدون تخمک یا تخمک تحلیل‌رفته طی مراحل تکوین است.

شکل 3- مراحل تکوین و تمایز دانۀ گردۀ گیاه بادرشبو (رنگ‌آمیزی با هماتوکسیلین- ائوزین). A) برش عرضی بساک بالغ (40 ×)، لایۀ کالوز اطراف دانۀ گرده هنوز مشاهده می‌شود، B) مراحل انتهایی تکوین دانه‌های گرده (40×)، فروپاشی لایۀ اندوتسیوم در برخی نقاط مشهود است، C و D) دانه‌های گرده بالغ، هسته‌های رویشی، زایشی مشاهده می‌شوند. تزئینات دیوارۀ اگزین به‌خوبی دیده می شوند. لایۀ کالوز در برخی دانه‌ها هنوز مشاهده می‌شود، E و F) دانه‌های گردۀ رسیده و شکوفایی بساک (40×)، G) دانه‌های گرده بالغ در نماهای قطبی و استوایی. ep: اپیدرم، en: اندوتسیوم، ml: لایۀ میانی، ta: لایۀ تاپی، an: بساک، mp: گردۀ بالغ، ex: اگزین، in: اینتین، col: شیار، vn: هستۀ رویشی، gn: هستۀ زایشی، ca: کالوز، ev: نمای استوایی، pv: نمای قطبی

Fig.3. Developmental stages of pollen grains in Moldavian dragonhead stained with hematoxylin-eosin. (A) cross section of mature anther (×40). Calluse layer is still visible around pollen grain (B) final stages of pollen grain development (×40). Decomposition of endothecium is obvious in some points. (C, D) mature pollen grains, vegetative and regenerative nuclei, exine ornamentation are observed. calluse layer is still seen in some grains. (E, F) mature pollen grains and dehiscence of anther (×40). (G) polar and equatorial view of mature pollen grains. ep: epiderm; en: endothecium; ml: middle layer; ta: tapetum; an: anther; mp: mature pollen; ex: exine; in: intine; col: colpus; vn: vegetative nucleus; gn: generative nucleus; ca: calluse; ev: equatorial view; pv: polar view

شکل 4- مراحل تکوین تخمک تا مراحل ابتدایی تشکیل کیسۀ رویانی در گیاه بادرشبو (رنگ‌آمیزی با هماتوکسیلین- ائوزین). A) برش عرضی گل جوان گیاه بادرشبو (100×)، تقارن تشکیل بساک جوان و تمایز سلول‌های مادر گرده با ایجاد پریموردیوم تخمک و تشکیل تخمدان، B) برش طولی غنچه (10×)، بساک‌های جوان به همراه مراحل ابتدایی شکل‌گیری مگاسپوروفیت، تکوین مادگی و تمایز تخمدان و خامه، C) تخمک جوان که به حالت واژگون قرار دارد (100×)، ایجاد سُفت، شکل‌گیری آرکئوسپور و مگاسپوروفیت، D و E) برش طولی تخمک جوان (100× و 100×). Se: کاسبرگ، pe: گلبرگ، an: بساک، fi: میلۀ پرچم، pi: مادگی، ip: گردۀ نابالغ، ar: سلول آرکئوسپور، tu: پوستۀ تخمک، pl: جُفت، mi: سُفت، nu: خورش، fu: بند، MMC: سلول مادر مگاسپور

Figure 4- Developmental stages of ovule to initial stages of embryo sac formation in Moldavian dragonhead stained with hematoxylin-eosin. (A) cross section of young flower (×40). Coincidence of young anther and PMC differentiation formation with formation of ovule primordium and ovary. (B) Longitudinal incision of bud (×10). Young anthers and initial stages of megasporophyte formation. development of ovary, style, and pistil. (C) young anatropous ovule (×40). Formation of microspore, archespore, and megasporophyte. (D, E) Longitudinal incision of young ovule (×40, ×100). Se: sepal; pe: petal; an: Anther; fi: filament; pi: pistil; ip: immature pollen; ar: archespore cell; tu: tunicate; pl: placenta; mi: micropyle; nu: nucellus; fu: funicule; MMC: megaspore mother cells

شکل 5- مراحل تکوین کیسۀ رویانی در گیاه بادرشبو (رنگ‌آمیزی با هماتوکسیلین- ائوزین). A) برش طولی تخمک (40×)، B) برش طولی تخمک (100×)، تشکیل کیسۀ رویانی، شکل‌گیری بافت هیپوستاسیز، C) کشیده‌شدن کیسۀ رویانی درون بافت خورش در مرحلۀ دو و چهار هسته ای (40×)، بافت هیپوستاسیر مشاهده می‌شود، D) برش طولی تخمک به همراه کیسۀ رویانی (40×)، تشکیل کیسۀ رویانی هشت‌هسته‌ای، تشکیل بافت هدایت کنندۀ گرده (ستاره)، E) برش طولی مادگی (40×)، ستارۀ آبی حفرۀ خالی از تخمک را نشان می‌دهد، F) برش طولی تخمک (100×)، G) کیسۀ رویانی (100×)، H) ورود آنتروزوئیدها و تشکیل سلول تخم (100×). an: بساک، fi: میلۀ پرچم، pi: مادگی، ip: گردۀ نابالغ، ar: سلول آرکئوسپور، tu: پوستۀ تخمک، pl: جُفت، mi: سُفت، nu: خورش، fu: بند، MMC: سلول مادر مگاسپور، Oo: سلول تخم‌زا، ch: شالاز یا بُن، hyp: هیپوستاسیز، syn: سلول‌های سینرژید، Ant: سلول های پایُنی یا آنتی‌پودال، sp: آنتروزوئید یا اسپرم، np: سلول دوهسته‌ای، en: آندوتلیوم

Figure 5- Developmental stages of embryo sac formation in Moldavian dragonhead stained with hematoxylin-eosin. (A) Longitudinal incision of ovule (×40). (B) Longitudinal incision of ovule (×100). Formation of embryo sac, formation of hypostasis tissue. (C) Stretching of the embryo sac inside nucleus tissue during two and four nuclei (×40). hypostasis tissue is obvious. (D) Longitudinal incision of ovule with embryo sac (×40). Formation of eight cells embryo sac. Forming of pollen-directing (asterisk). (E): Longitudinal incision of pistil (×40). Blue star indicates empty chamber lack of ovary. (F) Longitudinal incision of ovule (×100), (G) embryo sac (×100). (H) insertion of sperms and zygote formation (×100). An: anther; fi: filament; pi: pistil; ip: immature pollen; ar: archespore cell; tu: tunicate; pl: placenta; mi: micropyle; nu: nucellus; fu: funicule; MMC: megaspore mother cells; Oo: oosphore; ch: chalaza; hyp: hypostasis; syn: synergid cells; ant: antipods; sp: sperms; np: nucleus polar; en: endothelium 

بحث

تشکیل گل: رشد پرچم‌ها و گلبرگ‌ها درگیاه بادرشبو با فاصلۀ کمی از یکدیگر اتفاق می‌افتد که در گونه‌های مختلف این تیره گزارش شده است؛ مانند چند گونه از سردۀ مریم‌گلی (Kameli et al., 218)، گیاه ریحان (Jafari Marandi et al., 2017) و مرزنجوش وحشی (Tahmasebi et al., 2016)، دانه‌های گردۀ گیاه بادرشبو نیز پیش از شکوفایی گل به بلوغ می‌رسند؛ این در حالیست که در تخمک هنوز کیسۀ رویانی تشکیل نشده است.

تکوین پرچم و دانۀ گرده: تکوین پرچم‌ها مانند سایر اعضای تیره از الگوی رایج دولپه‌ای‌ها تبعیت می‌کند (Davis, 1962; Kai-Yu et al., 1997) که در آن، لایۀ میانی دیوارۀ بساک به‌طور موقت و در یک ردیف وجود دارد و معمولاً پیش از ناپدیدشدن لایۀ تاپی متلاشی می‌شود. در گیاه بادرشبو، لایۀ‌ میانی پس از شکل‌گیری تتراد و تا ایجاد گردۀ نابالغ وجود دارد، اما پیش از تجزیۀ لایۀ تاپی از بین می‌رود. متلاشی‌شدن لایۀ میانی در مراحل اولیۀ تکوین دانه‌های گرده، علاوه‌بر گیاهان این تیره در گیاهان تیره‌های دیگر مانند تیرۀ باقلائیان (Fabaceae) نیز گزارش شده است (Ebenus stellata: Tanaomi et al., 2018). در مطالعه‌ای که در زمینۀ گیاه Arabidopsis thaliana انجام شده است، لایۀ میانی تا مراحل انتهایی دانۀ گردۀ بالغ باقی می‌ماند و مشاهده می‌شود (Basiri et al., 2021).

لایۀ اپیدرمی که در بیرونی‌ترین بخش بساک قرار دارد، در تنظیم آب، دفاع و جذب گرده‌افشان‌ها نقش دارد (Sheikhbahaei et al., 2014). برخلاف گیاهانی مانند انبه (Mohsenzadeh et al., 2012; Jonoubi et al., 2015) که لایۀ اپیدرم در مرحلۀ بلوغ متلاشی می‌شود، در گیاه بادرشبو، این لایه به همراه لایۀ مکانیکی تا انتهای شکوفایی بساک‌ها و رسیدن دانه‌های گرده بالغ باقی می‌ماند؛ باوجوداین، لایۀ یادشده در مراحل انتهایی و شکوفایی بساک به‌شکل بسیار چروکیده و نامنظم روی لایۀ مکانیکی قرار دارد. باقی‌ماندن دو لایۀ اپیدرمی و مکانیکی تا انتهای شکوفایی بساک در دیگر گیاهان این تیره مانند ریحان، آویشن، مریم‌گلی و مرزنجوش نیز گزارش شده است (Tajadod et al., 2015; Tahmasebi et al., 2016; Jafari Marandi et al., 2017; Kameli et al., 2018). رفتار لایۀ تاپی در گیاهان مختلف متفاوت است؛ درحالی‌که این لایه در اغلب گیاهان تیرۀ نعنائیان و تیره‌های دیگر مانند باقلائیان (Alhaji pseudoalhai: Hashemi & Rezanejad, 2013) تا پس از تتراد و پیش از رهاسازی آنها مشاهده می‌شود، در برخی تیره‌ها (شبدر ترشکیان، Oxalidaceae) طی مراحل تتراد و در برخی مانند تیرۀ Cabombaceae حتی پیش‌تر از آن و در مراحل ابتدایی تقسیم‌های سلول مادر گرده از بین می‌رود (Moco & Mariath, 2004). در گیاه Ebenus stellata نیز لایۀ تاپی تا زمان آزادشدن گرده‌ها از کالوز وجود دارد و در مراحل انتهایی به‌تدریج محو می‌شود (Tanaomi et al., 2018). بر اساس نتایج مطالعۀ حاضر، لایۀ تاپی در گیاه بادرشبو همانند سایر اعضای این تیره از نوع ترشحی و آمیبی است. در این گیاه، سلول‌های تاپی دوهسته‌ای یا بیشتر، علاوه‌بر سلول‌های تک‌هسته‌ای دیده می‌شوند. سلول‌های دوهسته‌ای لایۀ تاپی در گونه‌های گیاهی مختلف این تیره مانند ریحان (Jafari Marandi et al., 2017) و Nepeta cataria (Daskalova, 2004) و برخی گونه‌های گیاهی تیرۀ کلمیان (Brassicaceae) مانند Brassica jordanoffri (Yankova-Tsvetkova et al., 2016) و Arabidopsis thaliana (Basiri et al., 2021) نیز گزارش شده است. افزایش حجم لایۀ تاپی با تمایز سلول‌های اسپوروژن همراه است که با تقسیم‌های خود، سلول‌های مادر گرده را ایجاد می‌کنند و شروع میوز در آنها سبب جدایی سلول‌های این لایه از یکدیگر و از لایۀ میانی می‌شود. پس از تشکیل دانه‌های گرده نابالغ، تجزیۀ این سلول‌ها آغاز می‌شود و در مراحل نمو و بلوغ دانۀ گرده به‌شکل سلول‌های آمیبی مصرف می‌شوند؛ باوجوداین در برخی موارد، آثار این سلول‌ها تا پیش از شکوفایی بساک در کنار دانه‌های گرده مشاهده می‌شود. حضور لایۀ تاپی تا آخرین مراحل تتراد، ویژگی کمتر رایجی است که در تعداد کمی از نهاندانگان مانند تیره باقلائیان (Chehregani Rad et al., 2011; Tanaomi et al., 2016) و برخی اعضای تیرۀ گل میمونیان (Scrophulariaceae) (Majd et al., 2014) گزارش شده است. لایۀ تاپی در دو نوع ترشحی و آمیبی در دیگر گیاهان تیرۀ نعنائیان مانند مرزنجوش (Tahmasebi et al., 2016) و ریحان (Jafari Marandi et al., 2017) و گیاهان برخی تیره‌های دیگر مانند Arabidopsis thaliana از تیرۀ کلمیان (Basiri et al., 2021) نیز مشاهده شده است که با نتایج مطالعۀ حاضر مطابقت دارد؛ این در حالیست که لایۀ تاپی در برخی گونه‌های گیاهی تیرۀ باقلائیان مانند Onobrychis sp. (Chehregani Rad et al., 2011; Tanaomi et al., 2016) و گیاه تشنه‌داری (Scrophularia striata) (Majd et al., 2014) از تیرۀ گل میمونیان، ترشحی است. تغذیۀ میکروسپورها و ترشح آنزیم کالاز به‌منظور حل‌کردن دیوارۀ کالوزی تتراد ازجمله نقش‌های لایۀ تاپی به شمار می‌آیند؛ همچنین این لایه به شکل‌گیری پیش‌ساخت‌های اگزین کمک می‌کند (Batygina, 2002). لایۀ مکانیکی که نقش مهمی تا آخرین مراحل شکوفایی بساک دارد، هم‌گام با تشکیل و بلوغ دانه‌های گرده، فرایند چوبی‌شدن را آغاز می‌کند. تتراد در گونۀ مطالعه‌شده از نوع تتراهیدرال است و نوع  تتراهگزال در برش‌های مطالعه‌شده مشاهده نشد. نوع تتراهیدرال در بیشتر گونه‌های گیاهی این تیره رایج است و با گزارش‌ Jafari Marandi et al. (2017) مطابقت دارد و در تیره‌های دیگر مانند تیرۀ کلمیان (Yankova-Tsvetkova et al., 2016; Basiri et al., 2021) و تیرۀ آلاله‌ایان (Ranunculaceae) (Yang et al., 2020) نیز گزارش شده است. در گونۀ Fritillaria stribrnyl از تیرۀ سوسنیان (Liliaceae)، تتراد نوع ایزوبایلترال مشاهده شده است (Kartal, 2015). واکوئله‌شدن دانۀ گرده، رانده‌شدن هسته به یک سمت و تقسیم میوز در آن سبب تشکیل یک هستۀ رویشی بزرگ و یک هستۀ زایشی کوچک می‌شود. هستۀ زایشی طی مرحله‌ای به دو هستۀ آنتروزوئید تقسیم می‌شود و لولۀ گرده آن را به‌سمت تخمک حمل می‌کند (Batygina, 2002). دانۀ گردۀ گیاه بادرشبو همانند سایر اعضای زیرتیرۀ نپتوئیده، شش‌شیاره است. بر اساس Erdman (1945)، اعضای این زیرتیره دانۀ گرده شش‌شیاره و به‌ندرت هشت تا دوازده شیاره دارند. اگزین در این گونه همانند مریم‌گلی و مرزنجوش (Ozler et al., 2011; Tahmasebi et al., 2016) از نوع مشبک است و شیارها تقارن شعاعی دارند.

تکوین تخمک و کیسۀ رویانی: تخمدان گیاه بادرشبو از نوع فوقانی، دوبرچه‌ای، چهارحجره‌ای و تخمک با تمکن محوری است که از ویژگی‌های رایج گیاهان این تیره به شمار می‌آید و در مطالعه‌های پیشین نیز تأیید شده است (Fortunato .& Ruta, 1996; Toma et al., 2003; Tahmasebi et al., 2016; Jafari Marandi et al., 2017; Kameli et al., 2018). در گیاه بادرشبو، تخمک از نوع واژگون، تک‌پوششی یا دیواره‌نازک است که در بسیاری از اعضای این تیره رایج است (Kamellina & Dzevaltovsky, 1996)، اما تخمک‌های واژگون دوپوششی تیز در گونه‌هایی از این تیره مانند مرزنجوش و مریم‌گلی گزارش شده‌اند (Fortunato & Ruta, 1996; Toma et al., 2003; Tahmasebi et al., 2016). علاوه‌بر تیرۀ نعنائیان، تخمک‌های واژگون تک‌پوششی در تیره‌های دیگر ازجمله تیرۀ آلاله‌ایان .(Rannunculus arvensis L.: Mohsenzadeh et al., 2012) و تیره پسته‌ایان (Anacardiaceae) (Mangifera indica L.: Jonoubi et al., 2015). نیز یافت می‌شوند. در گیاه بادرشبو، دو سلول آرکئوسپوری با فاصلۀ یک لایه زیر سلول‌های اپیدرمی تشکیل می‌شوند که از این نظر مشابه گیاه ریحان (Jafari Marandi et al., 2017) است؛ با تمایز سلول‌های آرکئوسپوری به سلول مادر مگاسپور و تقسیم میوز، چهار سلول ایجاد می‌شوند که تنها یکی از آنها به‌عنوان مگاسپور عملکردی باقی می‌ماند و سبب تشکیل کیسۀ رویانی می‌شود. تتراد در گیاه بادرشبو از نوع تتراهیدرال است. بسیاری از اعضای تیرۀ نعنائیان آرایش خطی یا T- شکل دارند (Daskalova, 2004; Tahmasebi et al., 2016; Jafari Marandi et al., 2017). در برخی گیاهان تک‌لپه‌ای مانند ارکیده‌ها، انجام سیتوکینز پس از میوز I در دیاد سُفتی سبب می‌شود میوز II تنها در دیاد بُنی انجام شود و درنتیجه به‌جای تتراد، مگاسپورها با آرایش تریاد قرار می‌گیرند (Kolomeitseva et al., 2021). در برخی گونه‌های گیاهی، سلول عملکردی باقیمانده در موقعیت بُنی و در برخی دیگر، در موقعیت سُفتی تخمک قرار دارد. در بادرشبو، مگاسپور سُفتی باقی می‌ماند و به مگاسپور عملکردی و سپس سلول مادر کیسۀ رویانی تبدیل می‌شود که مطابق با مطالعه‌های Jafari Marandi et al. (2017) و Kai-Yu et al. (1997) روی برخی گونه‌های گیاهی این تیره و تیره‌های دیگر مانند تیرۀ کلمیان (Chehregani Rad et al., 2009) است. سلول عملکردی با منشأ بُنی در گیاهان بسیاری مانند تبار Hedysareae از تیرۀ باقلائیان (Chehregani Rad et al., 2011; Salinas-Gamboa et al., 2016)، ارکیده (Kolomeitseva et al., 2021)، آلاله‌ایان (Yang et al., 2020) و عنابیان (Shao et al., 2019) مشاهده شده است. کیسۀ رویانی گیاه بادرشبو همانند سایر اعضای تیره و بسیاری از گیاهان گل‌دار از نوع پلی‌گونوم یا هفت‌بند است که نوع اجدادی و صفتی ابتدایی به شمار می‌آید (Davis, 1966). سلول‌های آنتی‌پودال (پابنی‌ها‌) در مراحل اولیۀ تشکیل، ارتباط‌‌های سیتوپلاسمی با هسته‌های قطبی نشان می‌دهند. در بادرشبو نیز همانند ریحان (Chehregani rad et al., 2009)، ساختارهای هیپوستاز (مرحلۀ کیسۀ رویانی 2 تا 4 هسته‌ای) و پوستامنت (به‌شکل ستونی از سلول‌های طویل) در قطب بُنی مشاهده می‌شوند و نقش حفاظتی و تغذیه‌ای دارند و عامل ارتباط آوندی کیسۀ رویانی با سیستم آوندی تخمک هستند (Rao, 1963; Sun et al., 2004). در گیاهی مانند ریحان، ساختار هیپوستاز به‌عنوان ویژگی این گونه یاد شده است (Jafari Marandi et al., 2017). در تخمک‌های با دیوارۀ نازک مانند اعضای تیرۀ نعنائیان، هیپوستاز بلافاصله زیر کیسۀ رویانی قرار دارد و اعتقاد بر این است که بین طول این بافت و الگوی تشکیل هسته، پوسته و کیسۀ رویانی ارتباط وجود دارد. در تخمک، معمولاً پس از مرحلۀ کیسۀ رویانی 2 تا 4 هسته‌ای، سلول هیپوستازی در ناحیۀ بُن ایجاد می‌شود (Shamrov, 2002; Basiri et al., 2021). مشابه با برخی گونه‌های دیگر (Basiri et al., 2021)، سلول‌های آنتی‌پودال در همان مراحل ابتدایی پیش از لقاح از بین می‌روند؛ این سلول‌ها در لقاح و جنین‌زایی نقشی ندارند، اما در تغذیۀ کیسۀ رویانی مفید هستند (Diboll, 1968). در گیاه بادرشبو نیز همانند ریحان (Jafari Marandi et al., 2017)، بافت هدایت‌کنندۀ لولۀ گرده دیده می‌شود؛ این بافت پریفرال از سلول‌های آرکئوسپوری اولیه نمو می‌یابد و در ناحیۀ سفتی متمایز می‌شود. تعداد این لایه‌ها از 1 تا 20 لایه متغیر است و بین سُفت و تخم‌زا، رشته‌ای از سلول‌ها به‌شکل کشیده‌شده وجود دارد (Jafari Marandi et al., 2017).

جمع‌بندی

دانه‌های گردۀ گیاه بادرشبو پیش از شکوفایی گل به بلوغ می‌رسند. لایۀ میانی که تا ایجاد گردۀ نابالغ وجود دارد، پیش از تجزیۀ لایۀ تاپی از بین می‌رود. هنگام شکوفایی بساک، لایۀ اپیدرمی و لایۀ مکانیکی باقی می‌مانند. لایۀ تاپی از نوع ترشحی و آمیبی و به‌شکل تک‌هسته‌ای، دوهسته‌ای یا بیشتر وجود دارد. تتراد در این گیاه از نوع تتراهیدرال است. دانۀگرده شش‌شیاره و اگزین از نوع مشبک است. تخمک از نوع واژگون، تک‌پوششی یا دیوارۀ نازک است. تتراد از نوع تتراهیدرال است. مگاسپور سُفتی به مگاسپور عملکردی و درنهایت، کیسۀ رویانی نوع پلی‌گونوم تبدیل می‌شود. ساختارهای هیپوستاز و پوستامنت و همچنین بافت هدایت‌کنندۀ لولۀ گرده در این گیاه دیده می‌شود.