مقایسه کاربرد صنعتی اگزوپلی ساکاریدهای دو سویه سیانوباکتری آبزی و خاکزی Neowestiellopsis Persica A1387 و Nostoc punensis در تصفیه زیستی فلزات سنگین

مقدمه

سیانوباکتری‌ها،‌ به‌عنوان منابع با ارزشی در تولید ﺍﮔﺰﻭﭘﻠﻲ‌ﺳﺎﻛﺎﺭﻳﺪﻫﺎ، ﻭﻳﮋﮔﻲﻫﺎﻱ ﻣﺘﻤﺎﻳﺰی نسبت به ﺩﻳﮕﺮ ﺑﺎﻛﺘﺮﻱﻫﺎ دارند. این ترکیبات ﺍﺯ ﺗﻌﺪﺍﺩ ﺯﻳﺎﺩﻱ ﻣﻮﻧﻮﺳﺎﻛﺎﺭﻳﺪﻫﺎﻱ ﻣﺘﻔﺎﻭت ﺗﺸﻜﻴﻞ ﺷﺪﻩ‌اند ﻛﻪ بیشتر آنها ﭘﻠﻴﻤﺮﻫﺎﻱ ﺩﺍﺭﺍﻱ ۱۳-۶ ﻗﻨﺪ ﻣﺨﺘﻠﻒ‌اند که در ﺗﻀﺎﺩ ﺑﺎ ﭘﻠﻴﻤﺮﻫﺎﻱ ﺗﻮﻟﻴﺪﺷﺪﻩ ﺗﻮﺳﻂ ﺩﻳﮕﺮ ﺑﺎﻛﺘﺮﻱﻫﺎ ﻭ ﺭﻳﺰﺟﻠﺒﻚﻫﺎ هستند. همچنین، ‌ﺍﮔﺰﻭﭘﻠﻲﺳﺎﻛﺎﺭﻳﺪﻫﺎﻱ ﺳﻴﺎﻧﻮﺑﺎﻛﺘﺮﻱﻫﺎ ﻣﻌﻤﻮﻻً ﺣﺎﻭﻱ ﺩﻭ ﺍﻭﺭﻭﻧﻴﻚ ﺍﺳﻴﺪ ﻣﺘﻔﺎﻭﺕ (ﮔﻠﻮﻛﻮﺭﻭﻧﻴﻚ ﻭ ﮔﺎﻻﻛﺘﻮﺭﻭﻧﻴﻚ اسید) ﻭ ﮔﺮﻭﻩﻫﺎﻱ ﺳﻮﻟﻔﺎﺕ بوده است ﻛﻪ ﺩﺭ ﺳﺎﺧﺘﻤﺎﻥ ﺍﮔﺰﻭﭘﻠﻲ‌ﺳﺎﻛﺎﺭﻳﺪﻫﺎﻱ ﺩﻳﮕﺮ ﺑﺎﻛﺘﺮﻱﻫﺎ متدوال نیست؛ درنتیجه،‌ ﺍﻳﻦ ﺧﺼﻮﺻﻴﺎﺕ ﺑﺎﻋﺚ ﻣﻲﺷﻮند ﺍﮔﺰﻭﭘﻠﻲ‌ﺳﺎﻛﺎﺭﻳﺪﻫﺎﻱ ﺳﻴﺎﻧﻮﺑﺎﻛﺘﺮﻱﻫﺎ ﺑﺮﺍﻱ ﻛﺎﺭﺑﺮﺩﻫﺎﻱ ﺑﻴﻮﺗﻜﻨﻮﻟﻮﮊﻳﻜﻲ همانند ﺣﺬﻑ ﻓﻠﺰﺍﺕ ﺳﻨﮕﻴﻦ ﺍﺯ ﺁﺏﻫﺎﻱ ﺁﻟﻮﺩﻩ، ﺗﻐﻠﻴﻆ ﻳﺎ ﻋﻮﺍﻣﻞ ﺍﻣﻮﻟﺴﻴﻮﻥ‌ﻛﻨﻨﺪﻩ ﺑﺴﻴﺎﺭ مناسب باشند [1].

ﺑﻬﺮه‌برداری ﺻﻨﻌﺘﻲ ﺍﺯ ﺳﻴﺎﻧﻮﺑﺎﻛﺘﺮﻱﻫﺎ ﺳﻮﺩ ﺑﻴﺸﺘﺮﻱ ﺭﺍ ﻧﺴﺒﺖ ﺑﻪ ﺩﻳﮕﺮ ﭘﻠﻲ‌ﺳﺎﻛﺎﺭﻳﺪﻫﺎﻱ ﺟﺪﺍﺷﺪﻩ ﺍﺯ ﮔﻴﺎﻫﺎﻥ ﻳﺎ ﺭﻳﺰﺟﻠﺒﻚﻫﺎﻱ ﺩﺭﻳﺎﻳﻲ ﺑﻪ ﻫﻤﺮﺍﻩ ﺩﺍﺷﺘﻪ ﺍﺳﺖ؛ ﺩﺭﻧﺘﻴﺠﻪ، ﺗﺤﻘﻴﻘﺎﺕ ﻭﺳﻴﻌﻲ ﺑﺮﺍﻱ ﺟﺴﺘﺠﻮﻱ ﭘﻠﻲ‌ﺳﺎﻛﺎﺭﻳﺪﻫﺎﻱ ﺟﺪﻳﺪ در ﺳﻮﻳﻪﻫﺎﻱ ﺳﻴﺎﻧﻮﺑﺎﻛﺘﺮﻱﻫﺎﻱ ﺩﺍﺭﺍﻱ ﻇﺮﻓﻴﺖ ﺗﺮﺷﺢ ﻣﻮﺍﺩ ﻣﻮﺳﻴﻼﮊﻱ ﺍﻧﺠﺎﻡ ﺷﺪﻩ‌اند. ﺗﺎﻛﻨﻮﻥ ﭼﻨﺪﻳﻦ ﺭﻳﺰﺟﻠﺒﻚ ﭘﺮﻭﻛﺎﺭﻳﻮﺕ ﻭ ﻳﻮﻛﺎﺭﻳﻮت ﺑﺮﺍﻱ ﺗﻮﻟﻴﺪ ﻭ ﺩﻓﻊ ﻣﻘﺎﺩﻳﺮ ﺯﻳﺎﺩﻱ ﺍﺯ ﺍﮔﺰﻭﭘﻠﻲ‌ﺳﺎﻛﺎﺭﻳﺪ ﺩﺭ ﺧﺎﺭﺝ ﻣﺤﻴﻂ ﺳﻠﻮﻟﻲ ﺷﻨﺎﺧﺘﻪ ﺷﺪﻧﺪ. گونه‌های ﺍﺻﻠﻲ ﺳﻴﺎﻧﻮﺑﺎﻛﺘﺮﻱﻫﺎی ﺗﻮﻟﻴﺪﻛﻨﻨﺪة پلی‌ساکاریدها ﺷﺎﻣﻞ Arthrospira platensis ﻭ Aphanizomenon ﻭ ﺭﻳﺰﺟﻠﺒﻚﻫﺎﻱ Chlorellavulgaris، Dunaliella salina، Isochrysis galbana، Bannochloropsis salina، Porphyridium cruentum و Haematococcuspluvialis هستند.

اگزوپلی‌ساکاریدها در سیانوباکتری‌ها یا شامل اگزوپلی‌ساکاردی‌های متصل به سلول‌اند که شامل ترکیبی از کپسول، غلاف و اسلیم هستند یا مواد پلی‌ساکاریدی محلول و آزادشده درون محیط هستند که یا از لایه‌های خارجی غشا یا از مراحل مختلف بیوسنتزی مشتق می‌شوند و هیچ ارتباط مستقیمی با سنتز اگزوپلی‌ساکاریدهای متصل به سلول ندارد [2].

و‌اژه ﺳﻢ‌ﺯﺩﺍﻳﻲ، به فرایند ﺧﻨﺜﻲ‌ﺳﺎﺯﻱ ﻳﺎ ﺣﺬﻑ ﻓﻠﺰﺍﺕ ﺳﻤﻲ ﺩﺭ ﻣﺤﻴﻂ ﺯﻳﺴﺖ اطلاق می‌شود. ﻓﻠﺰﺍﺕ ﺳﻨﮕﻴﻦ ﺁﻻﻳﻨﺪﻩﻫﺎﻱ ﻣﺤﻴﻄﻲ ﺷﺪﻳﺪی ﻫﺴﺘﻨﺪ که ﺑﺴﻴﺎﺭﻱ ﺍﺯ ﺁنها ﺣﺘﻲ ﺩﺭ ﻏﻠﻈﺖﻫﺎﻱ ﺑﺴﻴﺎﺭ ﭘﺎﻳﻴﻦ ﻫﻢ ﺳﻤﻲ‌اند. ﻓﻠﺰﺍﺕ ﺳﻨﮕﻴﻦ ﺑﻪ ﺩﻭ ﮔﺮﻭﻩ ﺍﺻﻠﻲ ﺗﻘﺴﻴﻢ ﻣﻲﺷﻮﻧﺪ: ﮔﺮﻭﻩ ﺍﻭﻝ ﺷﺎﻣﻞ ﻓﻠﺰﺍﺕ ﺿﺮﻭﺭﻱ ﻣﺎﻧﻨﺪ ﻣﺲ، ﺭﻭﻱ ﻭ ﺁﻫﻦ ﺍﺳﺖ ﻛﻪ ﺍﻳﻦ ﻓﻠﺰﺍﺕ ﺑﻪ‌ﻋﻨﻮﺍﻥ ﻣﻮﺍﺩ ﺭﻳﺰﻣﻐﺬﻱ ﺩﺭ ﻣﻘﺎﺩﻳﺮ ﻣﻨﺎﺳﺐ ﺑﺮﺍﻱ ﻣﻮﺟﻮﺩﺍﺕ ﺯﻧﺪﻩ ﺍﺯﺟﻤﻠﻪ ﺳﻴﺎﻧﻮﺑﺎﻛﺘﺮﻱﻫﺎ ﺿﺮﻭﺭﻱ ﺑﻮﺩﻩ است ﻭ ﺩﺭ فرایندﻫﺎﻱ ﻓﻴﺰﻳﻮﻟﻮﮊﻳﻚ ﻣﺘﻌﺪﺩ ﻭ ﻭﺍﻛﻨﺶﻫﺎﻱ ﻓﺘﻮﺳﻨﺘﺰﻱ ﺩﺧﻴﻞ‌اند؛ ﺍﻣﺎ ﺩﺭ ﻏﻠﻈﺖﻫﺎﻱ ﺑﺎﻻ ﺑﺴﻴﺎﺭ ﺳﻤﻲ ﺑﻮﺩﻩ‌اند ﻭ ﺑﺎﻋﺚ ﻛﺎﻫﺶ ﺭﺷﺪ ﻭ ﻋﻤﻠﻜﺮﺩ ﮔﻴﺎﻫﺎﻥ ﻣﻲﺷﻮﻧﺪ. ﻓﻠﺰﺍﺕ ﺳﻨﮕﻴﻦ ﮔﺮﻭﻩ ﺩﻭﻡ ﻧﻴﺰ ﺷﺎﻣﻞ ﻓﻠﺰﺍﺕ ﻏﻴﺮﺿﺮﻭﺭﻱ ﻣﺎﻧﻨﺪ ﺁﺭﺳﻨﻴﻚ، ﺟﻴﻮﻩ، ﺳﺮﺏ ﻭ ﻛﺎﺩﻣﻴﻮﻡ است ﻛﻪ ﺟﺰء ﺁﻻﻳﻨﺪﻩﻫﺎﻱ ﻋﻤﺪﻩ ﻣﺤﻴﻂ ﺯﻳﺴﺖ ﻣﺤﺴﻮﺏ ﻣﻲﺷﻮﻧﺪ و ﺩﺭ ﺗﻤﺎﻣﻲ ﻏﻠﻈﺖﻫﺎ ﺑﺴﻴﺎﺭ ﺳﻤﻲ ﺑﻮﺩﻩ ﻭ ﺑﺮﺍﻱ ﺁنها ﻫﻴﭻ ﻋﻤﻠﻜﺮﺩ زیستی ﺷﻨﺎﺧﺘﻪ ﻧﺸﺪﻩ ﺍﺳﺖ [3، 4]. ﺳﻴﺎﻧﻮﺑﺎﻛﺘﺮﻱﻫﺎ ﺩﺭ ﺗﻮﻟﻴﺪ ﺭﻭﺯﺍﻧﻪ ﺣﺪﻭﺩ 40 درصد ﺯﻳﺴﺖ‌ﺗﻮﺩﻩ ﻓﺘﻮﺳﻨﺘﺰﻱ ﺟﻬﺎﻥ ﺳﻬﻴﻢ ﻫﺴﺘﻨﺪ ﻭ ﺍﻧﺮﮊﻱ ﺧﻮﺭﺷﻴﺪﻱ ﺭﺍ ﺑﺎ ﺳﺮﻋﺖ ﺗﻘﺮﻳﺒﺎً
۴۵۰ ﺗﺮﺍﻭﺍﺕ ﺑﻪ ﺍﻧﺮﮊﻱ ﺷﻴﻤﻴﺎﻳﻲ ﺗﺒﺪﻳﻞ ﻣﻲﻛﻨﻨﺪ. ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ ﺍﻟﻜﺘﺮﻭﮊﻧﻴﻜﻲ ﺳﻴﺎﻧﻮﺑﺎﻛﺘﺮﻱﻫﺎ ﻣﺴﻴﺮ مهمی ﺑﺮﺍﻱ ﻫﺪﺍﻳﺖ ﺍﻧﺮﮊﻱ ﺧﻮﺭﺷﻴﺪﻱ ﺑﻪ ﺯﻳﺴﺖ ﻛﺮﻩ ﺍﺳﺖ ﻛﻪ بیشتر ﺗﻮﺳﻂ ﻓﻠﺰﺍﺕ ﺳﻨﮕﻴﻦ ﻭ ﺳﻤﻲ ﻣﺨﺘﻞ ﻣﻲﺷﻮد [5]

ﺗﻨﺶ ﻓﻠﺰﺍﺕ ﺳﻨﮕﻴﻦ، ﻳﻜﻲ ﺍﺯ ﺗﻨﺶﻫﺎﻱ ﻣﺤﻴﻄﻲ ﺍﺳﺖ ﻛﻪ ﺑﻪ‌ﻋﻠﺖ ﺻﻨﻌﺘﻲ‌ﺷﺪﻥ ﺳﺮﻳﻊ ﺟﻮﺍﻣﻊ ﺑﻪ‌ﻃﻮﺭ ﮔﺴﺘﺮﺩﻩ ﺩﺭﺣﺎﻝ ﺍﻓﺰﺍﻳﺶ است. ﺩﺭ ﻃﻮﻝ ﺗﻜﺎﻣﻞ، ﻣﻮﺟﻮﺩﺍﺕ ﺭﻭﺵﻫﺎﻱ ﻣﺘﻨﻮﻋﻲ ﺭﺍ ﺑﺮﺍﻱ ﺣﻔﻆ ﺗﻌﺎﺩﻝ ﺑﺎ ﻳﻮﻥﻫﺎﻱ ﻓﻠﺰﻱ ﻣﻮﺟﻮﺩ ﺩﺭ ﻣﺤﻴﻂ ﺍﻃﺮﺍﻑ ﺍﻳﺠﺎﺩ کرده‌اند. سلول‌ها ﺩﻭ ﻭﻇﻴﻔﻪ ﺍﺳﺎﺳﻲ ﺩﺭ ﺍﻳﻦ ﺯﻣﻴﻨﻪ ﺩﺍﺭﻧﺪ؛ ﺍﻭﻝ اینکه ﻓﻠﺰﺍﺕ ﺳﻨﮕﻴﻨﻲ ﺭﺍ ﺍﻧﺘﺨﺎﺏ می‌کنند ﻛﻪ ﺑﺮﺍﻱ ﺭﺷﺪ ﺿﺮﻭﺭﻱ‌اند ﻭ ﺁﻥ ﺩﺳﺘﻪ ﻛﻪ ﻣﻮﺭﺩ ﻧﻴﺎﺯ ﻧﻴﺴﺘﻨﺪ را ﺣﺬﻑ ﻛﻨﻨﺪ؛ ﺩﻭﻡ اینکه ﻳﻮﻥﻫﺎﻱ ﺿﺮﻭﺭﻱ ﺭﺍ ﺩﺭ ﻏﻠﻈﺖﻫﺎﻱ ﺩﺭﻭﻥ ﺳﻠﻮﻟﻲ ﻣﻄﻠﻮﺏ ﻧﮕﻪ ﺩﺍﺭﻧﺪ. ﺗﺸﻜﻴﻞ ﻛﻤﭙﻠﻜﺲ ﺗﺒﺎﺩﻝ ﻳﻮﻥ، ﺟﺬﺏ، ﺭﺳﻮﺏ‌ﺩﻫﻲ ﻣﻮﺍﺩ ﻏﻴﺮﺁﻟﻲ ﻭ ﺍﺳﺘﻔﺎﺩﻩ ﺍﺯ ﻣﻜﺎﻧﻴﺴﻢ ﺍﻛﺴﻴﺪﺍﺳﻴﻮﻥ ﻳﺎ ﺍﺣﻴﺎ ﺟﺰء ﺭﻭﺵﻫﺎﻳﻲ ﺍﺳﺖ ﻛﻪ ﺑﺮﺍﻱ مقابلة ﺳﻠﻮﻝ ﺑﺎ ﺍﺛﺮﺍﺕ ﻭ ﺁﺳﻴﺐﻫﺎﻱ ﻓﻠﺰﺍﺕ ﺳﻨﮕﻴﻦ ﻭ ﺳﻤﻲ ﺗﻜﺎﻣﻞ یافته‌اند [6]. ﺣﻀﻮﺭ ﺑﺎﺭﻫﺎﻱ ﻣﻨﻔﻲ (ﺍﺳﻴﺪﻫﺎﻱ اوره‌ای) ﺩﺭ ﺍﮔﺰﻭﭘﻠﻲ‌ﺳﺎﻛﺎﺭﻳﺪﻫﺎﻱ ﺳﻴﺎﻧﻮﺑﺎﻛﺘﺮﻱﻫﺎ ﻛﻪ ﻧﻘﺶ ﻣﻬﻤﻲ ﺩﺭ ﺟﺬﺏ ﻛﺎﺗﻴﻮﻥﻫﺎﻱ ﻓﻠﺰﻱ ﺩﺍﺭﺩ، ﻳﻚ ﭘﺪﻳﺪﻩ ﭘﺮ ﻣﻨﻔﻌﺖ ﺍﺣﺘﻤﺎﻟﻲ ﺑﺮﺍﻱ ﺗﺼﻔﻴﻪ ﺁﺏ ﺍﺳﺖ [7].

عوامل متفاوتی ازجمله محیط کشت، فلزات سنگین، منابع فسفات‌، ‌نیتروژن، سولفات، شوری، مواد مغذی و نور در تولید اگزوپلی‌ساکاریدها در سیانوباکتری‌ها نقش دارند؛ بنابراین، مشکل می‌توان نتیجه گرفت که آیا تفاوت‌های گزارش‌شده در تولید اگزوپلی‌ساکاریدها به‌دلیل تفاوت‌های فیزیولوژیکی در میان گونه‌هاست یا به‌دلیل تفاوت در شرایط کشت آزمایشگاهی به‌کاربرده‌شده است؛ برای مثال،‌ تأثیر شرایط کشت بر تولید پلی‌ساکاریدها، وابسته به گونه‌ است. سنتز اگزوپلی‌ساکاریدها‌ به‌طور مستقیم به محدودیت‌های محیطی (برای مثال، محیط فیزیکی و شیمیایی) مربوط به میکروارگانیسم وابسته است. با توجه به نوع سویه‌‌های ریزجلبک‌، سنتز پلی‌ساکارید خارج سلولی در طول فاز رشد یا‌ در طول فاز ایستایی متفاوت به نظر می‌رسد [7]؛ به همین دلیل است که در این مطالعه توانایی دو سویه سیانوباکتری Nostoc punensis و Neowestiellopsis Persica A1387 متعلق به دو زیستگاه مختلف خاک‌زی و آب شیرین در حذف فلزات سنگین کروم، نیکل و مس سنجش می‌شود.

مواد و روش‌ها

کشت سیانوباکتری‌های Nostoc punensis و Neowestiellopsis Persica A1387: ابتدا سویه‌های سیانوباکتری از مجموعه کشت سیانوباکتری‌های دانشگاه آزاد واحد علوم و تحقیقات Cyanobacteria culture collection (CCC) تهیه شدند. سویه‌های سیانوباکتری‌های خاک‌زی Nostoc punensis و آبزی Neowestiellopsis Persica A1387 متعلق به خاک‌های زراعی و آب‌های اطراف جنگل النگدره استان گلستان هستند. این سویه‌ها با کد دسترسی KT166436.1 و MZ327713.1 به‌ترتیب در بانک ژن موجودند. Neowestiellopsis Persica A1387، سویه سیانوباکتری منشعب است و در تیره Hapalosiphonaceae قرار دارد وNostoc punensis سویه سیانوباکتری غیرمنشعبی است که در تیره Nostocaceae قرار دارد. کشت در محیط کشت
BG-11₀ و در اتاقک رشد با دمای 2±28 درجه سانتی‌گراد و روشنایی ممتد فلورسنت با شدت
300 میکروانیشتین در مترمربع در ثانیه برای ۱۴ روز انجام شد [8].

تلقیح فلزات سنگین و اندازه‌گیری میزان جذب: ابتدا کیسه‌های دیالیز حاوی محیط کشت به مدت
40 دقیقه درون محلول 1/0 مولار HCl قرار گرفتند. این کار برای حذف یون‌های فلزی انجام می‌گیرد که ممکن است با گروه‌های با بار منفی باند شود. بعد از 30 دقیقه، برای حذف HCl اضافی در محیط، کشت‌ها با استفاده از آب به مدت 24 ساعت دیالیز شدند. در مرحله بعدی
50 میلی‌لیتر از کشت‌های تیمارشده حاوی بیومس و پلی‌ساکارید آزادشده، به درون 490 میلی‌لیتر از محلول‌های فلزی حاوی 10 میلی‌گرم بر لیتر Cu(II)، Cr(III) و Ni(II) به‌طور جداگانه با pH~5 منتقل شد. محیط‌های کشت برای 24 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‌گراد با تکان‌خوردن 100 دور بر دقیقه قرار گرفتند. پس از 24 ساعت، بیومس حاوی سیانوباکتری‌ها از محیط کشت حاوی محلول فلزی با سانتریفیوژ در g1200 برای 7 دقیقه جدا و سپس توسط کاغذ واتمن 7/0 میکرومتری فیلتر شد. محتوای نهایی فلزات، در سوپرناتانت با جذب اتمی (Spectr AA 10 plus, Varian, CA, USA) در طول موج 232 برای مس، 9/359 برای کروم و 7/324 نانومتر برای نیکل خوانده شد. میزان حذف فلزات از محلول با تفاوت در غلظت فلز در قبل و بعد از تماس با کشت سیانوباکتری اندازه‌گیری و با سویه کنترل مقایسه شد. همه آزمایش‌ها سه بار تکرار و اطلاعات به‌صورت میانگین ارزیابی شدند. میزان حذف فلزات (q) به‌صورت میلی‌گرم حذف فلزات به‌ازای هر گرم وزن خشک بیان شد.

معادله شماره 1:              q (mg g^-1)= v (C1-C2) m^-1

V: حجم سویه (در لیتر)، Ci: غلظت ابتدایی فلز و C2 غلظت نهایی فلز (میلی‌گرم بر لیتر)، m: مقدار وزن خشک (گرم)

اندازه‌گیری میزان وزن خشک: وزن خشک بیومس (گرم بر لیتر) با فیلتراسیون کشت‌های دیالیزشده و خشک‌کردن فیلترها در 100 درجه سانتی‌گراد اندازه‌گیری شد [8].

جداسازی و اندازه‌گیری اگزوپلی‌ساکاریدها: بعد از تلقیح فلزات سنگین با محیط کشت سیانوباکتری‌ها، اگزوپلی‌ساکارید‌ها از محیط کشت BG-11₀  حاوی سیانوباکتری‌ها برای بررسی میزان حذف فلزات سنگین پس از 30 روز استخراج شدند. سلول‌ها از محیط کشت‌ها با استفاده از سانتریفیوژ با سرعت بالا
(g 20000) برای 45 دقیقه در 10 درجه سانتی‌گراد جدا شدند. پس از جداشدن سلول‌ها، مایع رویی که حاوی پلی‌ساکاریدی‌های آزادشده است، به یک ارلن جدید منتقل شد و 700 میلی‌لیتر استون 80 درصد به آن اضافه و تمام شب در 4 درجه سانتی‌گراد برای رسوب‌گیری حفظ شد. پس از گذشت 18 ساعت، رسوب به‌دست‌آمده در ´ g 1200 برای 10 دقیقه سانتریفیوژ و سپس در آب دیونیزه حل شد. نمونه حاصل در 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 18 ساعت با آب مقطر دیالیز شد. بیومس‌ها برای آنالیزهای دستگاهی و بررسی میزان پلی‌ساکارید در انکوباتور 105 درجه سانتی‌گراد خشک می‌شوند [9].

سنجش محتوای کربوهیدرات‌ با استفاده از طیف‌سنجی مرئی- فرابنفش: سنجش محتوای کربوهیدرات بر طبق روش اسپکتروفتومتریک محاسبه شد. 1/0 گرم از اگزوپلی‌ساکارید خشک‌شده سیانوباکتری‌های بررسی‌شده، در 5 میلی‌لیتر اتانل
80 درصد ورتکس شده و در دمای 50 درجه سانتی‌گراد در بن‌ماری به مدت 10 دقیقه قرار گرفت. سپس در سانتریفیوژ با سرعت 4000 دور در دقیقه به مدت
10 دقیقه سانتریفیوژ شد. رسوب با الکل اتانل 80 درصد شستشو داده شده و این مراحل تکرار شده است و حجم الکل به 20 میلی‌لیتر رسید. به‌منظور حذف رسوبات اضافی و ترکیبات دیگر، مقدار 5 میلی‌لیتر از محلول
5 درصد سولفات روی و 5 میلی‌لیتر از محلول هیدروکسید باریوم 3 درصد به آن اضافه و سپس مجدداً ورتکس شده است. برای آخرین بار نمونه‌ها به مدت
10 دقیقه با سرعت 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. دو میلی‌لیتر از محلول برداشته و به آن 1 میلی‌لیتر محلول 5 درصد فنول اضافه شد، 5 میلی‌لیتر اسید سولفوریک غلیظ، اضافه و 1 ساعت ثابت گذاشته و سپس در طول موج 490 نانومتر میزان جذب خوانده شد. سپس با استفاده از محنی استاندارد گلوکز، محتوای کربوهیدرات‌ها برحسب میکروگرم بر میلی‌لیتر بیان شد [10].

سنجش محتوای پروتئین‌ با استفاده از طیف‌سنجی مرئی- فرابنفش: سنجش محتوای پروتئین بر طبق روش اسپکتروفتومتریک محاسبه شد. محلول‌های اگزوپلی‌ساکارید با 0125/0 مولار تترابورات سدیم در 100 درجه سانتی‌گراد برای 45 دقیقه غلیظ شدند و بعد از سردشدن در حمام آب یخ، معرف متاهیدروکسی دیفنیل، اضافه و جذب در طول موج 520 نانومتر اندازه‌گیری شد. پروتئین بر طبق روش برادفورد با استفاده از آلبومین سرم گاوی به‌عنوان استاندارد اندازه‌گیری شد [10، 11].

طیف‌سنجی تبدیل رامان و فوریه به مادون قرمز (FT-IR): در این طیف‌سنجی، از روش تهیه قرص پتاسیم برماید (KBr) با مخلوط ماده استفاده شد. مقدار
1/0 گرم از ماده با 4/0 پتاسیم برماید مخلوط شد و سپس به کمک دستگاه پرس مخصوص تهیه قرص IR تحت فشار 15 تن قرص مربوطه، آماده و طیف‌سنجی انجام شد [12].

آنالیز ترکیبات فرار با استفاده از طیف‌سنجی جرمی - کروماتوگرافی گازی: ابتدا 50 میلی‌لیتر از نمونه، سانتریفیوژ و با اسید هیدروکلریک 2 مولار به مدت
4 ساعت در دمای 100 درجه سانتی‌گراد متانوله شد. سپس محلول به‌دست‌آمده با سرعت g 7168 به مدت
10 دقیقه سانتریفیوژ شد. محلول رویی جمع‌آوری شد و به بالن، منتقل و به دستگاه روتاری وصل شد. پس از اتمام کار با روتاری، 2 میلی‌لیتر هگزان به محتویات داخل بالن، اضافه و سپس محتویات بالن از فیلتر pTEF با اندازه منافذ 45/0 میکرومتر عبور داده شد. محلول حاصل دوباره با سرعت g 7168 به مدت 10 دقیقه، سانتریفیوژ و محلول رویی برای آنالیز با دستگاه GC-MS جمع‌آوری شد. میزان 2 میکرولیتر از محلول رویی توسط سرنگ‌های خاص به دستگاه تزریق شد و طیف آن به دست آمد [13].

روش‌های آماری: واکاوی داده‌های آماری به‌دست‌آمده از هر آزمایش با نرم‌افزار SPSS (نسخه 24) انجام شد. همه داده‌ها از سه بار تکرار آزمون به دست آمده‌اند. معنی‌داربودن تفاوت‌ها بین موارد اندازه‌گیری‌شده با آنالیز واریانس یک‌طرفه با حدود اطمینان 95 درصد و مقایسة میانگین‌ها با آزمون tukey انجام شد.

نتایج

تأثیر فلزات مس، کروم و نیکل بر وزن خشک و غلظت اگزوپلی‌ساکاریدهای دو سویهNeowestiellopsis Persica A1387 و Nostoc punensis: نتایج حاصل از تیمار سیانوباکتری‌های Neowestiellopsis Persica A1387 و Nostoc punensis با فلزات کروم، مس و نیکل نشان دادند وزن خشک سلول‌ها تحت تیمار با فلزات به‌صورت معناداری در زمان‌های 24 و 48 در سیانوباکتری‌ها در مقایسه با کنترل کاهش یافته است (p-value<0.05). علاوه بر آن، تحت تیمار با مس علاوه بر زمان‌های 24 و 48 ساعت، وزن خشک سلولی در 12 ساعت نیز کاهش معناداری را در مقایسه با سویه شاهد نشان می‌دهد
(p-value<0.05). همان‌طور که در نمودارهای
شکل 1 (A) مشخص شده است، سیانوباکتری
Nostoc punensis نسبت به تیمارهای فلزی حساس‌تر بوده و وزن خشک سلولی آن در تیمارهای فلزی بیش از سیانوباکتری دیگر مطالعه‌شده کاهش یافته است. در مقایسه میزان تولید بیومس سلولی در تیمار فلزات مس، نیکل و کروم توسط دو گونه Neowestiellopsis Persica A1387 و Nostoc punensis نشان می‌دهد سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 در تولید بیومس سلولی سویه برتر بوده و بیومس بیشتری را تولید کرده است. علاوه بر این، سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 که در تولید بیومس سلولی سویه برتر بود، در مقاومت به فلزات سنگین نیز سویه برتر بود و مقاومت بیشتری در برابر فلزات مس، نیکل و کروم دارد که این نشان می‌دهد میزان بیومس سلولی و مقاوت به فلزات رابطه مستقیمی دارند (شکل 1، A).

نتایج حاصل از غلظت اگزوپلی‌ساکارید تولیدشده توسط سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 نشان دادند غلظت محتوای اگزوپلی‌ساکاریدی در سویه تحت تیمار با کروم و مس در زمان‌های 12، 24 و 48 ساعت تفاوت معناداری را با سویه کنترل نشان می‌دهد (p-value<0.05)؛ اما در سویه‌های تحت تیمار با نیکل، این تفاوت معنادار در زمان‌های 24 و 48 ساعت مشاهده می‌شود (شکل 1، B). در سیانوباکتری
Nostoc punensis نیز کاهش معناداری در محتوای غلظت اگزوپلی‌ساکاریدهای در سویه تحت تیمار با کروم در زمان‌های 12، 24 و 48 ساعت مشاهده شد
(p-value<0.05)؛ اما در سایر تیمارها تفاوت معناداری در زمان 12 ساعت مشاهده نشد (p-value>0.05). علاوه بر این، تفاوت معناداری در غلظت اگزوپلی‌ساکارید تولیدشده توسط این سیانوباکتری تحت تیمار با مس در زمان 48 ساعت مشاهده نشد که این نشان می‌دهد با افزایش زمان در مجاورت با فلز مس، سیانوباکتری با آن تطابق پیدا کرده است و سازگار می‌شود که می‌تواند در این زمان غلظتی مشابه با غلظت سویه شاهد، اگزوپلی‌ساکارید تولید کند. به‌طور کلی نتایج نشان می‌دهند سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 در تولید اگزوپلی‌ساکاریدها سویه برتر بوده و در یک زمان ثابت، اگزوپلی‌ساکارید بیشتری را در مقایسه با Nostoc punensis تولید کرده است
(شکل 1، B).

شکل 1- نتایج حاصل از اثر فلزات سنگین کروم، نیکل و مس بر A) وزن خشک سلولی و B) غلظت اگزوپلی‌ساکاریدها بین دو سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 (ستون‌های سیاه) و Nostoc punensis (ستون‌های سفید) در زمان‌های 12، 24 و 48 ساعت. حروف متفاوت بیان‌کنندة وجود تفاوت معنادار بین سویه‌ها است.

Fig 1 - The results of the effect of heavy metals chromium, nickel and copper on A) cell dry weight and
B) concentration of exopolysaccharides among two cyanobacteria Neowestiellopsis Persica A1387 (black columns) and Nostoc punensis (white columns) at 12, 24 and 48 hours. Different letters indicate significant differences
between strains.

تأثیر محتوای پروتئینی و کربوهیدرات بر حذف فلزات سنگین: نتایج حاصل از محتوای پروتئینی تولیدشده توسط دو سویه سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 و
Nostoc punensis نشان می‌دهند کاهش معناداری در مقایسه سویه‌های تیمارشده با فلزات و سویه شاهد در پروتئین تولیدشده توسط سیانوباکتری‌ها مشاهده می‌شود
(p-value<0.05). کمترین پروتئین تولیدشده در سویه تیمارشده با مس مشاهده شد؛ درحالی‌که سویه تیمارشده با نیکل بیشترین میزان پروتئین تولیدشده در میان سویه‌های تیمارشده با فلزات را نشان می‌دهد. تفاوت معناداری در سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 تیمارشده با نیکل و کروم مشاهده نشد
(p-value>0.05). تولید پروتئین در تمام تیمارهای سیانوباکتری Nostoc punensis تفاوت معناداری داشتند (p-value<0.05). در مقایسه محتوای پروتئینی در تیمار فلزات مس، نیکل و کروم توسط دو گونه Neowestiellopsis Persica A1387 و
Nostoc punensis (شکل 2، A) نشان می‌دهد سیانوباکتری Nostoc punensis در تولید پروتئین سویه برتر بوده و پروتئین بیشتری را در مقایسه با Neowestiellopsis Persica A1387 تولید کرده است.

نتایج حاصل از کربوهیدرات‌های تولیدشده توسط سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 و Nostoc punensis تیمارشده با فلزات مس، کروم و نیکل نشان دادند کاهش معناداری در مقایسه با سویه کنترل داشتند (p-value<0.05). همانند نتایج محتوای پروتئینی کمترین میزان کربوهیدرات تولیدشده در سویه‌های تیمارشده با مس و بیشترین کربوهیدرات تولیدشده در تیمار نیکل مشاهده شده است. میزان کربوهیدرات در تمامی تیمارهای سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 تفاوت معناداری داشتند (p-value<0.05)؛ اما در تیمارهای سیانوباکتری Nostoc punensis تفاوت معناداری در میزان کربوهیدرات تولیدشده در تیمارهای نیکل و کروم مشاهده نشده است (p-value>0.05). به‌طور کلی نتایج نشان می‌دهند در مقایسه محتوای پروتئینی در تیمار فلزات مس، نیکل و کروم توسط دو گونه Neowestiellopsis Persica A1387 و
Nostoc punensis، سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 در تولید کربوهیدرات‌ها سویه برتر بوده و در یک زمان ثابت، کربوهیدرات بیشتری را در مقایسه با سیانوباکتری Nostoc punensis تولید کرده است (شکل 2، B).

شکل 2- نتایج حاصل از اثر فلزات سنگین کروم، نیکل و مس بر A) غلظت پروتئین B) کربوهیدرات تولیدشده توسط سیانوباکتری‌های Neowestiellopsis Persica A1387 و Nostoc punensis در تیمار با فلزات مس، کروم و نیکل. حروف متفاوت بیان‌کنندة تفاوت معنادار بین سویه‌ها هستند.

Fig 2 - The results of the effect of heavy metals chromium, nickel and copper on A) protein concentration
B) carbohydrate produced by cyanobacteria Neowestiellopsis Persica A1387 and Nostoc punensis in treatment with copper, chromium and nickel metals. Different letters indicate significant differences between strains.

نتایج حاصل از حذف فلزات مس، نیکل و کروم در کشت مایع سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 و Nostoc punensis : نتایج حاصل از بررسی حذف فلزات مس، نیکل و کروم نشان دادند سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 بیشترین حذف فلز در سویه‌های تیمارشده با نیکل در دقیقه 10 را داشته است؛ درحالی‌که کمترین حذف برای فلز مس در دقیقه 90 است. در سیانوباکتری Nostoc punensis نیز بیشترین حذف مربوط به تیمار با فلز نیکل در دقیقه 10 بوده است؛ درحالی‌که کمترین میزان حذف در تیمار با مس در دقیقه 90 مشاهده شده است. همچنین نتایج مشخص کردند سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 توانایی بهتری در حذف نیکل و کروم در مقایسه با سیانوباکتری Nostoc punensis در زمان‌های 10، 30، 60 و 90 دقیقه دارد (p-value<0.05)؛ درحالی‌که تفاوت معناداری در حذف مس توسط دو سیانوباکتری مورد استفاده مشاهده نشد
(p-value>0.05). بیشترین حذف پس از 10 دقیقه تیمار سیانوباکتری‌ها با فلزات مشاهده شد و با افزایش زمان، میزان حذف فلزات از محیط کاهش یافت که می‌تواند به‌علت اشباع‌شدن پلی‌ساکاریدها و پروتئین‌های سیانوباکتری توسط فلزات باشد. تفاوت معناداری در حذف فلزات نیکل، کروم و مس در تیمارهای 30، 60 و 90 دقیقه‌ای سیانوباکتری Nostoc punensis مشاهده نشد (p-value>0.05)؛ اما تفاوت معناداری بین این تیمارها و تیمار 10 دقیقه‌ای با این فلزات مشاهده می‌شود (p-value>0.05) که این نشان می‌دهد بیشترین حذف فلزات توسط سیانوباکتری‌ها در 10 دقیقه ابتدایی رخ می‌دهد. به‌طور کلی نتایج نشان دادند در مقایسه حذف فلزات مس، نیکل و کروم توسط دو گونه Neowestiellopsis Persica A1387 و
Nostoc punensis، سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 در حذف فلزات سویه برتر بوده و در یک زمان ثابت، میزان بیشتری از فلزات را در مقایسه با سیانوباکتری Nostoc punensis حذف کرده است (شکل 3).

شکل 3- نتایج حاصل از حذف فلزات مس، نیکل و کروم توسط دو سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 و Nostoc punensis در زمان‌های صفر (زمان تلقیح)، 10، 30، 60 و 90 دقیقه پس از تیمار.

Fig 3 - The results of the removal of copper, nickel and chromium metals by two cyanobacteria Neowestiellopsis Persica A1387 and Nostoc punensis at zero times (inoculation time), 10, 30, 60 and 90 minutes after treatment.

نتایج حاصل از مطالعات GC-MS سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 و Nostoc punensis: نتایج حاصل از مطالعات GC-MS سویه شاهد (فاقد فلزات سنگین)، تیمارشده با Cr(III) و Ni(II)،‌ سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 نشان داده‌اند Acetic acid methyl ester با فرمول مولکولی C₃H₆O₂، وزن مولکولی 05/60 گرم بر مول، زمان پیک 03/7 دقیقه و جنس Ester بیشترین میزان فراوانی (491/12 درصد، 046/14 درصد و 888/12 درصد) و 4-Octan-3-one با فرمول مولکولی C₈H₁₄O، وزن مولکولی 20/126 گرم بر مول، زمان پیک 19/30 دقیقه و جنس Alkane کمترین میزان فراوانی (304/1 درصد، 321/1 درصد و 25/1 درصد) را به‌ترتیب بین دیگر ترکیبات داشته است (جدول 1). همچنین‌ نتایج حاصل از مطالعات GC-MS سویه سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 تیمارشده با Cu(II) نشان داده‌اند ترکیب 3-Hydroxy-2-Butanone با فرمول مولکولی C₈H₁₆O₄، وزن مولکولی 22/176 گرم بر مول، زمان پیک 25/17 دقیقه و جنسKetone  بیشترین درصد فراوانی (815/10 درصد) و ترکیب
4-Octan-3-one با فرمول ملکولی C₈H₁₀O، وزن مولکولی 16/122 گرم بر مول، زمان پیک 44/28 دقیقه و جنس Alkane کمترین درصد فراوانی (151/1 درصد) را داشته است.

نتایج حاصل از مطالعات GC-MS سویه شاهد (فاقد فلزات سنگین)، تیمارشده باCr(III) ، Cu(II) و Ni(II) در سیانوباکتری Nostoc punensis به‌ترتیب نشان داده‌اند Acetic acid methyl ester با فرمول مولکولی C₃H₆O₂، وزن مولکولی 05/60 گرم بر مول، زمان پیک 03/7 دقیقه و جنس Ester بیشترین درصد فراوانی (292/12 درصد، 135/13 درصد، 535/11 درصد و 17/13 درصد) و 4-Octan-3-one با فرمول مولکولی C₈H₁₄O، وزن مولکولی 20/126 گرم بر مول، زمان پیک 19/30 دقیقه و جنس Alkane کمترین درصد فراوانی را (518/1 درصد، 479/1 درصد، 497/1 درصد و 272/1 درصد) داشته است.

نتایج حاصل از مقایسه ترکیبات شیمیایی و درصد فراوانی آنها در سویه کنترل و سیانوباکتری‌های Neowestiellopsis Persica A1387 و Nostoc punensis تیمارشده با فلزات کروم، مس و نیکل نشان دادند در سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 تیمارشده با فلزات نسبت به سویه کنترل، میزان 2-بوتانول و تترادکانال افزایش یافته است؛ درحالی‌که میزان 1و3- دی متیل بنزن، 3- متیل-1- بوتانول،
3- هیدروکسی-2- بوتانول و بنزآلدهید کاهش یافته است. به‌طور کلی بیشترین تغییرات در این سیانوباکتری در تیمار نیکل مشاهده می‌شود. بیشترین جذب فلز سنگین نیز برای تیمار نیکل رخ می‌دهد که این نشان می‌دهد سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 با تغییر در ترکیبات ساختاری خود به افزایش جذب فلز نیکل از محیط منجر می‌شود؛ اما در سیانوباکتری Nostoc punensis میزان بوتانال،
1- بوتانول، 3- هیدروکسی-2- بوتانون و بنزآلدهید کاهش یافته است؛ درحالی‌که میزان استیک اسید،
3- هیدروکسی متیل بوتیل استر، 1و3- دی متیل بنزن،
2- دکانون، 2و4- هگزا دیانال و تترا دکانال افزایش یافته است. به‌طور کلی در این سیانوباکتری بیشترین تغییرات در تیمار با کروم دیده می‌شود؛ در صورتی که بیشترین جذب فلز از محیط مربوط به نیکل است (جدول 2).

جدول 1- مقایسه نتایج GC/MS حاصل از سویه شاهد و تیمار سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 توسط فلزهای مس، نیکل و کروم

Table 1- Comparison of GC/MS results obtained from the control strain and treatment of cyanobacterium Neowestiellopsis Persica A1387 by copper, nickel and chromium metals

نتایج حاصل از بررسی اگزوپلی‌ساکاریدها با استفاده از روش FT-IR: برای درک بهتر، نتایج FT-IR برای دو گونه سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 و Nostoc punensis در حضور فلزات سنگین کروم، مس و نیکل نسبت به گروه کنترل (فاقد فلزات) مقایسه شدند. در رابطه با سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 در ناحیه cm^-1 405 سویه کنترل پیک دیده می‌شود که مربوط به گروه خمشی C-N است؛ اما این پیک فقط در سویه تیمارشده با مس یافت شده و در سایرین این پیک حذف شده است. در ناحیه cm^-1 575 سویه کنترل و سویه‌های تیمارشده با کروم و نیکل پیک مربوط به گروه خمشی کربونیل (C=O) مشاهده شد؛ اما این پیک در سویه تیمارشده با مس دچار تغییرات شده بود. علاوه بر این، در ناحیه بین cm^-1920-813، 3 پیک جدید برای سویه تیمارشده با مس مشاهده شدند که در سایرین وجود نداشتند. پیک‌های محدوده cm^-1 1000 مربوط به گروه‌های C-O پلی‌ساکاریدی و اسکلت قندی‌اند که در همه تیمارها و سویه کنترل دیده می‌شوند. همچنین یک تفاوت فاحش در تعداد و مکان قرارگیری پیک‌های سویه تیمارشده با مس در بازة cm^-1 1115-1048 یافت شد که مربوط به کشش قویPO₄^3- و ⁺NH₃ است. پیک cm^-1 1055 مربوط به اسکلت قندی و گروه‌های C-O-C و C-O آنومریک قندها است. همه سویه‌ها به‌جز سویه تیمارشده با مس در ناحیه مربوط به گروه آمین تغییر شکل یافته (cm^-1 1244) پیک داشتند. تغییرات دیگر نیز در نواحی مربوط به گروه آمید و پیک مربوط به N-H و OH کششی در مقایسه سویه‌ها و کنترل دیده می‌شود. سویه‌ها در پیک مربوط به گروه کربونیل کششی و N-H و OH کششی که به‌ترتیب در ناحیه cm^-1 1654 و cm^-1 2935 دیده شدند، تغییراتی را نشان ندادند. نتایج مربوط به آنالیز FTIR ساختار پروتئین حاصل از سیانوباکتری Nostoc punensis تیمارشده با فلزات کروم، مس و نیکل تغییرات چندانی را در مقایسه با سویه کنترل نشان ندادند. در سویه تیمارشده با مس در ناحیه cm^-1 874، یک پیک جدید مشاهده شد که مربوط به پیوند β-گلیکوزیدی و گروه عاملی CO₃^2- است. علاوه بر این، در همین سویه در ناحیه cm^-1 1121 که مربوط به گروه عاملی NH₃ و PO₄^3- است، یک پیک جدید مشاهده شد. این ناحیه مربوط به اسکلت قندی و گروه‌های آنومریک قندها است (جدول 3).

جدول 2- مقایسه نتایج GC/MS حاصل از سویه شاهد و تیمار سیانوباکتری Nostoc punensis توسط فلزهای مس، نیکل و کروم

Table 2- Comparison of GC/MS results obtained from the control strain and Nostoc punensis cyanobacterium treatment by copper, nickel and chromium metals

جدول 3- مقایسه نتایج FTIR بین دو سیانوباکتری Nostoc punensis و Neowestiellopsis Persica A1387 تیمارشده با فلزات و سویه‌های شاهد

Table 3- Comparison of FTIR results between two cyanobacteria Nostoc punensis and Neowestiellopsis Persica A1387 treated with metals and control strains

بحث و نتیجه‌گیری

در این مطالعه با در نظر گرفتن توانایی‌های بالقوه سیانوباکتری‌ها در حذف فلزات سنگین کروم، نیکل و مس، از سیانوباکتری‌های آبزی و خاک‌زی
Nostoc punensis و Neowestiellopsis Persica A1387 استفاده شد. در این پژوهش، بعد از تلقیح فلزات سنگین مس، کروم و نیکل، غلظت محتوای اگزوپلی‌ساکاریدی، محتوای پروتئینی و کربوهیدرات تولیدشده توسط دو سویه، بررسی و با شاهد مقایسه شدند. همچنین از GC-MS و FT-IR به‌منظور بررسی میزان ترکیبات فرار مؤثر و گروه‌های عاملی دخیل در حذف فلزات سنگین استفاده شد.

افزایش روزافزونی مطالعات در استفاده از زیست‌توده‌های میکروبی برای جذب فلزات سنگین، فرایندی که معمولاً به‌عنوان جذب زیستی تعریف می‌شود، پتانسیل خوب این فناوری را برای غلبه بر محدودیت‌های مرتبط با روش‌های معمول مطرح می‌کند. مطالعات نشان دادند باکتری‌ها به‌دلیل نسبت سطح به حجم بالا و داشتن تعداد زیادی از مکان‌های جذب فعال بالقوه، جاذب‌های زیستی عالی هستند [14، 15].

در مطالعاتی که میچلتی و همکاران در سال ۲۰۰۷ انجام داده‌اند، توانایی حذف انتخابی فلزات سنگین مس، کروم یا نیکل به‌طور همزمان در محلول‌های آبی توسط سیانوباکتری‌های مختلف تولیدکنندة اگزوپلی‌ساکارید، ازجمله سویه نوستوک ارزیابی شده است. نتایج نشان دادند سویه Nostoc PCC 7936 گزینش ویژه و تقریباً انحصاری بالایی نسبت به حذف مس را دارد [16]. همچنین، کونور و همکاران در سال 2015، تیمار فلزات سنگین را ﺑﺎ ﺍﺳﺘﻔﺎﺩﻩ ﺍﺯ سویه‌هایChlorella vulgaris ، Scenedesmus quadricauda ﻭ Spirulina platensis بررسی کردند. نتایج نشان دادند این سویه‌ها قادر به ﺣﺬﻑ ﻣﺎﻻﺗﻴﻮﻥ ﺍﺯ ﻧﻤﻮﻧﻪﻫﺎﻱ ﻓﺎﺿﻼﺏ ﺑﺎ 99 درصد ﻛﺎﺭﺍﻳﻲ ﻭ ﺗﺠﻤﻊ ﺯﻳﺴﺘﻲ ﻧﻴﻜﻞ ﺗﺎ 95 درصد ﻛﺎﺭﺍﻳﻲ ﻫﺴﺘﻨﺪ. ﻋﻼﻭﻩ ﺑﺮ ﺍﻳﻦ، ﺗﻮﺍﻧﺎﻳﻲ ﺟﺬﺏ ﺳﺮﺏ ﻭ ﻛﺎﺩﻣﻴﻮﻡ ﺭﺍ ﺗﺎ ﺣﺪﻭﺩ 88 درصد ﻛﺎﺭﺍﻳﻲ ﺩﺍﺷﺘﻨﺪ [17]. همچنین قربانی و همکاران در سال ۲۰۲۲ حذف فلزات نیکل، کروم و مس را با استفاده از سیانوباکتری Nostoc sp بررسی کردند. نتایج نشان دادند سویه Nostoc sp. N27P72 به‌ترتیب حداکثر 188، 120، 100 میلی‌گرم بر گرم وزن سلول خشک و سویه Nostoc sp. FB71 به‌ترتیب 200، 140، 100 میلی‌گرم بر گرم وزن خشک سلول نیکل، مس و کروم را جذب می‌کردند [18].

نتایج این دانشمندان با پژوهش ما مطابق بود. با این تفاوت که در مطالعه ما، نتایج حاصل از تأثیر فلزات سنگین بر وزن خشک نشان دادند سویه Neowestiellopsis Persica A1387 در حذف فلزات سنگین سویه برتر بوده است. همچنین سویه Neowestiellopsis sp.، بیشترین میزان حذف را نسبت به نیکل نشان داده است که می‌تواند به این دلیل باشد که میزان بیومس سلولی و حذف فلزات رابطه مستقیمی با یکدیگر دارند.

همچنین در مطالعات دیگری که توسط سپوی و همکاران در سال ۲۰۲۲ انجام شد، عملکرد تجمع زیستی سویه ((Arthrospira platensis (Spirulina) در حذف فلزات سنگین بررسی شد. این دانشمندان، جذب فلز توسط زیست‌توده اسپیرولینا را با استفاده از تجزیه و تحلیل فعال‌سازی نوترون ارزیابی کردند. نتایج نشان دادند تجمع فلز در زیست‌توده به ترکیب پساب و غلظت یون فلز بستگی دارد. همچنین کاهش بهره‌وری (به‌طور متوسط
10 درصد) زیست‌توده اسپیرولینا رشدیافته در محیط‌های تیمارشده با نیکل، کروم، آهن، مس، استرانسیوم، روی و مولیبدن در طول اولین چرخه کشت مشاهده شد [19].

در برخی از مطالعات، دانشمندان نشان دادند سویه‌های سیانوباکتری که در تیمار با فلزات سنگین رشد می‌کنند،‌ حاوی محتوای رنگدانه‌ و محتوای پروتئین بالاتری نسبت به محیط‌های کشت استاندارد هستند؛ برای مثال، ‌مطالعاتی که توسط مصطفی ال-شیخ و همکاران در سال ۲۰۰۵ انجام شد نشان دادند دو سویه N. muscorum و
 A. sub- cylindrica محتوای پروتئینی و رنگدانه‌ای کلروفیل و کاروتنوئید بالایی را در تیمار با فلزات مس، ‌کبالت و سرب داشتند [20]. نتایج با پژوهش ما مطابقت داشتند. نتایج حاصل از محتوای پروتئینی در تیمار فلزات مس، نیکل و کروم توسط دو گونه Neowestiellopsis Persica A1387 و Nostoc punensis نشان می‌دهند سیانوباکتری Nostoc punensis ‌سویه برتر در تولید پروتئین بوده است. بیشترین میزان تولید پروتئین در این سویه در تیمار با فلز نیکل و کمترین تولید پروتئین در تیمار با فلز مس نشان داده شده است. مطالعات سپوی و همکاران در سال ۲۰۲۲ نشان دادند محتوای پروتئینی حدود ۱۵ تا ۲۷ درصد در سویه‌ Arthrospira platensis (Spirulina) در مواجه با فلز نیکل کاهش یافته است [19].

اگزوپلی‌ساکاریدهای سیانوباکتری، مجموعه‌ای از خواص بیوشیمیایی منحصربه‌فردی را ارائه می‌دهند که آنها را از نقطه‌نظر بیوتکنولوژی جالب می‌کند. این اگزوپلی‌ساکاریدهای پیچیده از حداقل 10 مونوساکارید مختلف تشکیل شده‌اند و با داشتن پنتوزها (معمولاً در پلی‌ساکاریدهای با منشأ پروکاریوتی وجود ندارد) و همچنین ماهیت آنیونی آنها به‌دلیل وجود قندهای اسیدی (گلوکورونیک و/یا گالاکتورونیک اسیدها) و جایگزین‌های آلی آنیونی (استیل و پیروویل) و معدنی (فسفات و سولفات) مشخص می‌شود [21]. مطالعات سهلان اوستورک و همکاران در سال ۲۰۱۴، حذف فلزات اگزوپلی‌ساکاریدهای سیانوباکتری با محتوای اسید اورونیک و ترکیب مونوساکاریدی را نشان دادند. این دانشمندان،‌ حذف فلزات سنگین کروم، کادمیوم و فلز مخلوط (کروم + کادمیوم) و ارتباط آن با اگزوپلی‌ساکاریدها و تولید اسیدهای اورونیک در سویه Synechocystis sp. را بررسی کردند. نتایج نشان دادند تولید اگزوپلی‌ساکارید توسط سویه Synechocystis sp، پس از قرارگرفتن در معرض کادمیوم افزایش یافت. ترکیب مونومر تولید اگزوپلی‌ساکارید نیز پس از تیمار با فلز تغییر کرد. همچنین، محتوای اسید گلوکورونیک و محتوای اسید گالاکتورونیک تولید اگزوپلی‌ساکارید با محتوای اسید اورونیک سلول‌ها ارتباط داشت [22]. نتایج در این پژوهش نشان دادند در تولید کربوهیدرات، سویه Neowestiellopsis Persica A1387 برتر بوده است. بیشترین میزان کربوهیدرات تولیدی در این سویه در تیمار با فلز نیکل و کمترین آن در تیمار با فلز مس نشان داده شده است.

طیف‌سنجی تبدیل رامان و فوریه به مادون قرمز ابزار مهمی برای شناسایی گروه‌های عاملی و برهمکنش‌های بین مولکول‌ها است. سهلان اوستورک و همکاران در سال ۲۰۱۴ با مطالعات حاصل از تجزیه و تحلیل طیف مادون قرمز تبدیل فوریه اگزوپلی‌ساکاریدها نشان دادند حضور گروه CH و CO ممکن است به‌عنوان مکان‌های اتصال برای کاتیون‌های دو ظرفیتی عمل کند [22].

نتیجه نهایی حاصل از این مطالعه نشان داد بیشترین میزان وزن خشک سلولی در کنترل مربوط به سویه Nostoc punensis است؛ اما در مواجهه با فلزات سنگین، سویه Neowestiellopsis Persica A1387، بیشترین میزان وزن خشک سلولی را در فلزات نیکل و کروم داشت. در مقابل، بیشترین میزان اگزوپلی‌ساکارید، کربوهیدرات و پروتئین در کنترل مربوط به سویه Neowestiellopsis Persica A1387 است؛ اما در مواجهه با فلزات سنگین، سویه Neowestiellopsis Persica A1387، بیشترین میزان اگزوپلی‌ساکارید، کربوهیدرات و پروتئین را در فلز نیکل داشت. این نتایج نشان می‌دهند بیومس سویه Nostoc punensis به شدت تحت‌تأثیر فلزات سنگین کاهش معناداری یافته است. علاوه بر آن، بالاترین میزان اگزوپلی‌ساکارید، کربوهیدرات و پروتئین در سویه Neowestiellopsis Persica A1387، بیشترین نقش را در مقاومت به نیکل دارد. همچنین نتایج حاصل از جذب اتمیک فلزات سنگین نشان دادند سویه Neowestiellopsis Persica A1387 در 10 دقیقه اول بیشترین میزان حذف فلز نیکل را نسبت به سویه Nostoc punensis داشت. نتایج حاصل از تکنیک طیف‌سنجی تبدیل رامان و فوریه در این پژوهش نشان دادند سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 مقاومت بیشتری نسبت به سیانوباکتری Nostoc punensis در تیمارهای فلزی از خود نشان داد. سویه برتر در حذف فلزات سنگین سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 بوده است. در رابطه با سیانوباکتری Neowestiellopsis Persica A1387 در ناحیه cm^-1 405 سویه کنترل پیک دیده شد که مربوط به گروه خمشی C-N بوده است. این پیک فقط در سویه تیمارشده با مس یافت شده است. در ناحیه cm^-1 575 سویه کنترل و سویه‌های تیمارشده با کروم و نیکل، پیک مربوط به گروه خمشی کربونیل (C=O) مشاهده شد؛ اما این پیک در سویه تیمارشده با مس دچار تغییرات شده بود. پیک‌های محدوده cm^-1 1000 مربوط به گروه‌های C-O پلی‌ساکاریدی و اسکلت قندی‌اند که در همه تیمارسویه Neowestiellopsis Persica A1387 و سویه کنترل دیده شدند. پیک‌های سویه تیمارشده با مس در بازة cm^-1 1115-1048 مربوط به کشش قوی PO₄^3- و ⁺NH₃ بوده است که مربوط به اسکلت قندی و گروه‌های C-O-C و C-O آنومریک قندها است. در نواحی cm^-1 1654و cm^-1 2935، پیک مربوط به گروه کربونیل کششی و N-H و OH کششی، ‌تغییراتی را نشان ندادند.