کاربرد اسید سالیسیلیک و سیلیکون بر برخی شاخص‌های ‏فیزیولوژیکی و ریخت‌شناسی در دو اکوتیپ گیاه گل سازویی ‏‎(Scrophularia striata L.)‎‏ در شرایط تنش خشکی

مقدمه.

تنش خشکی یکی از فاکتورهای اساسی محدودکنندة تولیدات کشاورزی است؛ به‌طوری‌که بیش از 45 درصد از زمین‌های کشاورزی به‌طور دائم در معرض خطر خشکسالی‌اند و 38 درصد جمعیت جهان در این مناطق ساکن‌اند. نتایج مطالعات مختلف نشان می‌دهند پاسخ‌های فیزیولوژیکی گیاهان به تنش خشکی به فاکتورهای متعددی همچون گونه، منطقه، مدت زمان تنش و مرحله رشدی گیاه بستگی دارد (Kordrostami et al., 2020). کمبود آب یک تنش غیرزنده چندبعدی و مخرب است که عملکرد متابولیک مانند کیفیت محصول و بهره‌وری را ازطریق فرایندهای فیزیولوژیکی و ریخت‌شناسی تغییر می‌دهد (Akman et al., 2020; Bhardwaj, 2021). به‌طور کلی فرض می‌شود علت اصلی کاهش فتوسنتز، بسته‌شدن روزنه و کاهش در دسترس بودن دی‌اکسیدکربن در مزوفیل برگ باشد و این شواهد قوی نشان می‌دهند خشکسالی بر متابولیسم و ساختار مزوفیل نیز تأثیر می‌گذارد (Akman et al., 2020; Bhardwaj, 2021). بررسی اثر تنش خشکی بر طول و عرض، تراکم روزنه و عرض سلول‌های نگهبان روزنه کاهش معنی‌دار این شاخص‌ها را نشان داد. این صفات مورفولوژیکی به‌طور چشمگیری بر تبادلات گازی و فرایند فتوسنتز نقش کلیدی دارند (Xuo et al., 2008; Bertolin, 2019; Lerthgin et al., 2022). یکی از اساسی‌ترین تغییرات ناشی از تنش خشکی، کاهش محتوی نسبی آب برگ (RWC) است که به‌عنوان شاخصی از سازگاری گیاهان به تنش خشکی شایان توجه پژوهشگران قرار گرفته است (Schonfeld et al., 1988). جنس Scrophularia یکی از بزرگ‌ترین جنس‌های خانواده Scrophulariaaceae و شامل 200 گونه از گیاهان گلدار است. گل سازویی S. striata با نام محلی تشنه‌داری از دیرباز به‌عنوان یک گیاه دارویی کاربرد داشته است. این گیاه در ایران و برخی از کشورها ازجمله کره جنوبی و چین رویش دارد (Rostami et al., 2021; Rostami et al., 2022). و در طب سنتی برای درمان دستگاه گوارش، عفونت چشم و گوش و بیماری‌های تنفسی استفاده می‌شود (Kerdar et al., 2019). سال‌هاست مردمان غرب کشور این گیاه را به‌صورت آزمایشی و به اشکال بخور و خوراکی استفاده می‌کنند (Zargoosh et al., 2019). براساس مطالعات انجام‌شده روی ترکیبات شیمیایی و مواد مؤثره Scrophularia striata در سال‌های اخیر، ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی در عصاره اتانولی این گیاه شناسایی شده‌اند. همچنین منبع غنی دو متابولیت مهم ایروئیدها و گلیکوزیدهای فنیل پروپانوئید است (Kerdar et al., 2019; Rostami et al., 2022; Bazi Zelan et al., 2022). اسید سالیسیلیک (SA) یک فنل گیاهی است که به‌عنوان یک تنظیم‌کنندة درون‌زا مکانیسم دفاعی در برابر تنش‌های زنده و غیرزنده دارد و در جذب مواد مغذی، پایداری غشا و روابط آب، تنظیم روزنه، فتوسنتز و مهار بیوسنتز اتیلن نقش دارد (Dianat et al., 2016). کاربرد سیلیکون (Si) در غلظت 1/0 گرم باعث بهبود ساختارهای غشایی، آوندی و مزوفیلی شد (Bharwaj et al., 2021). سیلیکون (Si) دومین عنصر فراوان در خاک پس از اکسیژن است (Bharwaj et al., 2021). سیلیکون یک ریزمغذی ضروری برای گیاهان در نظر گرفته نشده است؛ اما اثرات مفید آن روی رشد و توسعه گیاهان توسط بسیاری از مطالعات ثابت شده است (Kafi et al., 2011). کاربرد سیلیکون به افزایش آنزیم روبیسکو کربوکسیلاز و در نهایت به افزایش فعالیت فتوسنتزی در گیاهان تحت تنش خشکی منجر می‌شود (Seal et al., 2018). تاکنون مطالعه‌ای در خصوص اثرات همزمان اسید سالیسیلیک و سیلیکون در بهبود پاسخ‌های ریخت‌شناسی گیاه دارویی گل سازویی در معرض تنش خشکی انجام نشده است. با توجه به اهمیت اقتصادی و نیاز روزافزون جامعه به مصرف گیاهان دارویی، افزایش سطح زیرکشت این محصولات بیش‌ازپیش ضرورت دارد؛ اما شرایط اقلیمی ما اجازه افزایش کشت آنها را در شرایط کم‌آبی نمی‌‌دهد؛ بنابراین، پژوهش‌های روبه‌رشدی در این زمینه درحال شکل‌گیری هستند که تلاش می‌‌‌کنند با سازوکارهای مخصوص و ایجاد شرایط خاص به افزیش سطح زیرکشت آنها در مناطق خشک و نیمه‌خشک کمک کنند؛ بنابراین، پژوهش حاضر به‌منظور بررسی تغییرات ریخت‌شناسی و فیزیولوژیکی گیاه گل سازویی تحت تنش خشکی و نقش اسید سالیسیلیک و سیلیکون در کاهش اثرات منفی تنش خشکی انجام شد.

مواد و روش‌ها.

ماده گیاهی و شرایط رشد.

بذر‌های دو اکوتیپ گیاه گل سازویی در دی ماه 1399 از دو منطقه ایلام و آبدانان واقع در غرب رشته‌کوه‌های زاگرس با اقلیم معتدل و کوهستانی و گرم و خشک و با وضعیت جغرافیایی 47 درجه 25 دقیقه عرض شمالی 32 درجه و 59 دقیقه طول‌ شرقی با ارتفاع 88 متر از سطح دریا و همچنین 23 درجه 21 دقیقه 30 ثانیه عرض شمالی 46 درجه 51 دقیقه و 19 ثانیه طول شرقی با ارتفاع 1427 متر از سطح دریا، جمع‌آوری و سپس ویژگی‌های گیاه‌شناسی نمونه‌های بررسی‌شده براساس Flora Iranica تأیید شدند. بذرهای جمع‌آوری‌‌شده با کد دسترسی (IUGB02076) در بانک ژن دانشگاه ایلام نگهداری می‌شوند. برای ضدعفونی بذور از هیپوکلرید سدیم 10 درصد به مدت 30 ثانیه استفاده شد و سپس با آب مقطر سه بار شستشو داده شدند. برای از بین بردن خفتگی بذرها با محلول ppm 400 جیبرلین به مدت 48 ساعت تیمار و جوانه‌دار شدند. پتری‌دیش محتوی بذرها در دمای 25 درجه سانتی‌گراد و رطوبت نسبی 90 درصد در دستگاه ژرمیناتور (مدل KBWF 240، ساخت شرکت GERMANY) قرار داده شد. بعد از 48 ساعت بذرها در پتری‌دیش‌های حاوی کاغذ مرطوب در دستگاه ژرمیناتور قرار داده شدند. نهال‌های جوانه‌زده در گلدان‌های کاغذی کوچک حاوی خاک + کود آلی + رس و با خصوصیات فیزیکوشیمیایی هدایت الکتریکی (EC) 3/1 میکروموس بر سانتی‌متر، 4/7=pH، رطوبت 28 درصد و نسبت N: P: K به‌ترتیب 240 :4/9 :01/0 به گلخانه انتقال داده شدند و به مدت 30 روز تحت مراقبت لازم قرار گرفتند. گیاهچه‌های رشدیافته از هر دو اکوتیپ به گلدان‌های با عمق 12 و قطر 18 سانتی‌متر منتقل شدند.

تیمارها و طراحی آزمایش

به‌منظور بررسی بازخورد گیاهان به تنش خشکی تحت تیمار سیلیکون و اسید سالیسیلیک، آزمایشی در قالب فاکتوریل بر پایه طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار در گلخانه تحقیقاتی دانشکده کشاورزی دانشگاه ایلام در سال 1400-1399 انجام گرفت. در این آزمایش اسید سالیسیلیک و سیلیکون با فرمول‌های مولکولی C₇H₆O₃ و K₂SiO₃ از شرکت مرک آلمان خریداری شدند. برای تهیه محلول اسید سالیسیلیک، مقدار 1/0 گرم اسید سالیسیلیک در 5/0 میلی‌لیتر اتانول حل شد و قطره‌قطره به آب مقطر، اضافه و سیلیکون نیز در آب گرم (60 درجه) حل شد تا غلظت‌های مدنظر به دست آیند. 127 روز بعد از کاشت و زمانی که گیاهان در مرحله چهار تا پنج برگی بودند، اعمال تیمار شروع شد. در این آزمایش براساس نتایج منابع تنش خشکی در دو سطح (100 و 50 درصد ظرفیت زراعی)، اسید سالیسیلیک در دو سطح (0 و ppm100) و سیلیکون در دو سطح (0 و 1 گرم در لیتر) اعمال شد (Bazi Zelan et al., 2022; Shohani et al., 2023). اسید سالیسیلیک و سیلیکون به‌صورت محلول‌پاشی در اوایل صبح انجام گرفت؛ به‌طوری‌که شاخ و برگ گیاه را به‌طور کامل پوشش دهد و هشت بار در چهار هفته تکرار شد. دو روز بعد از محلول‌پاشی اعمال تنش خشکی در دو سطح (100 و 50 درصد ظرفیت زراعی) به مدت 50 روز انجام شد. نمونه‌برداری بعد از 177 روز از زمان کاشت در ساعت زمانی 11 صبح تا 2 عصر انجام شد. بعد از 198 روز گیاهان از سطح بالای خاک بین ساعت 8 تا 11 صبح برداشت شدند. همچنین ظرفیت زراعی با استفاده از روش Dahiya و همکاران (1979) و از رابطه (1) محاسبه شد.

(رابطه 1)                

FC: ظرفیت زراعی، DW: وزن خشک، FW: وزن مرطوب خاک

اندازه‌گیری فیزیولوژیکی

سنجش محتوی رطوبت نسبی برگ

به‌منظور سنجش محتوی رطوبت نسبی برگ از روش Diaz Perez و همکاران (1995) استفاده شد. در ابتدا برگ‌های میانی که موقعیت رشد یکسانی داشتند، انتخاب و از بوته جدا شدند و نمونه‌ها بلافاصله به محیط آزمایشگاه برای توزین انتقال داده شدند. در هر تیمار سه تکرار توسط ترازوی دیجیتالی (مدلSARTORIUS ، ساخت شرکت آلمان) و با دقت 0001/0 گرم توزین شدند (وزن تر). سپس نمونه‌ها در لوله‌های فالکون‌دار دربسته با 5 میلی‌لیتر آب مقطر به مدت 24 ساعت قرار داده شدند. بعد از این مرحله نمونه‌ها روی دستمال کاغذی برای خشک‌شدن سطحی گذاشته و دوباره وزن شدند (وزن اشباع). بعد از آن، نمونه‌ها در بسته‌های کاغذی کوچک قرار گرفتند و به مدت 24 ساعت در دمای 75 درجه سانتی‌گراد در داخل دستگاه آون (مدل Schutzart، ساخت شرکت آلمان) قرار داده و سپس مجدداً وزن شدند (وزن خشک). از رابطه زیر محتوی رطوبت نسبی سنجش شد.

(رابطه 2)                

RWC: رطوبت نسبی برگ، WT: وزن تر، WD: وزن خشک و TW: وزن اشباع

نشت یون

به‌منظور تعیین نشت یونی، برگ‌هایی انتخاب و از بوته جدا شدند که موقعیت رشد یکسانی داشتند و به محیط آزمایشگاه منتقل شدند. در ابتدا نمونه‌های مدنظر با آب مقطر، شسته و در 5 میلی‌لیتر آب مقطر در لوله‌های فالکون‌دار دربسته، روی شیکر قرار داده شدند. سپس EC اولیه (Ci) در تماس با نمونه‌ها با دستگاه ECمتر (مدل GLP31، ساخت شرکت CRISON) خوانده شد. نمونه‌ها بلافاصله در حمام آب جوش به مدت نیم‌ساعت قرار داده شدند. سپس EC ثانویه (CM) نمونه‌ها نیز خوانده شد. میزان هدایت الکتریکی از رابطه 3 محاسبه شد (Blum et al., 1981).

(رابطه 3)                

سنجش پروتئین محلول

به‌منظور سنجش میزان پروتئین کل از روش Lowry و همکاران (1951) با کمی تغییرات استفاده شد؛ به این ترتیب که به 1/0 گرم از بافت خشک، 2 میلی‌لیتر بافر تریس - اسید کلریدریک 2/0 نرمال با 8=pH (محتوی تریس 2/0 نرمال، اسید آسکوربیک 05/0 میلی‌مولار و ساکاروز 50 میلی‌مولار) اضافه شد. مخلوط بافر با بافت برگ به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. سپس محلول رویی به مدت 20 دقیقه در دور 4000 سانتریفیوژ شد. به 5/0 میلی‌لیتر از روشناور که حاوی پروتئین محلول بود، 2 میلی‌لیتر معرف سولفات مس اضافه شد. پس از 10 دقیقه، 1 میلی‌لیتر معرف فولین سیوکالتیو رقیق‌شده با نسبت 9:1 اضافه شد. سپس 30 دقیقه در محیط تاریک قرار داده شدند. در پایان، جذب نمونه‌ها در طول موج 660 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل SPEECORD 50 n، ساخت شرکت آلمان) خوانده شد. میزان پروتئین با استفاده از نمودار استاندارد از غلظت‌های مختلف آلبومین سرم گاوی محاسبه می‌‌‌شود.

تبادل گازی و روابط آب

به‌منظور اندازه‌گیری سرعت فتوسنتز در واحد سطح برگ (µmol co₂m^-2s^-1)، غلظت دی‌اکسیدکربن زیرروزنه‌ای (µmol co₂mol^-1)، تعرق (mmol H₂om^-2s^-1)، هدایت مزوفیلی (µmol H₂o.ms^-2s^-1) و کارایی مصرف آب (نسبت فتوسنتز خالص به تعرق) از دستگاه فتوسنتزمتر (RGA4 مدل LCA4، ساخت شرکت کره) استفاده شد. سنجش در بازه زمانی 9 صبح تا 1 بعدازظهر انجام شد. به‌منظور جلوگیری از بروز تنش در گیاهان، اعمال آبیاری انجام شد. در هر تیمار صفات مدنظر، اندازه‌گیری و 45 ثانیه بعد از قراردادن برگ داخل محفظه شیشه‌ای دستگاه، اعداد ثبت شدند (Fischer et al., 1998; Akman et al., 2020).

صفات ریخت‌شناسی روزنه.

به‌منظور آماده‌سازی نمونه آناتومیکی روزنه از روش Akman و همکاران (2020) با کمی تغییرات استفاده شد؛ بنابراین، ابتدا برگ‌های میانی بوته بر مبنای سه تکرار در هر تیمار، انتخاب و از بوته جدا شدند. سپس با یک لاک بی‌رنگ سطح رویی برگ پوشانده شد، یک چسب نواری روی محل مدنظر گذاشته و کاملاً منبسط و فشار داده شد. بعد از 60 ثانیه چسب نواری حاوی بافت اپیدرمی از برگ، جدا و روی لام تمیز مدنظر گذاشته شد. روزنه‌های سطح رویی برگ با میکروسکوپ (مدل Olympuc-cy، ساخت شرکت ژاپن) تصویربرداری شدند. تجزیه و تحلیل تصویر با استفاده از نرم‌افزار image انجام شد و برای صفات، طول و عرض روزنه، اندازه روزنه (طول × عرض)، عرض سلول محافظ نگهبان روزنه و تراکم روزنه (تعداد روزنه در واحد سطح) محاسبه شدند.

صفات ریخت‌شناسی برگ

برای آماده‌سازی نمونه میکروسکوپی برگ از روش Jafarian و همکاران (2013) استفاده شد. در ابتدا برگ میانی سالم بوته، انتخاب و از بوته جدا شد. به‌منظور تهیه مقاطع میکروسکوپی نمونه‌ها بلافاصله در فرمالین 10 درصد به مدت دو روز قرار گرفتند. برای جلوگیری از تاخوردگی برگ در محلول مدنظر برگ‌ها روی کاغذ منگنه شدند. سپس نمونه‌ها با محلول‌های مختلف اتانول، آبگیری و در نهایت دو بار در داخل محلول گزیلول خالص قرار داده شدند. برای پارافین‌گیری، نمونه‌ها طی دو مرحله در پارافین خالص قرار گرفته و بلوک‌های پارافین حاوی نمونه تهیه شدند. برای تعیین صفات بررسی‌شده، برش‌های میکروتومی با ضخامت 7 میکرومتر با دستگاه میکروتوم (مدل Panand-P1215) ساخت شرکت (ایران) انجام شد. نمونه‌ها برای مشاهده بهتر با محلول‌های رنگی هماتوکسلین و ائوزین رنگ‌آمیزی شدند. آنالیز با میکروسکوپ (مدل Olympuc-cy، ساخت شرکت ژاپن) و تجزیه و تحلیل تصویر از پنج میدان دید با استفاده از نرم‌افزار image برای اندازه‌گیری صفات آناتومیکی ضخامت سلول‌های اپیدرمی و مزوفیلی، قطر آوند چوبی و آبکش انجام شد.

تحلیل آماری

آزمایش در قالب فاکتوریل بر پایه طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار انجام شد. پردازش داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار SAS نسخه 9.4 انجام شد و مقادیر میانگین و خطای استاندارد از سه تکرار محاسبه شدند. مقایسه میانگین تیمارها با استفاده از روش LSD در سطح آماری 5 درصد انجام شد و برای ترسیم نمودارها از نرم‌افزار گراف پد نسخه 9 استفاده شد.

نتایج.

محتوی نسبی آب برگ.

نتایج تجزیه واریانس نشان می‌دهند تنش خشکی بر محتوی نسبی آب در هر دو اکوتیپ تأثیر معنی‌دار داشت؛ ولی اثرات متقابل چهارگانه اکوتیپ * تنش خشکی * اسید سالیسیلیک * سیلیکون اثر معنی‌دار بر محتوی رطوبت نسبی آب برگ نداشت؛ اما اثرات متقابل سه‌‌گانه اکوتیپ * تنش * اسید سالیسیلیک و اکوتیپ * تنش * سیلیکون اثر معنی‌دار (01/0P≤) بر محتوی نسبی آب برگ داشت. مقایسه میانگین نشان می‌دهد کمترین و بیشترین محتوی نسبی آب برگ در اکوتیپ ایلام تیمار شاهد * اسید سالیسیلیک (ppm100) * سیلیکون (1 گرم بر لیتر) و اکوتیپ آبدانان تیمار ظرفیت زراعی 50 درصد * سیلیکون (1 گرم بر لیتر) مشاهده شد (شکل 1 و جدول 1).

نشت یونی.

تنش خشکی اثرات معنی‌داری بر محتوی نشت یونی در برگ دو اکوتیپ داشت. محلول‌پاشی با اسید سالیسیلیک بر محتوی نشت یونی تأثیر معنی‌داری نداشت؛ اما اثرات متقابل چهارگانه اکوتیپ * تنش خشکی * اسید سالیسیلیک * سیلیکون تأثیر معنی‌دار (01/0P≤) بر محتوی نشت یونی داشت. مقایسه میانگین نشان می‌دهد کمترین محتوی نشت یونی در اکوتیپ آبدانان تیمار ظرفیت زراعی 50 درصد * اسید سالیسیلیک (ppm 100) و اکوتیپ ایلام تیمار ظرفیت زراعی 50 درصد * اسید سالیسیلیک * سیلیکون و اکوتیپ آبدانان ظرفیت زراعی 50 درصد * اسید سالیسیلیک * سیلیکون مشاهده شد؛ اما بین آنها اختلاف معنی‌داری وجود نداشت و بیشترین محتوی نشت یونی در اکوتیپ آبدانان تیمار 50 درصد ظرفیت زراعی مشاهده شد (شکل 1 و جدول 1).

سنجش پروتئین محلول.

نتایج تجزیه واریانس نشان می‌دهند تنش خشکی بر محتوی پروتئین در هر دو اکوتیپ در اندام هوایی تأثیر معنی‌دار داشت؛ اما اثرات چهارگانه اکوتیپ * تنش خشکی * اسید سالیسیلیک * سیلیکون بر محتوی پروتئین کل در اندام هوایی معنی‌دار نبود. اثرات متقابل سه‌گانه اکوتیپ * تنش‌ خشکی * اسید سالیسیلیک * سیلیکون و اکوتیپ * تنش خشکی * سیلیکون در سطح احتمال (01/0P≤) معنی‌دار بود. مقایسه میانگین نشان می‌دهد کمترین و بیشترین محتوی پروتئین در اکوتیپ ایلام تیمار شاهد * ظرفیت زراعی 50 درصد و اکوتیپ ایلام تیمار ظرفیت زراعی 50 درصد * اسید سالیسیلیک (ppm 100) مشاهده شد (شکل 1 و جدول 1).

تبادل گازی و روابط آب

در این مطالعه تنش خشکی بر فتوسنتز در هر دو اکوتیپ اثر معنی‌دار داشت؛ ولی اثرات متقابل تنش خشکی * اسید سالیسیلیک * سیلیکون معنی‌دار نبود؛ اما اثرات متقابل ‌چهارگانه اکوتیپ * تنش‌خشکی * اسید سالیسیلیک * سیلیکون در سطح احتمال (01/0P≤) اثر معنی‌دار داشت. نتایج مقایسه میانگین نشان می‌دهند کمترین میزان سرعت فتوسنتز در اکوتیپ ایلام * تیمار کنترل * ظرفیت زراعی 50 درصد و اکوتیپ آبدانان تیمار ظرفیت زراعی 50 درصد * سیلیکون (1 گرم بر لیتر) مشاهده شد؛ اما اختلاف بین آنها معنی‌دار نبود و بیشترین آن در اکوتیپ ایلام تیمار ظرفیت زراعی 50 درصد * اسید سالیسیلیک (ppm 100) * سیلیکون (1 گرم بر لیتر) مشاهده شد. تنش خشکی بر محتوی دی‌اکسیدکربن زیرروزنه‌ای در اندام هوایی در هر دو اکوتیپ تأثیر داشت. اثرات متقابل چهارگانه اکوتیپ * تنش خشکی * اسید سالیسیلیک * سیلیکون در سطح احتمال (05/0P≤) اثر معنی‌دار بر غلظت دی‌اکسیدکربن در اندام هوایی داشت. مقایسه میانگین نشان می‌دهد کمترین و بیشترین میزان غلظت دی‌اکسیدکربن زیرروزنه‌ای به‌ترتیب در اکوتیپ ایلام تیمار شاهد و اکوتیپ آبدانان تیمار ظرفیت زراعی 50 درصد * اسید سالیسیلیک (ppm 100) * سیلیکون (1 گرم بر لیتر) مشاهده شد. تنش خشکی اثرات معنی‌دار بر هدایت مزوفیلی در هر دو اکوتیپ داشت. اثرات متقابل چهارگانه اکوتیپ * تنش خشکی * اسید سالیسیلیک * سیلیکون در سطح احتمال (01/0P≤) اثر معنی‌دار بر هدایت مزوفیلی اندام هوایی داشت. مقایسه میانگین نشان می‌دهد کمترین و بیشترین هدایت مزوفیلی در اکوتیپ آبدانان تیمار شاهد سیلیکون (1 گرم بر لیتر) و اکوتیپ ایلام تیمار ظرفیت زراعی 50 درصد * اسید سالیسیلیک (ppm 100) * سیلیکون (1 گرم بر لیتر) مشاهده شد. تنش خشکی تأثیر معنی‌داری بر میزان تعرق در اندام هوایی در هر دو اکوتیپ داشت؛ اما اثرات متقابل چهارگانه اکوتیپ * تنش خشکی * اسید سالیسیلیک * سیلیکون اثر معنی‌دار (05/0P≤) بر تعرق اندام هوایی داشت. مقایسه میانگین نشان می‌دهد کمترین و بیشترین میزان تعرق در اکوتیپ ایلام تیمار 50 درصد ظرفیت زراعی * سیلیکون و اکوتیپ ایلام تیمار شاهد * اسید سالیسیلیک مشاهده شد. خشکی تأثیر معنی‌دار بر میزان کارایی مصرف آب در اندام هوایی در هر دو اکوتیپ داشت. محلول‌پاشی اسید سالیسیلیک تأثیر معنی‌داری بر کارایی مصرف آب نداشت؛ اما اثرات متقابل چهارگانه اکوتیپ * تنش خشکی * اسید سالیسیلیک * سیلیکون اثر معنی‌دار (01/0P≤) بر کارایی مصرف آب در اندام هوایی داشت. مقایسه میانگین نشان می‌دهد کمترین و بیشترین کارایی مصرف آب در اکوتیپ آبدانان تیمار شاهد * سیلیکون (1 گرم بر لیتر) و اکوتیپ ایلام تیمار ظرفیت زراعی 50 درصد * اسید سالیسیلیک (ppm 100) * سیلیکون (1 گرم بر لیتر) مشاهده شد (شکل 1 و جدول 1).

شکل 1- محلول‌پاشی اسید سالیسیلیک و سیلیکون بر سرعت فتوسنتز (A)، دی‌اکسیدکربن زیرروزنه‌‌ای (B) هدایت مزوفیلی (C)، تعرق، (D) کارایی مصرف آب (E)، رطوبت نسبی (F)، نشت یونی (G) و پروتئین کل (H) در اندام هوایی گل سازویی در شرایط تنش خشکی (ظرفیت مزرعه‌ای 50 درصد و 100 درصد) داده‌ها، میانگین سه تکرار ± خطای آزمایشی هستند. حروف کوچک نشان‌دهندة تفاوت معنی‌داری در سطح P≤ 0.05 هستند.

Figure 1- Foliar spraying of salicylic acid and silicon on photosynthesis rate (A), substomatal carbon dioxide (B), mesophilic conductance (C), transpiration, (D) water use efficiency (E), relative humidity (F), ion leakage (G) and total protein (H) in areal shoot of S. striata under drought stress conditions (FC50% and FC100%) Data, are mean of three replicates ± SE. Lowercase letters indicate significant differences at the P≤0.05 level

جدول 1- تجزیه واریانس: فتوسنتز (P_N)، غلظت دی‌اکسیدکربن زیرروزنه‌ای (Ci)، هدایت روزنه‌ای (gs)، محتوی نسبی آب (RWC)، نشت یونی (EC)، تعرق (Tr)، کارایی مصرف آب (WUE)، پروتئین کل اندام هوایی (Tpro) در اندام هوایی گیاه گل سازویی در شرایط تنش خشکی

Table 1- variance ANOVA: Net photosynthetic rate (P_N), substomatal CO₂ concentration (Ci), stomatal conductance to CO₂ (gs), RWC (relative water content), El (Electrolyte leakage), Tr (transpiration), WUE (water use efficiency) SPro (total shoot protein) in aerial shoot of S. striata L. under drought stress conditions

* و ** به‌ترتیب غیرمعنی‌دار و معنی‌دار در سطح احتمال پنج و یک درصد

ns, * and ** show no significant and significant differences at 0.05, 0.01 probability level, respectively

شاخص‌های آناتومی.

طول روزنه، عرض روزنه، عرض سلول‌های نگهبان روزنه و اندازه روزنه برگ در اکوتیپ ایلام تحت تنش خشکی نسبت به نمونه‌های شاهد کاهش یافت؛ درحالی‌که کاهش عرض سلول‌های نگهبان روزنه در اکوتیپ آبدانان مطابق با داده‌های تجزیه واریانس (شکل 2 و 4 و جدول 2) با اطمینان 95 درصد معنی‌دار نبود. محلول‌پاشی اسید سالیسیلیک باعث افزایش این شاخص‌ها در اکوتیپ ایلام تحت تنش خشکی شد؛ اما افزایش اندازه روزنه در برگ با اطمینان 95 درصد معنی‌دار نبود. بررسی اثر تنش خشکی بر ضخامت سلول‌های اپیدرمی، سلول‌های مزوفیلی، قطر آوند چوبی و آبکش کاهش معنی‌دار این شاخص‌ها را در اکوتیپ ایلام نسبت به نمونه شاهد نشان داد. محلول‌پاشی سیلیکون باعث کاهش ضخامت سلول‌های مزوفیلی گیاهان در شرایط تنش نسبت به شاهد شد؛ اما کاربرد همزمان اسید سالیسیلیک و سیلیکون باعث کاهش ضخامت سلول‌های اپیدرمی در اکوتیپ ایلام تیمار شاهد شد (شکل 2، 3، 4 و 5 و جدول 2).

شکل 2- اندازه LS (طول روزنه)، WS (عرض روزنه)، WG (عرض سلول‌های نگهبان روزنه) در سطح رویی برگ در گیاه گل سازویی در شرایط بدون تنش (A)، تنش خشکی (B)

Figure 2- The size of stoma length (LS), stoma width (WS), stoma guard cell width (WG) on the upper surface of the leaf in the flowering plant under no stress (A), drought stress (B)

شکل 3- تصاویر مقطع میکروسکوپی تغییرات آناتومیک برگ گیاه گل سازویی با بزرگنمایی 40 شرایط کنترل (A)، شرایط تنش (B)، شرایط کنترل + اسید سالیسیلیک (C)، شرایط تنش + اسید سالیسیلیک (D)، شرایط کنترل + سیلیکون (E)، شرایط تنش + سیلیکون (F)، شرایط بدون تنش + اسید سالیسیلیک + سیلیکون (G)، شرایط تنش + اسید سالیسیلیک + سیلیکون (H)

Figure 3- Microscopic cross-section images of anatomical changes in the leaf of Scrophularia striata L with 40 magnification control conditions (A), stress conditions (B), control conditions + salicylic acid (C), stress conditions + salicylic acid (D), control conditions + silicon (E) , stress condition + silicone (F), no stress condition + salicylic acid + silicone (G), stress condition + salicylic acid + silicone (H)

شکل 4- کاربرد اسید سالیسیلیک بر طول روزنه (A)، عرض روزنه (B)، عرض سلول‌های نگهبان روزنه (C)، تراکم روزنه (D) و اندازه روزنه (E داده ها، میانگین سه تکرار ± خطای آزمایشی هستند. حروف کوچک نشان‌دهندة تفاوت معنی‌داری در سطح P≤0.05 هستند.

Figure 4- Application of salicylic acid on stomatal length (A), stomatal width (B), stomatal guard cell width (C), stomatal density (D) and stomatal size (E). Data, are mean of three replicates ± SE. Lowercase letters indicate significant differences at the P≤0.05 level.

شکل 5- تأثیر محلول‌پاشی اسید سالیسیلیک و سیلیکون بر شاخص‌های آناتومیکی سلول‌های اپیدرم فوقانی (A)، تحتانی (B)، سلول‌های مزوفیل نرده‌ای (C)، اسفنجی (D) و دستجات آوندی چوب (E) و آبکش (F) در گیاه گل سازویی در شرایط تنش خشکی (ظرفیت مزرعه‌ای 50 درصد و 100 درصد) داده‌ها، میانگین سه تکرار ± خطای آزمایشی هستند. حروف کوچک نشان‌دهندة تفاوت معنی‌داری در سطح P≤ 0.05 هستند.

Figure 5- The effect of salicylic acid and silicon foliar application on the anatomical parameters of upper (A), lower (B) epidermal cells, fence (C), spongy (D) mesophyll cells, and wood vascular structures (E) and phloem (F) in flowering plants under drought stress conditions (FC50% and FC100%) Data, are mean of three replicates ± SE. Lowercase letters indicate significant differences at the P≤0.05 level

جدول 2- تجزیه واریانس: طول روزنه (LS)، عرض روزنه (WS)، عرض سلول‌های نگهبان روزنه (WG)، تراکم روزنه در واحد سطح (DS)، ضخامت سلول اپیدرم بالایی (Uep)، ضخامت سلول اپیدرم پاینی (Lep)، ضخامت سلول پارانشیم نرده‌ای (Pal)، ضخامت سلول پارانشیم اسفنجی (Spo)، قطر آوند چوبی (Xy)، قطر آوند آبکش (Ph)

Table 2- variance ANOVA: stoma length (LS), stoma width (WS), stoma guard cell width (WG), stoma density per unit area (DS), upper epidermis cell thickness (Uep), lower epidermis cell thickness (Lep), thickness of palisade parenchyma (Pal), thickness of spongy parenchyma (Spo), diameter of xylem (Xy), diameter of phloem (Ph)

 * و ** به‌ترتیب غیرمعنی‌دار و معنی‌دار در سطح احتمال پنج و یک درصد

ns, * and ** show no significant and significant differences at 0.05, 0.01 probability level, respectively

بحث و نتیجه‌گیری.

خشکسالی یک تنش محیطی کلیدی در رشد محصولات است که پیامدهای نامطلوب بر رشد گیاه و مسیر‌های متابولیکی مانند فتوسنتز و روابط آب و خاک دارد. نتایج به‌دست‌آمده از مطالعه حاضر نشان دادند تنش خشکی باعث کاهش محتوی نسبی آب برگ می‌‌‌شود. یکی از مهم‌ترین تغییرات ناشی از تنش خشکی کاهش محتوی نسبی آب برگ است. این شاخص می‌تواند توانایی گیاه در تحمل به تنش خشکی را نشان دهد (Heshmat et al., 2021). کاربرد اسید سالیسیلیک باعث افزایش محتوی رطوبت آب برگ در اکوتیپ آبدانان تیمار 50 درصد ظرفیت زراعی شد. کاربرد اسید سالیسیلیک باعث افزایش محتوی رطوبت نسبی در برگ گیاهان تحت تنش خشکی می‌تواند به‌علت افزایش اسمولیت‌ها در گیاهان باشد (Kabiri et al., 2014). در تأیید نتایج حاصل از این مطالعه، محلول‌پاشی با اسید سالیسیلیک باعث افزایش محتوی نسبی آب برگ در گیاه نعناع در شرایط تنش خشکی شد (Azad et al., 2021). نتایج نشان دادند تیمار خشکی باعث کاهش فتوسنتز، پارامترهای تبادل گازی همچون غلظت دی‌اکسیدکربن زیرروزنه‌ای، تعرق، هدایت مزوفیلی و کارایی مصرف آب شد؛ اما کاربرد اسید سالیسیلیک و سیلیکون باعث افزایش فتوسنتز، دی‌اکسیدکربن زیرروزنه‌ای، هدایت مزوفیلی و کارایی مصرف آب در اکوتیپ ایلام تیمار 50 درصد ظرفیت زراعی شد و کاربرد سیلیکون باعث کاهش تعرق در اکوتیپ ایلام تیمار 50 درصد ظرفیت زراعی شد. نتایج نشان دادند کاهش جذب آب و سریع بسته‌شدن روزنه‌ها پاسخ اولیه گیاهان به تنش خشکی است که متعاقب آن، فتوسنتز، تعرق، غلظت دی‌اکسیدکربن زیرروزنه‌ای، هدایت مزوفیلی و کارایی مصرف آب را کاهش می‌دهد که با نتایج ارائه‌شده در این پژوهش همخوانی دارد (Saheri et al., 2020). گزارش شده است که کاربرد اسید سالیسیلیک به‌طور مؤثری استفاده از دی‌اکسیدکربن را برای بهبود رشد در شرایط تنش خشکی با افزایش فعالیت آنزیم روبیسکو کربوکسیلاز بهبود می‌بخشد. Tahjib-Ul-Arif و همکاران (2018) گزارش کردند راندمان مصرف آب برای گیاهان در شرایط خشکسالی به‌عنوان یک شاخص مهم محسوب می‌شود و عامل تعیین‌کنندة بهروری در گیاهان است. سیلیکون با رسوب روی دیواره سلولی گیاهان تحت تنش خشکی باعث کاهش تبخیر و تعرق از سطح گیاه می‌شود که نتایج ارائه‌شده در این مطالعه را تأیید می‌کند (Thorne et al., 2020). گیاهان در شرایط تنش خشکی به‌منظور صرفه‌جویی در مصرف آب تحت‌تأثیر تغییرات ریخت‌شناسی (شامل کاهش تراکم روزنه، سلول‌های اپیدرمی، مزوفیلی و آوندی) به‌ویژه در برگ‌ها قرار می‌گیرند که اندام اصلی درونی هستند (Bosabalids et al., 2002). در مطالعه حاضر کمترین طول روزنه در اکوتیپ آبدانان تیمار ظرفیت زراعی 50 درصد * سیلیکون (1 گرم بر لیتر) و کمترین عرض روزنه و عرض سلول‌های نگهبان در اکوتیپ ایلام تیمار 50 درصد ظرفیت زراعی مشاهده شد. Yadollahi و همکاران (2011) گزارش کردند عرض روزنه در شرایط تنش خشکی کاهش یافته است که با نتایج حاصل از این پژوهش همخوانی دارد. در مطالعه حاضر اندازه روزنه به‌طور معنی‌داری بین دو اکوتیپ متفاوت بود. کمترین اندازه روزنه در اکوتیپ ایلام تیمار 50 درصد ظرفیت زراعی * سیلیکون مشاهده شد. این نتایج با یافته‌های Akman و همکاران (2020) مطابق هستند که گزارش کردند تنش خشکی اندازه روزنه را کاهش می‌‌‌دهد. این تغییرات نشان‌دهندة سازگاری مورفولوژیکی گیاه در برابر تنش خشکی است (Maherali et al., 2002). تراکم روزنه با توجه به عوامل ژنتیکی و محیطی متفاوت است. مطالعه حاضر نشان داد بیشترین تراکم روزنه در اکوتیپ آبدانان تیمار شاهد و کمترین در اکوتیپ آبدانان تیمار 50 درصد ظرفیت زراعی مشاهده شد. تراکم روزنه‌ای همبستگی قوی با تعرق در گیاه دارد؛ به این صورت که گیاهان با تراکم روزنه‌ای بالا، بیشتر آب را به شکل تعرق از دسترس گیاه خارج می‌کنند که با یافته‌های ما در این مطالعه همخوانی دارد (Bucklely et al., 2005). در مطالعه حاضر ضخامت اپیدرم فوقانی در اکوتیپ ایلام تیمار شاهد * سیلیکون به‌طور معنی‌دار نسبت به تیمار تنش افزایش نشان داده است. همچنین مساحت سلول‌های اپیدرم تحتانی در اکوتیپ آبدانان تیمار تنش نسبت به شاهد کاهش یافته است. کاهش در ضخامت اپیدرم فوقانی یک سازگاری مورفولوژیکی در گیاهان است تا از اثرات مخرب تنش خشکی بر شاخص‌های ریخت‌شناسی جلوگیری کند. کاهش ضخامت اپیدرم در گیاه لوبیا چشم بلبلی در شرایط تنش شوری مشاهده شد که با نتایج ما در این مطالعه همخوانی دارد (El-Taher et al., 2022). در پژوهش حاضر مساحت سلول‌های مزوفیل نرده‌ای و اسفنجی در اکوتیپ ایلام تیمار 50 درصد ظرفیت زراعی * سیلیکون کاهش یافت. یکی از دلایل کاهش مساحت سلول‌های مزوفیلی در گیاهان در شرایط تنش خشکی رسوب سیلیکون در فضای بین سلولی است که عرصه را بر این سلول‌ها تنگ کرده است و موجب کاهش مساحت در این سلول‌ها می‌‌‌شود (Agami et al., 2013). در مطالعه Abd Elbar و همکاران (2019) گزارش شده است ضخامت سلول‌های مزوفیلی (نرده‌ای و اسفنجی) در گیاه آویشن تحت تنش خشکی کاهش یافت که با نتایج ارائه‌شده در این پژوهش همخوانی دارد. در این مطالعه قطر سلول‌های آوند چوبی در اکوتیپ ایلام تیمار 50 درصد ظرفیت زراعی کاهش یافت. کاهش در قطر سلول‌های آوند چوبی در گیاهان تحت تنش خشکی احتمالاً بر اثر فعال‌شدن مسیر بیوسنتز متابولیت فنیل‌آلانین – تیروزین است که سنتز پلیمر لیگنین و رسوب آن در دیواره‌ها و در نتیجه کاهش اندازه سلول را سبب می‌شود (Liu et al., 2018). گزارش شده است رشد سلول در گیاهان در شرایط تنش خشکی توسط ژن‌های لاکاز، پراکسیداز‌ها و S- متیونین سنتتاز کنترل می‌شود که در مسیر بیوسنتز لیگنین هستند (Jafarian et al., 2013; Liu et al., 2018). درگیاهان در شرایط تنش خشکی، کاهش آب باعث ایجاد آمبولی در آوند چوبی می‌شود و در حفظ پیوستگی آب اختلال ایجاد می‌کند (Abd Elbar et al., 2019). در تأیید نتایج یافته‌های ما در این مطالعه، Abdelaal و همکاران (2015) گزارش کردند در گیاهان باقلا تحت تنش خشکی قطر آوند چوبی کاهش یافت. قطر آوند آبکش در اکوتیپ آبدانان تیمار 50 درصد ظرفیت زراعی کاهش یافت. مطالعات نشان می‌دهند خشکسالی بر تقسیمات پروکامبیوم آوندی در مراحل اولیه رشد تأثیر می‌گذارد و در نهایت به کاهش قطر آوندها منجر می‌شود (Ab Elbar et al., 2019). آوند آبکش، محصولات فتوسنتزی در همه جهات و در واحد زمان انتقال و همبستگی مثبت با قطر آوند آبکش دارد. با تغییر در قطر، سرعت حرکت مواد کاهش می‌یابد و در نهایت به رشد در گیاه منجر می‌شود (Canny et al., 1960). در مطالعه حاضر تنش خشکی به کاهش محتوی پروتئین کل منجر شد. تنش خشکی با تأثیر بر متابولیسم نیتروژن، سنتز پروتئین در گیاهان تحت تنش خشکی را کاهش می‌دهد (Kabiri et al., 2014). از دلایل دیگر کاهش پروتئین در مطالعه حاضر، افزایش گونه‌های فعال اکسیژن است؛ این گونه‌ها بسیار سیتوتوکسیک هستند و باعث کاهش پروتئین در گیاهان تحت تنش خشکی می‌شوند (Kabiri et al., 2014). محتوی پروتئین کل در گیاه سیاه‌دانه و به‌لیمو در شرایط تنش خشکی کاهش یافت که با نتایج مطالعه حاضر همخوانی دارد (Kabiri et al., 2014; Dianat et al., 2016). کاربرد اسید سالیسیلیک و سیلیکون باعث افزایش محتوی پروتئین در اکوتیپ ایلام تیمار 50 درصد ظرفیت زراعی شد؛ اما اختلاف بین آنها معنی‌دار نبود. کاربرد اسید سالیسیلیک، افزایش فعالیت آنزیم نیترات ردوکتاز و محتوی نیترات و در نتیجه افزایش محتوی کل پروتئین در گیاهان تحت تنش خشکی را سبب شد که با یافته‌های ما در این مطالعه همخوانی دارد (Fariduddin et al., 2003). در این پژوهش، تنش خشکی باعث افزایش نشت یونی در اکوتیپ آبدانان تیمار 50 درصد ظرفیت زراعی شد. نشت یونی اغلب به‌عنوان یک مورد آسیب رادیکال‌های آزاد به غشای سلول در شرایط تنش خشکی اندازه‌گیری می‌شود (Haliwel and Gutterideg, 1984). کاهش نشت یونی با کاربرد اسید سالیسیلیک و سیلیکون در اکوتیپ آبدانان با احتمال 95 درصد معنی‌دار نبود. اثر بهبود اسید سالیسیلیک بر رشد گیاه در شرایط تنش خشکی با نقش در جذب مواد مغذی و پایداری غشای سلولی مرتبط است (Dianat et al., 2016).

در مطالعه حاضر، تنش خشکی کاهش فتوسنتز، پارامترهای تبادل گازی، تغییرات ریخت‌شناسی و افزایش نشت یونی را در گیاه گل سازویی موجب شد. کاربرد سیلیکون موجب افزایش محتوی رطوبت نسبی شد. کاربرد همزمان اسید سالیسیلیک (ppm‌100) و سیلیکون (1 گرم بر لیتر) صدمات ناشی از تنش خشکی را کاهش داد و افزایش فتوسنتز و پارامترهای تبادل گازی را موجب شد. همچنین اسید سالیسیلیک و سیلیکون احتمالاً با تأثیر مثبت بر ساختار گیاه، شاخص‌های ریخت‌شناسی گل سازویی را در شرایط تنش خشکی بهبود می‌‌‌بخشد.