Phylogenetic Position of the Barnacle Chelonibia testudinaria Linnaeus, 1758 from the Persian Gulf

مقدمه

تحولات تاریخی زمین‌‌شناختی مانند یخبندان‌‌ها و رژیم‌‌های هیدروگرافی مثل جریان‌‌های اقیانوسی ازجمله عوامل مهم در شکل‌‌دهی الگوی تبارزادی و جغرافیای زیستی جانوران دریایی است (Porter, 1989; Hellberg, 2009; Woodruff, 2010)؛ اما موجودات مختلف ساکن یک منطقه به‌‌دلیل سبک‌‌های متفاوت زندگی و تفاوت در قدرت پراکنش، الگوهای متنوعی نشان می‌‌دهند (Grosberg & Cunningham, 2001; Bowen et al., 2013). خلیج فارس که دریایی نیمه‌‌بسته در شمال غرب منطقۀ اقیانوسی هند – آرام غربی شناخته می‌‌شود، به‌‌ظاهر به‌‌دلیل عمق کم، در دوره‌‌های یخبندان به‌‌طور تقریبی خشک و خالی از سکنه بوده است (Barth & Khan, 2008)؛ بنابراین به نظر می‌‌رسد اغلب ساکنین این خلیج بعد از یخبندان اخیر از آب‌‌های اطراف مثل دریای عمان و دریای عربی منشأ گرفته باشند (Sheppard et al., 2010). ناحیۀ هند - ‌‌آرام غربی یکی از متنوع‌‌ترین مناطق اقیانوسی ازنظر تنوع زیستی شناخته می‌‌شود (Roberts et al., 2002; Wafar et al., 2011). وجود خشکی‌‌های ممتد مثل شبه جزیرۀ مالایا و در امتداد آن جزایر سوماترا و جاوا این منطقۀ اقیانوسی را به دو بخش شرقی و غربی تقسیم کرده است. مطالعات مقایسه‌‌ای جغرافیای زیستی و بررسی فیلوجغرافیایی کمپلکس‌‌های گونه‌‌ای با کمک نشانگرهای مولکولی نیز این جدایی را تأیید می‌‌کند (Bowen et al., 2016)؛ برای مثال مطالعات فیلوجغرافیایی مولکولی روی خرچنگ‌‌های دوکمپلکس گونه‌‌ای Portunus pelagicus (Linnaeus, 1758) وNeosarmatium meinerti (De Man, 1887)  که یکی نمونۀ شناگر و دیگری ساکن جنگل‌‌های حرا است، وجود گونه‌‌های متفاوت در دو طرف این مرز اقیانوسی را نشان می‌‌دهد (Ragionieri et al., 2009; Lai et al., 2010).

کشتی‌‌چسب Chelonibia testudinaria (Linnaeus, 1758) گونه‌‌ای است که روی بدن سایر جانوران می‌‌چسبد و پراکنش جهانی دارد (Rawson et al., 2003). برای چندین سال‌‌ این گونه را دارای میزبان اختصاصی می‌‌دانستند که فقط روی بدن لاک‌‌پشت‌‌ها می‌‌چسبد؛ تا اینکه مطالعه‌‌ای مولکولی نشان داد نمونه‌‌های روی بسترهای مختلف ازجمله لاک‌‌پشت‌‌ها (C. testudinaria) و خرچنگ‌‌ها (C. patula) درواقع هم‌‌گونه‌‌هایی مشابه با تفاوت ناچیز ریختی هستند (Cheang et al., 2013). مطالعات فیلوجغرافیایی مولکولی نشان داده است نمونه‌‌های این گونه در سه تبار متمایز مربوط به سه حوزۀ مختلف اقیانوسی (اطلس، آرام شرقی و آرام غربی) قرار می‌‌گیرند (Rawson et al., 2003). این مطالعات نشان داد نمونه‌‌های غرب اقیانوس اطلس (نمونه‌‌های سواحل شرقی آمریکا) و شرق اطلس (نمونه‌‌های مدیترانه) در یک تبار و نمونه‌‌های غرب آرام از ژاپن تا سنگاپور نیز در یک تبار قرار می‌‌گیرند (Cheang et al., 2013). شایان ذکر است که این گونه از گونه‌‌های رایج در خلیج فارس و دریای عمان است؛ همچنین در مطالعات مختلف و از بسترهای متفاوت گزارش شده است (Shahdadi et al., 2014). در سال‌‌های اخیر مطالعات مولکولی متعددی برای تعیین هویت و بررسی جایگاه تبارزادی گونه‌‌های جانوری ایران انجام شده است (Sheikhalikalayeh & Ghasempouri, 2021; Shahdadi & Ghanbarifardi, 2021). مطالعۀ حاضر نیز در نظر دارد با استفاده از نشانگر مولکولی ناحیۀ بارکد ژن میتوکندریایی سیتوکروم اکسیداز 1 (COX1)، جایگاه تبارزادی نمونه‌‌های خلیج فارس را در بین نمونه‌‌های مناطق مختلف جهان نشان دهد.

مواد و روش‌‌ها

تعداد 10 نمونۀ کشتی‌‌چسب C. testudinaria از روی سپر پشتی دو نمونه خرچنگ Portunus segnis (Forscal, 1775) (شکل 1) برداشته و در اتانول 96 درصد نگهداری شد. نمونه‌‌های خرچنگ از آب‌‌های بین بندرعباس و قشم صید شد و در زمان برداشتن، نمونه‌‌های بارناکل زنده بود.

استخراج DNA به روش محلول نمک و از بافت پاهای رشته‌‌ای انجام شد. پاهای رشته‌‌ای در 200 میکرولیتر محلول لیزکنندۀ سلول قرار داده شد؛ سپس ضمن له‌‌کردن و هم‌‌زدن مداوم، محلول حدود 20 ساعت در دمای 65 درجۀ سانتی­گراد قرار داده شد. در مرحلۀ بعد، 70 میکرولیتر از محلول رسوب‌‌دهندۀ پروتئین به آن اضافه شد؛ پس از آن به‌‌خوبی هم زده و سپس سرد شد. پس از سانتریفیوژ، مایع رویی به 510 میکرولیتر الکل مطلق اضافه شد و در طول شب در فریزر قرار گرفت؛ سپس با استفاده از سانتریفیوژ یخچال‌‌دار به مدت 15 دقیقه در دور 14000، سانتریفیوژ و مایع رویی دور ریخته شد؛ سپس به رسوب کف لوله‌‌ها 25 میکرولیتر محلول بافر TE اضافه شد. پس از بررسی نمونه‌‌ها به کمک ژل آگاروز و اشعۀ ماوراءبنفش، نمونه‌‌های مناسب برای انجام واکنش زنجیره‌‌ای پلیمراز جدا شد.

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای رفت LCO1490 با توالی نوکلئوتیدی ’5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’ و برگشت HCO2198 با توالی نوکلئوتیدی ’5-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’ برای تکثیر قطعه‌‌ای با طول حدود 700 باز آلی از ژن سیتوکروم اکسیداز میتوکندریایی انجام شد (Folmer et al., 1994). واکنش در حجم 25 میکرولیتر (شامل 10 میکرولیتر آب، 12 میکرولیتر مستر میکس، یک میکرولیتر از هر آغازگر و یک میکرولیتر از DNA الگو) انجام شد. برنامه‌های سیکل حرارتی شامل 35 سیکل و به ترتیب زیر انجام شد: واسرشت‌‌سازی اولیه در دمای 94 درجۀ سانتی­گراد به مدت پنج دقیقه، واسرشت‌‌سازی‌‌های دوره‌‌ای در دمای 94 درجۀ سانتی­گراد به مدت 45 ثانیه، اتصال در دمای 48 درجۀ سانتی­گراد به مدت 45 ثانیه، تکثیر قطعه در دمای 72 درجۀ سانتی­گراد به مدت یک دقیقه و تکثیر نهایی در دمای 72 درجۀ سانتی­گراد به مدت پنج دقیقه. پس از بررسی کیفیت محصولات PCR روی ژل 5/1 درصد آگارز، نمونه‌هایی که مناسب تشخیص داده شد، برای توالی‌‌یابی به شرکت نیاژن نور (تهران) ارسال شد.

پس از دریافت توالی‌ها، ویرایش توالی‌های خام اولیه با کمک نرم‌افزار Choromas صورت گرفت؛ سپس توالی‌‌های این گونه از مناطق مختلف (از هر سه تبار مطالعات قبلی (Cheang et al., 2013)) از بانک ژن (NCBI) استخراج شد. دو توالی از گونۀ Chelonibia caretta (Spengler, 1790) نیز برای استفاده در جایگاه برون‌‌گروه از بانک ژن استخراج شد. به کمک نرم‌افزار Bioedit هم‌‌ترازسازی توالی‌ها صورت گرفت (Hall, 1999). برای ترسیم درخت، داده‌‌ با کمک نرم‌افزار AliView به فرمت PHYLIP تبدیل شد. درخت‌‌ حداکثر احتمال در نرم‌‌افزار raxmlGUI با 1000 تکرار بوتستراپ و با استفاده از مدل GTR+G رسم شد (Rodriguez et al., 1990; Silvestro & Michalak, 2012).

شکل 1- نمونه‌‌های کشتی‌‌چسب C. testudinaria روی سپر پشتی خرچنگ آبی P. segnis.

Figure 1 - Samples of the barnacle C. testudinaria on the carapace of the swimming crab P. segnis.

نتایج

تعداد نه توالی از نمونه‌‌های C. testudinaria از خلیج فارس به دست آمد. تعداد 49 توالی از این گونه مربوط به مناطق مختلف به همراه دو توالی از گونۀ C. caretta نیز از بانک ژن استخراج شد (شماره‌‌های دسترسی در درخت آورده شده است). درخت حداکثر احتمال به‌‌دست‌‌آمده (تصویر 2) حاوی سه تبار حمایت‌‌شدۀ مشخص و متمایز از گونۀ C. testudinaria است. تبار نخست شامل نمونه‌‌های غرب مکزیک (شرق اقیانوس آرام)، تبار دوم شامل نمونه‌‌های شرق آمریکا و یونان (مدیترانه) (تبار اطلس) و تبار سوم شامل سایر نمونه‌‌ها (شامل نمونه‌‌های هند – آرام غربی) می‌‌شود. همۀ نمونه‌‌های خلیج فارس به همراه نمونه‌‌های سنگاپور، مالزی، هنگ‌‌کنگ، تایوان و ژاپن در تبار هند و آرام غربی قرار گرفت. در این تبار نمونه‌‌های ژاپن در قاعده و سایر نمونه‌‌ها در زیرتباری با حمایت بوتستراپ 60 قرار گرفت. نمونه‌‌های خلیج فارس در سراسر این زیرتبار پخش شده است و جدایی خاصی از سایر نمونه‌‌های آسیای شرقی نشان نمی‌‌دهد.

شکل 2- درخت حداکثر احتمال ژن COX1 برای نمونه‌‌های گونۀ C. testudinaria از سراسر دنیا، رسم‌‌شده با نرم‌‌افزار raxmlGUI. نمونه‌‌های خلیج فارس با رنگ قرمز مشخص شده است. دو توالی C. caretta در جایگاه برون‌‌گروه انتخاب شد. اعداد روی شاخه‌‌ها مربوط به بوتستراپ است.

Figure 2 - Maximum Likelihood Gene Tree for COX1 gene of C. testudinaria samples from around the world, constructed using the software raxmlGUI. Samples from the Persian Gulf are highlighted in red. Two sequences of C. caretta were chosen as outgroups. Numbers on branches represent bootstrap support.

بحث

نتایج مطالعۀ حاضر نشان داد نمونه‌‌‌‌های خلیج فارس متعلق به تبار آسیای شرقی است (شکل 2). این الگوی تبارزادی نشان داد مرز موجود (جداکنندۀ شرق و غرب) در ناحیۀ اقیانوسی هند – آرام غربی (Bowen et al., 2016) بین جمعیت‌‌های این گونه در شرق آسیا و غرب اقیانوس هند جدایی ایجاد نکرده است. این نزدیکی تبارزادی نمونه‌‌های مربوط به مناطق جغرافیایی دور از هم (ژاپن، تایوان تا خلیج فارس) نشان از قدرت زیاد پراکنش این گونه دارد؛ همچنین این توانایی پراکنش موجب نزدیکی تبارزادی نمونه‌‌های شرق و غرب اطلس شده است (Rawson et al., 2003)؛ این درحالی است که بسیاری از سخت‌‌پوستان، چه آنهایی که خود در سواحل زیست می‌‌کنند ولی لارو پلانکتونی دارند (مثل کمپلکس گونه‌‌ایی خرچنگ N. meinerti) (Ragionieri et al., 2009) و چه آنهایی که هم خود پلاژیک و هم لارو پلانکتونی (مثل کمپلکس گونه‌‌ای خرچنگ P. pelagicus) (Lai et al., 2010) دارند، الگویی متفاوت نشان می‌‌دهند. خرچنگ‌‌های گفته‌‌شده در دو طرف مرز یادشده در تبارهای متفاوت قرار می‌‌گیرند و جدایی تاریخی در الگوی تبارزادی نشان می‌‌دهند. کشتی‌‌چسب‌‌‌‌های ساحلی متعلق به کمپلکس گونه‌‌ای Chthamalus malayensis Pilsbry, 1916 نیز واگرایی‌‌های تبارزادی در جمعیت‌‌های مناطق مختلف هند – آرام غربی نشان می‌‌دهند (Simon-Blecher et al., 2021)؛ اما مطالعات مولکولی انجام‌‌شده روی گونۀ C. testudinaria، جدایی نمونه‌‌های مربوط به حوزه‌‌های مختلف اقیانوسی را نشان می‌‌دهد (Rawson et al., 2003; Cheang et al., 2013). شواهد موجود نشان می‌‌دهد باوجود توانایی پراکنش زیاد، نمونه‌‌های این گونۀ کشتی‌‌چسب نتوانسته است از مرز بین این حوزه‌‌های اقیانوسی عبور و ساختار تبارزادی جهانی همگنی ایجاد کند. با توجه به کوتاهی دورۀ لاروی و محدودیت قدرت شنای لاروهای پلانکتونی سخت‌‌پوستان، بعید است که این گونه خود توانسته باشد در سراسر منطقۀ هند – آرام غربی پراکنش داشته باشد؛ به‌‌ویژه اینکه شواهد متعدد در سایر سخت‌‌پوستان و حتی کشتی‌‌چسب‌‌ها این محدودیت‌‌ها را تأیید می‌‌کند. یکی از اصلی‌‌ترین میزبان‌‌های این گونۀ کشتی‌‌چسب، خرچنگ‌‌های شناگر هستند که خود نیز ساختار تبارزادی متفاوت و گسسته‌‌ای را در منطقه نشان می‌‌دهند (Lai et al., 2010) و نمی‌‌توانند حامل‌‌های مناسبی برای جابجایی بین جمعیت‌‌های دور از هم باشند. با توجه به جدایی تبار‌‌های اقیانوسی، به نظر می‌‌رسد این گونه نتوانسته است مانند گونۀ Amphibalanus amphitrite (Darwin, 1854) (Chen et al., 2014) ازطریق کشتی‌‌ها (فعالیت زی‌‌چسبندگی و آب توازن) جابجا شود. با توجه به قدرت نسبی زیاد پراکنش لاک‌‌پشت‌‌های دریایی و طی‌‌کردن مسافت‌‌های به‌‌نسبت طولانی (Hays, 2002)، به نظر می‌‌رسد حامل اصلی این گونۀ کشتی‌‌چسب برای ارتباط جمعیت‌‌های دور از هم، همین لاک‌‌پشت‌‌های دریایی باشند.