ارزیابی تنوع ژنتیکی جمعیت‌های گز پرشاخه (Tamarix ramosissima Ledeb.) در استان اصفهان با استفاده از نشانگر مولکولی CDDP

مقدمه

سردۀ Tamarix که در تیرۀ گز (Tamaricaceae) از راستۀ میخک (Caryophyllales) قرار گرفته است (APG IV, 2016)، یکی از دشوارترین سرده‌های درختی نهاندانگان به لحاظ تاکسونومیکی است. تفکیک و تمایز گونه‌های این سرده با استفاده از صفات رویشی امکان‌‌پذیر نیست؛ علاوه‌‌بر این دورگه‌‌سازی بین گونه‌های این سرده و به دنبال آن نفوذ (introgression) ازجمله دلایلی است که رده‌‌بندی این جنس را با مشکل مواجه کرده است (Ijbari et al., 2014; Mayonde et al., 2015).

گونه‌های این سرده به خشکی هوا و شوری سازگارند. وجود غده‌های نمکی در برگ‌های این گیاهان و استخراج املاح از خاک و دفع آن از برگ‌ها باعث شده است این گیاهان قادر باشند در خاک‌هایی با غلظت نمک زیاد (از 650 تا 36000 ppm) رشد کنند و بردبار باشند (Arianmanesh et al., 2015 Vonlanthen et al. 2010;)؛ به طوری که گونه‌‌های این گیاه، طی سازش با تنش‌های محیطی مختلف مانند شوری و نوسان‌‌های رطوبتی، بسیار تغییرپذیر (plastic) و قادر به تحمل طیف وسیعی از تغییرات اکولوژیکی مناطقی با آب و هوای خشک و نیمه‌خشک با دسترسی به آب متغیر در طول سال هستند. انتخاب این چنین گونه‌ها و ژنوتیپ‌های بردبار، برای کمک به احیای مناطق حاشیه‌ای و امکان بازسازی محیط‌های تحت تأثیر سیلاب‌های آب شیرین و شور ناشی از تغییرات آب و هوایی، بسیار حائز اهمیت است؛ همچنین گیاهان گز آبیاری‌‌شده با فاضلاب در خاک‌های کشت‌‌ناپذیر رشد می‌‌کنند و در جایگاه منبع جدیدی برای تولید انرژی استفاده می‌‌شوند (Terzoli et al., 2014).

تعداد گونه‌‌های گزارش‌‌شدۀ جنس Tamarix در ایران در منابع گیاه‌‌شناسی مختلف، متفاوت است؛ به نحوی که 39 گونه در کتاب جنگل‌ها، درختان و درختچه‌های ایران (Sabeti, 2008)، 35 گونه در فلورا ایرانیکا (Schiman-Czeika, 1964; Sheidai et al., 2019)، 27 گونه در فرهنگ نام‌‌های گیاهان ایران (Mozaffarian, 1998) و 22 گونه در فلور ایران (Assadi, 1988) بیان شده است.

کاشت گونه‌های گز نقش مهمی در جلوگیری از جنگل‌زدایی و گسترش مناطق خشک و همین‌‌طور ایجاد بادشکن برای تثبیت و جنگل‌کاری تپه‌های شنی در ایران دارد. این گیاه از خواص دارویی مهمی برخوردار است (Rahman et al., 2011) که به استفاده از تانن استخراج‌‌شده از گیاه (Cheng et al., 2021) در جایگاه قابض و مان قندی (Takavar & Mohammadi, 2008) اشاره می‌‌شود. 

تاکنون تنوع ژنتیکی گونۀ T. ramosissima در ایران مطالعه نشده است؛ همچنین اطلاعات دقیق بسیار کمی وجود دارد دربارۀ تاکسونومی، ساختار ژنتیکی و ژنتیک جمعیت گونه‌های گزی که در کشور ایران می‌رویند (Gaskin & Kazmer, 2009; Ijbari et al., 2014; Arianmanesh, et al., 2015; Sheidai et al., 2019).

ساختار ژنتیکی جمعیت برای درک مقدمات، بررسی انتخاب قبل از انتشار، پیش‌بینی استقرار و ارزیابی عوامل و مخاطرات محیطی پس از انتشار در کاربردهای کنترل زیستی سنتی استفاده می‌شود. در جمعیت‌های طبیعی، جریان ژنی، چندشکلی‌‌‌های (پلی‌مورفیسم) جدیدی را ایجاد می‌کند و اندازۀ جمعیت مؤثر محلی را افزایش می‌دهد؛ درنتیجه با رانش ژنتیکی تصادفی مخالفت و ترکیب‌های ژنی جدیدی تولید می‌کند که انتخاب ممکن است به‌‌طور بالقوه روی آنها عمل کند (Mayonde et al., 2019). مطالعه و شناخت تنوع ژنتیکی، زمینه را برای اصلاح‌‌کنندگان گیاه به‌‌منظور ایجاد واریته‌هایی با صفات خاص مانند بهبود کیفیت و تحمل تنش‌های زنده و غیر زیستی تسهیل می‌کند؛ به همین دلیل پژوهش‌های متعددی دربارۀ تنوع ژنتیکی گونه‌های گز (Gaskin & Kazmer, 2009; Vonlanthen et al., 2010; Terzoli et al., 2014; Mayonde et al., 2019; Sheidai et al., 2019; Ghavampour et al., 2020 ) و شیوه‌های استخراج و خالص‌سازی DNA این گیاه (Cheng et al., 2021) انجام شده است.

اندازه‌‌گیری سطح تنوع ژنتیکی درون و بین جمعیت‌‌ها، نخستین مرحلۀ مهم در ارزیابی پویایی ژنتیکی یک گونه است. در سال‌‌های اخیر به فنون مولکولی مبتنی‌‌بر نواحی محافظت‌‌شدۀ ژن ازجمله نشانگر CDDP (Conserved DNA Derived Polymorphism) بیشتر توجه شده است. این نشانگر ژن‌‌هایی را هدف قرار می‌‌دهد که به‌‌طور مستقیم در پاسخ گیاه به تنش‌‌های زنده و غیر زنده درگیر هستند؛ همین‌‌طور به‌‌آسانی، نشانگرهایی کاربردی فراهم می‌‌کند که به فنوتیپ گیاه وابسته هستند (Ghavampour et al., 2020).

نشانگر CDDP، نشانگری غالب است که در آن با استفاده از نواحی بسیار حفاظت‌‌شدۀ پروتئین‌‌ها و طراحی پرایمرهایی براساس این نواحی اقدام به تکثیر  DNAمی‌‌کنند. این نشانگر با آنکه به‌‌طور معمول دارای توالی یکسان یا بسیار مشابه است، تفاوت توزیع آنها در سراسر ژنوم، چندشکلی‌های زیادی را با اندازه‌های مختلف قابل اندازه‌گیری تولید می‌کند. این تکنیک براساس تک‌‌پرایمرهای بلند با دمای اتصال زیاد طراحی شده است که باعث افزایش تکرارپذیری آن می‌شود (Collard & Mckill, 2009).

استفاده از نشانگر CDDPبرای توصیف منابع ژنتیکی، ارزیابی تنوع ژنتیکی و ساختار و شناسایی ارقام در گونه‌های مختلف ازجمله سیب‌زمینی  Poczai et al, 2011))، گل داوودی ((Li et al., 2013، گل صدتومانی (Wang et al., 2014)، گندم (Hamidi et al., 2014)، نخود (Hajibarat et al., 2015 ) و درخت سپستان (Latifi et al., 2018) مؤفقیت‌آمیز بوده است.

گونه‌های گز در استان اصفهان پراکنش چشمگیری دارند و اغلب در نواحی خشک و بیابانی استقرار یافته‌اند؛ ازجمله در شرق اصفهان که با خشکسالی‌های متوالی روبه‌‌رو بوده است؛ همچنین در برخی نقاط نبکاها را تشکیل داده‌اند. گز پرشاخه (Tamarix ramosissima Ledeb. ) بیشترین پراکنش را در بین سایر گونه‌های گز در استان اصفهان دارد (Ghavampour et al., 2020) و یکی از گونه‌های هدف برای ایجاد پوشش گیاهی در استان در نظر گرفته شده است؛ بنابراین این پژوهش با هدف نخستین بررسی تنوع ژنتیکی در جمعیت‌های گز پرشاخه (گونه‌ای که بیشترین سطح پوشش گیاهی از گونه‌های گز را در منطقۀ اصفهان دارد) انجام شد.

روش‌‌شناسی پژوهش

مواد گیاهی

با توجه به نقاط پراکندگی گز پرشاخه در فلور ایران (Assadi, 1988) و مراجعه به نقاط مختلف، در اردیبهشت و خردادماه سال 1397 نسبت به جمع‌آوری جمعیت‌های گز پرشاخه در شهرستان‌های مختلف استان اصفهان اقدام شد. درمجموع، 55 جمعیت از این گونه در 15 شهرستان استان شامل شهرستان‌های اردستان، اصفهان، نجف‌‌آباد، تیران، فلاورجان، حبیب‌‌آباد، زرین‌‌شهر، مبارکه، چادگان، شاهین‌‌شهر، گلپایگان، آران و بیدگل، فولادشهر، شهرضا و دهاقان شناسایی و از هر جمعیت یک فرد به شرح جدول 1 جمع‌آوری شد؛ سپس توسط کارشناسان گیاه‌‌شناسی مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی اصفهان و دانشگاه صنعتی اصفهان با استفاده از منابع معتبر علمی شامل فلور ایران (Assadi, 1988) و فلورا ایرانیکا - تیرۀ گز (Schiman-Czeika, 1964) شناسایی و تنوع ژنتیکی آنها ارزیابی شد.

جدول 1- فهرست نمونه‌های جمع‌‌آوری‌‌شده از جمعیت‌های گز پرشاخه در استان اصفهان. نمونه‌‌های هرباریومی در هرباریوم مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی اصفهان نگهداری می‌‌شود.

Table 1 - List of collected samples from the Tamarix ramosissima populations in Isfahan province. The herbarium samples are kept in the Herbarium of the Isfahan Agricultural Research and Education Center (SFAHAN).

استخراج ژنوم

استخراج DNA ژنومی با استفاده از روش (Vroh) Bi et al.  (1996) با کمی تغییرات از برگ گیاهان انجام شد. کمیت و کیفیت DNA‌های استخراج‌‌شده با استفاده از جذب در طول موج 260 نانومتر در دستگاه اسپکتوفتومتر (Shimadzu, UV-2550) و ژل آگارز 8/0 درصد بررسی شد. نمونه‌‌های DNA استخراج‌‌شده تا زمان استفاده در واکنش PCR در دمای 20- درجۀ سانتی‌‌گراد قرار داده شد. در این پژوهش از 10 آغازگر CDDP (Collard & Mckill, 2009) (شرکت Metabion International) برای بررسی تنوع ژنتیکی درون و بین جمعیت‌‌های مطالعه‌‌شده استفاده شد (جدول 2). واکنش زنجیره‌‌ای پلیمراز (PCR) با حجم نهایی 10 میکرولیتر شامل پنج میکرولیتر مسترمیکس (1x) (شرکت Ampliqon)، 2/3 میکرولیتر آب دیونیزه، 8/0 میکرولیتر آغازگر (10x) و یک میکرولیتر DNA ژنومی با غلظت 50-25 نانوگرم با استفاده از دستگاه ترموسایکلر (Bio Rad) به شرح زیر صورت گرفت:

مرحلۀ واسرشت‌‌سازی اولیه برای جداسازی و تک‌رشته‌ای‌‌شدن DNA الگو به مدت چهار دقیقه در دمای 94 درجۀ سانتی‌‌گراد و سپس تعداد 35 سیکل شامل مرحلۀ واسرشت‌‌سازی با دمای 94 درجۀ سانتی‌‌گراد برای یک دقیقه، مرحلۀ اتصال آغازگر با دمای 50 درجۀ سانتی‌‌گراد برای یک دقیقه، مرحلۀ بسط آغازگر با دمای 72 درجۀ سانتی‌‌گراد برای دو دقیقه و درنهایت مرحلۀ بسط نهایی آغازگر با دمای 72 درجۀ سانتی‌‌گراد برای پنج دقیقه.

محصولات واکنش PCR با استفاده از الکتروفورز روی ژل آگارز 5/1 درصد با دستگاه ژل‌‌داک (Bio Rad, Hind II) شناسایی شد.

جدول 2- اطلاعات مربوط به آغازگرهای استفاده‌‌شده در بررسی تنوع ژنتیکی جمعیت‌‌های گونۀ گز پرشاخه

Table 2 - Information about the primers used in the study of genetic diversity of Tamarix ramosissima populations.

تجزیه و تحلیل داده‌‌های مولکولی

در این پژوهش از 10 آغازگر نشانگر CDDP (Conserved DNA Derived Polymorphism) برای بررسی تنوع ژنتیکی جمعیت‌های گز پرشاخه استفاده شد. آغازگرهای CDDP به‌‌صورت 1 (حضورداشتن نوار) و صفر (حضورنداشتن نوار) نمره‌‌دهی شد. برای تجزیه و تحلیل داده‌ها از نرم‌‌افزارهای NTSYS-pc (ver. 2.1) (Rohlf, 1998)، GenAlex ver. 6.5 (Peakall & Smouse, 2006) و PowerMarker (ver. 3.25) (Liu & Muse, 2005) استفاده شد. میانگین محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) با استفاده از نرم‌‌افزار PowerMarker (Liu & Muse, 2005) براساس رابطۀ (1) به دست آمد.

در این رابطه، f_i برابر با فراوانی آلل i ام است (Botstein et al., 1980).

شاخص نشانگر (MI) برای کلیۀ آغازگرها نیز طبق رابطۀ (2) محاسبه شد.

در این رابطه، PIC محتوای اطلاعات چندشکلی، N تعداد نوارهای چند‌شکلی و  βدرصد چندشکلی برای هر آغازگر است.

برای انجام آنالیز خوشه‌ای (و ترسیم دندروگرام)، آزمون منتل برای ضرایب تشابه جاکارد، دایس (Dice) و SM (Simple Matching) مبتنی‌‌بر روش UPGMA با استفاده از نرم‌افزار NTSYS-pc (ver. 2.1) (Rohlf, 1998) انجام شد و براساس نتایج به‌‌دست‌‌آمده ضریب SM دارای بیشترین میزان همبستگی (9674/0r=) بود؛ ولی از ضریب تشابه جاکارد برای رسم استفاده شد. به‌‌منظور استخراج بیشتر اطلاعات از داده‌‌های حاصل، تجزیه به مختصات اصلی (PCoA) در جایگاه روش مکمل آنالیز خوشه‌ای توسط نرم‌افزار GenAlex ver. 6.5 (Peakall & Smouse, 2006) انجام شد.

آنالیز واریانس مولکولی (AMOVA) برای مطالعۀ تنوع ژنتیکی و میزان چندشکلی بین و درون جمعیت‌‌ها با استفاده از نرم‌افزار GenAlex ver. 6.5 (Peakall & Smouse, 2006) انجام شد؛ همچنین تجزیۀ تنوع ژنتیکی درون جمعیت‌های گز پرشاخه با استفاده از نرم‌افزار GenAlex ver. 6.5 (Peakall & Smouse, 2006) صورت گرفت. در این ارزیابی تعداد آلل‌های مشاهده‌‌شده (Na)، تعداد آلل‌های مؤثر (Ne)، شاخص تنوع ژنتیکی نی (Nei) (H) و شاخص شانون (I) با استفاده از نرم‌‌افزار GenAlex ver. 6.5 (Peakall & Smouse, 2006) برای هریک از جمعیت‌ها محاسبه شد.

یافته‌های پژوهش

در این پژوهش از نشانگر CDDP برای بررسی تنوع ژنتیکی 55 جمعیت گز پرشاخه استفاده شد. با استفاده از 10 آغازگر درمجموع 124 باند تولید شد که از این تعداد 102 باند (168/80) به‌‌صورت چندشکلی (پلی‌‌مورف) بود. آغازگر WRKY-F1 با تولید 16 باند، مکان‌‌های ژنی بیشتری را نسبت به سایر آغازگرها شناسایی کرد و آغازگر WRKY-R3 با تولید هشت باند، کمترین تعداد نوار را ایجاد کرد. کمترین و بیشترین میزان چندشکلی به ترتیب مربوط به آغازگرهای WRKY-R3 و MADS-4 با پنج باند (50/62 درصد، 45/45 درصد) و ABP1-1 با 15 باند (100 درصد) بود. به‌‌طور متوسط هر آغازگر 85/7 درصد باند چندشکلی ایجاد کرد. میانگین محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) به میزان 308/0 محاسبه شد که بیشترین میزان آن مربوط به آغازگر MADS-2 با مقدار 455/0 و کمترین آن مربوط به آغازگر KNOX-2 با مقدار 0975/0 بود. میانگین شاخص نشانگر برای هر آغازگر 865/3 و بیشترین و کمترین میزان آن به ترتیب مربوط به آغازگر ABP1-1 (664/6) و KNOX-2 (56/1) بود (جدول 3). نتایج داده‌‌های آزمون منتل در نرم‌‌افزار GenAlex نیز حاکی از میزان تفاوت ژنتیکی و فاصلۀ ژنی و فاصلۀ جغرافیایی بین جمعیت‌‌های گز پرشاخه بود؛ به نحوی که ارتباط زیادی بین فاصلۀ ژنی و فاصلۀ جغرافیایی در سطح پنج درصد معنی‌‌داری (P<0.05) به دست نیامد (شکل‌های 1 و 2).

دندروگرام حاصل از بررسی تنوع ژنتیکی در 55 جمعیت ‌‌گونۀ Tamarix ramosissima در استان اصفهان در سطح تشابه 40 درصد، حاکی از این بود که افراد گونۀ گز پرشاخه در دو خوشۀ اصلی تقسیم‌‌بندی شد (شکل 3، I و II). خوشۀ دوم (II) متشکل از 14 فرد بود که اگرچه تشابه کاملی نداشتند، دربرابر افراد خوشۀ دوم به‌‌طور کامل مجزا شده بودند. خوشۀ اول (I) مشتمل بر سه زیرخوشه بود که دو زیرخوشۀ آن همگن‌تر و با افراد به‌‌طور تقریبی مشابه تشکیل شده بود (IA)؛ به نحوی که در یک زیرخوشه از 14 فرد حاضر، 10 فرد تشابه صددرصدی داشتند (IAd). در زیرخوشۀ دیگر این خوشه، 17 فرد حضور داشتند که 11 فرد آنها در دو گروه پنج و شش‌‌تایی تشابه صددرصدی داشتند (IAf). افراد با تشابه صددرصد با حروف IC نشان داده شده‌اند. زیرخوشۀ سوم (IB) هم از تعدادی افراد نه‌‌چندان مشابه تشکیل شده بود (شکل 3، خوشه‌ها و زیرخوشه‌ها با علامت پیکان رنگی و حروف مشخص شده است). همان‌‌گونه که از نمودار شکل 3 استنتاج می‌شود، ارتباطی بین فاصلۀ ژنی و فاصلۀ جغرافیایی وجود ندارد و جمعیت‌های با پراکنش جغرافیایی متفاوت در کنار هم جمع شده‌اند. 

جدول 3- نتایج تکثیر حاصل از 10 آغازگر CDDP در نمونه‌‌های جمعیتی گونۀ Tamarix ramosissima

Table 3 - Results of amplification obtained from 10 CDDP primers in the population samples of the Tamarix ramosissima.

شکل 1- نتایج آزمون منتل در نرم‌‌افزار GenAlex به‌‌منظور بررسی ارتباط بین فاصلۀ ژنی و فاصلۀ جغرافیایی بین جمعیت‌های گز پرشاخه. همان‌‌گونه که از ضریب و شیب خط استنباط می‌شود، ارتباط بسیار کمی بین فاصلۀ ژنی و فاصلۀ جغرافیایی وجود دارد.

Figure 1 - Results of Mantel's test in GenAlex software to examine the relationship between genetic distance and geographic distance among the populations of Tamarix ramosissima. As inferred from the coefficient and the slope of the line, there is a very weak correlation between genetic distance and geographic distance.

شکل 2- نتایج آنالیز تفاوت ژنتیکی بین جمعیت‌‌های گز پرشاخه

Figure 2 - Results of the genetic differentiation analysis among the populations of Tamarix ramosissima.

شکل 3- دندروگرام حاصل از نرم‌افزار NTSYS و ضریب تشابه Jacard و روش UPGMA در جمعیت‌‌هایی ازگونۀ Tamarix ramosissima

Figure 3 - Dendrogram generated using NTSYS software, Jaccard similarity coefficient, and the UPGMA method in populations of the Tamarix ramosissima.

نتایج آنالیز واریانس نشان داد درمجموع، سهم تنوع درون جمعیت‌ها (100 درصد) از تنوع بین جمعیت‌ها (صفر درصد) بیشتر است (جدول 4).

برای بررسی دقیق‌‌تر ارتباط بین و درون جمعیت‌‌ها از روش تجزیه به مختصات اصلی (PCoA) استفاده شد (شکل 4). محورهای (مؤلفه‌های) اول و دوم به ترتیب 75/36 و 05/55 درصد واریانس کل را توجیه کردند. براساس نتایج، محورهای اصلی اول، دوم و سوم درمجموع 17/69 درصد کل تنوع را توجیه می‌کنند. همان‌‌گونه که از نتایج آنالیز مؤلفۀ اصلی استنتاج می‌‌شود، گروه‌بندی بین جمعیت‌ها منطبق با آنالیز خوشه‌‌ای است؛ بدین نحو که جمعیت‌ها به دو خوشۀ اصلی (I و II) تقسیم و یکی از خوشه‌ها به سه زیرخوشه (IA و IB) گروه‌‌بندی شده است (شکل 4). در این نمودار نیز ارتباطی بین فاصلۀ ژنتیکی و فاصلۀ جغرافیایی و نتایج آنالیز ژنتیکی مشاهده نمی‌شود. ‌

شاخص‌‌های تنوع ژنتیکی در جمعیت‌‌های بررسی‌‌شده نیز به دست آمد. بیشترین تعداد آلل‌‌های مشاهده (Na) در جمعیت اصفهان (Es) با 272/1 و کمترین مقدار آن در جمعیت شهرضا (Sh) با 072/0 بود. آلل‌‌های مؤثر (Ne)، یعنی آلل‌‌هایی که فراوانی برابری دارند و دارای توزیع خوبی هستند، در جمعیت اصفهان (Es) با 230/1 بیشترین مقدار بود. میزان تنوع در جمعیت اصفهان (Es) با شاخص شانون (I) و شاخص نی (He) برابر با 167/0He= و250/0I= بیش از سایر جمعیت‌‌ها بود. این جمعیت دارای تنوع‌‌پذیری و همچنین میزان پراکندگی بیشتری نسبت به سایر جمعیت‌‌ها بود (جدول 5).

جدول 4- آنالیز واریانس مولکولی (AMOVA) داده‌های حاصل از نشانگر مولکولی CDDP مربوط به جمعیت‌‌هایی ازگونۀ  Tamarix ramosissima

Table 4 - Molecular Analysis of Variance (AMOVA) of data obtained from the CDDP molecular marker related to populations of the Tamarix ramosissima.

شکل 4- نمودار PCoA براساس تجزیه به مختصات اصلی حاصل از نرم‌‌افزار GenAlex در 55 فرد از 15 جمعیت از گونۀ Tamarix ramosissima

Figure 4 - PCoA diagram based on Principal Coordinate Analysis from GenAlex software for 55 individuals from 15 populations of the Tamarix ramosissima.

جدول 5- شاخص‌‌های تنوع ژنتیکی در جمعیت‌هایی از گونۀ Tamarix ramosissima در استان اصفهان

Table 5 - Genetic diversity indices in populations of the Tamarix ramosissima in Isfahan province.

تجزیه و تحلیل یافته‌‌ها و تفسیر آن

گونه‌ها، واحد طبقه‌‌بندی بنیادی زیست‌‌شناسی در نظر گرفته می‌شوند و شناسایی دقیق و مؤثر گونه‌ها به‌‌طور معمول قبل از هر نوع پژوهشی در حوزۀ اکولوژی، حفاظت و کشت و پرورش نیاز است. تاکسونومی سردۀ Tamarix با ابهامات زیادی روبه‌‌رو است. در واقع، یافتن شیوه‌هایی خاص برای رده‌بندی این سرده دشوار است؛ به‌‌دلیل وجود صفات تشخیصی که به‌‌طور انحصاری در زمان گلدهی یافت می‌شود و همچنین برای تفسیر گمراه‌کنندۀ این صفات که اغلب در شناسایی گونه‌ها ناکام هستند. در واقع، صفاتی که در جایگاه تشخیصی برای شناسایی گونه‌ها توصیه می‌شوند، گاهی به‌‌صورت تغییراتی در یک فرد جامعه با اشکال حدواسط به نمایش گذاشته می‌شوند که شناسایی مورفولوژیکی واضح را مخدوش می‌کنند؛ بنابراین در مطالعۀ حاضر از صفات و نشانگر‌های مولکولی برای کمک به رده‌بندی یکی از گونه‌های سردۀ گز (گز پرشاخه) استفاده شد. مزیت نشانگرهای مولکولی این است که از آنها برای ارزیابی تمایز در طیف گسترده‌ای از سطوح طبقه‌بندی و پاسخگویی به پرسش‌‌های وضعیت گونه‌ها با مقایسۀ تمایز بین گونه‌ها استفاده می‌‌شود (Terzoli et al., 2014).

در مطالعۀ حاضر تنوع ژنتیکی چشمگیری درون جمعیت‌ها مشاهده شد. هرچه میزان تنوع ژنتیکی بیشتر باشد، حاکی از پویایی گونه است و فرصت سازگاری با تغییرات محیطی را فراهم می‌کند (Meng et al., 2014). تنوع ژنتیکی نقش مهمی در شناخت خاستگاه، تولید مثل و سازگاری گونه‌ها دارد. بررسی مولکولی گونه‌های گز نشان داده است که اگرچه گونه‌های مطالعه‌‌شده ازنظر ژنتیکی در محدودۀ بومی خود متمایز هستند، در ایالات متحده دورگه‌هایی را تشکیل داده‌‌اند (Gaskin & Schaal, 2002). در بین انواع روش‌های بررسی تنوع ژنتیکی، نوع نشانگرهای مولکولی و همچنین آغازگر استفاده‌‌شده در بررسی تنوع ژنتیکی از اهمیت زیادی برخوردار است (Ramzan et al., 2020). نتایج به‌‌دست‌‌آمده از به کارگیری 12 EST-SSR و پنج نشانگر SSR ژنومی برای سه گونه گز شامل T. africana، T. gallica و T. canariensis نشان داد به‌‌طور معمول EST-SSR‌ها انتقال‌‌پذیری بیشتری نسبت به SSR‌های ژنومی دارند؛ زیرا محدودیت‌های عملکردی در مناطق رونویسی‌‌شده نیز ممکن است بر جهش محل آغازگر تأثیر بگذارد؛ بنابراین تنوع کمتری مشاهده می‌‌شود (Woodhead et al., 2005). سه جفت آغازگر SSR ژنومی توسعه‌‌یافته در T. chinensis و T. ramosissima نتوانستند در T. africana تکثیر شوند؛ در حالی که قابلیت انتقال بیشتر همان نشانگرها در T. gallica و T. canariensis مشاهده شد (Terzoli et al., 2014). مطالعۀ جمعیت‌های گز پرشاخه در منطقۀ اصفهان با تأکید بر استقرار و ایجاد پوشش گیاهی در مناطق خشک و نیمه‌‌خشک بود. نتایج به‌‌دست‌‌آمده نیز تأیید کرد که نشانگر CDDP که برپایۀ ژنوم‌های سازگار با شرایط نامساعد محیطی است، نشانگری کارآمد در مطالعۀ جمعیت‌های این گونه است.

شناخت تنوع ژنتیکی در داخل و بین جمعیت‌های گز مستقر در نقاط مختلف برای کاربردهای اصلاحی و حفاظتی مفید خواهد بود. امکان اتخاذ تصمیمات حفاظتی به‌‌سرعت، براساس تنوع ژنتیکی و بدون در نظر گرفتن داده‌های اکولوژیکی وجود دارد. مطالعۀ‌‌ تنوع ژنتیکی گونه‌های گز برای نخستین‌‌بار از دلتای رودخانۀ زرد گزارش شد و نتایج آن نشانگر تنوع زیادی بود (Yao et al., 2008). Mahmood et al. (2013) نخستین کسانی بودند که تنوع ژنتیکی زیاد گونه‌های گز را در پاکستان گزارش کردند. آنها 13 گونه متحمل به نمک را با نشانگرهای تصادفی چندشکلی DNA (RAPD) تجزیه و تحلیل کردند. نتایج به‌‌دست‌‌آمده از مطالعۀ 23 ژنوتیپ گز با کمک نشانگرهای مولکولی به‌‌منظور بررسی عوامل محیطی روی گونه‌های این سرده که از سه مکان مختلف انتخاب و از 14 آغازگر اختصاصی استفاده شده بود، نشان داد سطح زیادی از واگرایی ژنتیکی درون و بین گونه‌ها وجود دارد (Abdelhamid et al, 2014).

در مطالعۀ حاضر، تنوع ژنتیکی بسیار زیادی درون جمعیت‌های هر مکان مشاهده شد. با توجه به شرایط اکولوژیک حاکم بر منطقۀ اصفهان، این میزان تنوع دور از انتظار نیست. در حقیقت، شرایط نامساعد محیطی و انزوای جغرافیایی از عواملی هستند که افراد گونه‌ها در چنین شرایطی تمایل به انباشتگی تغییرات ژنتیکی در طول دورۀ سازگاری با محیط دارند (Ramazan et al., 2020). بررسی تنوع ژنتیکی در جمعیت‌های گز در کشور پاکستان نشان داد جمعیت‌های گز روئیده در سواحل رود سند در کشور پاکستان به‌‌دلیل برخورداری از رطوبت کافی و حاصلخیزی خاک، تنوع ژنتیکی کمی دارند و جمعیت‌های مستقر در نواحی خشک و بیابانی تنوع ژنتیکی بیشتری نشان دادند (Ramzan et al., 2020).

نتایج پژوهش حاضر در جمعیت‌های گز پرشاخۀ استان اصفهان با استفاده از 10 آغازگر نشان داد از مجموع 124باند تولیدشده، 102 باند (168/80 درصد) به‌‌صورت چندشکلی بود؛ همچنین به‌‌طور متوسط هر آغازگر 85/7 درصد باند چندشکل ایجاد کرد. دامنۀ باندهای چندشکلی و درصد چندشکلی مشاهده‌‌شده در مطالعۀ حاضر مشابه یافته‌های پژوهش‌های قبلی است. در پژوهش مشابهی که از دو نوع نشانگر برای آشکارسازی تنوع ژنتیکی در بین 21 جمعیت گونه‌های گز استفاده شد، نتایج نشان داد هر دو نشانگر ISSR و SSR پدیدۀ چندشکلی نشان می‌دهند. درصد پلی‌‌مورفیسم در نشانگرهای ISSR و SSR به ترتیب 50/88 و 28/80 درصد بود (Ramzan et al., 2020).

دندروگرام به‌‌دست‌‌آمده از خوشه‌‌بندی 55 جمعیت بررسی‌‌شده نشان داد آنها در دو گروه عمده قرار دارند. گروه دوم (II) که در بخش بالایی دندروگرام مشاهده می‌‌شود (شکل 3)، 14 جمعیت از درختان گز پرشاخه را با منشأ جغرافیایی متفاوت دسته‌بندی کرده است که اگرچه تفاوت‌هایی با یکدیگر نشان می‌دهند، تفاوت آنها با سایر جمعیت‌های گز بسیار بیشتر بوده است. نتایج حاصل از نمودار PCoA (شکل 4) نیز نشانگر مجزابودن این گروه و تجمع آنها در سمت چپ نمودار است که با کادر قرمزرنگ مشخص شده است. همسان‌‌بودن نتایج آنالیز خوشه‌ای و آنالیز مؤلفۀ اصلی، حاکی از گروه‌بندی دقیق جمعیت‌های گز توسط نشانگر انتخابی است؛ علاوه‌‌بر این واقع‌‌شدن ژنوتیپ‌هایی با منشأ جغرافیایی متفاوت (برای مثال افرادی از اردستان، فلاورجان، زرین‌‌شهر و حبیب‌‌آباد) از همدیگر در یک زیرخوشه (IAF)، اگرچه نتایج خاصی را بیان نمی‌کند، بیانگر آن است که به‌‌طور احتمالی منشأ آنها واحد بوده است. دربارۀ زیرخوشۀ دیگر (IAD) نیز همین وضع صادق است؛ در حالی که تعدادی از جمعیت‌‌های با پراکنش متفاوت از شهرستان‌‌های مبارکه، زرین‌‌شهر، فلاورجان، نجف‌‌آباد، تیران و حتی اردستان در آنالیز ژنتیکی مشابه هستند و در کنار یکدیگر قرار گرفته‌‌اند.

جمعیت گروه اول (مشخص‌‌شده با رنگ بنفش و زیرخوشۀ IB) اگرچه در نمودار پراکنش (شکل 4) در مرکز پلات و همچنین در پایین دندروگرام متمرکز شده، از مجموعۀ ژنوتیپ‌هایی تشکیل شده است که نسبت به سایر ژنوتیپ‌ها شباهت کمتری به هم دارند. تفاوت ژنتیکی کم بین ژنوتیپ‌ها و قرارگرفتن آنها در یک گروه ممکن است ناشی از نزدیک‌‌بودن زمان پیدایش، مبدأ جغرافیایی یکسان، قرابت‌های ژنتیکی، خویشاوندی‌های احتمالی و داشتن اجداد مشترک باشد (Amini et al., 2008; Mahasi et al., 2009). نظر به اینکه افراد جمع‌‌شده در هرکدام از زیرخوشه‌ها، مبد‌‌أ جغرافیایی یکسانی ندارند، شاید بتوان گروه‌بندی آنها را به نزدیک‌‌بودن زمان پیدایش آنها و سرآغاز جدایی جمعیت به‌‌دلیل تشکیل زیرخوشه نسبت داد. نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد هیچ ارتباط جغرافیایی بین جمعیت‌‌های بررسی‌‌شده تصورشدنی نیست و افراد مختلف از نقاط متفاوت جغرافیایی استان اصفهان به لحاظ مطالعۀ مولکولی انجام‌‌شده، در کنار یکدیگر دسته‌بندی شده‌اند. بارزترین مثال آن، افرادی از جمعیت‌های منطقۀ اردستان در شمال استان (با حرف اختصاری A) است که در تمام خوشه‌ها و زیرخوشه‌ها خود را نشان داده‌اند. 

یکی از مهم‌ترین شاخص‌ها برای ارزیابی تنوع ژنی در بین ژنوتیپ‌ها و جمعیت‌ها، شاخص تنوع ژنی نی است. برآورد شاخص Nei نشان داد میزان تنوع ژنی بین صفر تا 167/0 متغیر بود. وجود تنوع ژنی صفر در بین جمعیت‌ها ناشی از حضور تنها یک جمعیت در آن منطقۀ جغرافیایی همچون دهاقان و شهرضا بوده است؛ همچنین در بین سه فرد جمع‌آوری‌‌شده از منطقۀ مبارکه، تنوع ژنی صفر به معنای مشابه‌‌بودن افراد است که دندروگرام نیز آنها را با تشابه صددرصد گروه‌‌بندی کرده است (شکل 3). میانگین تنوع ژنی برحسب شاخص نی در پژوهش حاضر 050/0 بود. بررسی منابع نشان داد شاخص نی برای جمعیت‌های پرتقال 11/0 تا 47/0 با میانگین تنوع ژنتیکی 34/0 گزارش شده است (Rajabi et al., 2022). این تفاوت در میانگین شاخص بین این پژوهش و مطالعات صورت‌‌گرفته روی محصولات باغی، بیشتر ناشی از تنوع صددرصدی درون جمعیت‌های گز پرشاخه است.

نتایج حاصل از تجزیۀ واریانس مولکولی بین و درون جمعیت‌ها حاصل از تجزیۀ ساختار جمعیت نشان داد سهم واریانس درون و بین جمعیت‌ها به ترتیب 100 و صفر درصد از واریانس کل بود. وجود تنوع ژنتیکی زیاد درون جمعیت‌ها علاوه‌‌بر اینکه نشان‌‌دهندۀ هتروزیگوسیتی زیاد آنها است، بیانگر ناهمگنی و اختلاف ژنتیکی زیاد افراد درون جمعیت از لحاظ مکان ژنی تکثیریافته است. به‌‌طور کلی ناهمگنی شدید درون جمعیت ممکن است به دلایل زیادی ازجمله ماهیت دگرگشنی، تلاقی مختلف بین ارقام مختلف، تعدد مکان‌های بررسی‌‌شده، موقعیت باندی و ژنوتیپی جمعیت، بزرگ‌‌بودن ژنوم و اندازۀ جمعیت باشد (Mahjoob et al., 2014). تنوع ژنتیکی در جمعیت‌ها به‌‌دلیل دخالت چندین عامل ازجمله پیوستگی، تلاقی خویشاوندی، مهاجرت و تفاوت‌های موجود در افراد تشکیل‌‌دهندۀ جمعیت‌ها ممکن است در پیچیدگی ساختار و تنوع ژنتیکی دخیل باشد (Ebrahimi, 2022). نتایج این پژوهش نشان داد وجود تنوع ژنتیکی شدید درون جمعیت‌های گز پرشاخه ممکن است نشانگر پایۀ ژنتیکی قوی آنها برای سازگاری با شرایط محیطی باشد. این نوع سازش منجر به تسهیل سازگاری کوتاه‌‌مدت به تغییرات اقلیمی می‌شود (Jump et al., 2006). از مزایای دیگر زیادبودن تنوع ژنتیکی درون جمعیت‌ها این است که امکان انتخاب والدین اصلاحی در برنامه‌های به‌نژادی گز پرشاخه برای صفات مناسب را فراهم می‌‌کند. یافته‌های پژوهش حاضر هم‌‌راستا و تأییدکنندۀ سایر مطالعات انجام‌‌شدۀ مشابه در سایر گونه‌ها برای بررسی تنوع ژنتیکی به لحاظ درصد تنوع درون و بین جمعیت‌ها است (Rajabi et al., 2022; Ebrahimi, 2022).

خلاصه و نتیجه‌‌گیری

نتایج این مطالعه نشان داد امکان استفاده از نشانگر CDDP با تولید شایان توجه باندهای چندشکلی در بررسی تنوع ژنتیکی جمعیت‌های گز پرشاخه وجود دارد. تنوع ژنتیکی بسیار زیادی درون جمعیت‌های این گونه آشکار شد که از جنبه‌های مختلف حائز اهمیت است؛ علاوه‌‌بر این بررسی شباهت جمعیت‌ها با رسم دندروگرام و محور مختصات PCoA نشان داد جمعیت‌های مطالعه‌‌شده در دو گروه اصلی دسته‌‌بندی و یکی از گروهها به دو زیرجمعیت تقسیم شده است. ژنوتیپ‌های مستقر در اصفهان بیشترین تنوع ژنتیکی را در بین جمعیت‌ها نشان داد