پاسخ‌های فیزیولوژیک Spirulina platensis به نانوذرات تیتانیوم و سیترات

مقدمه

عنصر تیتانیوم، جزو عناصر ضروری برای رشد گیاهان نیست ولی برخی شواهد نشان می‌دهد که در مواردی به بهبود، فرآیندهای متابولیکی آنها منجر شده است(Gohari et al., 2022; Carvajal and Alcaraz 1998). نانوذرات TiO₂ در فرم های مختلف، کاربردهای فراوانی در صنعت دارند و بنابراین، امکان راهیابی آنها به اکوسیستم‌های آبی و تأثیر بر موجودات آبزی وجود دارد. در واقع، نانوذرات دی اکسید تیتانیوم NPs) (TiO₂ نسبت به سایر نانوذرات فلزی، دارای سمیت کمتری بوده و در سه شکل کریستالی آناتاز، روتایل و بروکیت وجود دارند (Yang et al., 2015). فرم کریستالی آناتاز یک تتراگونال است که از چهار واحد آناتاز تشکیل شده و فرم کریستالی روتایل یک فرم تتراگونال متشکل از دو واحد TiO₂ روتایل است. پایداری روتایل در دماهای مختلف محیطی از آناتاز بیشتر است(Oi et al., 2016) . دو فرم آناتاز و روتایل، خواص سطحی مختلف، واکنش‌پذیری و سمیت‌زایی متفاوتی دارند (Parrino et al., 2021). روتایل چربی دوست، و آناتاز آب دوست است (Clement et al., 2013; Warheit et al., 2007). برخی مطالعات نشان داده‌اند که آناتاز سمیت سلولی و فعالیت فتوکاتالیستی بیشتری نسبت به فرم روتایل نشان می‌دهد (Clement et al., 2013)، زیرا سبب وقوع واکنش‌های اکسیداسیون بر روی سطح و در شعاع اطراف ذرات و درنتیجه تولید ROS زیادی می‌شود. تشکیل رادیکال‌های آزاد هیدروکسیل و هیدروپراکسیل می‌توانند موجب آسیب به غشاهای سلولی شوند (Odling and Robertson, 2015) . البته برخی منابع TiO₂، را دارای سمیت پایین و کم ذکر می‌کنند (Parrino et al., 2021). با این‌حال تأثیرات نانوذره TiO₂ بستگی به نوع موجود زنده مورد بررسی، غلظت نانوذره، ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی و مورفولوژیک نظیر اندازه و ساختار کریستالی آن دارد.

میکروجلبک S. platensis، یک میکروجلبک سبز-آبی رشته‌ای، مارپیچی و فتوسنتز‌کننده از خانواده Oscillatoriaceae است که به دلیل کاربردهای اقتصادی متعدد از جمله به‌عنوان کود و تقویت کننده در کشاورزی، مورد توجه محققان قرار دارد (Godlewska et al., 2019; Deng and Chow, 2010). رنگدانه اصلی فتوسنتزی در این میکروجلبک، کلروفیل a بوده و همچنین، دارای رنگدانه‌های فیکوبیلین، گزانتوفیل و کاروتن‌ها است که از نظر اقتصادی حائز اهمیت هستند (Yaakob et al., 2014; Hoseini et al., 2013). میکروجلبک S. platensis دارای مقدار زیادی پروتئین در حدود 55 تا 70 درصد وزن خشک هست که حاوی کلیه اسیدهای آمینه ضروری است (Sharma et al., 2019). این میکروجلبک همچنین، دارای کربوهیدرات و مقادیر زیادی اسیدهای چرب غیر اشباع با زنجیره بلند و امگا-6 بوده و دارای ویتامین‌ها، عناصر معدنی و آنتی‌اکسیدان‌های طبیعی نیز است (Habib et al., 2008). در مقایسه با سایر جلبک‌های سبز-آبی هیچ اثر سمیتی از S. platensis گزارش نشده است (Habib et al., 2008). در سال‌های اخیر، توجهات زیادی به ترکیبات بیواکتیوجلبک‌ها شده است و تنش‌های نانوفلزات، ممکن است روشی برای تحریک بیوسنتز محصولات زیستی در فتوبیوراکتورهای رشد میکروجلبک‌ها باشند. مطالعات نشان داده است که افزودن 1/0 گرم در لیتر نانوذرهTiO₂ در حضور تابش UV-A، تولید اسیدهای چرب را بدون کاهش رشد در سلول‌های Chlorella vulgaris افزایش داده (Kang et al., 2014) یا نانوذرات آهن (1/5 میلی‌گرم در لیتر) برای افزایش مقدار لیپید در کشت‌های Arthrospira maxima،Desmodesmus subspicatus و Parachlorella kessleri به کارگرفته شده است (Padrova et al., 2014). یون‌های فلزی آزاد شده از نانوذرات می‌توانند رشد جلبک‌های سبز و سبز-آبی را القا کنند (Miazek et al., 2015) با این حال، نانوفلزات ممکن است سبب کاهش رشد میکروجلبک ها نیز شوند (Chen et al., 2012). در واقع، نانوذرات فلزی (NPs) پاسخ‌های سلولی را از طریق تولید ROS، یون‌های فلزی آزاد شده، آسیب مکانیکی یا ایجاد سایه و برهم‌کنش با اجزای محیط کشت القا می‌کنند(Xia et al., 2015; Suman et al., 2015; Manier et al., 2013; Sadiq et al., 2011).

اسید سیتریک یک اسید تری‌کربوکسیلیک طبیعی آلی است که در بسیاری از فرآیندهای بیولوژیک مانند تنفس سلولی و اکسیداسیون کربوهیدرات‌ها، چربی‌ها و پروتئین‌ها دخالت دارد (Mudunkotuwa and Grassian, 2010). تحقیقات نشان داده که کمپلکس سیترات- نانوفلز می‌تواند، سبب تسهیل ورود نانوفلز به همراه سیترات به درون سلول شود (Rupasinghe, 2011) و از این‌رو فرم سیتراته نانوفلزات برای پرورش گیاهان توصیه شده‌اند (Chandrika et al., 2021). برخی تحقیقات بر روی گیاهان نیز نشان داده‌اند که سیترات سبب کاهش آثار منفی نانوذرات می‌شود (Tirani et al., 2018).

در واقع، در نقش کلاتوری سیترات در کمپلکس‌هایی نظیر سیترات-آهن، پیوند ایجاد شده با فلز محکم است (Yang et al., 2016)، اما سیترات می‌تواند بر روی اکسیدهای نانوذرات، از طریق پیوندهای واندروالس جذب سطحی شده مانع از چسبیدن ذرات به یکدیگر و بنابراین، سبب پراکنده‌شدن نانوذرات در محیط می‌‌شود (Park and Shumaker-Parry 2014; Rupasinghe 2011; Mudunkotuwa and Grassian, 2010). این مسأله نشان می‌دهد که بنابراین، جذب ترکیبات آلی بر روی سطح نانوذرات می‌تواند رفتار آنها و تأثیر آنها بر سلول زنده را تغییر دهد (Rupasinghe, 2011).

در مجموع، علی‌رغم استفاده‌های گسترده از فرم‌های مختلف نانو TiO₂، هنوز تأثیرات احتمالی تحریک کننده آن در القای پاسخ‌های سلولی میکروجلبک‌ها و همینطور آثار منفی آن به طور کامل مشخص نشده است. همچنین، بررسی تأثیر تعامل ذرات با سیترات در تأثیر بر میکروجلبک، نیز از اهداف این تحقیق است. بنابراین، در این مطالعه تأثیر فرم‌های آناتاز و روتایل نانو TiO₂ در مقایسه با فرم بالک (توده‌ای) به همراه سیترات یا بدون آن، بر روی رشد، بیوماس و ترکیبات درون سلولی میکروجلبک S. platensis در یک دوره 5 روزه، بررسی شد.

مواد و روش‌ها

کلیه مواد لازم برای تهیه محیط کشت‌های جلبک از شرکت سیگما یا مرک آلمان خریداری شدند. برای رشد میکروجلبک از محیط کشت Zarrouk استفاده شد (Raoof et al., 2006). نانوذرات آناتاز 25-10 نانومتر(Purity 99.9% ,Specific surface area, SSA 200-240 m² g^-1)، نانوذرات روتایل30 نانومتر، (Purity 99.9% ,SSA 35-60 m² g^-1) و نمونه بالک (قطر ذرات کمتر از 500 نانومتر) از شرکت US Research Nanomaterials, Inc, خریداری و استفاده شدند.

 طراحی تیمارهای آزمون و شرایط کشت

تیمارها به تعداد 32 عدد و به‌صورت جدول شماره 1 طراحی شدند. نمونه S، سوسپانسیون جلبکی شاهد بدون هرگونه تیمار بود. در نمونه‌های حاوی سیترات و TiO₂، مقدار سیترات به دی اکسید تیتانیوم به نسبت مولی 5/3 به 1 استفاده شد (Mudunkotuwa and Grassian, 2010). در نمونه C که صرفاً دارای سیترات بود، مقدار سیترات معادل مقدار آن در تیمار 200 میلی‌گرم بر لیترTiO₂ ، در نظر گرفته شد.

نمونه‌های شاهد و تیمار پس از تهیه، همگی در محیط آزمایشگاهی کنترل شده از نظر شرایط نوری (100 میکرومول بر مترمربع بر ثانیه) با فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و دمای 2 ± 28 درجه سانتیگراد در مدت 5 روز قرار داده شدند. هوادهی توسط پمپ‌های هوا انجام و نمونه‌برداری و سنجش شاخص‌ها در روزهای صفر (روز تلقیح)، 3 و 5 آزمایش انجام شد. به‌منظور استخراج کامل ترکیبات درون سلولی، بر روی بیوماس جلبکی پس از برداشت، چند بار مراحل فریز شدن- گرم کردن و سپس سونیکیشن (80 هرتز دمای 40 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه) انجام شد.

کلیه مراحل اسپکتروفتومتری و خوانش جذب نمونه‌ها، به جز شاخص‌های ROS، MDA، و DPPH، با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر،(آمریکا - مدل6405  (JEN Way, انجام شد. میزان جذب نمونه‌ها در سنجش‌های ROS، MDA، و DPPH با اسپکتروفتومتر 96-well microplate reader, Epoch-BioTek, Winooski, USA ، خوانده شدند.

اندازه‌گیری وزن خشک

مقادیر همگنی از سوسپانسیون سلولی، پس از سانتریفیوژ (g 10000 ، 15 دقیقه) وزن شد. برای حذف هر گونه نمک، سطح بیوماس تر جلبک، 2 تا 3 بار با آب مقطر شستشو و سپس در دمای 75 درجه سانتیگراد به مدت 6 ساعت خشک و وزن شد.

سرعت رشد ویژه ماکزیمم (µm, maximum specific growth rate)

نرخ یا سرعت رشد ویژه یکی از شاخص های روتین برای رشد سلولی است و بر اساس وزن خشک و زمان از رابطه محاسبه 1می‌شود.

رابطه 1:

μ_m (Cell weight day^-1) = ln (x₂-x₁)(t₂-t₁)^-1

X₁: وزن توده خشک جلبک در زمان t₁، X₂، وزن توده خشک جلبک در زمان t₂ (Madkour et al., 2012).

سنجش کلروفیل a

برای سنجش رنگدانه کلروفیل از بیوماس تر جلبک و متانول 95 درصد و حمام آب گرم 60 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه برای خروج رنگدانه‌ها، استفاده شد. جذب کلروفیل در طول موج 665 نانومتر خوانده و مقدار آن بر اساس

فرمول های مربوطه محاسبه شد (Bennett and Bogorad, 1978).

سنجش کاروتنوئید کل

برای سنجش کاروتنوئید کل، از بیوماس تر جلبک و از استون 85 درصد به عنوان حلال استفاده و جذب در 450 نانومتر خوانده و مقدار آن بر اساس فرمول مربوطه محاسبه شد (Devanathan and Ramanathan, 2013).

سنجش فیکوبیلین‌ها

استخراج با استفاده از بافر فسفات نمکی (05/0 مولار فسفات سدیم،  15/0 مولار نمک و اسیدیته 7)، انجام (Moraes et al., 2011) و جذب محلول در طول موج‌های 615، 652 و 562 نانومتر خوانده شد و مقادیر رنگدانه‌های فیکوسیانین، آلوفیکوسیانین و فیکواریترین محاسبه شدند (Bennett and Bogorad, 1978).

جدول 1. شرح تیمارهای طراحی شده نانو دی اکسید تیتانیوم _.

Table 1– Description of designed Nano TiO₂ treatments.

سنجش آستاگزانتین

استخراج برای سنجش آستاگزانتین با استفاده از وزن خشک جلبک و حلال دی متیل سولفوکسید (DMSO) در حمام آب گرم 60 درجه سانتیگراد انجام و پس از سانتریفیوژ به آن استون اضافه شد. میزان جذب محلول در طول موج 489 نانومتر خوانده و مقدار رنگدانه برحسب میلی‌گرم در گرم وزن خشک تعیین شد (Ni et al., 2008).

سنجش قند محلول کل

اندازه‌گیری قند کل برمبنای روش Albalasme و همکاران (2013) انجام شد. بیوماس تر حاصل از 1 میلی‌لیتر از سوسپانسیون همگن جلبکی (پس از انجام مراحل فریز-آب نمودن، سونیکیشن، سانتریفیوژ و دور ریختن محلول رویی) با 5/1 میلی‌لیتر اسید سولفوریک غلیظ به سرعت مخلوط و ورتکس شد. افزایش دمای محلول حاصل از افزودن اسیدسولفوریک غلیظ، به سرعت بر روی یخ (تا رسیدن به دمای اتاق) کاهش یافت. در نهایت تغییرات جذب نوری محلول در 315 نانومتر خوانده شد. از D-گلوکز برای تهیه سریال غلظت و ترسیم منحنی استاندارد استفاده شد.

سنجش پروتئین محلول کل

محتوای پروتئین با استفاده از معرف کوماسی برلیانت بلو و خواندن جذب نمونه در طول موج 595 نانومتر سنجش شد. از سرم آلبومین گاوی (BSA) برای رسم منحنی استاندارد استفاده شد (Bradford, 1976).

سنجش لیپید کل

از بیوماس تر S. platensis و مخلوط 2:1 کلروفرم: متانول (V/V) استفاده و سپس سونیکیشن (80 هرتز، 15 دقیقه و 45 درجه سانتیگراد) انجام شد. از کاغذ صافی شماره 1، برای جداسازی محلول حاوی لیپید از باقیمانده سلولی استفاده شد و محلول به دست آمده در g 5000 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ و وزن لیپید خالص هر نمونه محاسبه و تعیین شد (Bligh and Dyer, 1959).

سنجش شاخص‌های آنتی اکسیدانی/ اکسیدانی

ارزیابی میزان پراکسیداسیون لیپیدی

میزان پراکسیداسیون لیپیدی غشاها بر اساس سنجش غلظت مالون‌دی‌آلدهید (MDA) با روش Hodges و همکاران (1999) انجام شد. استخراج بهینه به کمک محلول 80:20(v/v) ، از آب: اتانل انجام شد. پس از سانتریفیوژ، محلول رویی یکبار با –TBA (فاقد تیوباربیتوریک اسید) و بار دیگر و به طور جداگانه با +TBA (دارای تیوباربیتوریک اسید) حل شد. نمونه‌ها به شدت ورتکس و در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 25 دقیقه قرار داده شدند و سپس سرد شدند. میزان جذب نوری در طول موج‌های440، 532 و 600 نانومتر خوانده شد. مقادیر مالون‌دی‌آلدهید محاسبه و به صورت درصد در وزن خشک جلبک گزارش شد.

سنجش فعالیت آنتی اکسیدانی (مهار رادیکال آزاد(DPPH

فعالیت آنتی اکسیدانی کل به وسیله مهار رادیکال آزاد 1و1- دی فنیل -2- پیکریل هیدرازیل (DPPH) سنجش شد. استخراج با استفاده از محلول 1:10 متانول: اتانول انجام شد و سپس محلول DPPH در متانول اضافه شد. پس از انکوباسیون در دمای اتاق به مدت 30 دقیقه، جذب در 520 نانومتر خوانده و فعالیت آنتی‌اکسیدانی کل محاسبه شد (Shalaby and Shanab, 2013).

سنجش ROS

برای ارزیابی مقدار رادیکال‌های آزاد اکسیژن از معرف زایلنول اورنج اسیدی استفاده شد (Bindschedler et al., 2001). به‌منظور استخراج ROS از وزن تر جلبک و بافر فسفات 50 میلی‌مولار با اسیدیته 8/6 استفاده و پس از استخراج رادیکال‌های آزاد، جذب نوری محلول حاصل در طول موج 560 نانومتر خوانده شد. ازH₂O₂ 30 درصد برای رسم منحنی استاندارد استفاده و نتایج حاصل بر حسب میکرومول بر گرم وزن تر جلبک بیان شدند.

آنالیز آماری داده‌ها

آزمون‌ها در قالب یک طرح کاملاً تصادفی به صورت فاکتوریل در سه تکرار انجام شدند. تحلیل آماری واریانس ANOVA و مقایسات میانگین چند دامنه‌ای دانکن با نرم افزار (V. 16) SPSS انجام شد.

نتایج

در بررسی مقایسه‌ای تأثیر تیمارهای بالک و نانوذرات آناتاز و روتایل، تغییرات وزن خشک و سایر شاخص‌ها‌ی رشد، رنگیزه‌های فتوسنتزی و فعالیت‌های اکسیدانی/آنتی اکسیدانی بررسی شدند. براساس نتایج به‌دست آمده از آنالیز واریانس (جداول 2 و 3) کلیه تأثیرات متقابل چهارتایی معنی‌دار (P<0.01,0.05) بودند.

تأثیر تیمارهای TiO₂ بر تغییرات شاخص‌های رشد میکروجلبک 

شکل 1- الف، تأثیر تیمارها بر بیوماس خشک میکروجلبک  S. platensis را نشان می‌دهد. در نمونه شاهد S، بیوماس خشک بر اثر گذشت زمان افزایش یافت. تیمار زمان به جز در غلظت‌های نانوذره روتایل، تقریبا در اغلب غلظت‌های مختلف فرم بالک و نانوذره آناتاز سبب کاهش معنی‌دار (p<0.05) بیوماس خشک در روز پنجم نسبت به شاهد S شد. نانوذره روتایل چه با سیترات و چه بدون آن، سبب افزایش قابل توجه بیوماس خشک در روز پنجم تنش شد. مقایسه نتایج تأثیر فرم‌های مختلف تیتانیوم فاقد سیترات با نمونه شاهد بدون سیترات (S)، نشان می‌دهد که کاهش وزن خشک در تیمارهای فرم بالک و آناتاز در روز پنجم مشاهده شد، درحالی‌که بیشترین افزایش‌ در تیمار نانوذره روتایل هم در غلظت‌‌های اولیه 5/12 و 25 میلی‌گرم در لیتر و هم در بیشترین غلظت (200 میلی‌گرم در لیتر) وجود داشت و غلظت‌های میانی در نانوذره روتایل فاقد سیترات افزایش کمتری نسبت به سایر غلظت‌ها در این تیمار و نیز نسبت به نمونه S نشان دادند.

بررسی تأثیر سیترات به تنهایی (C)، حاکی از عدم تغییر معنی‌دار (p<0.05) مقدار بیوماس خشک نسبت به نمونه شاهد فاقد سیترات (S) در هر دو روز سوم و پنجم بود. در تأثیر همزمان سیترات و تیتانیوم، در غالب غلظت‌ها در فرم بالک و نانوذره آناتاز کاهش وزن خشک وجود داشت اما در کلیه غلظت‌های نانو ذره روتایل افزایش معنی‌دار (p<0.05) وزن خشک نسبت به شاهد C مشاهده شد. در مجموع، اکثر تیمارهای مختلف اکسید تیتانیوم به جز نانوذره روتایل به تنهایی و یا با افزودن سیترات (R, R+C)، سبب کاهش بیوماس خشک شدند اما نانو ذره روتایل در روز پنجم در کلیه غلظت‌ها و تیمارهای بالک صرفا در روز سوم، سبب افزایش  معنی‌دار (p<0.05) بیوماس خشک شدند.

جدول 2- تجزیه واریانس شاخص‌های فیزیولوژیک جلبک S. platensis تحت تأثیر فرم‌های TiO₂، غلظت TiO₂، وجود یا عدم وجود سیترات و مدت زمان تنش (0، 3 و 5 روز). Df: درجه آزادی، Dw: وزن خشک، µm: نرخ رشد ویژه ماکزیمم، Chl a: کلروفیل a، PC: فیکوسیانین، APC: آلوفیکوسیانین.

Table 2- Variance analysis of the physiological indices of S. platensis algae under treatment of theTiO₂ forms, TiO₂ concentration, presence or absence of citrate and duration of stress (0, 3 and 5 days). Df, degree of freedom; DW, dry weight; µm, maximum specific growth rate; Chl a, chlorophyll a; PC, phycocyanin; APC, allophycocyanin.

* و ** به ترتیب معنی‌دار در سطح 05/0 و 01/0 و ns ، نشان دهنده عدم معنی‌داری هستند.

جدول 3- تجزیه واریانس شاخص‎های فیزیولوژیک جلبک S. platensis تحت تأثیر فرم‌های TiO₂، غلظت TiO₂، وجود یا عدم وجود سیترات و مدت زمان تنش (0، 3 و 5 روز). :Df درجه آزادی، PE: فیکواریترین، MDA: مالون دی آلدهید،ROS : گونه‌های فعال اکسیژن.

Table 3- Variance analysis of the physiological indices of S. platensis algae under treatment of theTiO₂ forms, TiO₂ concentration, presence or absence of citrate and duration of stress (0, 3 and 5 days). Df, degree of freedom; PE, phycoerythrin; MDA, malondialdehyde; ROS, reactive oxygen species.

* و ** به ترتیب معنی‌دار در سطح 05/0 و 01/0 و ns ، نشان دهنده عدم معنی‌داری هستند.

شکل 1-ب، تأثیر تیمارها بر سرعت رشد ویژه ماکزیمم (µ_m) در میکروجلبک  S. platensis را نشان می‌دهد. در شاهد S، شاخص µ_m بر اثر گذشت زمان (از روز سوم به پنجم) افزایش یافت. از میان تیمارها، کلیه غلظت‌های فرم بالک سبب افزایش شاخص µ_m و تیمارهای آناتاز و روتایل- سیترات (R+C) سبب کاهش آن، در روز سوم تنش شدند. در روز پنجم آزمون، غالب غلظت‌های فرم‌های آناتاز و روتایل، سبب افزایش سرعت رشد، نسبت به روز سوم شدند. در مقایسه تأثیر تیمارهای فاقد سیترات با نمونه شاهد بدون سیترات (S)، نانوذره روتایل سبب افزایش معنی‌دار (p<0.05) شاخص µ_m شد و بیشترین مقدار در غلظت‌های ابتدایی و انتهایی روتایل (R5) در روز پنجم مشاهده شد.

بررسی تأثیر سیترات نشان داد با آنکه میزان µ_m تحت تأثیر تیمار سیترات (C) در روز سوم، نسبت به مقدار آن در شاهد بدون سیترات (S) به‌صورت معنی‌دار (p<0.05) افزایش یافت، اما این افزایش قابل توجه نبود. همچنین، در مورد تأثیر همزمان سیترات و تیتانیوم، تیمارهای فرم روتایل- سیترات سبب افزایش شاخص µ_m شدند، درحالی‌که غلظت‌های بیشتر R+C ، سبب کاهش سرعت رشد شدند. در کل، فرم‌های مختلف اکسید تیتانیوم به تنهایی و یا با افزودن سیترات، به جز تیمارهای روتایل (R, R+C) سبب کاهش شاخص µ_m در روز پنجم شدند، و نانوذره روتایل در روز پنجم تنش سبب افزایش شاخص µ_m شد.

تأثیر تیمارها بر رنگیزه‌های فتوسنتزی

بر اساس شکل 2-الف، در نمونه شاهد S، مقدار کلروفیل a با گذشت زمان تغییر نکرد. همه غلظت‌های بالک (با یا بدون سیترات) و غالب تیمارهای روتایل (به‌ویژه در روز پنجم) سبب کاهش معنی‌دار (p<0.05) مقدار کلروفیل نسبت به شاهدهای S و C شدند. اما تأثیر نانوذره آناتاز، به صورت دارا بودن محتوای بیشتر کلروفیل a در سلولها نسبت به سایر تیمارها نمایان شد. بررسی تأثیر سیترات (C)، نشان‎دهنده عدم تغییر معنی‌دار (p<0.05) مقدار کلروفیل a نسبت به نمونه شاهد فاقد سیترات (S) بود.

شکل1- بیوماس خشک (الف) و سرعت رشد ویژه ماکزیمم (µ_m) (ب). S: سوسپانسیون میکروجلبک فاقد سیترات (شاهد S)، C: سوسپانسیون میکروجلبک دارای سیترات (شاهد C)،B1  تا B5 بالک TiO₂،B1+C  تا B5+C بالک و سیترات،A1  تا A5 نانوآناتازTiO₂ ،A1+C  تا A5+C نانوآناتاز و سیترات،R1  تا R5 نانوروتایلTiO₂ ، R1+C  تا R5+C نانو روتایل و سیترات، اعداد 1 تا 5، به‌ترتیب غلظت‌های 5/12، 25، 50، 100، و 200 میلی‌گرم بر لیتر TiO₂ در روزهای سوم و پنجم آزمون. داده‌ها میانگین سه تکرار SD± بوده و حروف متفاوت نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار براساس آزمون دانکن در سطح p< 0.05 است.  

Figure 1-dry biomass (A) and maximum specific growth rate (µm) (B). S, microalgal suspension without citrate (control S); C, microalgal suspension with citrate (control C); B1 to B5 bulk TiO₂; B1+C to B5+C bulk and citrate; A1 to A5 nanoanatase TiO₂; A1+C to A5+C nanoanatase and citrate; R1 to R5 nanorutile TiO₂; R1+C to R5+C nano rutile and citrate; Numbers 1 to 5, respectively, concentrations of 12.5, 25, 50, 100, and 200 mg L^-1 TiO₂ at 3 and 5 days of the experiment. The data is the average of three replicates±SD, and different letters indicate significant differences based on Duncan's test at p<0.05.

شکل 2- رنگدانه های کلروفیل a (الف)، کاروتنوئید کل (ب)، آستئاگزانتین (ج). S: سوسپانسیون میکروجلبک فاقد سیترات (شاهد S)، C: سوسپانسیون میکروجلبک دارای سیترات (شاهد C)،B1  تا B5 بالکTiO₂،B1+C  تا B5+C بالک و سیترات،A1  تا A5 نانوآناتازTiO₂ ،A1+C  تا A5+C نانوآناتاز و سیترات،R1  تا R5 نانوروتایلTiO₂ ، R1+C  تا R5+C نانو روتایل و سیترات، اعداد 1 تا 5 به‌ترتیب غلظت‌های 5/12، 25، 50، 100، و 200 میلی‌گرم بر لیتر TiO₂ در روزهای سوم و پنجم آزمون. داده‌ها میانگین سه تکرار SD± بوده و حروف متفاوت نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار براساس آزمون دانکن در سطح p< 0.05 است.  

Figure 2- Pigments Chlorophyll a (A), Total Carotenoid (B), Astaxnathin (C). S, microalgal suspension without citrate (control S); C, microalgal suspension with citrate (control C); B1 to B5 bulk TiO₂; B1+C to B5+C bulk and citrate; A1 to A5 nanoanatase TiO₂; A1+C to A5+C nanoanatase and citrate; R1 to R5 nanorutile TiO₂; R1+C to R5+C nano rutile and citrate; Numbers 1 to 5, respectively, concentrations of 12.5, 25, 50, 100, and 200 mg L^-1 TiO₂ at 3 and 5 days of the experiment. The data is the average of three replicates ±SD, and different letters indicate significant differences based on Duncan's test at p<0.05.

شکل 2-ب، مقدار کاروتنوئید کل جلبک را برحسب میکروگرم در گرم وزن خشک نشان می‌دهد. در نمونه شاهد S، مقدار کاروتنوئید با گذشت زمان تنش کاهش یافت. روند کاهش مقدار کاروتنوئید در روز پنجم تنش نسبت به روز سوم، تقریباً در کلیه تیمارها مشاهده شد. بیشترین مقدار کاروتنوئید تحت تأثیر نانوذره روتایل در غلظت 100(R4) و سپس در غلظت 5/12 میلی‌گرم در لیتر (R1) مشاهده شد. سیترات به تنهایی (C) سبب کاهش معنی‌دار (p<0.05) مقدار کاروتنوئید نسبت به نمونه شاهد فاقد سیترات (S) شد. تقریباً کلیه غلظت‌های نانوذرات آناتاز و روتایل، سبب افزایش معنی‌دار (p<0.05) مقدار کاروتنوئید، و فرم بالک سبب کاهش یا بی تغییر ماندن آن شدند. 

شکل 2- ج مقدار آستاگزانتین تولید شده را برحسب میلی‌گرم در گرم وزن خشک در تیمارهای مختلف در روزهای سوم و پنجم تنش نشان می‌دهد. در نمونه شاهد S، مقدار آستاگزانتین با افزایش روزهای تنش ثابت ماند. برخی تیمارهای فرم بالک سبب کاهش مقدار آستاگزانتین از روز سوم به پنجم شدند، به جز غلظت میانی 50 میلی‌گرم در لیتر (B3) که افزایش معنی‌دار (p<0.05) مقدار آستاگزانتین را نسبت به سایر تیمارها نشان داد. نانوآناتاز و نانوروتایل، سبب افزایش معنی‌دار (p<0.05) مقدار آستاگزانتین نسبت به شاهد S، (به ویژه در روز پنجم) شدند.

سیترات (C) سبب افزایش قابل توجه مقدار آستاگزانتین نسبت به شاهد S شد، با اینحال تأثیر همزمان آن با تیمار تیتانیوم، بسته به نوع فرم تیتانیوم متفاوت بود، مثلاً تحت تأثیر آناتاز و سیترات (A+C)، افزایش بیشتری نسبت به تأثیر آناتاز بدون سیترات (A) مشاهده شد. در مجموع، غالباً غلظت‌های 50 میلی‌گرم بر لیتر نانوذرات تیتانیوم و بالاتر از آن سبب افزایش آستاگزانتین نسبت به C شدند.

شکل 3 ، تغییرات رنگدانه‌های فیکوسیانین (الف)، آلوفیکوسیانین (ب) و فیکواریترین (ج) را برحسب میکروگرم در گرم وزن خشک جلبک نشان می‌دهد. بر اساس شکل 3- الف، در نمونه شاهد S، مقدار رنگدانه فیکوسیانین با افزایش روزهای تنش افزایش یافت، درحالی‌که تحت تأثیر تیمارهای تیتانیوم و حتی تیمار C، مقدار رنگدانه PC، در غالب اوقات در روز پنجم کاهش یافت. افزایش قابل ملاحظه و معنی‌دار (p<0.05) مقدار PC، تحت تأثیر تیمارهای بالک و فرم نانوروتایل، به ویژه نسبت به S مشاهده شد، درحالی‌که نانوذره آناتاز، مشابه بالک و روتایل بر افزایش آستاگزانتین تأثیر تحریک کنندگی نداشت. تیمار سیترات سبب تحریک تولید قابل ملاحظه PC در روز سوم نسبت به S، و کاهش آن در روز پنجم شد. بیشترین مقدار فیکوسیانین تحت تأثیر غلظت‌ 5/12 میلی‌گرم بر لیتر نانوروتایل (R1) در روز سوم تنش به دست آمد.

بر اساس شکل 3-ب، علیرغم ثبات نسبی مقدار APC در نمونه شاهد S، مقدار رنگدانه تقریباً در کلیه تیمارها، در روز پنجم (نسبت به روز سوم)، کاهش یافت. برخلاف تأثیر فرم بالک و نانوذره روتایل، نانوذره آناتاز (با یا بدون سیترات) سبب تحریک تولید یا تجمع قابل ملاحظه و معنی‌دار (p<0.05) APC نسبت به تیمارهای بالک و روتایل شد. در مقایسه با شاهد S، سیترات (C) سبب کاهش معنی‌دار (p<0.05) مقدار رنگدانه شد، همچنین، تأثیر همزمان آن با TiO₂، در غالب موارد سبب افزایش مقدار APC، نسبت به شرایط تیمار بدون سیترات نشد. بیشترین مقدار رنگدانه در غلظت 5/12 میلی‌گرم در لیتر (A1) و در روز سوم مشاهده شد.

شکل 3-ج مقدار رنگدانه PE را برحسب میکروگرم درگرم وزن خشک نشان می‌دهد. تغییر در مقدار رنگدانه PE تقریبا مشابه تغییرات APC بود، به جز آنکه اختلاف مقادیر رنگدانه در تیمارهای مختلف، مثلاً میان تأثیر تیمارهای بالک و روتایل نسبت به تأثیر آناتاز کمتر بود، بنابراین، دوباره تیمارهای آناتاز سبب تحریک تولید معنی‌دار (p<0.05) PE نسبت به سایر تیمارهای دی اکسید تیتانیوم شدند و مقدار شاخص در روز پنجم در اغلب تیمارها، کاهش یافت.

تأثیر تیمارها بر ترکیبات درون سلولی و فرآورده‌های متابولیسمی

شکل 4، مقدار کربوهیدرات، پروتئین و لیپید را نشان می‌دهد. مقدار کربوهیدرات در نمونه

شکل 3- رنگدانه‌های فیکوسیانین (PC) (الف)، آلوفیکوسیانین (APC) (ب) و فیکواریترین (PE) (ج). S: سوسپانسیون میکروجلبک فاقد سیترات (شاهد S)، C: سوسپانسیون میکروجلبک دارای سیترات (شاهد C)،B1  تا B5 بالک TiO₂،B1+C  تا B5+C بالک و سیترات،A1  تا A5 نانوآناتازTiO₂ ،A1+C  تا A5+C نانوآناتاز و سیترات،R1  تا R5 نانوروتایلTiO₂ ، R1+C تا R5+C نانو روتایل و سیترات، اعداد 1 تا 5 به‌ترتیب غلظت‌های 5/12، 25، 50، 100، و 200 میلی‌گرم بر لیتر TiO₂ در روزهای سوم و پنجم آزمون. داده‌ها میانگین سه تکرار SD± بوده و حروف متفاوت نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار براساس آزمون دانکن در سطح p< 0.05 است.  

Figure 3- Pigments Phycocyanin (PC) (A), Allophycocyanin (APC) (B), Phycoerithrin (PE) (C). S, microalgal suspension without citrate (control S); C, microalgal suspension with citrate (control C); B1 to B5 bulk TiO₂; B1+C to B5+C bulk and citrate; A1 to A5 nanoanatase TiO₂; A1+C to A5+C nanoanatase and citrate; R1 to R5 nanorutile TiO₂; R1+C to R5+C nano rutile and citrate; Numbers 1 to 5, respectively, concentrations of 12.5, 25, 50, 100, and 200 mg L^-1 TiO₂ at 3 and 5 days of the experiment. The data is the average of three replicates±SD, and different letters indicate significant differences based on Duncan's test at p<0.05.

شکل 4- کربوهیدرات محلول کل (الف)، پروتئین محلول کل (ب)، لیپید (ج). S: سوسپانسیون میکروجلبک فاقد سیترات (شاهد S)، C: سوسپانسیون میکروجلبک دارای سیترات (شاهد C)،B1  تا B5 بالک TiO₂،B1+C  تا B5+C بالک و سیترات،A1  تا A5 نانوآناتازTiO₂ ،A1+C  تا A5+C نانوآناتاز و سیترات،R1  تا R5 نانوروتایلTiO₂ ، R1+C تا R5+C نانو روتایل و سیترات، اعداد 1 تا 5 به‌ترتیب غلظت‌های 5/12، 25، 50، 100، و 200 میلی‌گرم بر لیتر TiO₂ در روزهای سوم و پنجم آزمون. داده‌ها میانگین سه تکرار SD± بوده و حروف متفاوت نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار براساس آزمون دانکن در سطح p< 0.05 است.

Figure 4- Total soluble carbohydrate (A), Total soluble protein (B), Lipid (C). S, microalgal suspension without citrate (control S); C, microalgal suspension with citrate (control C); B1 to B5 bulk TiO₂; B1+C to B5+C bulk and citrate; A1 to A5 nanoanatase TiO₂; A1+C to A5+C nanoanatase and citrate; R1 to R5 nanorutile TiO₂; R1+C to R5+C nano rutile and citrate; Numbers 1 to 5, respectively, concentrations of 12.5, 25, 50, 100, and 200 mg L^-1 TiO₂ at 3 and 5 days of the experiment. The data is the average of three replicates±SD, and different letters indicate significant differences based on Duncan's test at p<0.05.

شاهد S و نیز اکثر تیمارها، در روز پنجم افزایش پیدا کرد (شکل 4-الف). بیشترین مقدار کربوهیدرات در تیمار با فرم بالک و سیترات در غلظت50 میلی‌گرم در لیتر (B2+C) و در روز پنجم تنش تولید شد. برخلاف فرم روتایل، فرم آناتاز با یا بدون سیترات (A, A+C) سبب کاهش مقدار کربوهیدرات نسبت به S شد، درحالی‌که تیمارهای فرم بالک، سبب افزایش قابل توجه و معنی‌دار (p<0.05) مقدار کربوهیدرات نسبت به S و C شد. سیترات (C) سبب کاهش مقدار کربوهیدرات نسبت به نمونه شاهد فاقد سیترات (S) شد و نانوذرات به همراه سیترات، سبب بهبود شاخص نشدند.

مقدار پروتئین در نمونه شاهد S، با افزایش روزهای تنش تغییر زیادی نکرد ولی تیمار سیترات (C) مقدار آن را به ویژه در روز سوم، به صورت معنی‌دار (P<0.05) افزایش داد (شکل 4-ب). سایر تیمارها، به‌ویژه تیمارهای بالک و آناتاز نیز، سبب تحریک تولید پروتئین شدند. سیترات در تیمار با بالک (B+C)، سبب تحریک معنی‌دار (p<0.05) تولید پروتئین در روز سوم (در مقایسه با تأثیر تیمار B) شد، اما میزان آن را در روز پنجم نسبت به تیمار B کاهش پیدا کرد.

شکل 4-ج مقدار لیپید کل را برحسب میکرو‌گرم در گرم وزن خشک نشان می‌دهد. سیترات مقدار لیپید را در روز سوم نسبت به شاهد به‌صورت معنی‌دار (p<0.05) افزایش و در روز پنجم کاهش داد. از میان سایر تیمارها، بیشترین تأثیر افزایشی به تیمارهای آناتاز (A, A+C) و تیمار روتایل (R+C) در روز سوم مربوط بود.

تغییرات شاخص‌های اکسیدانی/ آنتی اکسیدانی

مقدار MDA در روز پنجم در شاهد S، نسبت به روز سوم، به مقدار کمی کاهش یافت (شکل 5-الف)، درحالی‌که تحت تأثیر سیترات تغییر نکرد. نانوذرات آناتاز و روتایل، سبب افزایش معنی‌دار (p<0.05) پراکسیداسیون لییپدی غشاء و MDA در روز سوم، نسبت به شاهد S شدند. بیشترین مقدار MDA تحت تأثیر تیمار روتایل با سیترات (R+C) و در غلظت 5/12 میلی‌گرم بر لیتر و سپس غلظت 50 میلی‌گرم بر لیتر آناتاز (A) یعنی غلظت‌های ابتدایی دی اکسید تیتانیوم به دست آمد. مقدار MDA در نمونه های تیمار شده با نانوذره روتایل در روز پنجم، خیلی بیشتر از نمونه های تیمار شده با آناتاز کاهش یافت. تحت تأثیر تیمارهای بالک، چه در روز سوم و چه در روز پنجم، مقدار مالون دی آلدهید نسبت به هر دو  Sو C به‌صورت معنی‌دار (p<0.05) کاهش یافت. 

در نمونه شاهد S، پتانسیل آنتی اکسیدانی کل سلول، در روز پنجم نسبت به روز سوم، به شدت کاهش یافت (شکل 5-ب). تیمار بالک تیتانیوم توانست سبب تحریک پتانسیل آنتی اکسیدانی سلولها، به مقدار بسیار قابل توجه و معنی‌دار (p<0.05) در هر دو روز سوم و پنجم  نسبت به شاهد های S و C شد. مقدار فعالیت آنتی اکسیدانی در روز سوم در نمونه‌های تیمار شده با آناتاز (A) نیز به‌شدت افزایش یافت، اما در روز پنجم مقدار آن نسبت به روز سوم بسیار کاهش پیدا کرد. پتانسیل آنتی اکسیدانی تحت تأثیر شاهد سیترات (C) در روز پنجم قدری بالاتر از نمونه شاهد S بود، اما تفاوت زیادی در مقدار شاخص تحت تأثیر نمونه‌های دارای سیترات و فاقد آن در R و B ملاحظه نشد، درحالی‌که سیترات سبب کاهش زیاد و معنی‌دار (p<0.05) فعالیت آنتی اکسیدانی در نمونه‌های تیمار شده آناتاز (A+C) نسبت به نمونه آناتاز بدون سیترات (A) شد.

مقدار ROS در نمونه شاهد S، در روز پنجم قدری افزایش پیدا کرد (شکل 5-ج) و این افزایش به میزان بسیار بیشتری تحت تأثیر تیمار سیترات مشاهده شد. سیترات در تیمار همزمان با بالک و روتایل سبب تحریک تولید ROS شد. غالبا غلظت‌های ابتدایی و نیز بالاترین غلظت‌ها، سبب تحریک تولید ROS شدند. بیشترین مقدار ROS به طور معنی‌دار (p<0.05) در غلظت 200 میلی‌گرم بر لیتر تیمار روتایل به همراه سیترات (R+C) ملاحظه شد.

بحث

این تحقیق، با هدف ارزیابی مقایسه‌ای تأثیرات احتمالی تحریک کنندگی و یا بررسی تأثیرات منفی تیمارهای بالک و نانوذرات TiO₂ آناتاز و روتایل به همراه یا فاقد ترکیب سیترات، در غلظت‌های 5/12، 25، 50، 100 و 200

شکل 5- مقدار مالون‌دی‌آلدهید (MDA) (الف) ، فعالیت آنتی اکسیدانی کل (درصد مهار (DPPH (ب) و میزان رادیکالهای فعال اکسیژن (ROS) (ج). S: سوسپانسیون میکروجلبک فاقد سیترات (شاهد S)، C: سوسپانسیون میکروجلبک دارای سیترات (شاهد C)،B1  تا B5 بالک TiO₂،B1+C  تا B5+C بالک و سیترات،A1  تا A5 نانوآناتازTiO₂ ،A1+C  تا A5+C نانوآناتاز و سیترات،R1  تا R5 نانوروتایلTiO₂ ،R1+C  تا R5+C نانو روتایل و سیترات، اعداد 1 تا 5 به‌ترتیب غلظت‌های 5/12، 25، 50، 100، و 200 میلی‌گرم بر لیتر TiO₂ در روزهای سوم و پنجم آزمون. داده‌ها میانگین سه تکرار SD± بوده و حروف متفاوت نشان‌دهنده اختلاف معنی‌دار براساس آزمون دانکن در سطح p< 0.05 است.

Figure 5- Malondealdehyde (MDA) (A), Total antioxidant potential (percentage of DPPH Scavenging) (B), Reactive oxygen species (ROS) (C). S, microalgal suspension without citrate (control S); C, microalgal suspension with citrate (control C); B1 to B5 bulk TiO₂; B1+C to B5+C bulk and citrate; A1 to A5 nanoanatase TiO₂; A1+C to A5+C nanoanatase and citrate; R1 to R5 nanorutile TiO₂; R1+C to R5+C nano rutile and citrate; Numbers 1 to 5, respectively, concentrations of 12.5, 25, 50, 100, and 200 mg L^-1 TiO₂ at 3 and 5 days of the experiment. The data is the average of three replicates ±SD, and different letters indicate significant differences based on Duncan's test at p<0.05.

میلی‌گرم در لیتر بر روی میکروجلبک S. platensis در یک دوره 5 روزه آزمون انجام شد.

براساس نتایج به‌دست آمده از تأثیر تیمار نانوذرات TiO₂ بر شاخص‌های فیزیولوژیک میکروجلبک S. platensis ، نانوذره روتایل درحضور سیترات یا بدون آن، در مقایسه با شاهد، بهتر از فرم بالک توانست سبب افزایش بیوماس خشک (شکل 1-الف) و شاخص µ_m (شکل 1-ب) شود، در حالیکه نانوذره آناتاز، سبب کاهش بیوماس شد. این مسأله را می‌توان به اختلاف در سایز ذرات و بیش از آن به اختلاف سطح ویژه (SSA) ایجاد شده توسط ذرات روتایل و آناتاز نسبت داد. هنگامی که اندازه ماده در مقیاس نانومتر کوچک‌تر می‌شود، خواص فیزیکی و شیمیایی جدیدی ظاهر می‌شوند که تا حد زیادی تحت تأثیر اندازه و هندسه هستند (Parrino et al., 2021). در این تحقیق، اندازه نانوذرات آناتاز در محدوده 10 تا 25 نانومتر و کوچکتر از سایز ذرات روتایل (حدود 30 نانومتر) و همچنین، سطح ویژه نانوذره آناتاز تقریبا 5 برابر بیشتر از سایز نانوذره روتایل بوده است. این ویژگی‌ها می‌توانند بر تأثیرات نانوذره بر سلول تأثیر بگذارند و هرچه سطح تماس سلول با نانوذرات بیشتر باشد، در القای پاسخ سلولی نسبت به آنها مؤثرتر است (Gao et al., 2018). کلمنت و همکاران (2013) اظهار کردند که نانوذرات روتایل، به دلیل چربی دوستی ساختار کریستالیشان، مولکول‌های بزرگتری را در محیط آبی تشکیل می‌دهد و بنابراین، از طریق کاهش سطح تماس، سمیت کمتری نسبت به شکل کریستالی آناتاز دارند (Clement et al., 2013). در مطالعه دیگری، برهمکنش جلبک سبز Chlorella pyrenoidosa با آناتاز و روتایل TiO₂-NPs و سمیت آنها مورد بررسی قرار گرفت. در این آزمایشات نیز نانوذرات آناتاز دارای سمیت سلولی بالاتری نسبت به نانوذره روتایل بودند که به افزایش میزان ROS و در نتیجه آسیب اکسیداتیو بیشتر آناتاز ربط داده شدند (Odling and Robertson, 2015). آزمایشات دیگری که بر روی جلبک Dunaliella  انجام شد، کاهش بیشتر µ_m سلولها بر اثر تیمار با دی اکسید تیتانیوم آناتاز را نسبت به تیمار با روتایل در غلظت‌های 150 و 200 میلی‌گرم بر لیتر نشان داد(Ghazaei and Shariati, 2019) .

با این حال نتایج سنجش میزان ROS در پژوهش حاضر، در میکروجلبک S. platensis ، بالا بودن محتوای ROS در اکثر تیمارهای نانوذره آناتاز در روزهای سوم و پنجم نمونه برداری را نشان نداد) شکل 5-ج)، بالعکس تیمارهای نانوذره R+C و تا حدودی B+C (به‌ویژه در روز سوم تنش)، مقادیر بیشتر ROS را نسبت به شاهد بدون سیترات (S) نشان دادند. همچنین، بررسی مقدار ROS در شاهد C نشان داد که محتوای رادیکال‌های آزاد اکسیژن در روز پنجم در این نمونه زیاد است، درحالی‌که حضور هم‌زمان تیتانیوم و سیترات، سبب کاهش قابل توجه ROS در کلیه تیمارهای حاوی سیترات، در روز پنجم، (نسبت به شاهد C) شد.

بر اساس آزمایشات Mudunkotuwa وGrassia  (2010)، جذب سطحی سیترات بر روی نانوذرات TiO₂ و تشکیل کمپلکس سیترات- نانوفلز در محلول، موجب ممانعت از تجمع و به هم پیوستگی نانوذرات TiO₂ می‌شود. این مسأله دسترسی سلول به نانوفلز را افزایش می‌دهد. همچنین،Zhou  و همکارانش (2016) نشان دادند که کمپلکس شدن سیترات با نانوذرات Ag، به خاطر وجود بار منفی سطحی سیترات، سبب محدود نمودن جذب الکترواستاتیک نانوذره به سطح سلول Chlorella شده و بنابراین، ورود کمپلکس نانوفلز- سیترات به درون سلول را تسهیل می‌کند. با این وجود، همین محققان (Zhou et al., 2016) در بخش دیگری از تحقیقات خود نشان دادند که اگزوپلیمرهای متصل به سطح خارجی سلول جلبک (نظیر ترکیبات پلی ساکاریدی، پروتئین‌ها و غیره) سبب جذب سطحی بخشی از کمپلکس نانوفلز- سیترات می‌شوند و حذف این اگزوپلیمرها از سطح سلول، می‌تواند جذب صرفا سطحی کمپلکس سیترات- نانوفلز را کاهش و ورود آن به داخل سلول را افزایش دهد. بنابراین، افزایش میزان این اگزوپلیمرها بر اثر شرایط محیطی، می‌تواند سهم جذب سطحی کمپلکس سیترات – نانوفلز بر روی سطح سلول را افزایش داده و بالعکس ورود آن به درون سلول را کاهش دهد. برخی مطالعات، افزایش و تحریک تولید اگزوپلیمرهای سیانوباکترها در پاسخ به تنش های فلزی را نشان داده‌اند (Behzadian et al., 2020).

از آنجا که سیترات به‌عنوان یک مخزن کربنی و یک عامل کلیدی در چرخه کربس و روند کاتابولیسم کربوهیدرات نقش دارد، ورود آن به داخل سلول و تغییرات مقدار آن در درون سلول می‌تواند با طولانی شدن زمان در معرض قرار‌گیری تشدید شود و ممکن است، حالت تعادل انرژیایی سلول و تعادل مخزن کربن به نیتروژن ‌را دستخوش تغییر نماید (Kynshi et al., 2021) و این عدم تعادل سبب تولید ROS بیشتر شود. اختلاف زیاد در مقدار ROS در شاهد C در روز پنجم و سوم نسبت به عدم اختلاف مقدار ROS در این دو روز در شاهد S، می‌تواند با ورود بیشتر سیترات به درون سلول در طی زمان مرتبط باشد.

محتوای ROS غالب تیمارها در روز پنجم نسبت به روز سوم، مقدار کمتری را نشان داد که می‌تواند حاکی از سازگار شدن سلول با شرایط تیمار، در نتیجه پاسخ‌های سلولی باشد که بخشی از آنها فعالیت‌های انجام شده برای مهار رادیکال‌های آزاد است. بخش دیگری از پاسخ‌های سلولی می‌توانند افزایش تولید و ترشح اگزوپلیمرهایی باشند که قادر هستند چه در داخل سلول و چه بر روی سطح آن، سبب تجمع نانوذرات تیتانیوم و کاهش ورود و تأثیر آنها بر سلول شوند. در زمینه تولید اگزوپلیمرهایی نظیر پلی ساکاریدها، پروتئین‌ها و غیره از سلول‌های میکروجلبکی که در معرض تنش نانوفلزات قرار گرفته‌اند، گزارشهای زیادی وجود دارد (Sendra et al., 2017; Zhou et al., 2016).  

بررسی نتایج به‌دست آمده از سنجش مهار رادیکال آزاد DPPH، بالارفتن فعالیت‌های آنتی اکسیدانی در روز سوم در نمونه S که در واقع فاقد هر گونه تیمار است را نسبت به نمونه استوک مادر نشان داد )شکل 5-ب). تلقیح سلول‌ها در محیط جدید، به خاطر تغییر شرایط کشت و نیز شرایط نوری سلولها، می‌تواند برای مدتی سبب القای آنتی اکسیدان‌های سلول شود و در روز پنجم، با سازگار شدن سلولها نسبت به شرایط جدید، این فعالیت‌های آنتی اکسیدانی به شرایط قبل از تلقیح، بازگشت نموده‌اند.

بررسی فعالیت‌های آنتی اکسیدانی تیمارهای حاوی نانوذرات )شکل 5-ب) نشان داد که در روز سوم، فعالیت مهار رادیکال DPPH توسط سیستم آنتی اکسیدانی سلول در تیمارهای نانوآناتاز افزایش یافته و احتمال می‌رود که دست کم بخشی از کاهش مقدار ROS در نمونه‌های آناتاز فاقد سیترات به همین دلیل اتفاق افتاده باشد. اگرچه در یک تحقیق نشان داده شده که نانوذراتCu  و Ag می‌توانند مستقیما به رادیکالDPPH الکترون داده و آنرا احیا نمایند (Mallikarjuna et al., 2020). در واقع این عمل مستقل از فعالیت‌های آنتی اکسیدانی سلول انجام می‌شود و این احتمال که در سنجش میزان مهار DPPH در نمونه‌های تحقیق حاضر، نیز (هرچند به مقدار کم اتفاق افتاده باشد) وجود دارد.

مقدار فعالیت آنتی اکسیدانی برای خاموش سازی DPPH، در هر دو روز سوم و پنجم غالباً در نمونه‌های حاوی نانوذره بالک، از سایر نمونه‌ها بیشتر بود. نتایج تحقیقات Sendra و همکاران (2017)، نشان داد که میزان ترشح اگزوپلیمرهای سلول‌های جلبکهای Chlamydomonas و Phaeodactylum در تیمار با نانوذرات TiO₂، بسیار بیشتر از زمانی است که با نمونه بالک TiO₂ تیمار می‌شوند. این مساله ممکن است، به تجمع بیشتر و متراکم شدن ذرات نانوفلز در مقایسه با نمونه بالک اشاره داشته باشد که از تأثیر بر سلول و تحریک فعالیت آنتی اکسیدانی آن، در مقایسه با ذرات نمونه بالک می‌کاهد و این تأثیر در روز پنجم، بیشتر خود را نشان می‌دهد. با این‌حال آثار منفی ذرات نانو بر غشاهای سلول و افزایش میزان MDA در کلیه تیمارهای حاوی نانوذره (در مقایسه با بالک)، دست کم در روز سوم قابل مشاهده است )شکل 5-الف).

بر اساس شکل 1- الف، نانوذره روتایل (R, R+C)، در روز پنجم و نمونه بالک بدون سیترات (B) در روز سوم، موجب افزایش وزن خشک و µ_m نسبت به شاهد S شدند که سرعت رشد ویژه بالاتری بر اساس وزن خشک را نشان داد. بررسی‌های محققان نشان

داده است که نانو ذره تیتانیوم می‌تواند با پروتئین‌ها و یا لیپیدها، واکنش دهد و بر فیزیولوژی سلول تأثیر بگذارد (Saptarshi et al., 2013). افزایش ذی توده جلبکی بر اثر تیمار با نانودی اکسیدتیتانیوم گزارش شده است(Kulacki and Cardinale 2012) .

در پژوهش حاضر، غلظت‌های اولیه یعنی 5/12، 25 و 50 میلی‌گرم بر لیتر TiO₂، (برای مثال، تیمار A1 در شاخص‌های APC،  PEو نیز B1-B3 در شاخص پروتئین و ...( موجب بروز پاسخ‌های مشخص‌تری نسبت به سایر غلظت‌ها شدند. اگرچه، تمرکز زیادی بر بررسی تأثیرات نامطلوب یا سمی غلظت‌های زیاد نانومواد بر سلول‌های زنده، متمرکز شده، اما داده‌های تجربی نشان می‌دهند که غلظت‌های پایین نانومواد مهندسی‌شده نظیر TiO₂ و ZnO، با غلظت کمتر از 50 میلی‌گرم در کیلوگرم، معمولاً سبب تحریک بیشتر و مثبت سلول‌های گیاهی می‌شوند (Agathokleous et al., 2019). یک دلیل اصلی در واقع تجمع بیشتر و سریعتر ذرات در غلظت‌های بالا است که سبب کاهش تأثیر نانو ذرات منفرد و پراکنده در محیط می‌شود، و از این‌رو سمیت در غلظت‌های بالا را کاهش می‌دهد. بحث سمیت سلولی علاوه بر جنبه فوق، از چندین منظر دیگر نیز قابل بررسی است. اثر سایه زنی، عامل شناخته شده دیگری است که در آن توده‌های تیتانیوم بالک و نانو، به‌ویژه در غلظت‌های زیاد، مانعی بین سلول‌های جلبک و منبع نور ایجاد می‌کنند و مانع از فتوسنتز کارا می‌شوند (Baharlooeian et al., 2021; Thiagarajan et al., 2019).

در برخی تحقیقات، مهار رشد و تقسیمات سلولی جلبک Phaeodactylum tricornutum در غلظت‌های بالاتر از 20 میلی‌گرم در لیتر نانوذره TiO₂ در 24 ساعت اول تنش (Wang et al., 2016) ، مشاهده شد، اما برخی گزارش‌ها نیز حاکی از عدم کاهش رشد D. tertiolecta در تماس با غلظت‌های کم نانوذرات TiO₂ در طی زمان طولانی‌تر 72 ساعت هستند (Morelli et al., 2018). این مطالعات ممکن است وابستگی تأثیر نانو TiO₂ به نوع گونه جلبک مورد بررسی را نشان ‌دهند. با این‌همه، تأثیر زمان در مطالعات زیادی تأیید شده است. کلمنت و همکاران (2013) نشان دادند که مدت زمان در معرض بودن نانوذرات از عوامل مؤثر در سمیت نانوذرات است. در تحقیق حاضر نیز تأثیر زمان به‌صورت القاکننده و یا مهار کننده ظاهر شد. با آنکه طول عمر ROS کوتاه است، اما اتصال نزدیک بین NPs و سلول‌های میکروجلبک سبب القای تولید ROS درون سلولی به‌صورت پیوسته می‌شود. همچنین، اتصال نانوذرات بر سطح سلول می‌تواند سبب ایجاد سموم ثانویه دیگر و به‌راه افتادن مسیرهای آسیب فیزیکی یا برهم‌کنش با پروتئین‌ها، فسفولیپیدها و سایر بیوماکرومولکول‌ها شود.

در تحقیق حاضر، بیشترین میزان رنگدانه‌های کلروفیل، کاروتنوئید، فیکوسیانین، آلوفیکوسیانین و فیکواریترین (شکل‌ 3) در روز سوم تنش، تقریباً در اکثر تیمارها مشاهده شد. این امر اهمیت مدت زمان در معرض قرار بودن میکروجلبک به TiO₂ را نشان می‌دهد، به‌طوری‌که با افزایش مدت زمان تنش (تا روز پنجم تنش)، مقدار رنگدانه‌ها در میکروجلبک کاهش یافته است. گزارش‌هایی از تأثیر منفی TiO₂ در فرم بالک یا نانوذره بر کاهش مقدار کاروتنوئیدها در میکروجلبک Chaetoceros muelleri یا بر کاهش میزان کلروفیل در گیاهان دارویی وجود دارد (Baharlooeian and Haq, 2020; Rico et al., 2015). 

از میان تیمارهای غلظت‌ TiO₂، غلظت 100 میلی‌گرم بر لیتر توانست بیشترین مقدار تولید کلروفیل a، کاروتنوئید و آستاگزانتین را در میکروجلبک القا کند. در تطابق با این نتیجه، افزایش کلروفیل های a و b در گیاه مریم گلی، بر اثر تیمار با غلظت 100 میلی‌گرم بر لیتر نانوذرات TiO₂ نسبت به شاهد و نیز غلظت 50 میلی‌گرم بر لیتر مشاهده شده است (مزارعی و همکاران، 1397). بهترین غلظت برای افزایش رنگدانه‌های APC، PC، PE و فیکوبیلین‌ کل، کمترین غلظت یعنی 5/12 میلی‌گرم در لیتر نانو ذرات بود. همچنین، نانوذره آناتاز تولید بیشترین میزان کلروفیل، APC و PE، به‌ویژه در روز سوم را در میکروجلبک تحریک نمود. نانوذره روتایل به طور مشخص سبب القای تولید رنگدانه‌های کاروتنوئید، آستاگرانتین و PC شد.

به نظر می‌رسد، تأثیر  TiO₂نوع بالک بر روی سلول‌های میکروجلبک که (در مقایسه با رفتار نانوذرات) دارای تعاملات با سطح سلول‌ها برای تولید و تکثیر ROS نیست به ویژه در روز سوم تنش، به صورت تحریک سرعت تقسیمات سلولی (µ_m)، افزایش مقدار وزن خشک و نیز تحریک فعالیت‌های آنتی اکسیدانی، بروز می‌نماید که در نتیجه مقدار MDA را در مقایسه با شاهد و نیز سایر تیمارها به میزان قابل ملاحظه‌ای، کاهش می‌دهد (شکل 5). کاهش قابل توجه رنگدانه‌هایی نظیر کلروفیل، کاروتنوئید و برخی فیکوبیلین‌ها و نیز افزایش مقدار پروتئین نیز می‌تواند یک پاسخ سریع به تنش، به حساب آید که با کاهش مقدار جذب نور توسط رنگدانه‌های اصلی و کمکی (Hamida et al., 2020) از اکسیداسیون نوری سلولها جلوگیری می‌نماید. تفاوت رفتار انواع بالک و نیز نانو TiO₂ در تحقیقات دیگر نیز گزارش شده است (Baharlooeian and Haq, 2020; .Baharlooeian et al., 2021)

با این‌حال تحریک تولید و القای تجمع کاروتنوئیدها، آستاگزانتین و فیکوبیلین‌ها تحت تأثیر تیمارهای نانو روتایل و نانوآناتاز و نیز افزایش مقدار کربوهیدرات توسط نوع بالک و نانوروتایل مشاهده شد، (شکل‌ 3). محتمل است که بتوان از Spirulina با شاخص‌های بهبود یافته که حاوی سطح مشخصی از نانوذره است، به عنوان کود در کشاورزی استفاده کرد(Avila-Quezada et al., 2022; Joshi et al., 2019). البته با‌توجه‌به بر اساس منابع متعدد و تگرانی‌های زیادی که در رابطه با استفاده از منابع حاوی نانوذرات وجود دارد، در استفاده‌های دارویی و غذایی، بهتر است از عدم آلودگی میکروجلبک به نانوذرات تیتانیوم و یا کاهش آن تا سطح سلامت غذایی مطمئن شد (Gao et al., 2018).

افزایش مقدار پروتئین‌ها در شرایط تنش، می‌تواند دلیل بر بیوسنتز برخی پروتئین‌ها برای سازگاری با تنش، و کاهش آنها می‌تواند به‌ علت برطرف شدن عوامل تحریک کننده و یا صدمه به پروتئین‌ها در طی تنش، اتفاق افتاده باشد (Pereira et al., 2018; Singh and Tewari, 2003). بر اساس یک مطالعه، تیمار جلبکGracilaria  با نانو TiO₂ سبب افزایش اندک غلظت پروتئین محلول در طی 3 روز اول و سپس کاهش تدریجی طی روزهای بعدی شد (Liu et al., 2018).

در این تحقیق، افزایش مقدار لیپید تحت تأثیر تیمار سیترات و نیز نمونه‌های نانوتیتانیوم (بایا بدون سیترات) و نیز نمونه بالک دارای سیترات مشاهده شد (شکل‌ 3). مقدار لیپیدها و ترکیب اسیدهای چرب جلبک می‌تواند تحت تأثیر نانوذرات تغییر نماید (Sarkar et al., 2021). علاوه بر شرکت لیپیدها در ساختار غشاها و تشکیل وزیکول‌هایی که در ورود نانوذرات به داخل سلول نقش دارند، چربی‌ها همچنین، می‌توانند در سیگنال‌دهی سلولی و تنظیم سیالیت غشاء مداخله نمایند (Ibarguren et al., 2014). تحریک تولید لیپید در سلول‌های سرطانی توسط تیمار سیترات نیز مشاهده شده است (Zhao et al., 2022). مقدار آستاگزانتین نیز که یک ترکیب محلول در چربی است، نیز تحت تأثیر تیمار سیترات افزایش یافت. در خصوص بیوسنتز کربوهیدرات‌ها، رفتار سیترات در تیمار منفرد با حضور آن در تیمار همزمان با نانو ذره TiO₂ متفاوت بود. افزودن سیترات به طور منفرد به محیط کشت، سبب تغییر کاهشی جزئی در مقدار کربوهیدرات (p<0.05) و افزایش قابل توجه و معنی‌دار (p<0.05)  مقدار پروتئین مشابه با بیوسنتز لیپید، در نمونه C نسبت به S شد.

سیترات می‌تواند در ممانعت و یا بالعکس تحریک فعالیت آنزیمهایی که در ورودی یا خروجی مسیر گلیکولیز، سیکل کربس، گلوکونئوژنز و بیوسنتز اسیدهای چرب قرار دارند، نقش ایفا نماید (Lacobazzi and Infantino, 2014). در درون سیتوپلاسم، سیترات همچنین، می‌تواند از طریق آنزیم سیترات لیاز (وابسته به ATP) به استیل کوانزیم آ تبدیل شود که یک متابولیت واسطه مهم در گذرگاه مسیرهای متفاوت آنابولیکی و کاتابولیکی است و در اکسیداسیون کربن حاصل از کاتابولیسم کربوهیدراتها، لیپیدها و یا پروتئین ها نقش دارد (Fatland et al., 2002). استیل کوانزیم‌آ در تولید اسیدهای چرب و طویل شدن آنها نقش دارد

(Fatland et al., 2002). بنابراین، به نظر می‌رسد ورود سیترات به سلول میکروجلبک Spirulina، مسیرهای بیوسنتز و تجمع لیپید و پروتئین را فعال نموده است. افزایش میزان لیپید و اسیدهای آمینه ضروری بر اثر تیمار با پساب حاوی اسید سیتریک، در جلبک Chlorella نیز گزارش شده است(Li et al., 2013).

جمع‌بندی

در این تحقیق، تأثیر تیمارها به‌صورت وابسته به فرم و غلظت TiO₂، وجود یا عدم وجود سیترات و مدت زمان در معرض قرارگیری سوسپانسیون سلولی به نانوذرات مشاهده شد که شامل تأثیرات تحریک کننده و مثبت و در شرایطی منفی بر بهبود شاخص‌ها بود. شاخص بیوماس (وزن خشک سلول‌ها)، تحت تأثیرتیمار نانوروتایل و تا حدودی فرم بالک، افزایش یافت. افزایش مقدار کلروفیل، کاروتنوئید، آستاگزانتین، فیکوبیلین‌ها، کربوهیدرات، لیپید و پروتئین تحت تأثیر تیمارها مشاهده شد. بنابراین، به نظر می‌رسد که تیمار TiO₂ در برخی از غلظت‌های به کار برده شده، می‌تواند برای تحریک تولید متابولیت‌های سلولی به کار گرفته شود. سیترات در همه موارد تأثیر یکسانی نشان نداد و آثار آن به نوع نانوذره همراه، غلظت TiO₂ و مدت زمان تنش وابسته بود. این تأثیرات همچنین، می‌تواند به نوع میکروارگانیسم مورد آزمون و پاسخ‌های آن به تنش TiO₂ بستگی داشته باشد.