مطالعه تنوع جنس‌های جلبک‌های تک‌سلولی دریاچه ارومیه با تأکید بر گونه‌های جنس دونالیلا

مقدمه

جلبک‌ها ساده‌ترین موجودات دارای کلروفیل^[1] هستند که در نتیجة انجام فتوسنتز^[2]، اکسیژن تولید و آن را آزاد می‌کنند. جلبک‌ها در طبیعت در محیط‌های گوناگونی یافت می‌شوند. آب، محیطی است که بیشترین جلبک را در خود جای داده است. سطح خاک‌های مرطوب، اندام‌های هوایی درختان، سطح سنگ‌ها و صخره‌ها ازجمله محیط‌هایی هستند که جلبک‌ها توانایی زیست در آنها را دارند. برخی از جلبک‌ها می‌توانند در محیط‌های غیرمعمولی نظیر دریاچه‌های نمک، چشمه‌های آب گرم، یخچال‌های طبیعی و حتی درون بدن و بافت‌های موجودات زنده رشد کنند (1). ریز‌جلبک‌ها به‌عنوان اولین موجودات تولیدکنندة اکسیژن در سطح کره زمین، کاربرد‌های گسترده‌ای را در زندگی بشر پیدا کرده‌اند. این نوع از جلبک‌ها علاوه بر اینکه غنی از انواع پروتئین‌ها و قند‌ها هستند، حاوی ترکیباتی‌اند که از نظر درمانی بسیار حائز اهمیت‌اند. تولید انواع ویتامین‌ها، اسید‌های چرب غیراشباع و ترکیباتی با خواص دارویی توسط گونه‌های مختلف ریز‌جلبک‌ها سبب توسعه کشت و خالص‌سازی این نوع از جلبک‌ها شده است (2)؛ بنابراین، شناسایی جنس و گونه جلبک‌ها اولین قدم در کاربردی‌کردن استفاده از این موجودات و کشت آنها بوده است و با شناسایی و بررسی فیزیولوژیک آنها به‌صورت دقیق، می‌توان سیستم‌های کشت، محیط‌های کشت و ارزش غذایی آنها را بررسی کرد و جنس و گونه مفید به‌‌منظور استفاده در آبزی‌پروری را خالص‌سازی کرد. جلبک تک‌سلولی تاژکدار دونالیلا^[3] یکی از جنس‌های مهم از شاخه جلبک‌های سبز است که به اشکال مختلف بیضی شکل، تخم‌مرغی، کروی، گلابی شکل یا مخروطی دیده می‌شود. در شرایط حداکثر، مانند تنش اسمزی سلول‌های این نوع از جلبک، غالباً کروی‌شکل می‌شود؛ اما پس از چند لحظه به شکل عادی خود برمی‌گردد (3 و 4). سلول‌های دونالیلا متقارن، شعاعی، دوطرفه یا اندکی متقارن هستند. سلول‌ها فاقد دیواره سلولی هستند؛ اما یک پوشش سلولی موسیلاژی گلیکوکالیکسی سلول‌ها را احاطه می‌کند که با ضخامت مختلف در سلول‌های پیرتر مشاهده می‌شود. این پوشش سلولی را می‌توان در میکروگراف^[4] الکترونی دید؛ اما توسط میکروسکوپ^[5] نوری دیده نمی‌شود. سلول‌های متحرک، دوتاژکی هستند. تاژک‌ها در انتهای قدامی (جلویی) سلول قرار گرفته‌اند. طول تاژک بین گونه‌های مختلف متفاوت است. معمولاً یک پاپیلا^[6] در انتهای تاژکداران، به‌خصوص سلول‌های جوان مشاهده می‌شود. کلروپلاست بزرگ خلفی (پشتی) بیشتر حجم سلول را اشغال کرده است. کلروپلاست به اشکال متفاوت فنجانی شکل، بشقابی یا زنگوله‌ای شکل بوده و شامل یک پیرنوئید^[7] در قسمت ضخیم پایه‌ای در همه گونه‌ها به‌جز بعضی گونه‌های آب شیرین است. کلروپلاست ممکن است در بعضی گونه‌ها در ناحیه قدامی به چندین بخش تقسیم شده باشد. تیلاکوئیدها^[8] به‌طور غیرعادی انباشته شده‌اند و جفت تیلاکوئیدها معمولاً در محل ورود به پیرنوئید دیده می‌شوند؛ اما هرگز درون پیرنوئید وارد نمی‌شوند. درجه انباشتگی تیلاکوئید‌ها با توجه به شدت نور و میزان شوری متفاوت است. پیرنوئید معمولاً با یک آمیلوسفر^[9] احاطه شده که از دانه‌های نشاسته ساخته شده است و دانه‌های کوچک‌تر نشاسته ممکن است به‌صورت آزاد در استرومای کلروپلاست به‌خصوص در سلول‌های پیرتر یافت شوند. در بیشتر گونه‌ها یک استیگمای واحد مشاهده می‌شود که در یک سوی انتهای قدامی لوب کلروپلاست قرار گرفته است (5 و 6).

جلبک‌های سبز - آبی به‌صورت تک‌سلولی یا رشته‌ای هستند که گونه‌های تک‌سلولی نیز اغلب تشکیل کلنی می‌دهند. این گروه از جلبک‌ها علاوه بر کلروفیل a دارای رنگ آبی خاصی به نام فیکوسیانین هستند؛ البته رنگ قرمز فیکواریترین^[10] در برخی از گونه‌ها دیده می‌شود. در جلبک‌های رشته‌ای مواد ژله‌ای به شکل لوله است و سلول‌ها در امتداد یکدیگر ازطریق پلاسمودیوم به یکدیگر متصل‌اند. این جلبک‌ها قدیمی‌ترین جانداران فوتواتوتروف^[11] به شمار می‌روند که در سراسر جهان پراکنده‌اند و در محل‌هایی که امکان زندگی برای سایر گیاهان وجود ندارد، نظیر چشمه‌های آب گرم، یخچال‌های طبیعی، تخته‌سنگ‌ها و حتی دیوار منازل دیده می‌شوند. بیشتر جلبک‌های سبز-آبی ساکن آبهای شیرین می‌باشند و با این حال در آبهای لب‌شور نیز دیده می‌شوند. این جلبک‌ها از مهم‌ترین تولیدکنندگان مواد آلی به شمار می‌روند و در استخرهای پرورش ماهی برای شکوفایی آن از کوددهی استفاده می‌کنند (7).

دیاتومه‌ها^[12] گروه بزرگی از ریزجلبک‌های یوکاریوتی‌اند که در محیط‌های آب شیرین، شور و خاک یافت می‌شوند. این جانداران از لحاظ تقارن کفه‌هایشان ممکن است دارای تقارن شعاعی، دوطرفه یا فاقد تقارن باشند. بعضی از دیاتومه‌ها در یک یا هر دو کفه دارای شکاف^[13] هستند که با ترشح موسیلاژ آن را قادر به حرکت می‌کند. دیاتومه‌ها به‌عنوان تولیدات اولیه اقیانوس‌ها و نیز به‌علت تثبیت سطوح درخور توجه کربن دی‌اکسید و تولید اکسیژن اهمیت دارند. از لحاظ تجاری به‌عنوان غذا در پرورش آبزیان نقش دارند و نیز به‌عنوان منابع مخصوص روغن‌ها و سوخت‌ها از آنها استفاده می‌شود (8). این جلبک‌ها به‌دلیل داشتن منبع عظیمی از ویتامین‌ها و پروتئین‌ها قدرت زیادی در جذب عناصر سنگین دارند. این جلبک‌ها قادرند حتی در زمانی که حیات ندارند، به جذب فلزات سنگین ادامه دهند. به‌دلیل حساسیت بالای دیاتومه‌ها به آلودگی، اسیدیته و شوری، جزء شاخص‌های مهم زیستی محسوب می‌شوند و برای سنجش کیفیت آب می‌توان از آنها استفاده کرد. در دریاچه‌های الیگوتروف گرم، ممکن است همزیستی بین باکتری‌های تثبیت‌کنندة نیتروژن، سیانوباکتری‌ها و دیاتومه‌ها دیده شود. در این نواحی تثبیت نیتروژن توسط این همزیست‌ها، مقدار چشمگیری از نیتروژن را به اکوسیستم وارد می‌کند. دیاتومه‌های دریاچه‌ای متناسب با شرایط محیطی مانند نور، دما و تراکم املاحی مانند نیترات و فسفات رشد متفاوتی دارند. در فصل پاییز و بهار، زمانی که مواد غذایی کاهش نیافته و شدت نور و طول روز برای فتوسنتز آنها مناسب است، به وفور در قسمت سطحی آب مشاهده می‌شوند؛ درحالی‌که با کاهش مواد غذایی، به‌صورت کلنی‌هایی در کف دریاچه‌ها ته‌نشین می‌شوند (9 و 10).

دریاچه ارومیه با مختصات جغرافیایی 37 درجه تا 5/38 درجه عرض شمالی و 45 تا 46 درجه طول شرقی، بزرگ‌ترین پهنه آبی واقع در شمال غربی ایران است. میانگین مساحت این دریاچه 5000 کیلومتر مربع برآورد شده و از نظر تولید مواد اولیه جزء دریاچه‌های الیگوتروف است. میانگین شوری آب این دریاچه در سال‌های پرآبی در حدود 150 گرم در لیتر بود که هم‌اکنون به بیش از 300 گرم در لیتر (حد اشباع) رسیده است (11). به‌علت افزایش شوری آب، جمعیت آرتمیا^[14] کاهش یافته است و بخشی از کاهش جمعیت این موجودات، به‌علت کاهش جمعیت جلبک‌های تک‌سلولی دونالیلا در دریاچه است. شوری بالا عامل ایجاد استرس و تولید بتاکارتن در این نوع از جلبک‌ها است که باعث مشاهده رنگ قرمز در برخی از نقاط دریاچه می‌شود (12). تحقیقات پیش از خشکسالی در دریاچه ارومیه، جنس‌ها و گونه‌های مختلفی از جلبک‌های تک‌سلولی را در این دریاچه گزارش داده است؛ جنس‌های مختلفی از رده‌های مختلف مانند کلروفیسه، دیاتومه‌ها و سیانوفیسه‌ها^[15] مشاهده شد که در این بین جنس دونالیلا متعلق به رده کلروفیسه به‌صورت غالب مشاهده شده است.

مواد و روش‌ها

نمونه‌برداری از جلبک‌ها: در این تحقیق، نمونه‌برداری با استفاده از روش مستقیم و با کمک توری پلانکتون‌گیری انجام شد. نمونه‌برداری از آب دریاچه طی چهار فصل متوالی و در ماه آخر هر فصل انجام گرفت. به این ترتیب در هر فصل نمونه‌برداری در هر ایستگاه از کل ستون آب، 10 لیتر توسط ظروف پلی‌اتیلنی برداشت شد. نمونه‌برداری از پل میانگذر شهید کلانتری از 4 ایستگاه انجام گرفت. همچنین، نمونه‌برداری در منطقه حیدر‌آباد دریاچه ارومیه به‌دلیل کاهش شدید سطح آب در بخش جنوبی دریاچه به سختی انجام گرفت. میزان شوری آب منطقه مطالعه‌شده، با دستگاه شوری‌سنج (Refractometer model ATAGO) و میزان pH با دستگاه pH-meter model HANA تعیین شد. در شکل 1 ایستگاه‌های جمع‌آوری نمونه در منطقه مدنظر مشخص شده است.

بررسی تراکم سلولی جلبک‌ها: پس از انتقال نمونه‌های آب حاوی جلبک درون ظروف پلی‌اتیلنی تاریک و دمای بالاتر از 4 درجه سانتی‌گراد به آزمایشگاه، نمونه‌های آب هر ایستگاه جداگانه، پس از جداکردن اجرام خارجی توسط فیلتر 100 میکرونی معمولی، با استفاده از میکروسکوپ نوری بررسی شدند. در بررسی اولیه هیچ‌گونه تراکم سلولی مشاهده نشد؛ به همین منظور، مقدار 5 لیتر از نمونه‌های آب هر ایستگاه سانتریفیوژ شد. به‌منظور انجام سانتریفیوژ، از دستگاه سانتریفیوژ مدل Sigma-8k با دور بالا (4000 گرادیان) و حجم 400 میلی‌لیتری استفاده شد. در هر مرحله از سانتریفیوژ، آب سطحی دور ریخته شد و نمونه آب جدید روی نمونه قبلی اضافه شد تا حجم 5 لیتر کامل شود. درنهایت، آب و رسوبات ته ظروف از حجم کل 5 میلی­لیتر، به حجم 50 میلی­لیتر رسانده و با استفاده از میکروسکوپ نوری بررسی شد. به‌منظور شمارش ریز‌جلبک‌ها از لام هماسیتومتر^[16] استفاده شد (13). بدین منظور، یک قطره از نمونه آب بررسی‌شده که کاملاً مخلوط شده و همگن است، با پیپت پاستور از بالای لامل و یک قطره از پایین لامل روی لام قرار گرفت تا با خاصیت موئینگی بین لام و لامل نفوذ کند. سپس لام زیر میکروسکوپ بررسی شد.

شکل 1- عکس هوایی از دریاچه ارومیه و ایستگاه‌های نمونه‌برداری: 1) بخش شمالی دریاچه ارومیه 2) تفرجگاه باری 3) روبه‌روی کوه زنبیل 4) ابتدای جاده شهید کلانتری در سمت شمال 5) انتهای جاده شهید کلانتری در سمت شمال 6) گمیچی 7) آق گنبد 8) انتهای جاده شهید کلانتری در سمت جنوب 9) ابتدای جاده شهید کلانتری در سمت جنوب 10) اسکله عسگرآباد 11) بندر گلمانخانه

محیط کشت جلبک‌ها: نمونه‌های آب مربوط به هر ایستگاه به‌طور جداگانه، در دو شوری 30 و 100 گرم در لیتر در ارلن‌های 250 میلی‌لیتری توسط محیط کشت مخصوص جلبک‌های تک‌سلولی^[17]، تحت جریان ملایم هوادهی و نور ممتد فلورسنت با شدت نور 100 کاندلا^[18] کشت داده شدند (4 و 14). مقداری از آب هر ایستگاه به‌منظور تکرار کشت در یخچال نگهداری شد. از محیط کشت walne تغییریافته برای کشت تمامی جلبک‌های تک‌سلولی شامل رده دیاتومه‌ها و کلروفیسه استفاده شد (15).

این محیط کشت حاوی مواد ویتامینی و مواد معدنی است. ترکیبات طبق دستورالعمل تهیه و اندازه‌گیری شدند و به یک لیتر آب دوبار تقطیر افزوده شدند. سپس در دمای 122 درجه سانتی‌گراد و فشار 1 بار به مدت 15 دقیقه در دستگاه اتوکلاو استریل شد. از این محیط کشت به مقدار 10 میلی‌لیتر در حجم یک لیتر از محلول کشت جلبک استفاده شد (8). پس از گذشت حدود 10 روز، با سبزشدن رنگ آب موجود در هر ارلن شکوفایی جلبکی مشاهده شد. با مشاهده شکوفایی جلبکی، نمونه جلبک‌های کشت‌شده مربوط به هر ایستگاه با استفاده از لام و لامل معمولی زیر میکروسکوپ نوری (ZEISS) بررسی شد. اندازه هر جلبک با استفاده از عدسی مدرج، اندازه‌گیری و با استفاده از دوربین (Nikon P90) متصل به میکروسکوپ نوری عکس‌برداری شد. از لوگول برای تثبیت و رنگ‌آمیزی جلبک‌ها استفاده شد. مورفولوژی جلبک‌ها و اندازه آنها برای شناسایی اولیه آنها استفاده شد (16، 17، 18 و 19).

خالص‌سازی و تهیه استوک فعال از جلبک: در این تحقیق به‌منظور خالص‌‌سازی جلبک‌ها از دو روش مستقیم با استفاده از میکروسکوپ معکوس و کشت استریک استفاده شد. برای شناسایی اولیه نمونه‌های خالص از خصوصیات ریخت‌شناسی و ریخت‌سنجی، شامل اندازه سلول، شکل سلول و شکل کلروپلاست استفاده شد (20). با توجه به شباهت‌ ریخت‌شناسی گونه‌های مختلف جنس دونالیلا و تغییر مورفولوژی و رفتار فیزیولوژیکی این گونه‌ها در شرایط مختلف محیطی، شناسایی دقیق گونه‌ها با استفاده از روش‌های ریخت‌شناسی امکان‌پذیر نبوده است و این کار با استفاده از روش مولکولی انجام شد.

خالص‌سازی با استفاده از میکروسکوپ اینورت^[19]: به محض مشاهده شکوفایی جلبکی و قبل از اینکه جلبک‌ها به شکوفایی کامل برسند، چند قطره از نمونه جلبکی کشت‌شده از هر ایستگاه در پتری‌دیش شیشه‌ای حاوی آب استریل با شوری یکسان با نمونه کشت‌شده ریخته شد و زیر میکروسکوپ اینورت توسط پیپت پاستوری که قبلاً سر آن استریل و باریک شده بود، جداسازی و به محیط کشت مایع در حجم پایین حدود 20 میلی‌لیتر انتقال داده شد.

برای کشت جلبک‌ها در این مرحله از محیط کشت مخصوص هر نمونه جلبکی استفاده شد. بدین ترتیب، برای کشت گونه‌های مختلف جنس دونالیلا از محیط کشت جانسون^[20] استفاده شد. ترکیب شیمیایی این محیط کشت در جدول 1 آورده شده است (21).

جدول 1- مواد و مقادیر لازم به‌منظور تهیه محیط کشت جانسون

بدین ترتیب، 10 میلی‌لیتر از محلول‌های ذخیره آهن و عناصر کمیاب به همراه سایر اجزا به 980 میلی‌لیتر آب مقطر، افزوده و پس از تهیه، pH محیط به 5/7 رسانده شد. به‌منظورکشت دیاتومه‌ها از محیط کشت DM و برای کشت سیانوباکتری‌ها از محیط کشت CG₁₀ استفاده شد (20). بعد از حدود 10 روز، با مشاهده سبزشدن نمونه‌ها دوباره زیر میکروسکوپ اینورت مراحل خالص‌سازی تکرار شد. جداسازی هر جلبک زیر میکروسکوپ اینورت چندین‌بار تکرار شد؛ زیرا در این روش احتمال ورود جلبک‌های ناخواسته علاوه بر جلبک مدنظر زیاد است. به‌منظور خالص‌سازی نهایی، نمونه‌های جلبکی به محیط کشت جامد (آگار) انتقال‌ یافتند. هر کلنی ظاهر‌شده روی آگار نشان‌دهندة یک جلبک خالص است. در این مطالعه در زمان ایزوله‌سازی یک جنس خاص سعی شد دیگر جنس‌های جلبک‌های تک‌سلولی از محیط حذف شوند تا کشت و بررسی این جنس یا احتمالا گونه دقیق‌تر انجام شود.

خالص‌سازی توسط کشت استریک: برای کشت استریک به محیط کشت جامد یا آگار نیاز است. برای تهیه محیط کشت جامد به هر لیتر محیط کشت مایع 12 تا 15 گرم در لیتر آگار اضافه شد که پس از اتوکلاو استفاده شد. پس از خارج‌کردن محیط کشت جامد از اتوکلاو، وقتی دمای محلول کاهش یافت به هر لیتر محیط کشت طبق فرمول، ویتامین (B300-B12) اضافه شد و در کنار شعله به درون پلیت‌های پلاستیکی انتقال‌داده شد. نمونه جلبکی هر ایستگاه توسط آنس استریل در کنار شعله به‌صورت زیگزاگ به روی محیط آگار منتقل شد. درب پلیت‌ها توسط پارافیلم پوشانده شدند تا ضمن ممانعت از تبخیر آب محیط کشت از ورود اجرام ناخواسته به داخل محیط کشت جلوگیری کند. پلیت‌ها در انکوباتور با دمای 23 درجه سانتی‌گراد، در معرض نور ممتد فلورسنت به شدت 50 کاندلا قرار گرفتند که این دما و شدت نور برای فتوسنتز، رشد و تکثیر جلبک‌ها ضروری است. پس از حدود 2 هفته کلنی‌های مجزایی از هر جلبک روی آگار مشاهده شدند. کلنی‌هایی که به اندازه کافی رشد کرده و بزرگ شده بودند و فاصله زیادی با کلنی‌های اطراف خود داشتند، انتخاب و به محیط کشت آگار جدید منتقل شدند. این کار چند بار تکرار شد تا خلوص بیشتری حاصل شود. در مرحله بعد با انتقال به محیط کشت مایع و تهیه حجم‌های مدنظر استوک فعال جلبک مدنظر تهیه شد. در شکل 2 تصویری از کلنی‌های تشکیل‌شده روی آگار مشاهده می‌شود.

شکل 2- کلنی‌های تشکیل‌شده روی آگار. کلنی‌های منفرد با شکل کاملاً منتظم نشان‌دهندة موفقیت در ایزوله‌سازی یک گونه خالص هستند.

مطالعه مولکولی نمونه‌ها: شناسایی مولکولی گونه‌های مختلف دونالیلا با استفاده از ژن 18srDNA و توالی ITS صورت گرفت. استخراج DNA از کلنی‌های جداشده و خالص به روش CTAB انجام شد. کیفیت و کمیت محصول توسط اسپکتروفتومتری در طول موج‌های 260 و 280 نانومتر بررسی شدند (22). برای تکثیر ژن 18srDNA و ناحیه ITS به‌ترتیب جدول ذیل اقدام شد (23).

واکنشگر‌های واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و غلظت‌های استفاده‌شده برای تکثیر ژن 18srDNA و تکثیر ناحیه ITS در جدول 3 بیان شده‌اند. هر واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در حجم نهایی 25 میکرولیتر انجام شد.

جدول 2- خصوصیات آغازگر‌ها

جدول 3- واکنشگر‌های واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و مقادیر استفاده‌شده

چرخه دمایی به‌کاررفته برای تکثیر ژن 18srDNA شامل 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه به‌منظور واسرشت اولیه، 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه به‌منظور واسرشت نهایی، 52 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه به‌منظور اتصال آغازگر، 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 2 دقیقه و 20 ثانیه به‌منظور تولید رشته جدید و 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 4 دقیقه به‌منظور گسترش نهایی بود که در این شرایط، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز برای هر نمونه در 33 چرخه تکرار شد. محصول نهایی PCR با استفاده از تکنیک الکتروفورز (24) روی ژل آگارز 5/1 درصد آشکارسازی و بررسی شد.

اما برای تکثیر ناحیه ITS از جفت آغازگر‌های AB استفاده شد. چرخه دمایی به‌کاررفته برای تکثیر ناحیه ITS شامل 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه به‌منظور واسرشت اولیه، 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه به‌منظور واسرشت نهایی، 57 درجه سانتی‌گراد به مدت 50 ثانیه به‌منظور اتصال آغازگر، 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه به‌منظور تولید رشته جدید و 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه به‌منظور گسترش نهایی رشته جدید در 35 چرخه بود. محصول PCR با استفاده از ژل آگارز 5/1 درصد و با کمک تکنیک الکتروفورز آشکار‌سازی و بررسی شد. به­منظور تعیین توالی و بررسی دقیق­تر ناحیه ITS، بخشی از محصول PCR به شرکت سیناکلون - ایران ارسال شد؛ درنهایت، نتایج به‌دست‌آمده از تعیین توالی با توالی‌های ITS موجود در پایگاه داده‌های ژنی GenBank تطبیق داده شدند.

برش آنزیمی آندونوکلئاز: محصول PCR با آنزیم آندونوکلئاز Tag1 برش داده شد. بدین منظور، براساس دستورالعمل شرکت سازنده، برش توالی مدنظر، انجام و محصول برش آنزیمی روی ژل آگارز 2 درصد بررسی شد.

نتایج.

بررسی نمونه‌های جداشده از ایستگاه‌های مختلف دریاچه ارومیه به شناسایی جنس‌هایی از رده کلروفیسه، باسیلاریوفیسه و سیانوفیسه منجر شد. به‌دلیل بالابودن شدید شوری و تراکم بسیار پایین جلبک‌های تک‌سلولی در آب دریاچه ارومیه، بررسی فراوانی کمی برای هیچ رده و جنسی در این مطالعه انجام نشد.

.گونه‌های شناسایی‌شده از جنس دونالیلا در بخش .شمالی دریاچه و منطقه باری (ایستگاه 1 و 2): بین نمونه‌های جدا‌شده از ایستگاه 1 و 2، نمونه‌هایی با شکل مورفولوژیکی استوانه‌ای، لوله‌ای و بیضی دیده شدند. طول سلول‌های جلبکی 16 تا 20 میکرومتر و عرض آنها 4 تا 6 میکرومتر اندازه‌گیری شد. طول تاژک تقریباً برابر با طول سلول بود. استیگمای کوچک و نسبتاً طویلی در انتهای قدامی سلول مشاهده شد (نمونه D). در نمونه E، سلول بزرگ‌تر، از لحاظ شکل سلولی به‌صورت بیضی شکل یا گلابی شکل با تقارن شعاعی بود. طول سلول10 تا20 میکرومتر، عرض سلول 7 تا 12 میکرومتر است. طول تاژک تقریباً برابر با طول سلول است. کلروپلاست فنجانی شکل با پیرنوئید بزرگ است که به‌خوبی تشخیص داده می‌شود. این نمونه Dunaliella salina در نظر گرفته شد. سلول کوچک‌تر با یک کلروپلاست فنجانی شکل، یک استیگما در قسمت رأسی سلول و دو تاژک مساوی قابل تشخیص بود. سلول‌ها با تقارن شعاعی و استیگمای واحد و همیشه سبز هستند که این نمونه Dunaliella tertiulecta در نظر گرفته شد. در نمونه F، سلول‌ها کشیده با انتهای گرد و تقارن شعاعی‌اند که اغلب سبز رنگ هستند و از لحاظ اندازه سلولی، 5 تا 18 میکرومتر طول و 3 تا 13 میکرومتر عرض داشتند. اندازه طول تاژک 2-5/1 برابر طول سلول بود. استیگمای کوچک قرمز رنگی مشاهده شد که به‌صورت مجزا در پروتوپلاسم قرار داشت. شکل استیگما در این گونه، کلید اصلی شناسایی مورفولوژیکی است. با توجه به خصوصیات بالا، گونه ذکرشده را Dunaliella primulecta (25) می‌توان در نظر گرفت. مراحل کار و تعدادی از نمونه‌های جلبکی ایزوله‌شده از ایستگاه‌های نمونه‌برداری در شکل 3 آورده شده‌اند.

.منطقه تفکیکی اطراف کوه زنبیل (ایستگاه 3): نمونه‌های C، F و D (شکل 4) را می‌توان مربوط به گونه Dunaliella salina دانست. نمونه D در شوری ppt 250 کشت داده شده که رنگ نارنجی سلول‌ها و شکل کروی آنها به‌علت افزایش تولید بتاکارتن در اثر تنش شوری است. نمونه E (شکل 4)، نمونه مشابه با نمونه‌های جمع‌آوری‌شده از ایستگاه 1 و 2 است که این گونه را نیز می‌توان Dunaliella primulecta در نظر گرفت (25).

شکل 3- جنس دونالیلا متعلق به رده کلروفیسه جدا‌شده از ایستگاه 1 و 2

شکل 4- جنس دونالیلا متعلق به رده کلروفیسه جدا‌شده از ایستگاه 3

ایستگاه شهید کلانتری و گمیچی (ایستگاه 4، 5، 6، 8 و 9): نمونه‌های C و E (شکل 5) از لحاظ شکل سلولی به‌صورت بیضی شکل، گلابی شکل تا کروی (به‌خصوص سلول‌های قرمز) دیده می‌شوند. طول سلول 5 تا 29 میکرومتر (به‌صورت متوسط 9/10 تا 9/16میکرومتر) و عرض سلول 8/3 تا 20/3 میکرومتر (به‌صورت متوسط 9/7 تا 2/13 میکرومتر) است. طول تاژک تقریباً با طول سلول برابر است. کلروپلاست فنجانی شکل با لوب‌های جانبی توسعه‌یافته است که در بعضی نمونه‌ها تا پایه تاژک کشیده شده است. پیرنوئید بزرگ، محوری و پایه‌ای است که به‌خوبی تشخیص داده می‌شود. این گونه با ویژگی‌های بالا، Dunaliella salina در نظر گرفته شد. نمونه D (شکل 5) دارای سلول­های همیشه سبز است که در میانه­های طولی سلول، کمی گسترده شده و در انتهای قدامی و خلفی سلول، قطر آن کمتر شده است. از لحاظ اندازه سلولی، سلول‌ها 24 تا 28 میکرومتر طول و 12 میکرومتر عرض دارند. طول تاژک 2-3/1 برابر طول سلول است. کلروپلاست جامی شکل حاوی پیرنوئید مرکزی است. با توجه به ویژگی‌های مورفولوژیکی، گونه بالا را می‌توان Dunaliella ruineniana در نظر گرفت. نمونه F (شکل 5)، نمونه‌ای با اندازه سلولی 6 تا 15 میکرومتر طول و 2 تا 4 میکرومتر عرض با تقارن شعاعی است. استیگما در این سلول‌ها دیده نمی‌شود. طول تاژک تقریباً 75/0 برابر طول سلول است. با توجه به خصوصیات ریخت‌شناسی، این گونه Dunaliella acidophila در نظرگرفته شد (25).

نمونه A (شکل 6) گونه Dunaliella salina است که در شوری ppt 200 کشت داده شده است. نمونه E (شکل 6) مربوط به زیرگونه‌ای از Dunaliella salina است. نمونه F (شکل 6) از لحاظ مورفولوژی، شکل سلول بیضی یا کروی با تقارن شعاعی، به‌صورت عمده در بخش پایه‌ای سلول گرد و در بخش قدامی به‌صورت باریک شده است. از لحاظ اندازه سلولی 9 تا 16 میکرومتر طول (متوسط ‌‌12 میکرومتر) و 4 تا 10 میکرومتر عرض (متوسط ‌‌7 میکرومتر) دارد. طول تاژک تقریباً 3/1 برابر طول سلول است. کلروپلاست به شکل فنجانی بوده است و پیرنوئید به‌صورت محوری و در پایه قرار دارد. با توجه به مشخصات بالا، این گونه Dunaliella parva تشخیص داده شد (25).

شکل 5- نمونه جلبکی جداشده از ایستگاه‌های نمونه‌برداری 4، 5، 6، 8، 9

شکل 6- جنس دونالیلا متعلق به رده کلروفیسه جدا‌شده از ایستگاه 4، 5، 6، 8 و 9

منطقه تفکیکی آق گل (ایستگاه 7): نمونه C (شکل 7) با کلیدهای مورفولوژیکی شناسایی گونه Dunaliella salina مطابقت دارد (20). نمونه D (شکل 7) را می‌توان جزء گونه Dunaliella bardawil دانست. نمونه E (شکل 7) مربوط به گونه Dunaliella ruineniana است. این گونه در آب منطقه میانگذر شهید کلانتری نیز مشاهده شد. نمونه F (شکل 7) با توجه به شباهت‌های مورفولوژیکی، جزء گونه Dunaliella tertiolecta است (20).

شکل 7- جنس دونالیلا متعلق به رده کلروفیسه جدا‌شده از ایستگاه 7

.منطقه تفکیکی ساحلی روستای حیدرآباد (ایستگاه 10): نمونه‌های C و F (شکل 8) با توجه به ویژگی‌های ریخت‌شناسی، گونه Dunaliella bardawil است (20). همچنین، این گونه در بعضی از ایستگاه‌ها، ازجمله ایستگاه میانگذر شهید کلانتری شناسایی شده است. نمونه‌های D و E (شکل 8)، گونه Dunaliella salina تشخیص داده شدند (20).

شکل 8- جنس دونالیلا متعلق به رده کلروفیسه جدا‌شده از ایستگاه 10

منطقه تفکیکی بندر گلمانخانه (ایستگاه 11): نمونه D (شکل 9) Dunaliella salina است که در شوری ppt 250 کشت داده شده است. سلول‌ها به‌علت تجمع رنگیزه بتاکارتن بزرگ‌تر شده‌اند و به‌دلیل افزایش وزن سلول، حرکت آن نیز به‌شدت کاهش یافته است (20). نمونه‌های C، E و F (شکل 9) به‌دلیل مشخص‌بودن کامل استیگما و جایگاه پایه‌ای پیرنوئید، گونه Dunaliella tertiolecta تشخیص داده شدند (20).

.جنس‌های شناسایی‌شده از شاخه Bacillariophyceae: نمونه A (شکل 10) دارای سلول‌هایی اغلب منفرد و گاهی موسیلاژشده هستند. دیاتومه سنتریک بوده است و اساساً در اکوسیستم‌هایی با آب شیرین و لب‌شور یافت می‌شود. مرکز سطح قاب آنها نودوله یا صاف بوده است و ردیف‌های آرول‌ها از مرکز به سمت حاشیه‌های قاب بدون هیچ‌گونه شکستگی کشیده شده‌اند. در بیشتر گونه‌ها منتل مشخصی دیده نمی‌شود. با توجه به ویژگی‌های ریخت‌شناسی بالا، این گونه از جنس Cyclotella تشخیص داده شد (26).

نمونه B (شکل 10) دارای سلول‌هایی منفرد و 4 کلروپلاست است که در نمای جانبی مشخص است. در نمای جانبی قاب در قسمت مرکزی خطی استوا در دو انتها یک‌باره گرد و باریک می‌شود. از نمای بالایی قاب مستطیل شکل دیده می‌شود. شکاف راف مرکزی است و استری‌ها تک‌سری هستند. از لحاظ اندازه سلولی، 20 میکرومتر طول و 8 میکرومتر عرض دارند. گونه بالا گونه‌ای از جنس Neidium است (26).

در نمونه‌های C، D و E (شکل 10) سلول‌ها منفرد هستند و قاب این دیاتومه‌ها جهت عرضی و طولی متقارن و بیضی شکل، تار کشیده و پهن است. دو انتهای قاب گرد است. ناحیه مرکزی سلول پهن است. استری‌ها به شکل آرول‌های موازی با رأس سلول هستند و گاهی در میکروسکوپ نوری دیده نمی‌شوند. سپتای کاذب در برخی گونه‌ها وجود دارد و در برخی وجود ندارد. راف راست، نخ مانند و جانبی است. نمونه‌های بالا گونه‌هایی از جنس Navicula تشخیص داده شدند (26).

بررسی نمونه F (شکل 10) نشان داد قاب از نمای جانبی، مستطیل شکل و از نمای بالایی، بیضی شکل دیده می‌شود که در هر دو انتها گرد و متورم شده است. خط‌بندی‌های سیلیسی مشخص در عرض قاب وجود دارد. یک sternum مرکزی نازک به هر دو انتها کشیده شده است. استری‌ها بسیار ظریف‌اند و با میکروسکوپ نوری دیده نمی‌شوند. سلول‌ها معمولاً در کلنی‌های زیگ‌زاگ متصل شده‌اند؛ اما در بعضی گونه‌ها به‌صورت منفرد دیده می‌شوند. گونه بالا به‌عنوان Diatoma vulgar تشخیص داده شد (27).

شکل 9- جنس دونالیلا متعلق به رده کلروفیسه جدا‌شده از ایستگاه 11

شکل 10- جنس‌های مختلف Bacillariophyceae جدا‌شده از ایستگاه‌های مختلف دریاچه ارومیه

جنس‌های شناسایی‌شده از شاخه سیانوفیسه: نمونه A (شکل 11) جلبک سبز - آبی است که بیشتر به‌صورت رشته‌ای مستقیم مشاهده شد. معمولاً ضخامت رشته‌ها یکسان است؛ اما گاهی به سمت انتهای رشته‌ها از ضخامت کاسته می‌شود. غلاف سخت ندارند؛ اما پوشش موسیلاژی بی‌رنگ اطراف آنها را فراگرفته است. تریکوزوم‌ها تک‌ردیفی، دانه‌دانه، ایزوپلار و متامتریک (هتروسیست‌ها منفرد و در فواصل یکسان از هم قرار دارند؛ به‌طوری‌که در یک تریکوزوم بالغ 9-3 هتروسیست وجود دارد) هستند. سلول‌های گرد یا استوانه‌ای به رنگ سبز، آبی یا زیتونی کم‌رنگ هستند. هتروسیست‌ها گرد یا استوانه‌ای پهن بوده‌اند؛ اما به هر حال از سلول‌های رویشی درشت‌تر هستند (26).

نمونه‌های B و C (شکل 11) جلبک سبز - آبی رشته‌ای با رشته‌های غیرمنشعب شناور یا چسبیده هستند که اندازه آن از میکروسکوپی تا چند سانتی‌متر متغیر است. معمولاً فاقد غلاف یا پوشش است. تریکوزوم‌ها ایزوپلار و راست یا اندکی پیچ‌خورده هستند. سلول‌ها استوانه‌ای یا دیسکی شکل بوده‌اند و طول سلول‌ها کمتر از ضخامت عرض رشد کرده است. انتهای رشته‌ها باریک‌تر است و حرکت دارد. سلول‌ها سبز - آبی، صورتی یا قهوه‌ای هستند و تیلاکوئیدهای نامنظم و پیچ‌خورده دارند. انشعاب کاذب، هتروسیست یا تشکیل آکینات در این جنس وجود ندارد. تریکوزوم‌ها با جداشدن از هم به رشته‌های کوتاه و متحرک تبدیل می‌شوند. با توجه به خصوصیات ریخت‌شناسی بالا، این دو نمونه جزء گونه‌هایی از جنس Oscillatoria هستند (26).

شکل 11- جنس‌های متعلق به شاخه سیانوفیتا

نتایج بررسی‌های مولکولی گونه‌های جدا‌شده دونالیلا: نتایج PCR ژن 18srDNA با استفاده از جفت آغازگر MA باندهایی با طول 2170، 2570، 1170 و 2570 جفت‌باز برای نمونه‌های جداسازی‌شده (شکل 12 و 13) تولید کرد که به‌ترتیب با اعداد 1 تا 4 در شکل 12 مشخص شده‌اند. این نتایج نشان‌دهندة وجود تنوع گونه‌ای هستند. بدین ترتیب، باندهای مربوط به D. tertiolecta، D.salina، D. parva و D. bardawil به‌ترتیب با طول 1770، 2170، 2570 و 2570 جفت‌باز تشخیص داده می‌شوند. لازم به توضیح است پیش از این یک کلید شناسایی برای شناسایی گونه‌های جنس دونالیلا براساس برش آنزیمی و اندازه باندهای حاصل ارائه شده بود که در این تحقیق استفاده شد (23 و 28).

شکل 12- ژل الکتروفورز محصول PCR ژن 18srDNA جداشده از ایستگاه‌های 4، 5، 6، 8 و 9

شکل 13- ژل الکتروفورز محصول PCR ژن 18srDNA ایستگاه‌های 1، 2، 3، 10 و 11

برش آنزیمی: بررسی نتایج برش آنزیمی انجام‌شده با آنزیم Taq1 نشان‌دهندة حداقل چهار الگوی مختلف برش است. این برش آنزیمی در تأیید بررسی مورفولوژیک و بررسی محصول PCR نشان‌دهندة همان تنوع چهار‌گانه مشاهده‌شده در نمونه‌های جلبکی مطالعه‌شده است که در شکل 14 نشان داده شده است.

محصول PCR ناحیهITS : پس از انجام PCR، قطعه مدنظر روی ژل آگارز بررسی و کیفیت و اندازه باند تأیید شد (شکل 15). استفاده از جفت آغازگرهای AB موجب شد قطعاتی با طول حدود 750 جفت‌باز در نمونه‌های جدا‌شده تولید شوند.

شکل 14- الگوی به‌دست‌آمده از هضم نوکلئازی محصول PCR

شکل 15- محصول PCR ناحیه ITS. حروف GK نماینده ایستگاه گمچی و اطراف جاده شهید کلانتری، AARI نماینده منطقه اطراف کوه زنبیل، GOL نماینده ایستگاه آق‌گل و BARI نماینده ایستگاه نمونه‌برداری باری هستند. هر ستاره نشان‌دهندة وجود نوکلئوتید یکسان بین همه نمونه‌های مطالعه‌شده است.

نتایج حاصل از آنالیزهای بیوانفورماتیک: پس از تعیین توالی نمونه‌های جلبک دونالیلای مطالعه‌شده، توالی این نمونه‌ها با استفاده از ابزار BLAST با سایر توالی‌های موجود در پایگاه داده NCBI مقایسه شد. در این مطالعه 7 الگوی متفاوت و جدید از 11 سویه تعیین توالی شده، بررسی و مشاهده شدند. گونه Dunaliella tertiolecta با سویه استاندارد  CCAP (EF473748.1Accesion no) و سویهATCC  (EF473742.1Accesion no) در ناحیه ITS 1 همخوانی ژنوتیپی 100 درصد نشان داد (جدول 4).

جدول 4- بررسی تشابهات و همپوشانی توالی گونه‌های ایزوله‌شده با گونه‌های موجود در NCBI

بحث و نتیجه‌گیری

بررسی و شناسایی فلور جلبکی مناطق آبی هر منطقه از اهداف مهم تحقیقاتی در بیشتر کشورهای جهان است. تحقیقات انجام‌شده روی گونه‌های مختلف جنس Dunaliella نشان داده است تعدادی از گونه‌ها یا جنس‌ها قادرند در شوری زیاد به‌خوبی رشد کنند و حتی قادر به تولید مقادیر بالایی از بتاکارتن باشند (12). این بررسی‌ها همچنین نشان دادند حتی برخی گونه‌ها ازجمله D. salina قابلیت بهتری در تولید بتاکاروتن نسبت به دیگر گونه‌ها دارند. دریاچه ارومیه به‌عنوان دریاچه الیگوتروف دارای تنوع و مقدار کمتری از جلبک‌های تک‌سلولی نسبت به آب‌های اقیانوسی و آب‌های شیرین است. تنوع جنس‌ها با توجه به میزان شوری آب متفاوت است. گفتنی است شناسایی میکروارگانیسم‌ها به‌خصوص جلبک‌های تک‌سلولی با استفاده از خصوصیات مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی از دقت کافی برخوردار نیست؛ اما توسعه ابزارهای بیوتکنولوژی مدرن مانند PCR امکان شناسایی دقیق میکروارگانیسم‌ها را فراهم می‌کند (24).

مطالعه براساس خصوصیات مورفولوژیکی دونالیلاهای جداشده از 11 منطقه مختلف دریاچه ارومیه نشان‌دهندة حضور حداقل 7 گونه از جنس دونالیلا است. براساس مطالعات مورفولوژیکی گونه D. salina در تمام مناطق مطالعه‌شده از دریاچه ارومیه جداسازی شد؛ اما گونه‌های D.acidophilia و D. parva فقط در یک منطقه مطالعه‌شده (میانگذر شهید کلانتری) جداسازی و شناسایی شدند. گونه‌های بررسی‌شده در منطقه حیدرآباد D. salina و D.tertiolecta هستند. مطالعه گونه‌های دونالیلا در منطقه حیدرآباد نشان‌دهندة تنوع گونه‌ای پایین در این منطقه است که می‌تواند به‌دلیل کاهش بیش از اندازه بارندگی، پسروی شدید آب دریا در این منطقه و درنتیجه، افزایش شوری ‌باشد. گونه‌های جلبک D.bardawil، D. salina و D. tertiolecta از بندر گلمانخانه جدا‌ شده‌اند. مطالعات مورفولوژیکی نشان داد گونه‌های D. bardawill، D. salina و D. Tertiolecta از منطقه آق‌گل جدا شده‌اند. در منطقه کوه زنبیل گونه‌های D.salina و D. Primulecta جداسازی شدند. D. salina و D. primulecta گونه‌های شناسایی‌شده در منطقه باری هستند. در منطقه میانگذر شهید کلانتری 6 گونه D.salina، D.tertiolecta، D.bardawil، D. parva، D. ruineniana و D.acidophilia جداسازی و بررسی شدند. بررسی‌ها نشان دادند بیشترین تنوع ریز‌جلبک دونالیلا در اطراف میانگذر شهید کلانتری است که این تنوع را می‌توان به تغییرات محیطی از قبیل تفاوت شوری و تفاوت املاح و کانی‌های موجود در مناطق مختلف اکوسیستم دریاچه ارومیه نسبت داد. تنوع مورفولوژیکی و توانایی این میکروارگانیسم برای انطباق با تغییرات محیطی، رده‌بندی این ریز‌جلبک را امری پیچیده و گیج‌کننده کرده است؛ به‌طوری‌که شناخت و تعیین صحیح هویت گونه‌ها دشوار است (29)؛ بنابراین، برای تأیید طبقه‌بندی تاکسونومیکی، تکیه بر خصوصیات مورفولوژیکی نمی‌تواند کافی باشد. با توجه به عدم قطعیت در سیستماتیک مورفولوژیکی جنس دونالیلا و تنوع ظاهری سویه‌های شناسایی‌شده توسط محققان مختلف، تصمیم گرفته شد در کنار مطالعه صفات فنوتیپی از صفات ژنوتیپی برای ارزیابی این مشکلات استفاده شود (29). نتایج بررسی‌های اکولوژیکی نشان دادند تنوع جلبکی در این ایستگاه‌ها به‌شدت تابع شرایط اکولوژیک منطقه است؛ به‌طوری‌که تنوع جلبک‌های جدا‌شده در فصل بهار بیشتر از تنوع جلبکی در فصل تابستان است که این کاهش تنوع در فصل تابستان می‌تواند به‌علت افزایش دما و درنتیجه، افزایش شوری و تشدید خشکسالی در این فصل باشد. همچنین، نتایج بررسی مورفولوژیک و فیزیولوژیک جلبک‌های جدا‌شده و کشت‌شده در دو شوری متفاوت نشان دادند تنوع جلبکی در ایستگاه میانگذر شهید کلانتری بیشتر بود که بررسی‌های مولکولی نیز آن را تأیید کرد. در هر حال، مطالعه حاضر نشان داد تنوع زیادی از گونه‌های جلبک بالا در ایستگاه‌های دریاچه ارومیه وجود دارد که براساس مطالعات آزمایشگاهی به‌عمل‌آمده، نیازهای متفاوتی برای رشد بهینه دارند. امروزه پیشرفت‌های جدید در زمینة مطالعات مولکولی امکان مناسبی را برای پاسخگویی به بسیاری از پرسش‌ها در زمینة رده‌بندی گونه‌ها، بررسی روابط فیلوژنتیک و تکاملی گونه‌ها فراهم کرده است. اینگونه اطلاعات می‌تواند در زمینة تعیین گونه‌ها و اولویت‌بندی آنها و همچنین تعیین مناطق حفاظتی بسیار مفید باشد. استفاده از تکنیک‌های مولکولی برای فهم بهتر روابط بین سوش‌های مختلف جنس‌های این گونه از جلبک‌ها انجام گرفته است. با مطالعات همزمان ویژگی‌های مورفولوژیکی و مولکولی می‌توان به‌صورت قطعی بیان کرد حداقل چهار گونه D. salina، D. tertiolecta، D. viridis و D. bardawil و چهار سویه جدید در دریاچه ارومیه یافت می‌شوند.

[1]- Chlorophyll

[2]- Photosynthesis

[3]- Dunaliella

[4]- Micrograph

[5]- Microscope

[6]- Papilla

[7]- Pyrenoid

[8]- Thylakoids

[9]- amylosphere

[10]- Phycoerythrin

[11]- Photoautotroph

[12]- Diatoms

[13]- Raphe

[14]- Artemia

[15]- Cyanobacteria

[16]- Neubauer chamber

[17]- Walne

[18]- moles m^-2s^-1µ

[19]- Invert

[20]- Jhonson