بهینه‌سازی جذب‌زیستی اورانیوم توسط زیست‌توده پیش‌تیمارشده سیتروباکتر

مقدمه

آلودگی ناشی از فلزات سنگین و رادیواکتیو یک مشکل جهانی است که با گسترش صنایع و تخلیه پساب‌های آنها، شاهد گسترش کنترل‌نشده این آلودگی‌ها هستیم. فلزات سنگین در بافت‌های موجودات زنده انباشت پیدا می‌کنند و در نهایت از طریق زنجیر غذایی به انسان می‌رسند که در رأس هرم غذایی قرار دارد و سبب مسمومیت، سرطان و حتی آسیب مغزی می‌شوند. اورانیوم یکی از فلزات سنگینی است که به‌دلیل سمیت بالا و قدرت رادیواکتیویته، انتشار آن به محیط زیست با مخاطرات جدی همراه است. انتشار این فلز خطرناک به محیط زیست با گسترش معدن کاری و فعالیت‌های هسته‌ای افزایش یافته است و محققان و دانشگران مختلف به‌دنبال یافتن راه‌هایی برای بازیابی اورانیوم منتشرشده با استفاده از روش‌های مؤثر و به‌صرفه هستند (1-5).

روش‌های مرسوم برای حذف اورانیوم و دیگر فلزات سنگین از پساب‌های صنعتی مانند رسوب، جداسازی لجن، اکسیداسیون شیمیایی و احیا، تعویض یونی، اسمز معکوس، تکنولوژی‌های غشایی، اغلب علاوه بر هزینه‌های بالا برای سرمایه‌گذاری، در غلظت‌های پایین فلزات کارایی خوبی ندارد؛ بنابراین، دانشگران محیط زیست به‌دنبال روش‌هایی مقرون‌به‌صرفه، محیط‌دوستانه و آسان برای حذف فلزات سنگین از محلول‌های آبی هستند (1, 6-9). امروزه ثابت شده است زیست پالایی پتانسیل خوبی در این زمینه دارد. مطالعات مختلف نشان داده است فرایند جذب‌زیستی نسبت به سایر روش‌های زیست پالایی کاربردی‌تر است، در زمان کوتاه‌تری انجام می‌شود و افزایش مقیاس فرایند با هزینه‌های کمتری انجام خواهد شد. علاوه بر این، در فرایند جذب‌زیستی می‌توان از سلول‌های غیرزنده استفاده کرد که نیاز به ماده غذایی و افزایش میزان اکسیژن زیستی^[1] و مقدار اکسیژن شیمیایی^[2] در پساب را ندارند و مدل‌سازی ریاضی آنها نیز آسان‌تر است (10,1).

جلبک‌های دریایی، باکتری‌ها، قارچ‌ها، مخمرها، پسماندهای صنایع غذایی و صنعتی ازجمله جاذب‌های طبیعی هستند که برای حذف اورانیوم از محلول‌های آبی استفاده شده‌اند. این جاذب‌ها، با برهمکنش میان فلزات و گروه‌های عملکردی پروتئین‌ها، لیپیدها و کربوهیدرات‌ها باعث حذف و برداشت فلزات از محیط می‌شوند که در نهایت فلزات حذف‌شده توسط تیمار با محلول‌های مختلف جاذب می‌توانند بازیابی و تغلیظ شوند (4, 11-13). تحقیقات نشان داده‌اند ظرفیت حذف فلزات می‌تواند با پیش‌تیمار زیست‌توده یا جاذب‌های زیستی افزایش یابد. پیش‌تیمارهای فیزیکی (مانند تیمار حرارتی، استفاده از حرارت مرطوب و جوشاندن) و شیمیایی (تیمار با اسید، قلیا و مواد شیمیایی آلی) متعددی می‌توانند برای این هدف استفاده شوند. موفقیت این پیش‌تیمارها به نوع زیست‌توده بستگی زیادی دارد؛ برای مثال، در برخی مقالات گزارش شده است تیمار اسیدی و قلیایی باعث افزایش ظرفیت جذب‌زیستی می‌شود؛ زیرا ناخالصی‌ها و یون‌های مسدودکننده در جایگاه‌های اتصالی طی این تیمار به‌راحتی زدوده و حذف می‌شود (8).

علاوه بر این، پارامترهای محیطی نیز با توجه به نوع جاذب و مشخصات آن می‌توانند بر عمل جذب تأثیر بگذارند. از میان این عوامل می‌توان به pH محلول، دماهای جذب، مقدار جاذب و مقدار اولیه ماده جذب‌شونده اشاره کرد؛ بنابراین، بهینه‌سازی پارامترهای محیطی می‌تواند در افزایش میزان ظرفیت جذب‌زیستی تأثیر به‌سزایی داشته باشد. هدف از این پژوهش بهینه‌سازی پارامترهای محیطی مؤثر بر جذب‌زیستی اورانیوم توسط زیست‌توده باکتری گرم منفی سیتروباکتری فروندی^[3] است که با استفاده از اتوکلاو تیمار حرارتی شده است.

مواد و روش‌ها

تهیه سویه، محیط کشت و مواد استفاده‌شده: تمامی مواد استفاده‌شده در این پژوهش شامل محیط کشت نوترینت براث، اسید سولفوریک، سدیم هیدروکسید از شرکت مرک است. نمک UO₂(NO₃)₂.6H₂O، از پژوهشگاه علوم و فنون هسته‌ای تهیه شده است. باکتری سیتروباکتری فروندی با PTCC No. 1772 از سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران خریداری و در این پژوهش استفاده شده است.

تهیه محلول ذخیره اورانیوم: در ابتدا محلول ذخیره با غلظت 1000 میلی‌گرم بر لیتر از نمک UO₂(NO₃)₂.6H₂O با استفاده از آب دیونیزه تهیه شد. محلول‌های مورد نیاز هر مرحله با رقیق‌کردن این محلول تهیه شدند. مقدار pH محلول‌های حاوی اورانیوم با استفاده از اسید سولفوریک و سدیم هیدروکسید 1 نرمال تنظیم شد. پس از تهیه هر محلول، غلظت نهایی با استفاده از دستگاه ICP (ساخت شرکت Perkin Elmer مدل Optima 7300DV) اندازه‌گیری شد.

آماده‌سازی زیست‌توده: به‌منظور تهیه پیش‌کشت، باکتری سیتروباکتر فروندی در محیط نوترینت براث (pH نهایی 2/0±7) تلقیح شد و به مدت 48 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‌گراد با 150 دور بر دقیقه (گرمخانه شیکردار به مدل HTiNFORS، ساخت شرکت Multitron) قرار گرفت. سپس به میزان 10 درصد با غلظت نیم مک فارلند از محیط کشت حاصل در محیط کشت نوترینت براث جدید، با همان شرایط تلقیح شد و همزنی صورت گرفت. سپس زیست‌توده به‌دست‌آمده با 5000 دور بر دقیقه به مدت 15 دقیقه با سانتریفیوژ برداشته و با آب دیونیزه، سه مرتبه شستشو داده شد.

تیمار حرارتی زیست‌توده با اتوکلاو: زیست‌توده به‌دست‌آمده درون فالکون ریخته شد و درون اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه با فشار 5/1 اتمسفر قرار گرفت. برای استفاده در آزمایش‌های بعدی وزن خشک زیست‌توده به‌دست‌آمده نیز محاسبه شد.

.بهینه‌سازی فرایند جذب اورانیوم با استفاده از طراحی آزمایش به روش سطح پاسخ: در این پژوهش از روش سطح پاسخ^[4] برای بررسی تأثیر پارامترهای مؤثر بر فرایند جذب‌زیستی اورانیوم توسط باکتری سیترو باکتری فروندی و بهینه‌سازی آن استفاده شده است. طراحی آزمایش به روش سطح پاسخ با نرم‌افزار دیزاین اکسپرت^[5] صورت گرفت. چهار عامل شامل غلظت اورانیوم (A) در محدودة 100-10 میلی‌گرم بر لیتر، pH (B) در محدودة 5-2، دما (C) در محدودة 40-25 درجه سانتی‌گراد و مقدار جاذب (D) در محدودة 25-5 گرم بر لیتر، در پنج سطح α-، 1-، 0، 1+، α+، برای طراحی آزمایش استفاده شدند (جدول 1).

جدول 1- متغیرها و سطوح روش طراحی مرکب مرکزی

براساس این، یک سری شامل 27 آزمایش با استفاده از طراحی مرکب مرکزی^[6] ارائه شد. در جدول 2 مقدار متغیرها و پاسخ‌های به‌دست‌آمده نشان داده شده است. آزمایش‌های طراحی‌شده با افزودن مقدار زیست‌توده باکتری مشخص‌شده برای هر آزمایش، درون ارلن‌های 20 میلی‌لیتری حاوی محلول اورانیوم با غلظت و pH مربوط و قراردادن نمونه در دمای مشخص‌شده انجام گرفتند. پس از مدت زمان 90 دقیقه، هر نمونه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه با 4500 دور بر دقیقه سانتریفیوژ شد و میزان اورانیوم باقی‌مانده در محلول که زیست‌توده موفق به جذب آن نشده است، با استفاده از روش ICP-OES سنجیده شد؛ در نهایت، با استفاده از رابطه زیر میزان درصد حذف یا برداشت اورانیوم (R) محاسبه شده است.

معادله (1)                                                    

C₀ (mg/l) غلظت اولیه فلز در محلول، (mg/l) C_f غلظت نهایی فلز پس از جذب توسط جاذب‌ها در محلول است.

 نتایج.

.ارزیابی پارامترهای مؤثر در جذب‌زیستی اورانیوم: با استفاده از روش سطح پاسخ مبتنی بر طراحی مرکب مرکزی (RSM-CCD)، بهینه‌سازی فرایند جذب‌زیستی انجام شد. جدول 2 نتایج تجربی را براساس هر نقطه از طراحی آزمایش نشان می‌دهد. سپس نتایج به‌دست‌آمده برای ارزیابی برازش با استفاده از تحلیل واریانس (ANOVA) ارزیابی شدند.

جدول 2- مقادیر متغیرها و پاسخ‌های آزمایشگاهی طراحی مرکب مرکزی در روش سطح پاسخ

برازش مدل: مدل پیشنهادشده توسط نرم‌افزار به‌صورت زیر تعریف شده است:

Removal= +68.97045-1.43160 * C (ppm)+12.81296 * pH+1.08935 * T (0C)+2.89856 * M (g/l)+0.55737 * C (ppm) * pH+0.011459* C (ppm)* T (0C)+0.014961* C (ppm)* M (g/l)-0.32111 * pH * T (0C)-0.62783 * pH * M (g/l)-0.037633* T (0C) * M (g/l)-6.93488E-003* C (ppm)2-4.06361 * pH2

به‌طور کلی، مقدار P کمتر از 05/0 و مقدار F بزرگ در جدول تحلیل واریانس نشان‌دهندة تأثیر بیشتر متغیرها با سطح اطمینان 95 درصد است. مقادیر P و F مدل پیشنهادی برای بازده حذف به‌ترتیب برابر با 0027/0 و 03/5 هستند که دلالت بر صحت مدل پیشنهادی دارند و همچنین، مقدار R² برابر با 81/0 است؛ این مقادیر نشان می‌دهند مدل پیشنهادی به خوبی قادر است مقادیر تجربی را پیش‌بینی کند.

در جدول 3 تحلیل واریانس مدل، پارامترهای اصلی و برهمکنش پارامترهای میزان حذف اورانیوم نشان داده شده‌اند. نتایج جدول 3 نشان می‌دهند پارامترهای غلظت اولیه اورانیوم و pH از لحاظ آماری (05/0>p-value ) بر فرایند حذف اورانیوم تأثیرگذار هستند. نتایج نشان دادند با افزایش غلظت اورانیوم از 10 میلی‌گرم بر لیتر تا 5/77 میلی‌گرم بر لیتر میزان حذف از 5/66 درصد به 92/99 درصد افزایش می‌یابد. سپس با افزایش غلظت اورانیوم از 5/77 میلی‌گرم بر لیتر تا 100 میلی‌گرم بر لیتر میزان حذف به 34/97 درصد کاهش می‌یابد. همچنین نتایج نشان دادند با افزایش pH از 2 تا 5 میزان حذف از 82/96 درصد به 01/79 درصد کاهش یافته است. علاوه بر این، نتایج نشان می‌دهند پارامترهای دما و مقدار جاذب از لحاظ آماری ( > p-value05/0) بر فرایند حذف اورانیوم توسط باکتری سیتروباکتر فروندی بدون تأثیر هستند (جدول 3).

سطح‌های سه‌بعدی پاسخ‌ها که ناشی از برهمکنش چهار متغیر غلظت اورانیوم، دما، pH و مقدار جاذب هستند، در اشکال 1 تا 6 نشان داده شده‌اند.

جدول 3- تحلیل واریانس مدل پیشنهادی برای میزان حذف اورانیوم (R)

بحث و نتیجه‌گیری

جذب‌زیستی یکی از امیدوارکننده‌ترین روندهای زیست پالایی است که به‌دلیل هزینه‌های پایین افزایش مقیاس و عدم تولید لجن ثانویه و کارایی در غلظت‌های پایین فلزات، توجه بسیاری از دانشگران را به خود جلب کرده است (14,3). بررسی‌ها نشان داده‌اند نقش اصلی در فرایند جذب‌زیستی توسط میکروارگانیسم‌ها مربوط به دیواره سلولی است که با اعمال پیش‌تیمارهای فیزیکوشیمیایی مختلف امکان تغییر گروه‌های عاملی سطحی در دیواره وجود دارد که با توجه به نوع میکروارگانیسم می‌تواند سبب افزایش یا کاهش جذب‌زیستی شود (15). گاد^[vii] و همکارانش در سال 2010، زیست‌توده ساکارومایسس سرویزیه را با سدیم هیدروکسید 75/0 مولار در دمای 70 تا 90 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 تا 15 دقیقه حرارت دادند و ظرفیت جذب زیستی آن را قبل و بعد از تیمار در مورد فلزات مس، کادمیوم و آهن بررسی کردند. مشخص شد ظرفیت جذب مس (II)، کادمیوم (II) و آهن (III) که قبل از تیمار زیست‌توده به‌ترتیب 35 میلی‌گرم بر لیتر، 15 میلی‌گرم بر لیتر و 25 میلی‌گرم بر لیتر بود، بعد از تیمار به‌ترتیب به 11/36 میلی‌گرم بر لیتر، 11/18 میلی‌گرم بر لیتر و 52/33 میلی‌گرم بر لیتر رسیده است (16). در سال 2012 نیز داس^[viii] و همکارانش، از محلول سدیم دو دسیل سولفات، برای تیمار زیست‌توده مخمر در غلظت‌های 1 تا 8 میلی‌مولار استفاده کردند. نتایج افزایش چشمگیری در حذف روی (II) را نشان دادند؛ به‌گونه‌ای‌که زیست‌توده تیمارشده با محلول 3 میلی‌مولار تا 7/84 درصد موفق به حذف اورانیوم شد (17). در سال 2019، کرمانشاهی و همکارانش پیش‌تیمار فیزیکی با استفاده از حرارت اتوکلاو را روی باکتری اسیدیتیوباسیلوس فرواکسیدانس ^[ix]ZT-94 انجام دادند و ظرفیت جذب‌زیستی را قبل و بعد از تیمار روی محلول اورانیوم در شرایط بهینه بررسی کردند. نتایج نشان دادند کارایی حذف سلول‌ها بعد از اتوکلاو اندکی کاهش یافته است و از 70/80 درصد به 84/76 درصد رسیده است. آنها علت این امر را با تغییرات جایگاه‌های اتصال سلولی و تخریب گروه‌های عاملی سطح سلولی در فشار و دمای اتوکلاو مرتبط دانسته‌اند (18). در مطالعه دیگری که گالون^[x] و همکاران در سال 1987 توسط تیمار با سدیم هیدروکسید روی زیست‌توده پنی‌سیلیوم دیجیتاتوم^[xi] انجام داده‌اند، مشخص شد حذف زیستی نیکل (II)، روی (II)، کادمیوم (II) بعد از تیمار افزایش می‌یابد. آنها علت این پدیده را به حذف ناخالصی‌های سطح سلول، شکستن غشای سلول و بیشترشدن تعداد جایگاه‌های اتصال فلزات مربوط دانسته‌اند. مک گاهرن^[xii] و همکاران نیز بیان کردند تیمار قلیایی زیست‌توده سبب فعال‌شدن آنزیم‌های اتوکاتالیتیک می‌شود که باعث عریض‌شدن زیست‌توده و حذف پروتئین‌ها و لیپیدهایی می‌شود که جایگاه‌های برهمکنش با فلزات را پوشانده‌اند و به این ترتیب، پیش تیمار سبب آزادی عمل گروه‌های عملکردی برای اتصال به یون‌های فلزی می‌شود (19). علاوه بر تیمار اسیدی و قلیایی، مطالعات نشان داده است زیست‌توده جلبک سیتوسریا ایندیکا^[xiii] و شکل تیمارشده آن با کلسیم می‌تواند به‌عنوان جاذب‌زیستی مؤثری برای تیمار پساب‌های حاوی اورانیوم مطرح باشد (1). در مطالعه حاضر نیز از زیست‌توده تیمارشده با اتوکلاو برای بهینه‌سازی جذب‌زیستی اورانیوم استفاده شد و با توجه به این امر که پارامترهای محیطی مانند میزان pH، غلظت اولیه اورانیوم، مقدار جاذب و دما و ... می‌توانند بر میزان حذف زیستی اورانیوم تأثیر بگذارند، بسیاری از دانشگران در پژوهش‌های خود این پارامترها را در عمل جذب بررسی کرده‌اند. نتایج نشان دادند پارامتر pH از لحاظ آماری (05/0>p-value ) بر فرایند حذف اورانیوم توسط باکتری سیتروباکتر فروندی تیمارشده تأثیرگذار است.

مطالعات دیگر نیز نشان می‌دهد pH عامل مؤثری بر جذب‌زیستی فلزات است؛ برای مثال، صولت و همکارانش نیز طی بررسی جذب‌زیستی اورانیوم توسط زیست‌توده اسپرژیلوس نایجر^[xiv] با بررسی بازه 3 تا 7 برای مقدار pH، گزارش کردند بهینه pH برای جذب اورانیوم 5 است و با افزایش pH از 3 تا 5 میزان حذف اورانیوم افزایش یافته است و دلیل این امر را رقابت یون‌های هیدروژن برای برهمکنش با جایگاه‌های اتصالی موجود در سطح جاذب دانسته‌اند (10). خانی و همکارانش نیز با بررسی جذب‌زیستی اورانیوم توسط جلبک سیستوسریا اندیکا گزارش کردند بهینه جذب‌زیستی اورانیوم در 4 pH است؛ به‌گونه‌ای‌که در این جلبک قبل و بعد از تیمار با یون‌های کلسیم، میزان ظرفیت جذب اورانیوم، از pH 2 تا 4 افزایش یافته است؛ اما با افزایش pH از 4 تا 8 با کاهش روبه‌رو شده است (1). محققان رابطه بین pH و علت افزایش یا کاهش ظرفیت جذب اورانیوم را اینگونه تحلیل می‌کنند که در مقادیر پایین pH، غلظت بالای هیدروژن با یون‌های اورانیوم برای جایگاه‌های اتصال رقابت می‌کند و جذب اورانیوم (VI) کاهش می‌یابد. به‌طور متقابل، همزمان با افزایش مقدار pH، سطح جاذب با از دست دادن پروتون، بار منفی پیدا می‌کند و همزمان میزان جذب افزایش می‌یابد. همچنین در pH‌های بالاتر، کمپلکس‌های اورانیل مانند (UO₂)₃(OH)₅⁺، (UO₂)₂(OH)₂²⁺ و UO₂(OH)⁺ تشکیل می‌شوند که به کاهش جذب اورانیوم منجر می‌شوند (12, 20-22).

در بررسی میزان جذب‌زیستی اورانیوم توسط زیست‌توده سیتروباکتری فروندی تیمارشده با اتوکلاو همچنین مشخص شد غلظت اولیه اورانیوم پارامتر مؤثر بعدی در عمل جذب‌زیستی توسط این جاذب است. در بسیاری از تحقیقات انجام‌شده نیز به خوبی نشان داده شده است درصد حذف و ظرفیت جذب تعادل، از غلظت‌های متفاوت اورانیوم تأثیر می‌گیرد؛ زیرا با توجه به در دسترس بودن جایگاه‌های جذب، باید میان جایگاه‌های جذب در دسترس و برداشت فلزات سنگین و رادیونوکلئیدها تناسب برقرار باشد (23). با این حال، مشخص شد پارامترهای دما و غلظت اولیه جاذب از لحاظ آماری ( > p-value05/0) بر جذب‌زیستی اورانیوم توسط زیست‌توده سیتروباکتر فروندی تأثیری ندارند. با توجه به اینکه ویژگی‌های جذب‌زیستی می‌توانند بین جنس‌های میکروبی و حتی سویه‌های جهش‌یافته یک سویه نیز متفاوت باشند، نتایج به‌دست‌آمده کاملاً با اختصاصی‌بودن شرایط جذب برای هر سویه همخوانی دارند (21, 24)؛ اما در برخی موارد و بررسی‌های انجام‌شده، دما و غلظت اولیه جاذب نیز بر ظرفیت و کارایی جذب مؤثرند. صولت و همکاران در سال 2015 گزارش کردند در جذب‌زیستی اورانیوم توسط زیست‌توده آسپرژیلوس نایجر، در غلظت 3/0 گرم وزن خشک زیست‌توده در 100 میلی‌لیتر، بیشترین درصد حذف (43/98 درصد) دیده می‌شود؛ درحالی‌که با افزایش غلظت زیست‌توده به بیش از این مقدار، میزان برداشت اورانیوم تغییری نمی‌کند؛ این در حالی است که میزان ظرفیت جذب‌زیستی، با افزایش غلظت زیست‌توده کاهش یافته است (10). گزارش‌های کمی از تأثیر دما بر جذب وجود دارند؛ اما به‌صورت کلی به نظر می‌رسد تأثیر دما بر جذب بیشتر محدود به بازه 20 تا 35 درجه سانتی‌گراد باشد. در برخی موارد گزارش شده است درجه حرارت‌های بالاتر نیز با افزایش سطح فعالیت و انرژی جنبشی محلول سبب افزایش جذب شده است؛ اما احتمال آسیب فیزیکی به جاذب‌زیستی در دماهای بالا بسیار بدیهی است (20).

با توجه به نتایج بررسی باکتری سیتروباکتر فروندی تیمارشده در جذب زیستی یون اورانیوم، پارامترهای غلظت اولیه اورانیوم و pH در فرایند جذب تأثیر داشته‌اند. در نهایت، نتایج پیش‌بینی کردند باکتری سیتروباکتر فروندی تیمارشده در شرایط بهینه پیشنهادشده توسط نرم‌افزار دیزاین اکسپرت (84/19 گرم بر لیتر زیست‌توده، دمای 92/28 درجه سانتی‌گراد و 89/2pH ) قادر به حذف تقریباً 99/99 درصد اورانیوم از محیط آلوده به 71/53 میلی‌گرم بر لیتر اورانیوم است که نشان‌دهندة پتانسیل ارزشمند باکتری سیتروباکتر فروندی تیمارشده در کاربردهای زیست پالایی اورانیوم از پساب‌های آلوده است.

[1]- Biological Oxygen Demand: BOD

[2]- Chemical Oxygen Demand: COD

[3]- Citrobacter freundii

[4]- Response surface methodology

[5]- Design Expert

[6]- Central Composite Design

[vii]- Gad

[viii]- Das

[ix]- Acidithiobacillus ferroxidans ZT-94

[x]- Galun

[xi]- Penicillium digitatum

[xii]- McGahren

[xiii]- Cystoseira indica

[xiv]- Aspergillus niger