مطالعه برخی شاخص‌های فیزیولوژیک و بیوشیمایی گیاه بامیه (Abelmoschus esculentus L.) تحت تنش شوری در حضور نانوذره کیتوزان

مقدمه

محتوای نمک زیاد می‌تواند بر روی فرایندهایی مانند فتوسنتز، متابولیسم لیپیدها و سنتز پروتئین‌ها تأثیر داشته باشد (Zayed et al., 2017). میزان نمک بالای خاک یکی از مشکلات عمده در مناطق نیمه خشک و خشک محسوب و باعث ایجاد اختلال در وضعیت تغذیه گیاهان می‌شود و رشد و بهره‌وری محصولات زراعی را کاهش می‌دهد. افزایش نمک در خاک موجب کاهش انتقال مواد مغذی از ریشه به بخش هوایی، کاهش رشد ریشه، تخریب رنگدانه‌های برگ مانند کلروفیل و کاروتنوئید می‌شود، که بر سیستم فتوسنتزی مؤثر است. گونه‌های فعال اکسیژن ROS‌ها، باعث ایجاد تنش اکسیداتیو، وبه‌ دنبال آن آسیب به پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک می‌شوند و با تولید مالون‌دی‌آلدئید اضافی باعث غیرفعال کردن آنزیم‌های پاد اکسنده، و در نهایت موجب ایجاد مرگ سلولی گیاه تحت تنش شوری می‌شوند.

در هنگام تنش شوری، گیاهان ازترکیبات غیرآنزیمی مانند فنل‌ها و فلاونوئیدها، آسکوربات، کلروفیل‌ها و کاروتنوئیدها، گلوتاتیون و آلفاتوکوفرول برای حذف ROS‌ها استفاده می‌کنند (Sheikhalipour et al., 2021). در شرایط تنش، بافت‌های گیاهی ممکن است پروتئین‌ها و کربوهیدرات‌های مؤثر در تنظیم اسمزی سلول‌های گیاهی را انباشته کنند. در بسیاری از گونه‌های گیاهی، تنش شوری می‌تواند با تغییرمحتوای رنگدانه‌های فتوسنتزی کلروفیل و کاروتنوئید، بازده فتوسنتز را تحت تأثیر قرار دهد. کاروتنوئیدهای موجود در کلروپلاست‌ها، با از بین بردن ROS‌ها، نقش مهمی در حفاظت از سیستم فتوسنتزی در برابر تنش‌های زیستی و غیر زیستی دارند. فلاونوئیدها با فعالیت پاداکسندگی با حذف ROS‌ها نقش مهمی در محافظت از تنش بازی می‌کنند (sen et al., 2020)

کیتوزان (Cs) توسط استیل‌زدایی از کیتین طبیعی که جزء ساختاری در اسکلت بیرونی سخت پوستان است، استخراج می‌شود و حاوی مولکول‌های دی- گلوکزامین و ان-استیل-دی-گلوکزامین است که در یک پلیمر خطی با پیوند بتا (4-1) قرار دارند (Zayed et al., 2017). کیتوزان به دلیل دارا بودن گروه‌های آمین و هیدروکسیل رفتار هسته دوست از خود نشان می‌دهد و در واکنش‌های مختلف شیمیایی شرکت می‌کند و درکشاورزی دامنه کاربرد وسیعی دارد. استفاده از کیتوزان در غلظت مناسب می‌تواند تأثیرات مضر تنش شوری را کاهش، و رشد و عملکرد گیاه را افزایش دهد که در مطالعات قبلی روی گیاهان گوجه فرنگی (Lycopersicon esculentum)، (Ullah et al., 2020)، برنج (Oryza sativa)، (Balusamy et al., 2022)، آفتابگردان (Helianthus annuus)، (Golkar et al., 2019) و لوبیا(Phaseolus vulgaris) ، (Sen and Mandal, 2016) گزارش شده است.

کیتوزان به عنوان محرک دفاعی گیاه شناخته شده است و در واکنش‌های دفاعی مانند تغییرات در نفوذپذیری غشا، تولید ROS‌ها، آنزیم‌های دخیل در دفاع، لیگنینه کردن و شارش یونی درگیر است، ولی به دلیل حل نشدن کیتوزان در محیط‌های آبی بسیاری از کاربردهای آن محدود شده است. راهکار‌های زیادی برای افزایش حلالیت آن استفاده شده است، ترکیبات کلات نانوکیتوزان، نسبت به ترکیبات آلی و معدنی، برای بهبود حلالیت و فعالیت زیست‌تخریبی آن مناسب هستند. نانوذرات به دلیل خواص زیست تخریب پذیری، حلالیت، نفوذپذیری بالا، عدم سمیت برای انسان و مقرون به صرفه بودن در سراسر جهان کاربردهای مختلفی دارند، از جمله اینکه برای کشاورزی و صنعت استفاده می‌شوند و بسیار عالی‌تر از مواد با اندازه بزرگ عمل می‌کنند. فعالیت بهبود یافته آن‌ها به دلیل نسبت سطح به حجم بالا، کیفیت‌های وابسته به اندازه و ویژگی نوری منحصر به فرد است. نانوذرات کیتوزان به‌عنوان یک محرک مؤثر دفاعی گیاه عمل می‌کنند و در مقایسه با کیتوزان طبیعی، تأثیر تعدیل کننده ایمنی بهتری را نشان می‌دهند (Sathiyabama and Manikandan, 2016). در مطالعات قبلی کاربرد نانوذرات کیتوزان در افزایش تحمل به شوری درگیاه ذرت (Zea mays)،(Oliveira et al., 2016) و خارمریم (Silybum marianum)، (Mosavikia et al., 2020) گزارش شده است.

گیاه بامیه به خانواده Malvaceae تعلق دارد و منشأ اصلی این گیاه گرمادوست، آفریقا است و از آنجا به خاورمیانه گسترش یافته و در آب و هوای مناطق جنوب ایران و خاک‌های شنی تا لومی متوسط با زهکشی مناسب رشد خوبی دارد. در سالهای اخیر سطح زیر کشت بامیه در شرق خوزستان افزایش پیدا کرده است. برای دستیابی به عملکرد مطلوب گیاه بامیه، آب کافی در دوره رشد آن باید فراهم شود. یکی از حساس‌ترین مراحل زندگی گیاهان زراعی، مرحله جوانه‌زنی بذر است (Eskandari and Alizadeh Amraei, 2017) که باعث ایجاد کاهش پتانسیل آب و کاهش جذب مواد مغذی می‌شود و بر رشد و عملکرد گیاه نقش نامطلوبی را ایفا می‌کند (Iqbal et al., 2020). این گیاه منبع مهم و ارزان قیمتی از کربوهیدرات‌ها، موادمعدنی، ویتامین‌ها (A، B وC)، پروتئین‌ها و اسیدهای آمینه است ((Kargar Khorrami et al., 2013. این محصول در سرتاسر جهان از لحاظ ارزش غذایی و دارویی اهمیت دارد، از روغن آن به عنوان سوخت زیستی، از موسیلاژ آن در دارو و صنعت و از برگ و جوانه‌های آن به عنوان غذا استفاده می‌شود. در ایران از این گیاه به‌عنوان غذا (خورشت بامیه) و در درمان کاهش چربی خون، سم زدایی کبد استفاده می‌شود. همچنین، به دلیل اینکه منبع غنی از فولات است برای جلوگیری از زایمان زوددرس، مصرف آن به زنان باردارتوصیه می‌شود. فیبر موجود در بامیه نیز در رفع یبوست و کاهش وزن مفید است.

درخاک‌های شور، درصد جوانه زنی، طول ریشه و ساقه، ارتفاع گیاه و میزان فتوسنتز و هدایت روزنه ای در گیاه بامیه کاهش و میزان سدیم و کلر با افزایش شوری ، افزایش پیدا می‌کند و میزان پتاسیم در برگ و ریشه کاهش می‌یابد. با افزایش میزان شوری در خاک یا آب مورد استفاه برای آبیاری، این گیاه کاهش درصد عملکرد تا 50 درصد را تجربه خواهد کرد (Salehi Salmi and Daneshvar, 2016). با افزایش روز افزون جمعیت و افزایش نیاز غذایی مردم ضروری است که کشت و کار در حداکثر اراضی ازجمله خاک‌های شور با روش‌های گوناگون اصلاحی برای تولید و یا ایجاد مقاومت بیشتر در دوره رشد گیاه توسط هورمون‌ها یا استفاده از فناوری نانو انجام شود. در مطالعه‌ی حاضر، سعی شده است که نحوه‌ی تأثیر تنش شوری از طریق مطالعه‌ی برخی شاخص‌های بیوشیمیایی و فیزیولوژیک گیاه بامیه بررسی و تأثیر نانوذرات کیتوزان بر کاهش تأثیرات منفی تنش شوری بررسی شود.

مواد و روش‌ها

در این پژوهش، بذرهای بامیه سبز رقم استانداردکلمسون بدون خار (Clemson Spineless) با شماره ثبت: GB-34265 توسط شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه شد. بذر‌ها با محلول هیپوکلریت سدیم 10 درصد (w/v) ضدعفونی و سپس کاملاً با آب مقطر شست‌وشو داده شدند. بذر‌ها به مدت 12 ساعت برای طی کردن دوره آماس در آب مقطر، و سپس به مدت 72 ساعت بر روی کاغذ صافی مرطوب در پتری‌های با قطر 15 سانتیمتر قرار داده شدند. رشد دانه رست‌ها در دمای 27 درجه سانتیگراد و در تاریکی انجام شد. پس از گذشت سه روز دانه رست‌های با شرایط یکسان به گلدان‌هایی با ارتفاعcm 19 و قطر دهانه cm 22 حاوی پرلیت در اتاق کشت، با شرایط شدت نور 150 (میکرو مول بر متر مربع بر ثانیه) ، دمای بیشینه و کمینه به ترتیب 27 و 20 درجه سانتیگراد، رطوبت60-80 درصد (Temperature Humidity Meter UNI-T A12T) ، دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی منتقل شدند. برای آبیاری از محلول هوگلند و آب مقطر استفاده شد. نانوذره کیتوزان با قطر 50 نانومتر از شرکت نانوسان مشهد (Iranian Nanomaterials Pioneers Company, Mashhad, Iran) تهیه شد (شکل1).

پس از استقرار گیاه بامیه و گذشت 21 روز در شرایط محیطی یکنواخت، زمانیکه گیاهچه به مرحله سه برگ حقیقی رسید، به طور تصادفی برای هر تیمار 4 گلدان و هر گلدان سه گیاه در نظر گرفته شد. تیمار با دو سطح 2/0 و 4/0گرم برلیتر نانوذره کیتوزان بصورت محلول پاشی در صبح اول وقت به صورت یک روز در میان انجام شد. هرگیاه با 3 میلی‌لیتر محلول نانوکیتوزان اسپری شد. 24 ساعت پس از اعمال تیمار نانوکیتوزان، تنش شوری در سطوح 75 و 150 میلی‌مولار همراه با محلول هوگلند اعمال شد. تنش شوری هر روز صبح به صورت آبیاری به گیاه داده شد و هر سه روز یکبار آبشویی با آب مقطر انجام شد. پس از گذشت 14 روز از اعمال تنش شوری، برداشت گیاهان با تفکیک گروه‌های شاهد و تیمار انجام شد.

اندازه‌گیری شاخص‌های رشدی پس از برداشت نمونه‌های گروه شاهد و تیمار، با استفاده از خط‌کش طول بخش هوایی و ریشه هرکدام از نمونه‌ها اندازه‌گیری شد. نمونه‌های ریشه و بخش هوایی، با آب مقطر شست و شو و با کاغذ صافی خشک و وزن تر آن‌ها با ترازوی دیجیتال با دقت 0001/0 اندازه گیری شد.سپس نمونه‌ها در آون با دمای 80 درجه‌ی سانتیگراد به مدت 72 ساعت قرار داده شد و اندازه‌گیری وزن خشک نمونه‌ها انجام شد.

برای اندازه‌گیری محتوای کلروفیل و کاروتنوئید، 1/0گرم بافت برگی گیاه (دومین برگ جوان) در استون هشتاد درصد (v/v) توسط هاون چینی سائیده و پس از صاف کردن، میزان جذب آن در طول موج‌های 645، 470 و 665 توسط دستگاه اسپکتروفتومتر UV/Vis (Agilent 8453,US) خوانده شد. از استون 80 درصد به‌عنوان شاهد استفاده شد. غلظت رنگیزه‌های گیاهی با اعمال حجم و وزن توسط رابطه‌های زیر محاسبه شد (Lichtenthaler,1987).

رابطه 1:

Chl.a = (12.25A_663.2 – 2.79A_646.8)

رابطه 2:

Chl.b = (21.21A_646.8 – 5.1A_663.3)

رابطه 3:

Cx+c=1000A₄₇₀-1.82C_a-85.02C_b/198

برای سنجش میزان فنل کل میزان 5/0گرم وزن خشک بخش هوایی و ریشه به همراه 10 میلی‌لیتر متانول 80 درصد (v/v) در هاون چینی سائیده و در دمای 4 درجه سانتیگراد و g10000 به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شد. به یک میلی‌لیتر از عصاره استخراجی یک میلی‌لیتر معرف فولین سیوکالتئو ( رقیق شده با 9 میلی‌لیتر آب مقطر) اضافه، و مخلوط شد. پس از 5 دقیقه 5/2 میلی‌لیتر سدیم کربنات 7 درصد اضافه و به مدت 90 دقیقه در دمای آزمایشگاه انکوبه شد. جذب نمونه‌ها در طول موج 750 نانومتر خوانده شد. منحنی استاندارد از غلظت‌های معلوم گالیک اسید برای تعیین میزان فنل کل تهیه شد. (معادله خط منحنی استاندارد Y=0.001X + 0.0031) (Marinova et al., 2005).

تعیین میزان فلاونوئید کل بر مبنای رنگ سنجی آلومینیوم با روش  Changو همکاران (2002) انجام شد. 1/0 گرم وزن خشک بخش هوایی به همراه آب دیونیزه در هاون سائیده و سپس در g5000 به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شد. به نیم میلی‌لیتر از محلول رویی، 5/1 میلی‌لیتر اتانول 95 درصد، 1/0 میلی‌لیتر آلومینیوم کلراید 10 درصد، 1/0 میلی‌لیتر پتاسیم استات 1مولار و 8/2 میلی‌لیتر آب دیونیزه اضافه شد. مخلوط حاصل به مدت 45 دقیقه در دمای آزمایشگاه (25 -27 درجه سانتیگراد) انکوبه و سپس جذب هر یک از نمونه‌ها در 415 نانومتر خوانده شد. برای تعیین محتوای فلاونوئید کل، منحنی استاندارد از غلظت‌های معلوم کوئرستین تهیه شد (معادله خط منحنی استاندارد Y=0.0158X + 0.0198).

برای اندازه‌گیری میزان آنتوسیانین، 1/0 گرم بافت خشک بخش هوایی در 10 میلی‌لیتر متانول اسیدی، حاوی 99 درصد متانول و 1 درصد اسید کلریدریک توسط هاون چینی سائیده شد. عصاره حاصل در g6000 به مدت ده دقیقه سانتریفوژ و محلول رویی به مدت 24 ساعت در دمای آزمایشگاه (25 -27 درجه سانتیگراد) در تاریکی قرار داده شد. پس از گذشت 24 ساعت جذب نمونه‌ها در طول موج 550 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. از ضریب خاموشی معادل 150 میلی‌مول بر ثانیه برای محاسبه غلظت آنتوسیانین استفاده شد (Fulcki and Francis, 1968).

برای سنجش درصد جمع‌آوری رادیکال (2, 2- دی فنیل 1- پیکریل هیدرازیل DPPH)، 1/0 گرم بافت تر بخش هوایی و ریشه با 1 میلی‌لیتر متانول در هاون چینی سائیده شد و دو میلی‌لیتر محلول متانولی  DPPH004/0 درصد (w/v) با 20 میکرولیتر از عصاره گیاهی مخلوط و جذب مخلوط پس از 15 دقیقه انکوباسیون در تاریکی و دمای اتاق در طول موج 517 نانومتر خوانده شد. برای محاسبه درصد فعالیت جاروب کنندگی عصاره‌ها از رابطه 4 استفاده شد، که در آن A_Sample جذب کنترل و A_Blank میزان جذب نوری عصاره‌ها را نشان می‌دهد (Burits and Bucar, 2000). برای مقایسه فعالیت عصاره‌ها از مفهوم IC50 استفاده شد. غلظتی از عصاره‌ها که باعث 50 درصد مهار کنندگی است به عنوان IC50 استفاده شد. در این مطالعه از پاداکسنده سنتزی بوتیل هیدروکسی آنیزول(BHA) به‌عنوان کنترل مثبت استفاده شد.

رابطه 4:

I%=[(A_Blank-A_Sample)/A_Blank]*100

برای سنجش میزان قندهای محلول از روش فنل سولفوریک اسید استفاده شد، که اساس آن هیدرولیز اسیدی قندهای محلول است و کمپلکس رنگی از ترکیب فورفورال با فنل ایجاد می‌شود. 5/0 گرم بافت تر بخش هوایی و ریشه به همراه 5 میلی‌لیتر آب دیونیزه توسط هاون چینی به خوبی سائیده و توسط کاغذ صافی صاف شد. بر روی یک میلی‌لیتر از عصاره حاصل، 5/1 میلی‌لیتر آب مقطر به همراه یک میلی‌لیتر فنل 5 درصد (w/v) اضافه شد. در مرحله‌ی پس 3 میلی‌لیتر اسید سولفوریک 98 درصد (v/v) اضافه شد. در دمای آزمایشگاه لوله‌های آزمایش به مدت یک ساعت انکوبه شدند و پس از ایجاد رنگ نهایی شدت جذب آن‌ها در طول موج 485 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر خوانده شد. منحنی استاندارد با غلظت‌های معلوم گلوکز تهیه شد (معادله خط منحنی استاندارد Y= 0.008X + 0.0180). (Dubios et al.,1956).

رسوب حاصل از بقایای بافتی حاصل از استخراج قند محلول در مخلوط دی متیل سولفوکسید/اسید کلریدریک 8 نرمال (v/v4:1) حل و در g12000 به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شد. به 5/0 میلی‌لیتر عصاره گیاهی، 5/0 میلی‌لیتر از معرف یدین(زرد رنگ) اضافه و پس از 15 دقیقه انکوباسیون، جذب در طول موج 600 نانومتر خوانده شد. برای تهیه معرف یدین-HCl، 06/0 گرم از یدور پتاسیم و003/0 گرم از ید در 100 میلی‌لیتر HCl 05/0 نرمال حل شد. برای تهیه محلول‌های استاندارد، از غلظت‌های مشخص نشاسته (صفر تا100میلی گرم بر لیتر) استفاده شد (Magne et al., 2006).

به‌منظور اندازه‌گیری میزان مالون‌دی‌آلدئید، 2/0گرم از بافت تر بخش هوایی و ریشه در 5 میلی‌لیتر تری کلرواستیک اسید 1/0 درصد (v/v) سائیده وسپس عصاره‌ها در g 5000 به‌مدت ده دقیقه سانتریفوژ شدند. به هر یک میلی‌لیتر از محلول فاز بالایی حاصل از سانتریفوژ نمونه‌ها، 5 میلی‌لیتر محلول تری کلرواستیک اسید 20 درصد و تیوباربیتوریک اسید 5/0 درصد اضافه شد. سپس در حمام آب گرم 95 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه حرارت داده شدند و پس از کاهش دما، به مدت 10 دقیقه در g5000 سانتریفوژ شدند. جذب محلول‌های حاصل، در طول موج 532 نانومترو جذب بقیه رنگیزه‌های غیراختصاصی در 600 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر خوانده و از این میزان کسر شد. برای محاسبه غلظت مالون‌دی‌آلدئید از ضریب خاموشی معادل 155 میلی‌مول بر ثانیه و رابطه 5 استفاده شد (Heath and Packer, 1968).

رابطه 5:

MDA(µmol/gFw)=[A532-A600/155]×1000

به‌منظور کاهش خطا، نمونه‌برداری برای هر تیمار در 4 تکرار و سه گیاه در هر تکرار انجام و آزمایش به صورت فاکتوریل دو عاملی بر پایه طرح کاملاً تصادفی در چهار تکرار اجرا شد. برای آنالیز داده‌های آماری از نرم‌افزارSAS 9.4 استفاده شد.

نتایج

نتایج تجزیه واریانس و برش دهی تأثیر متقابل تیمارهای شوری بر شاخص‌های رشدی گیاه بامیه در حضور نانوذره کیتوزان در جدول 1 آمده است. بررسی نتایج حاصل از تأثیر نانوذره کیتوزان در دوسطح 2/0 و 4/0 گرم بر لیتر و تنش شوری 75 و 150 میلی‌مولار نشان داد که تنش شوری 75 و 150 میلی‌مولار به ترتیب موجب کاهش 27/1 و46/1 برابری وزن تر، 2/1 و5/1 برابری وزن خشک و 18/1 و23/1 برابری طول در بخش هوایی، و نیز موجب کاهش به ترتیب 26/1 و31/1 برابری وزن تر، 16/1 و4/1 برابری وزن خشک و 33/1 و 52/1 برابری طول ریشه نسبت به شاهد شد. تیمار نانوذره کیتوزان در سطح 2/0 و 4/0 گرم برلیتر به ترتیب موجب افزایش در وزن تر(06/1 و10/1 برابر)، وزن خشک (12/1 و 22/1 برابر) و کاهش طول (1/1 و1برابر) در بخش هوایی، و افزایش 17/1 و23/1 برابری وزن تر، 21/1 و 28/1برابری وزن خشک، و کاهش 1 و 05/1 برابری طول در ریشه نسبت به شاهد شد.

جدول1: جدول تجزیه واریانس و برش دهی تأثیر متقابل تأثیر سطوح شوری بر روی شاخص‌های رشدی گیاه بامیه در حضور نانوذره کیتوزان

Table 1: Variance analysis table and cross section of the interaction effect of salinity levels on the growth traits of Okra plant in the presence of chitosan nanoparticles

ns، * و ** به‌ترتیب غیرمعنی‌دار و معنی‌دار در سطح احتمال یک و پنج درصد است.

تیمار همزمان نانوذره کیتوزان 2/0گرم برلیتر با شوری 75 و 150 میلی‌مولار به ترتیب موجب افزایش در وزن تر(09/1 و21/1 برابر)، وزن خشک (08/1 و24/1برابر) و طول (01/1 و03/1برابر) در بخش هوایی، و وزن تر (21/1 و16/1 برابر) ، وزن خشک (1/1 و2/1 برابر) و طول (1 و07/1برابر) نسبت به شوری هم سطح در ریشه شد. کاربرد نانوذره 4/0گرم برلیتر همزمان با شوری 75 و 150 موجب افزایش 19/1 و23/1 برابری وزن تر، 15/1 و23/1 برابری وزن خشک و 03/1 و07/1 برابری طول در بخش هوایی، و وزن تر (3/1 و2/1 برابری) ، وزن خشک (3/1 و3/1 برابری) و طول (08/1 و1/1 برابری ) در ریشه نسبت به شوری هم سطح شد (جدول1 و شکل2). نتایج تجزیه واریانس و برش دهی تأثیر متقابل سطوح شوری بر رنگیزه‌های فتوسنتزی گیاه بامیه در حضور نانوذره کیتوزان در جدول 2 آمده است. بررسی نتایج حاصل از تأثیر نانوذره کیتوزان در دوسطح 2/0 و 4/0 گرم برلیتر و تنش شوری 75 و 150 میلی‌مولار بر محتوای کلروفیل a، b و کاروتنوئید نشان داد که تنش شوری 75 و 150 میلی‌مولار به‌ترتیب موجب کاهش کلروفیل a (5/1و8/1 برابر)، کلروفیل b (1 و2/1 برابر) وکاروتنوئید (2/1و 6/1 برابر) شد. کاهش کلروفیل‌ها و کاروتنوئید در تنش شوری 150 میلی‌مولار نسبت به شاهد در سطح 5 درصد معنی‌دار بود. تیمار با نانوذره کیتوزان 2/0 و 4/0 گرم برلیتر افزایش 38/1 و 39/1 برابری کلروفیل a، 19/1 و 18/1 برابری کلروفیل b و 31/1 و4/1 برابری کاروتنوئید نسبت به گروه شاهد را در پی داشت.

تیمار همزمان نانوذره کیتوزان 2/0 گرم برلیتر با شوری 75 و 150میلی‌مولار به ترتیب موجب افزایش کلروفیلa (8/1 و26/2 برابر)، کلروفیلb (15/1 و32/1برابر) و کاروتنوئید (4/1 و68/1 برابر) نسبت به تیمار‌های شوری هم سطح شد. میزان افزایش در هر دو سطح شوری نسبت به شوری‌های هم سطح معنی‌دار است. تیمار نانوذره کیتوزان 4/0 گرم برلیتر در هر دو سطح شوری موجب افزایش کلروفیل  a(7/1 و68/1 برابر)، کلروفیلb  (1/1 و 13/1 برابر) و کاروتنوئید (4/1 و4/1برابر) نسبت به شوری‌های هم‌سطح شد (جدول 2 و شکل 3).

نتایج تجزیه واریانس و برش دهی تأثیرمتقابل سطوح شوری بر محتوای مالون‌دی‌آلدئید در بخش هوایی و ریشه در حضور نانوذره کیتوزان در جدول 2 آمده است. تنش شوری 75 و 150 میلی‌مولار موجب افزایش محتوای مالون‌دی‌آلدئید به ترتیب (4/1و8/1) در بخش هوایی و ( 5/1 و8/2) برابری در ریشه شد. تیمار نانوذره کیتوزان 2/0 و4/0گرم بر لیتر به ترتیب موجب کاهش 8/1و 6/1 برابری در بخش هوایی و8/2و7/1 برابری در ریشه نسبت به گروه شاهد شد. تیمار همزمان نانوذره کیتوزان 2/0گرم بر لیتر در هر دو سطح شوری در مقایسه با سطوح شوری هم سطح به ترتیب موجب کاهش 5/2 و12/4 برابری محتوای مالون‌دی‌آلدئید در ریشه و 28/2 و69/2 برابری در بخش هوایی شد. تیمار همزمان نانوذره 4/0گرم برلیتر با شوری 75 و150میلی‌مولار به ترتیب کاهش 2 و5/2 برابری محتوای مالون‌دی‌آلدئید در ریشه و 2/2 و4/2 برابری در بخش هوایی، در مقایسه با شوری‌های هم سطح را به‌دنبال داشت (جدول2 و شکل 4).

جدول تجزیه واریانس و برش‌دهی تأثیر متقابل آنتوسیانین، فلاونوئید و فنل کل در بخش هوایی و فنل کل در ریشه در جدول 3 آمده است. نتایج حاصل از بررسی محتوای فنل کل در بخش هوایی و ریشه گیاه بامیه تحت تنش شوری و تیمار نانوذرات کیتوزان نشان داد که تنش شوری75 و150 میلی‌مولار موجب افزایش محتوای فنل کل به ترتیب 1 و3/1 برابری در بخش هوایی و 2/1 و4/1 برابری در ریشه نسبت به گروه شاهد شد. کاربرد نانوذرات 2/0 و 4/0گرم برلیتر موجب افزایش محتوای فنل کل به ترتیب در بخش هوایی (11/1 و16/1 برابر) و ریشه (1/1 و3/1 برابر) در مقایسه با گروه شاهد شد. تیمار نانوذره 2/0 و4/0گرم برلیتر همزمان با شوری 75 میلی‌مولار در بخش هوایی به ترتیب 08/1 و 12/1 برابر و در ریشه 06/1 و1/1 برابر افزایش را در مقایسه با شوری هم سطح نشان داد.

تیمار نانوذره 2/0 با شوری 150 میلی‌مولار موجب کاهش 03/1 برابری در بخش هوایی و 01/1 برابری در ریشه نسبت به شوری هم سطح شد. نانوذره 4/0گرم بر لیتر با شوری150میلی‌مولار با افزایش 06/1 برابری در بخش هوایی وکاهش 1 برابری در ریشه به

شکل3: نمودار کلروفیل a (الف)، کلروفیلb  (ب) و کاروتنوئید (ج) در برگ گیاه بامیه در محلول پاشی نانوذره کیتوزان در دو غلظت 2/0 و 4/0 گرم برلیتر در حضور شوری 75 و 150 میلی مولار. مقادیر، میانگین 4 تکرار ±SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح p<0.05 با آزمون دانکن است .

Figure 3: The graph of chlorophyll a (a), b (b) and carotenoid (c) in the leaves of okra plant in the foliar application of chitosan nanoparticles in two concentrations of 0.2 and 0.4 g per liter in the presence of 75 and 150 mM salinity. Values ​​are mean of 4 replicates ±SE. The same letters indicate no significant difference at the p<0.05 level using Duncan's test.

شکل4: نمودار محتوای مالون‌دی‌آلدئید در بخش هوایی (الف) و ریشه (ب) گیاه بامیه در محلول پاشی نانوذره کیتوزان در دو غلظت 2/0 و 4/0 گرم برلیتر در حضور شوری 75 و 150 میلی‌مولار. مقادیر، میانگین 4 تکرار ±SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح p<0.05 با آزمون دانکن است .

Figure 4: The diagram of malondialdehyde in the aerial part(a) and root(b) of okra plant in chitosan nanoparticle foliar spraying at two concentrations of 0.2 and 0.4 g per liter in the presence of 75 and 150 mM salinity. Values ​​are mean of 4 replicates ±SE. The same letters indicate no significant difference at the p<0.05 level using Duncan's test.

جدول3: جدول تجزیه واریانس و برش دهی تأثیر متقابل تأثیر سطوح شوری بر پارامترهای فیزیولوژیک و بیوشیمیایی گیاه بامیه در حضور نانوذره کیتوزان

Table 3: Variance analysis and cross-section table of interaction effect of salinity levels on physiological and biochemical parameters of okra plant in the presence of chitosan nanoparticles

ns، * و ** به‌ترتیب غیرمعنی‌دار و معنی‌دار در سطح احتمال یک و پنج درصد است.

به سطح شوری 150میلی‌مولار همراه بود (جدول3 و شکل5).

نتایج حاصل از سنجش محتوای فلاونوئید کل در این تحقیق، نشان داد که میزان فلاونوئید کل در گیاهان تحت تنش نمکی با افزایش میزان شوری در مقایسه با نمونه‌های شاهد، به طور معنی‌داری افزایش یافته است. تنش شوری 75 و 150 میلی‌مولار به ترتیب موجب افزابش 45/1 و75/1 برابری میزان فلاونوئید کل در بخش هوایی شد. تیمار با نانوذرات 2/0و4/0 گرم برلیتر در بخش هوایی به ترتیب با افزایش 5/1 و7/1 برابری نسبت به نمونه شاهد همراه بود و تیمار گیاه با نانوذره کیتوزان در هر دوسطح موجب افزایش معنی‌دار در غلظت فلاونوئید کل نسبت به شاهد شد. تیمار همزمان نانوذرات2/0 و4/0گرم بر لیتر با شوری 75میلی‌مولار به ترتیب افزایش 2 و9/1 برابری را نسبت به تیمارشوری 75 میلی‌مولار نشان داد. درکاربرد شوری 150میلی‌مولار همزمان با نانوذره 2/0 و 4/0گرم برلیتر به ترتیب افزایش22/1 و24/1 برابری در مقایسه با شوری هم سطح مشاهده شد (جدول3 وشکل5).

آنالیز داده‌های آماری نشان داد که محتوای آنتوسیانین بخش هوایی با کاربرد نانوذرات کیتوزان در دو سطح 2/0 و4/0گرم برلیتر در مقایسه با نمونه شاهد به ترتیب 3/1 و5/1 برابر افزایش را نشان داد که این میزان افزایش در سطح 5 درصد معنی‌دار بود. میزان آنتوسیانین در تنش شوری 75 و 150 میلی‌مولار به ترتیب 2/ 1و4/1 برابر نسبت به گروه شاهد (شوری صفر) افزایش نشان داد. تیمار همزمان نانوذره 2/0 و 4/0گرم برلیتر با شوری 75 میلی‌مولار به ترتیب باعث افزایش 1/1 و2/1 برابری نسبت به شوری هم سطح شد و همچنین، تیمار نانوذرات با شوری 150میلی‌مولار نیز به ترتیب با افزایش 1 و3/1 برابری نسبت به شوری هم سطح همراه بود (جدول 3 و شکل5).

در بررسی درصد مهار IC50 از BHA (0004/0±98/0) به‌عنوان کنترل مثبت استفاده شد. نتایج نشان داد که تنش شوری 75 و 150 میلی‌مولار به ترتیب کاهش 15/1 و67/1 برابری در بخش هوایی و 65/1و4/4 برابری در ریشه را نسبت به شاهد نشان داد. تیمار نانوذره کیتوزان 2/0 و4/0گرم برلیتر به‌ترتیب باعث کاهش 13/1 و3/1 برابری در بخش هوایی و 41/1 و87/1 برابری در ریشه نسبت به گروه شاهد شد. تیمار همزمان نانوذره 2/0 و 4/0 گرم برلیتر با شوری 75 میلی‌مولار به ترتیب کاهش 04/1و16/1 برابری در بخش هوایی و 25/1 و45/1 برابری در ریشه را نسبت به شوری هم سطح به‌دنبال داشت. کاربرد همزمان شوری 150 میلی‌مولار با نانوذره 2/0گرم بر لیتر افزایش 12/1 برابری را در بخش هوایی و 5/1 برابری را در ریشه نسبت به شوری هم سطح نشان داد. کاربرد نانوذره کیتوزان 4/0گرم بر لیتر و شوری 150 میلی‌مولار در بخش هوایی باکاهش13/1 برابری و در ریشه با افزایش 15/1 برابری درصد مهار IC50 نسبت به شوری هم سطح همراه بود. کمترین میزانIC50  به نمونه شوری 150 میلی‌مولار همزمان با نانوذره کیتوزان 4/0گرم بر لیتر مربوط بود که در بخش هوایی و ریشه به ترتیب 27/2و 5/6 برابرکمتر نسبت به نمونه کنترل مثبت BHA، و بیشترین میزان IC50 به نمونه شاهد (شوری صفر) وپس از آن نانوذره کیتوزان 2/0گرم برلیتر در بخش هوایی و ریشه به ترتیب 36/1 و 39/2 برابر کمتر نسبت به نمونه کنترل مثبتBHA مربوط بود (جدول4 وشکل 6).

نتایج مطالعه‌ی حاضر، در مورد بررسی میزان قندهای محلول نشان داد که در تیمار شوری 75 و 150 میلی‌مولار غلظت قندهای محلول در بخش هوایی و ریشه گیاه بامیه افزایش معنی‌داری را نسبت به شاهد شوری نشان داد، میزان افزایش به‌ترتیب در بخش هوایی5/1 و8/1 برابر و ریشه 2/1 و5/1 برابر بود. تیمار نانوذره 2/0 و 4/0گرم برلیتر موجب افزایش محتوای قند محلول به ترتیب 7/1 و8/1 برابری در بخش هوایی و 62/1 و5/1 برابری در ریشه نسبت به نمونه شاهد شد. تیمار همزمان هرکدام از نانوذره 2/0 و 4/0گرم برلیتر با شوری 75 میلی‌مولار نیز به‌ترتیب موجب افزایش محتوای قند محلول در بخش هوایی(3/1 و2/1 برابر) و ریشه (4/1 و3/1 برابر) نسبت به سطح شوری 75 میلی‌مولار شد. کاربرد همزمان تیمار نانوذره 2/0 با شوری 150 میلی‌مولار به‌ترتیب در بخش هوایی موجب 12/1 و در ریشه 3/1 برابر افزایش نسبت به شوری هم سطح شد. کاربرد همزمان نانوذره 4/0 گرم بر لیتر با شوری 150 میلی‌مولارنیز در بخش هوایی کاهش یک برابری و در ریشه افزایش12/1 برابری را نسبت به تیمار شوری هم سطح نشان داد (جدول4 و شکل6).

در بررسی آنالیز داده‌های غلظت نشاسته گیاه بامیه در تیمار با نانوذرات کیتوزان (2/0و 4/0 گرم بر لیتر)، کاهش معنی‌داری در محتوای نشاسته در بخش هوایی (4/1و3/1 برابر) و ریشه (4/2و9/1 برابر) نسبت به گروه شاهد را در پی داشت.

تنش شوری 75 و 150 میلی‌مولار نیز به ترتیب باعث کاهش معنی‌دار 27/1 و 8/1 برابری محتوای نشاسته در بخش هوایی و 7/2 و6/3 برابری در ریشه نسبت به گروه شاهد شد.

شکل5: نمودار فلاونوئید (الف) و انتوسیانین (ب) در بخش هوایی و فنل کل در بخش هوایی (ج) و ریشه (د) گیاه بامیه در محلول پاشی نانوذره کیتوزان در دو غلظت 2/0 و 4/0 گرم برلیتر در حضور شوری 75 و 150 میلی‌مولار. مقادیر، میانگین 4 تکرار ±SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی‌دار در سطح p<0.05 با آزمون دانکن است .

Figure 5: The diagram of flavonoid (a) and anthocyanin (b) in aerial part and total phenol in aerial part (c) and root (d) of okra plant in chitosan nanoparticle foliar spraying at two concentrations of 0.2 and 0.4 g per liter in the presence of 75 and 150 mM salinity. Values ​​are mean of 4 replicates ±SE. The same letters indicate no significant difference at the p<0.05 level using Duncan's test.

جدول4: جدول تجزیه واریانس و برش دهی تأثیر متقابل تأثیر سطوح شوری بر پارامترهای فیزیولوژیک و بیوشیمیایی گیاه بامیه در حضور نانوذره کیتوزان

Table 4: Variance analysis and cross-section table of interaction effect of salinity levels on physiological and biochemical parameters of Okra plant in the presence of chitosan nanoparticles

ns، * و ** به‌ترتیب غیرمعنی‌داری و معنی‌داری در سطح احتمال یک و پنج درصد است.

در رابطه با محتوای نشاسته، تیمار همزمان نانوذره کیتوزان2/0 و4/0گرم برلیتر با شوری 75 میلی‌مولار به ترتیب افزایش 9/1 و1 برابری در بخش هوایی و 4/2و 8/1 برابری در ریشه نسبت به شوری هم سطح را نشان داد. کاربرد شوری 150 میلی‌مولار با هر یک از نانوذرات نیز به‌ترتیب در بخش هوایی 28/3 و 3/2 برابری و در ریشه 3/4 و 4/4 برابری افزایش غلظت نشاسته نسبت به گروه تیمار هم‌سطح را در پی داشت (جدول4 و شکل6).

بحث

تنش غیر زیستی شوری، که با سمیت یونی و تنش اسمزی نیز همراه است، باعث کمبود مواد غذایی در گیاه و بر سازوکارهای متعدد بیوشیمیایی و فیزیولوژیک دخیل در رشد و نمو گیاه تأثیرگذار است. بر طبق نتایج حاصل از این تحقیق تولید زیست توده و میزان شاخص‌های رشد در گیاه بامیه در تأثیر تنش شوری کاهش یافت که با یافته‌های پیشین در گیاه بامیه (Abelmoschus esculentus)، (Kargar Khorrami et al., 2020) و یونجه (Medicago sativa)، (Wang et al., 2009) در تطابق است. پژوهش‌های یاد شده علت اصلی کاهش میزان رشد را ایجاد اختلال در فتوسنتز و تنفس که در تولید انرژی گیاه مؤثر هستند، می‌دانند. در مطالعه‌ای که تأثیرنانوذره کیتوزان (1/0، 2/0 و3/0 درصد) را بر شاخص‌های رشد گیاه لوبیا (Phaseolus vulgaris) در شرایط تنش شوری با غلظت انتخابی 100 میلی‌مولار کلرید سدیم بررسی کرده است، مشخص شد که شوری باعث کاهش جوانه‌زنی و رشد نهال شد و تیمار با نانوذره کیتوزان در تمام سطوح شاخص‌های رشد را بهبود بخشید و بالاترین میزان افزایش رشد در تیمار 3/0 درصد مشاهده شد(et al., 2017 Zayed). نانوذرات کیتوزان نقش بالقوه‌ای را در بهبود تأثیرات منفی تنش‌های غیر زیستی به ویژه تنش شوری ایفا می‌کنند. یکی از فاکتورهای ضروری برای تعیین کارایی فتوسنتز، تعیین محتوای کلروفیل و کاروتنوئید است. در مطالعه‌ی حاضر، تأثیر نامطلوب شوری بر میزان کلروفیل برگ به وضوح مشهود بود. در مطالعه‌ای که Saha و همکاران (2010) در برگ گیاه ماش سبز ( (Vigna radiata L. تیمار شده با کلرید سدیم 50 میلی‌مولار انجام داده‌اند، دریافتند که تنش نمک باعث کاهش

تدریجی کلروفیل و کاهش شدت فلوئورسانس کلروفیل و کاهش رنگدانه‌های جانبی دیگر مانند کاروتنوئید هم دیده می‌شود، که احتمالاً این کاهش در غلظت رنگیزه‌های فتوسنتزی به فعالیت کلروفیلاز و یا اختلال در ساختار کروپلاست‌ها مربوط هست که در فرایند تخریب کلروفیل‌ها نقش دارد، که با نتایج مطالعه حاضر، همخوانی داشت. در مطالعه‌ای که Sen و همکاران (2020) درنهال‌های ماش تحت تنش شوری (2، 4 و 8 دسی زیمنس) با حضور الیستورهایی مانند نانوذرات کیتوزان و کیتوزان انجام داده اند، کاهش محتوای کلروفیل برگ با افزایش شوری را مشاهده کردند و نانوذره کیتوزان به رشد بهتر، افزایش محتوای کلروفیل و متابولیسم نهال ماش منجر شد، و نتیجه گرفتند که نانوذره کیتوزان می‌تواند بر تأثیر نامطلوب تنش نمک در نهال‌های ماش غلبه کند و به فعال شدن سازوکار‌های دفاعی آن‌ها برای محافظت بهتر در برابر تنش شوری عمل کند و با نتایج پژوهش حاضر، همخوانی داشت. در مطالعه‌ای، گل پریوش (Catharanthus roseus) که تحت تنش 150 میلی‌مولار کلرید سدیم همزمان با محلول پاشی 1 درصد نانوذره کیتوزان بود، رشد گیاه به‌طور قابل توجهی تحت شرایط تنش شوری مختل شد. با این حال، تیمار نانو ذره کیتوزان به طور قابل توجهی این تأثیر را معکوس کرد. به‌طورکلی، نانوذرات کیتوزان کاهش کلروفیل برگ را به تأخیر انداختند و با نتایج پژوهش حاضر، در تطابق بود (Hassan et al., 2021). نتایج مطالعه تأثیر سطوح مختلف شوری (0، 25، 50، 100، 150 و 300 میلی‌مولار کلرید سدیم) بر گیاه اسفرزه (Plantago ovata) نشان داد که با افزایش شوری رنگیزه‌های فتوسنتزی کاهش می‌یابند (Hatami et al.,2021).

فلاونوئیدها از طریق مسیر فنیل پروپانوئید سنتز و فنیل آلانین را به 4-کوماروئیل-CoA تبدیل می‌کنند که در نهایت وارد مسیر بیوسنتز فلاونوئید می‌شود. فلاونوئیدها متابولیت‌های ثانوی هستند و به طور گسترده در گیاهان توزیع شده‌اند. گیاهان با حفظ هموستازی بین مواد شیمیایی گیاهی مانند پلی‌فنل‌ها و ROSها با تنش شوری سازگار می‌شوند. در تنش شوری بالاتر میزان فنل‌ها و فلاونوئید بالاتر است. با افزایش تجمع پلی‌فنل‌ها، از بین بردن رادیکال‌های آزاد و کاهش پراکسیداسیون لیپیدی، موجب کاهش آسیب اکسیداتیو به گیاه می‌شود (Sakamoto and Suzuki, 2019). افزایش فنل‌ها را می‌توان به این واقعیت نسبت داد که که سنتز فنولیک‌ها نسبت به فلاونوئید‌ها پاسخ اولیه در تنش است و بیوسنتز فلاونوئیدها در مقایسه با ترکیبات فنلی که به‌عنوان پیش‌ساز برای بیوسنتز فلاونوئیدها هم هستند، مسیرهای پیچیده‌ای را دنبال می‌کند (Robbins and Bean, 2004). آنتوسیانین‌ها به‌عنوان زیرگروهی از فلاونوئیدها، حاوی پاداکسنده، ضد ویروس، ضد باکتری، ضد سرطان و ضد التهاب و بهبود خواص بینایی هستند وگیاهان آن را به‌عنوان سازوکار محافظتی در شرایط تنش شوری تولید می‌کنند. تغییرات آنتوسیانین با برانگیختگی مسیر شیکمیک اسید و تأثیرات تنظیم‌کنندگان رشد ایجاد می‌شود (Falcone Ferreyra et al., 2012). در مطالعه‌ای که به‌منظور تعیین محتوای آنتوسیانین سیانیدین-3-گلوکوزید و فعالیت پاداکسندگی ارقام برنج تحت تنش شوری (0و60میلی مولارکلرید سدیم) انجام شده است، نتایج نشان داد که آنتوسیانین به‌عنوان تعدیل کننده تنش شوری است و نقش مهمی درجلوگیری از آسیب اکسیداتیو ناشی از تنش نمکی دربرگ‌های تقریباً همه واریته‌های برنج به جز BC2F7#62-56 (مقاوم به شوری) ایفا کرده است و با نتایج مطالعه حاضر، همخوانی داشت (Daiponmak et al., 2010).

 در مطالعه‌ی حاضر، به‌منظور بیان تأثیر مهارکنندگی رادیکال‌های آزاد با روش DPPH از مفهوم IC50  استفاده شد. مقدارIC50  بدست آمده در تیمارها از نمونه کنترل مثبت کمتر بود و هرچه مقدار IC50 کمتر باشد قدرت بازداری عصاره بیشتر است. به‌طورکلی مقدار IC50 با فعالیت ضد رادیکالی عصاره رابطه‌ی عکس دارد. کمترین میزان IC50 در تیمار همزمان نانوذره کیتوزان 4/0 گرم برلیتر با شوری 150 میلی‌مولار مشاهده شد که نشان دهنده قدرت پاداکسندگی بیشتر نمونه نسبت به نمونه کنترل مثبت بود. در مطالعه‌ای که بر روی گیاهی از تیره گل‌داران بنام کتان­کش (Camelina sativa) تحت تأثیر نانوذرات روی در غلظت‌های (0، 20، 40 و 80 میلی‌گرم در لیتر) و تنش شوری در غلظت‌های ( 0، 50 و 100 میلی‌مولار) انجام شد، مشخص شد که تنش شوری به‌طور قابل توجهی ترکیبات فنلی کل، آنتوسیانین، کاروتنوئید و درصد مهار رادیکال DPPH در بخش هوایی و ریشه را افزایش داد و در تطابق با نتایج مطالعه حاضر بود. محلول‌پاشی نانوذرات روی تأثیر معنی‌داری بر میزان فلاونوئید در گیاه کتان‌کش نشان نداد اما باعث افزایش ظرفیت مهار رادیکال DPPH در بخش هوایی و ریشه شد (Hezaveh et al., 2020). در مطالعه‌ای تأثیر کیتوزان (25 و 50 میلی‌گرم در لیتر) و هورمون سالسیلیک اسید (50 و 100 میلی‌گرم در لیتر) بر روی گیاه گلرنگ تحت تنش شوری (5/1 درصد (w/v) کلرید سدیم) بررسی و نشان داده شد که محتوای فنل کل، فلاونوئید کل، فلاونول کل، آنتوسیانین وفعالیت پاداکسندگی (با روش 1،1-دی فنیل-2 پیکریل هیدرازیل (DPPH))، به‌طور قابل توجهی تحت تنش شوری افزایش یافت و با نتایج مطالعه حاضر، همخوانی داشت (Golkar et al., 2019). در مطالعه‌ای که به‌منظور ارزیابی تأثیر نانو تیتانیوم اکسید در غلظت‌های (40، 60 و 80 ppm) بر گیاه ذرت تحت تنش شوری 200 میلی‌مولار انجام شد، نشان داد که تیمار با نانوذره تیتانیوم اکسیدغلظت ppm 60 موجب افزایش قابل توجهی در محتوای فنل کل و کاهش میزان مالون‌دی‌آلدئید در بافت برگ شد و با نتایج مطالعه حاضر همخوانی داشت (et al., 2021 Shah). در مطالعه حاضر، تحت تنش شوری به‌طور قابل توجهی میزان فلاونوئیدها و فنل کل افزایش یافت، نتایج مشابهی در برخی از شورزیست‌ها مانند گیاه مسواک ((Salvadora persica بود که در شرایط تنش افزایش ترکیبات فنلی کل، کربوهیدرات‌های محلول و درصد مهار DPPH را نسبت به شاهد نشان داد و با نتایج مطالعه حاضر همخوانی داشت (Sharma and Ramawat, 2013). سازگاری کارامد برای تنش شوری می‌تواند افزایش فعالسازی پاداکسنده‌ها و حذف ROSها باشد.DPPH  به‌طور گسترده معرف مفیدی برای ارزیابی مهار رادیکال‌های آزاد ترکیبات فنلی است (Akkol et al., 2008). تأثیر مهار رادیکال DPPH معیاری برای فعالیت پاداکسندگی غیرآنزیمی است. فعال‌سازی بیشتر سازوکارهای مهار رادیکال DPPH در گیاهان پنبه (Xie et al., 2008) و گلرنگ (Salem et al., 2014) تحت تنش شوری گزارش شده است.

کربوهیدرات‌ها ترکیبات مهمی هستند که در این تحقیق بررسی شدند، کاهش محتوای نشاسته همزمان با افزایش سطح قند محلول در شرایط تنش شوری بود که ممکن است به دلیل کاهش سنتز نشاسته و یا تجزیه نشاسته به قند محلول برای تنظیم اسمزی باشد. زمانی که تنش شوری و یا خشکی به گیاه وارد می‌شود گیاه سعی می‌کند، فشار اسمزی خود را تنظیم کند تا از خشک شدن سلول‌ها جلوگیری و چروک سلولی خود را حفظ کند. برای حفظ فشار اسمزی، گیاهان سازوکارمناسبی به‌نام تنظیم اسمزی دارند که با واسطه ی اسمولیت‌ها،.یعنی آمین‌ها، قندهای محلول (قندهای محلول در تنظیم اسمزی نقش محوری دارند)، پرولین، گلیسین بتائین و غیره انجام می‌شود. این ترکیبات به حفظ تورگوری در گیاهان تحت تنش کمک می‌کنند (Dianat et al., 2016). در مطالعه‌ای روی گیاه دارویی بابونه گاو چشم (Tanacetum parthenium L) تحت تنش شوری (30، 60، 90، 120، 150 و180میلی‌مولار) نیز مشاهده شده است که میزان قند محلول با افزایش شوری افزایش، و میزان نشاسته با افزایش غلظت نمک کاهش می‌یابد، که با نتایج پژوهش حاضر، همخوانی داشت (Mallahi et al., 2018). نشاسته یک هموپلیمر گلوکز است که به‌صورت گرانول‌های جدا از هم در پلاستیدها رسوب می‌کند. این کربوهیدرات اصلی ذخیره سازی در گیاهان است و تا90 درصد وزن خشک اندام‌های گیاهی را تشکیل می‌دهد. به علت اینکه منبع 50 درصد کالری مصرف شده توسط جمعیت انسانی بوده است، همیشه در تحقیقات مورد توجه قرار گرفته است. اخیراً نشان داده شده است که محرک‌های اصلی بهره وری گیاهی، مخزن‌های نشاسته‌ای سنتز شده در بافت‌های فتوسنتزی منبع و یا مخرن‌های غیر ذخیره‌ای است. هر گرانول نشاسته از میلیون‌ها مونومر گلوکز پلیمریزه شده تشکیل شده است. نشاسته امکان ذخیره طولانی مدت تعداد بیشتری از مولکول‌های گلوکز در واحد فضا بدون هیچ گونه اختلال شیمیایی یا اسمزی در سلول را فراهم می‌کند. اگرچه در داخل گرانول پلیمریزه شده است، اما در صورت نیاز می‌توان به سرعت به این مولکول‌های گلوکز برای جلوگیری از گرسنگی دسترسی پیدا کرد (Dong and Beckles, 2019).

از آنجایی‌که نشاسته به عنوان یک ذخیره کربن و انرژی در بسیاری از گیاهان تکامل یافته است، منطقی به نظر می‌رسد که در طول دوره های تنش محیطی، زمانی که جذب کربوهیدرات‌ها به خطر می‌افتد، متابولیسم نشاسته می‌تواند در برابر تأثیرات نامطلوب کاهش کربن ناشی از تنش، محافظت کند (Krasavina et al., 2014). تنظیم متابولیسم نشاسته ناشی از القای تنش می‌تواند موجب افزایش قند سلولی شود یا اینکه موجب تجمع بیشتر نشاسته شود. زمانی‌که گیاه تحت تنش محیطی است، قند تجمع می‌یابد و غلظت‌های بالای قند به‌دلیل محافظت اسمزی قند مفید است. تبدیل نشاسته به قند ممکن است برای ترویج تجمع قند به قند تسریع شود و کمبود قند را به تأخیر اندازد، اما سیستم‌های بازخورد ممکن است باعث افزایش جریان قند به سمت نشاسته شوند تا وقوع "آسیب قند" را به تعویق بیندازند. تخریب نشاسته ناشی از تنش، شارش کربن را از مخزن هگزور فسفات افزایش می‌دهد. تبدیل بخشی از قندها به نشاسته می‌تواند اختلالات فیزیولوژیک قندهای اضافی در برگ منبع را به حداقل برساند (Dong and Beckles, 2019).

در مطالعه‌ای که تأثیر تنش شوری در غلظت‌های (0،50،100،150 میلی‌مولار) بر برگ و ریشه دو رقم پسته (Pistacia vera L) انجام شد، مشخص شد که شوری باعث کاهش رنگدانه‌های فتوسنتزی و افزایش قند محلول در برگ و ریشه شده است، که با نتایج مطالعه حاضر، همخوانی داشت al., (Rahneshan et 2018). نتایج پژوهشی که نهال برنج را تحت شوری 200 میلی‌مولار بررسی کرده بود نشان داد که میزان قند محلول بخش هوایی به طور معنی‌داری افزایش، و محتوای نشاسته ریشه کاهش پیدا کرد و با نتایج مطالعه کنونی در تطابق است (Amirjani, 2011).

افزایش میزان مالون‌دی‌آلدئید در پاسخ به تنش‌های محیطی یک پاسخ رایج است و محتوای مالون‌دی‌آلدئید بالاتر نشان دهنده پراکسیداسیون لیپیدی غشاهای سلولی است و ناپایداری اندامک‌های سلولی را نشان می‌دهد (Sehgal et al., 2018). تولید بیش از حد ROSها در شرایط تنش، به ماکرومولکول‌های سلولی آسیب می‌رساند که در نهایت باعث مرگ سلولی می‌شود و تولید مالون‌دی‌آلدئید که محصول اسید‌های چرب غیر اشباع غشایی است به واسطه وجود تنش اکسیداتیو رخ می‌دهد (Ali et al., 2014). در گیاهان تیمار شده با نانوذره‌ی کیتوزان، عملکرد غشا بهتر حفظ می‌شود واحتمالا در تایید نتایج Xie وهمکاران (2001) این نانوذره‌ها به عنوان پاداکسنده عمل می‌کنند. در گیاه Catharanthus roseus کاربرد نانوذره کیتوزان موجب کاهش سطح مالون‌دی‌آلدئید و در نتیجه حفظ یکپارچگی غشا شده است که با نتیجه کسب شده دراین مطالعه همخوانی داشت (Hassan et al., 2021). فعالیت پاداکسندگی کیتوزان عمدتاً به دلیل گروه آمینه هیدروکسیله آن است که آن را به یک پاک کننده موثر ROSها تبدیل می‌کند.

در مطالعه‌ی انجام شده بر روی گیاه کتان (Linum usitatissimum) تحت تنش شوری در غلظت‌های 0 و 150میلی‌مولار، نتایج نشان داد که محتوای فنل‌کل و فلاونوئید در تنش شوری افزایش یافت، درصد مهار رادیکال DPPH و محتوای مالون‌دی‌آلدئید هم در حضور نمک افزایش را نشان داد، که تأییدی بر نتایج به‌دست آمده در این مطالعه است Amraee and) (Abdollahi, 2019. در تحقیقی که برروی گندم و ذرت تحت شوری با غلظت‌های 0، 50، 100، 150 و200 میلی‌مولار و تیمار کیتوزان در غلظت‌های 25، 50 و 75 درصد انجام شده است، داده‌ها نشان داد که تنش شوری باعث پراکسیداسیون لیپیدی و تجمع مالون‌دی‌آلدئید در بخش هوایی و ریشه شد درحالی‌که در حضور کیتوزان کاهش یافت که با نتایج پژوهش حاضر، تطابق دارد ((Peykani and Sepehr, 2018.

نتیجه‌گیری

نانوذرات کیتوزان را می‌توان به‌صورت محلول‌پاشی و کاربرد بر روی خاک استفاده کرد. فناوری نانو (ذراتی با قطر کمتر از 100 نانومتر)، در بخش کشاورزی و مدیریت تنش‌های محیطی یک چشم انداز امید را ایجاد کرده است. محلول‌پاشی نانوذرات کیتوزان بر گیاه بامیه می‌تواند نقش اصلی در مهار تنش اکسیداتیو ناشی از تنش نمکی داشته باشد. در مطالعه حاضر، تیمار نانوذرات کیتوزان محتوای کلروفیل a، کلروفیلb ، کاروتنوئید، آنتوسیانین‌ها، فنل و فلاونوئید را افزایش داد و موجب کاهش میزان مالون‌دی‌آلدئید شد که باعث حفظ عملکرد غشا و افزایش تحمل در برابر تنش شوری شد. نانوذرات کیتوزان را می‌توان به‌عنوان نامزد مناسبی برای تخفیف تأثیرات نامطلوب تنش شوری بر گیاهان معرفی کرد که می‌توان این خاصیت را به وجود گروهای آمین و هیدروکسیل آن نسبت داد که به راحتی در واکنش‌های شیمیایی در دسترس است و باعث بهبود تنش نمکی و افزایش بهره‌وری محصولات زراعی می‌شوند.

سپاسگزاری

 نگارندگان بر خود لازم می‌دانند که از خانم دکتر ندا فرناد، و معاونت پژوهشی دانشگاه ارومیه به‌خاطر حمایت‌های مالی این پژوهش، تشکر و قدردانی نمایند.