Molecular Phylogeny and Divergence Time Estimation of Onobrychis sect. Onobrychis (Fabaceae) based on nrDNA ITS

مقدمه

سردۀ Onobrychis Mill. در منطقه‌‌ای از جنوب اروپا، منطقۀ مدیترانه تا قفقاز، رشته‌‌کوههای زاگرس، آسیای مرکزی و معتدل غربی، در سراسر مناطق معتدل و نیمه‌‌گرمسیری اوراسیا و شمال آفریقا پراکنده شده است (Širjaev, 1925, 1926; Townsend, 1974; Rechinger, 1984; Abou-El-Enain, 2002). این سرده شامل 360 گونۀ چندساله و یک‌‌ساله است (Nixon, 2006). در فلورا ایرانیکا 54 گونه از ایران در هشت بخش قرار گرفته است که شامل Dendrobrychis، Lophobrychis، Onobrychis، Laxiflorae، Anthyllium، Afghanicae، Heliobrychis و Hymenobrychis (Rechinger, 1984) می‌‌شود؛ اما براساس مطالعات تبارزایشی اخیر (Amirahmadi et al., 2016)، محدودۀ رده‌‌بندی Onobrychis دستخوش تغییرات اساسی شده است. زیرسردۀ Onobrychis شامل دو بخشۀ Onobrychis  و Hemicyclobrychis Širj. و زیرسردۀ Sisyrosema شامل هفت بخشۀ Afghanicae Širj.، Laxiflorae (Širj.) Rech.f.، Heliobrychis (Bunge ex Boiss.) Širj.، Hymenobrychis DC.، Insignes (Širj.) Rech.f.، Lipskyanae (Širj.) Amirah. & Kaz. Osaloo  و Litvinovianae (Širj.) Amirah. & Kaz. Osaloo. می‌‌شود.

Onobrychis sect. Onobrychis با گیاهان یک‌‌ساله یا چندساله و گاهی اوقات بوته‌‌های بالشتکی، از حدود 104 گونه تشکیل شده است که طبق مطالعۀ تبارزایشی Amirahmadi و همکاران (2016)، پرگونه‌‌ترین بخشه از سردۀ Onobrychis شناخته شده است. پراکنش جغرافیایی این بخش از آسیای مرکزی تا اروپا و تا شمال آفریقا را شامل می‌‌شود (Boissier, 1843; Širjaev, 1925, 1926; Ball, 1968; Grossheim, 1972; Townsend, 1974; Rechinger, 1984; Ranjbar et al. 2007, 2008, 2009, 2011, 2012; Amirahmadi et al., 2014b; Ghanavati and Amirabadizadeh, 2018; Amirahmadi and Khoshsokhan-Mozaffar, 2021).

دو عدد پایۀ کروموزومی x=7 و x=8 و دو سطح پلوییدی دیپلویید و تتراپلویید در این بخش گزارش شده است (Baltisberger, 1991; Abou-El-Enain, 2002; Hejazi et al., 2010; Ranjbar et al., 2010; Sepet et al., 2011; Karamian et al., 2012; Akchlik, 2012).

هدف از انجام مطالعۀ حاضر، بررسی تک‌‌نیایی و روابط بین گونه‌‌ای در بخشۀ ‌‌Onobrychis و تجزیه و تحلیل روابط تبارزایشی با استفاده از نواحی فاصله‌‌گذار رونویسی‌‌شدۀ داخلی DNA ریبوزومی هسته‌‌ای (nrDNA ITS) به روش‌‌های بیشینۀ درست‌‌نمایی و بایزین (Bayesian) و همچنین تخمین زمان واگرایی Onobrychis است.

مواد و روش‌‌ها

74 نمونه از60 گونۀ Onobrychis، هفت گونه از زیرسردۀ Sisyrosema و هشت برون‌‌گروه از قبیلۀ Hedysareae در این مطالعه استفاده شد. علاوه‌‌بر nrDNA ITS (51) که در مطالعات قبلی به دست آمده بود (Amirahmadi et al., 2014a, 2016) و از GenBank بازیابی شد، توالی‌‌یابی 40 نمونۀ جدید نیز صورت گرفت. اطلاعات مربوط به گونه‌‌های مطالعه‌‌شده در جدول 1 ارائه شده است.

DNA کل ژنوم با روش CTAB اصلاح‌‌شده (Doyle and Doyle, 1987) استخراج شد. نواحی nrDNA با استفاده از پرایمر ITS5m (Sang et al., 1995) و ITS4 (White et al., 1990) تکثیر شد. واکنش زنجیری پلیمراز (PCR) در حجم 20 میکرولیتر حاوی 8 میکرولیتر آب دیونیزه، 10 میکرولیتر از مخلوط اصلی 2× Taq DNA پلیمرازRed (Amplicon) ، 5/0 میکرولیتر از هر پرایمر (10 pmol/μl) و یک میکرولیتر از هر پرایمر انجام شد. DNA الگوی چرخه‌های PCR شامل: 1. پیش‌‌دناتوره‌‌شدن در دمای 94 درجۀ سانتی‌گراد به مدت سه دقیقه؛ 2. 28 تا 35 چرخه، هریک شامل دناتوره‌‌شدن در دمای 94 درجۀ سانتی‌گراد به مدت یک دقیقه؛ 3. annealing در دمای 55 درجۀ سانتی‌گراد به مدت یک دقیقه؛ 4. طویل‌‌سازی در 72 درجۀ سانتی‌گراد به مدت یک دقیقه؛ 5. یک مرحله افزایش طول نهایی به مدت هفت دقیقه در دمای 72 درجۀ سانتی‌گراد بود. کیفیت محصولات PCR با الکتروفورز روی ژل آگارز یک درصد (w/v) (با استفاده از 1X TBE در جایگاه بافر ژل) و رنگ‌آمیزی با اتیدیوم‌‌بروماید بررسی شد. محصولات PCR به همراه پرایمرهای استفاده‌‌شده برای توالی‌‌یابی Sanger در Macrogen (Seoul, South Korea) ارسال شد. کروماتوگرام‌‌های حاصل از تعیین توالی نواحی هسته‌‌ای با استفاده از نرم‌‌افزار BioEdit ویرایش شد و فایل‌‌ها به‌‌صورت فستا (Fasta) درآمد؛ سپس با استفاده از نرم‌‌افزار Muscle v4.0 (Edgar, 2004) و همچنین به‌‌صورت چشمی، هم‌‌ردیف‌‌سازی (alignment) شد.

بازسازی روابط فیلوژنی توالی هسته‌‌ای ITS براساس روش maximum likelihood (ML) و(BI)  Bayesian صورت گرفت.

برای آنالیز داده‌‌ها به روش بیشینۀ درست‌‌نمایی از برنامۀ RaxmIGUI ver 1.1 (Silvestro and Michalak 2012) استفاده شد.

به‌‌منظور آنالیز داده‌‌ها، مدل‌‌های تکاملی با استفاده از برنامۀ MrModeltest (Nylander, 2004) و براساس معیار اطلاعاتی Akaike information criterion (AIC) (Posada and Buckley, 2004) انتخاب شد. از مدل GTR+G با برنامۀ (Ronquist et al., 2012) Mrbayes version 3.2 برای آنالیزهای تبارزایشی بایزین استفاده شد. احتمالات ثانویه روی پارامترهای مدل از داده‌‌ها با استفاده از پیش‌‌فرض‌‌های اولیه برآورد شد. آنالیزها در هشت میلیون نسل تکرار شد. چهار زنجیرۀ مارکوف مونته کارلو (MCMC) در یک زمان از یک درخت به‌‌طور تصادفی شروع به کار کرد. یک درخت در هر 100 نسل نمونه‌‌برداری و بعد از رسیدن به فاز همگرایی (خطی) (بعد از سوختن 25 درصد نسل‌‌ها) جمع‌‌آوری شد؛ سپس یک درخت اجماعی مبتنی‌‌بر قاعدۀ 50 درصد اکثریت همراه با مقادیر احتمال پسین برای نمایش با Treeview (Page, 2001) استفاده شد.

برنامۀ Bayesian برای تخمین زمان واگرایی بین گونه‌‌ها براساس مدل ساعت مولکولی ثابت یا آزاد استفاده می‌‌شود (Rambaut and Drummond, 2007). بستۀ نرم‌‌افزاری  BEASTشامل BEAUTi، Tree Annotator، Tracer و Figtree است. ابتدا با استفاده از برنامۀ BEAUTi توالی‌‌هایی به‌‌شکل اجراشدنی درمی‌‌آید؛ در ادامه پس از انتخاب برون‌‌گروه و مدل جایگزینی، مدل آزاد ساعت مولکولی براساس برنامۀ Mrmodeltest2 انتخاب می‌‌شود.

احتمال اولیه یا پیشین به‌‌صورت نرمال بود و زمان کالیبراسیون براساس مطالعات پیشین (Lavin et al., 2005) 3/29 میلیون سال تعیین و دو اجرای جداگانۀ MCMC برای 10 میلیون نسل در نظر گرفته شد؛ سپس از هر 200 نسل، یک درخت نمونه‌‌برداری شد. با استفاده از Tracer v 1.5، توزیع احتمالات ثانویه و effective sample size داده‌‌ها مشاهده و با Tree Annatator، 10 درصد درخت‌‌ها سوزانده شد؛ در ادامه با Figtree درخت اجمالی 50 درصد به دست آمد.

نتایج

اندازۀ ماتریس داده‌‌هایnrDNA ITS ، 70 جایگاه نوکلئوتیدی است که 140 صفات اطلاعاتی و 541 صفات غیر اطلاعاتی دارد و ایندل‌‌های اطلاعاتی 33 و غیر اطلاعاتی 31 جفت باز است؛ همچنین CI برابر 562/0 و RI برابر با 897/0 است. در بررسی بصری درختان، روابط بین کلادها و گروه خواهری، تفاوتی بین توپولوژی‌‌های درختان به‌‌دست‌‌آمده از MP، ML و BI دیده نشد.

تک‌‌نیایی‌‌بودن بخشۀ Onobrychis با حمایت زیاد (PP = 1, ML = 100) نشان داده شده است (شکل 1). سایر بخشه‌‌های سردۀ Onobrychis مانند Hymenobrychis و Heliobrychis در جایگاه گروه خواهری برای بخش Onobrychis قرار می‌‌گیرند.

بخشۀ اسپرس به دو کلاد اصلی و مشخص شامل کلاد A با حمایت PP= 0.99 و BS= 65 و کلاد B با حمایت PP= 1 و BS= 88 (شکل 1) تقسیم می‌‌شود.

کلاد A شامل O. pulchella (Schrenk)، O. micrantha (Schrenk) و O. cristagalli (L.) از بخشۀ Lophobrychis است که در مطالعۀ Amirahmadi و همکاران (2016) در بخشۀ Onobrychis ادغام شده‌‌اند؛ به‌‌علاوه حاوی گونه‌‌های بال بلند بخشۀ Onobrychis (O. densijuga Hedge & Hub، O. sosnovskyi Grossh.، O. saxatilis (L.)، O. stenostachya Freyn & Sint.، O. petrae (M. Bieb., ex villd Fish.)، O. alamutensis Amirah., Kaz.Osaloo & Charkhch، O. verae Sirj.، O. gontscharovii vas و O. ptychophylla Sirj.) است که درواقع با تعریف زیربخشۀ Macropterae مطابقت دارند؛ همچنین دارای دو گونه از بخشۀ Dendrobrychis شامل O. elymaitica (Boiss. & Hausskn. Ex Boiss.) و O. cornuta (L.) است.

این کلاد خود به دو زیرکلاد اصلی تقسیم می‌‌شود. زیرکلاد اول شامل O. pulchella و O. micrantha با حمایت PP= 0.99 و BS= 82 است و زیرکلاد دوم دربرگیرندۀ سایر‌‌ گونه‌‌های کلاد A با حمایت PP= 1 و BS= 71 و متشکل از دو گروه است؛ به طوری که در گروه اول گونه‌‌های O. sosnovskyi، O. saxatilis،O. araxina ، O. densijuga، O. stenostachya  وO. cristag-alli  با حمایت متوسط (PP= 0.88, BS= 50) قرار می‌‌گیرند و گروه دوم شامل O. cornuta و O. elymaitica از بخش Dendrobrychis و O. alamutensis، O. verae، O. ptychophylla و O. gontscharovii با حمایت زیاد (PP= 0.99, BS=76) است.

کلاد B دربرگیرندۀ تمام گونه‌‌های بال کوتاه همراه با دو گونه از بخشۀ Lophobrychis شامل(Sibth. & Sm)  O. aequidentata و O. caputgalli (L.) Lam. است.

1. aequidentata با حمایت زیاد (PP= 1, BS= 88) یک کلاد تشکیل می‌‌دهد؛ همین‌‌طور O. caputgalli با حمایت زیاد (PP= 1, ML= 96) یک کلاد مجزا تشکیل می‌‌دهد و سپس سایر گونه‌‌ها در یک کلاد با حمایت PP= 1 و ML= 70 قرار می‌‌گیرند. در میان این گونه‌‌ها، گروههایی با حمایت کم و مقدار زیاد polytomy مشاهده می‌‌شود.

تخمین زمان واگرایی

کرونوگرام BEAST (شکل 2) ازنظر توپولوژیکی با درختان به‌‌دست‌‌آمده از تجزیه و تحلیل بیزی غیر ساعتی nrDNA ITS سازگار بود. میانگین سنی برآوردشده و میانگین نرخ تکامل در جدول 2 آورده شده است. میانگین زمان واگرایی کلاد Taverniera  21.44 Ma (13.5_30.88 Ma 95% HPD) برآورد شد.

میانگین سن کلاد «CEGO» شامل Onobrychis، Eversmannia، Corethrodendron و Greuteria 15.69 Ma (9.9_21.53 Ma 95% HPD)  برآورد شد که در مقایسه با مطالعۀ قبلی Nafisi et al., 2019)) با میانگین سنی 13.07 Ma (8.48_18.48 Ma 95% HPD) با نمونه‌‌گیری تاکسونی کم از گروههای خواهری Heliobrychis و Hymenobrychis در 9.63 Ma (4.89_14.17 Ma 95% HPD) از سرده‌‌های همسایه اشتقاق پیدا کرده‌‌اند. سن برآوردشده برای زمان واگرایی سردۀ Onobrychis 14.14 Ma (8.89_19.73 Ma 95%HPD) و برای بخشۀ Onobrychis 11.95 Ma (7.60_17.99 Ma 95% HPD) است. کلاد A از کلاد B در 9.85 Ma (5.45_14.90 Ma 95% HPD) جدا شده است. بال بلندهای چندسالۀ این بخشه با عدد پایۀ کروموزومی اغلب x=8 در 7.45 Ma (4.04_11.43 Ma 95% HPD) نمایان شده است. یک‌‌ساله‌‌های بال بلند شامل O. pulchella و O. micrantha در 6.37 Ma (2.70_10.80 Ma 95% HPD) تکامل یافته است. بال بلندهای شمال غرب با عدد پایۀ کروموزومی x=7 در2.88 Ma (1.04_5.45 Ma 95% HPD) و بال بلندهای شمال شرق در 2.69 Ma (2.52_8.47 Ma 95% HPD) ظاهر شده است.

در کلاد B، O. aequidentata با بال بلند و یک‌‌ساله در 7.45 Ma (4.04_11.43 Ma 95% HPD) جدا شده که با O. caputgalli دنبال می‌‌شود و سن واگرایی آن 7.41 Ma (4.13_11.14 Ma 95% HPD) برآورد شده است. آخرین زیرکلاد به بال کوتاههای چندساله مربوط است و زمان واگرایی آنها 5.84 Ma (4.13_11.14 Ma 95% HPD) تخمین زده می‌‌شود.

بحث

براساس اطلاعات حاصل از توالی nrDNA ITS هسته‌‌ای، تک‌‌تباربودن بخشۀ Onobrychis با حمایت زیاد مشخص می‌‌شود. تک‌‌نیایی بخشۀ Onobrychis در مطالعات پیشین نیز تأیید شده بود (Safaei Chaei Kar et al., 2014; Amirahmadi et al., 2016)؛ همچنین بخشۀ Onobrychis در مفهوم جدید  Amirahmadiو همکاران (2016) متشکل از اعضای بخشۀ Lophobrychis و دو عضو از بخشۀ Dendrobrychis است. همان‌‌طور که از قبل در مطالعۀCarbonero  و همکاران (2012) به‌‌طور کلی از تمایز بین بخشه‌‌های Heliobrychis، Hymenobrychis Lophobrychis و Onobrychis حمایت شده بود، احتمال هم‌‌پوشانی‌‌هایی بین آنها نیز پیشنهاد شد. در مطالعۀ Safaei Chaei Kar و همکاران (2014) نیز گونه‌‌های بخشۀ Lophobrychis و دو گونه از بخشۀ Dendrobrychis در میان گونه‌‌های بخشۀ Onobrychis قرار گرفتند؛ ولی گونۀ O. arnacantha در کلاد جداگانه و خارج از بخشۀ Onobrychis واقع شد؛ سپس در مطالعۀ Amirahmadi و همکاران (2016)، این دو بخشه در بخشۀ Onobrychis ادغام شد.

بخشۀ Onobrychis با حمایت قوی به دو کلاد اصلی A و B تقسیم می‌‌شود و گونه‌‌های بخشه‌‌های Heliobrychis و Hymenobrychis در جایگاه گروه خواهری این بخشه قرار می‌‌گیرند (شکل 1).

کلاد A شامل گونه‌‌هایی بال بلند با عدد پایۀ کروموزومی به‌‌طور عمده x=8 است که پیش‌‌تر در زیر بخشۀ Macropterae (Hand. – Mazz., 1910) تعریف می‌‌شد؛ به‌‌علاوه شامل O. pulchella، O. micrantha و O. cristagalli از بخشۀ Lophobrychis و همچنین O. cornuta و O. elymaitica از بخشۀ Dendrobrychis است. خود کلاد A به دو زیرکلاد تقسیم می‌‌شود. زیرکلاد اول شامل گونه‌‌های O. pulchella و O. micrantha از بخشۀ Lophobrychis است که یک‌‌ساله، کم‌‌گل و با عدد پایۀ کروموزومی x=8 است. زیرکلاد دیگر شامل O. crista-galli و گونه‌‌های چندسالۀ بال بلند با دو گروه عدد پایۀ کروموزومی متفاوت x=8 و x=7 و بیشتر مختص فلات ایران و آناتولی و آسیای مرکزی و خود متشکل از سه گروه است. گروه اول شامل گونه‌‌های O. densijuga، O. araxina، O. saxatilis، O. sosnovskyi، O.petrae  و O. stenostachya همگی با عدد پایۀ کروموزومی x=7 است که در شمال غرب ایران، ترکیه، آذربایجان و ارمنستان پراکنش دارند و از این میان تنها گونۀ O. saxatilis اروپایی است. مشخصۀ ریخت‌‌شناسی این گروه برگچه‌‌های مستطیلی - خطی، طول میوۀ 5 تا 6 میلی‌‌متر و طویل‌‌شدن گل‌‌آذین در میوه (به‌‌جز O. densijuga) است. (Širjaev, 1925, 1926; Ball, 1968; Hedge, 1970; Grossheim 1972; Rechinger, 1984; Magulaev, 1989; Garnatje et al, 1988).

1. cornuta و O. elymaitica با عدد پایۀ کروموزومی x=8 (Astanova et al., 1981; Abou-El-Enain, 2002) در گروه دوم با حمایت زیاد قرار می‌‌گیرند. O. cornuta در ایران، ترکیه، قفقاز، سوریه، افغانستان، پاکستان، فلسطین، لبنان و آسیای مرکزی پراکنش دارد و به‌‌صورت کپه‌‌ای خاردار و ارتفاع‌‌پسند است. O. elymaitica که گونۀ انحصاری ایران از کوه نور لرستان است، به‌‌صورت درختچه‌‌ای تا درختچه‌‌ای خاردار مشاهده می‌‌شود (Ball, 1968; Hedge, 1970; Grossheim, 1972; Rechinger, 1984). گونۀ O. alamutensis به زیرکلاد O. cornuta و O. elymaitica متصل می‌‌شود.

گروه سوم، گونه‌‌های O. gontscharovii، O. verae و O. ptychophylla را در بر می‌‌گیرد. این گونه‌‌ها همگی بال بلند و چندساله با عدد پایۀ کروموزومی x=8 هستند، در آسیای مرکزی و شمال شرق ایران پراکنش دارند (بال بلندهای شمال شرق) و براساس داده‌‌های حاضر با حمایت قوی در یک زیرکلاد قرار می‌‌گیرند. ویژگی‌‌های بارز این زیرکلاد شامل شکل برگچه‌‌های مستطیل، بیضوی تا تخم‌‌مرغی، طول میوۀ 5 تا 7 میلی‌‌متر، کاسۀ 5/4 تا 7 میلی‌‌متر و گل‌‌آذین در میوه طویل‌‌نشده و فشرده، می‌‌شود (Grossheim, 1972; Kliphuis, 1977; Rechinger, 1984; Amirahmadi et al., 2014b).

اعضای کلاد B همگی عدد پایۀ کروموزومی x=7 دارند (Baltisberger, 1991; Lifante et al., 1992; Magulaev, 1989; Favarger, 1997; Abou-El-Enain, 2002; Hadadi, 2008, Ranjbar et al., 2009, 2010, 2011; Hejazi et al., 2010; Sepet et al., 2011; Ghanavati and Nematpajooh, 2012; Akchlik et al., 2012; Zarrabian, 2015). این کلاد متشکل از سه زیرکلاد است. نخستین زیرکلاد O. aequidentata از بخشۀ Lophobrychis است. این زیرکلاد یک‌‌ساله و بال بلند با میوه‌‌های بزرگ حاوی دندانه‌‌ای بزرگ و مثلثی روی تاج میوه است و در اروپا، ترکیه، قفقاز، ایران، عراق، سوریه، فلسطین، لبنان و Cyprus پراکنش دارد. دومین زیرکلاد مربوط به O. caputgalli از بخشۀ Lophobrychis (گونه_‌‌ای با گل‌‌های گوچک، بال بلند و یک‌‌ساله) است و در اروپا، ایران، ترکیه، قفقاز و آسیای مرکزی یافت می‌‌شود (Širjaev 1925; Ball, 1968; Hedge, 1970; Grossheim 1972; Jafri, 1980; Rechinger, 1984)؛ بنابراین در مطالعۀ حاضر گونه‌‌های بخشۀ Lophobrychis که با بخشۀ Onobrychis ادغام شده‌‌اند، کنار یکدیگر قرار نمی‌‌گیرند و آنهایی که عدد پایۀ کروموزومی x=8 دارند در کلاد A و آنهایی که عدد پایۀ کروموزومی x=7 دارند در کلاد B واقع شده‌‌اند؛ اما در مطالعۀ Safaei Chaei Kar و همکاران (2014) گونه‌‌های بخشۀ Lophobrychis در کنار هم واقع شده‌‌اند که ممکن است مربوط به تعداد گونه‌‌های کمتر از بخشۀ Onobrychis در آن مطالعه باشد؛ ولی در مطالعۀ حاضر با حضور بیشتر گونه‌‌های بخشۀ Onobrychis، توپولوژی دقیق‌‌تری به دست آمد. سومین زیرکلاد شامل گونه‌‌های بال کوتاه چندساله است. براساس جمع‌‌بندی نهایی مطالعۀ Carbonero و همکاران (2012)، گونه‌‌های بال کوتاه اغلب رابطۀ نزدیکی با گونۀ O. viciifolia دارند که نتایج آن با نتایج حاصل از مطالعۀ حاضر مطابقت دارد و گونۀ یادشده با حمایت زیاد در زیرکلاد سوم مربوط به گونه‌‌های بال کوتاه قرار می‌‌گیرد؛ به‌‌علاوه با نتایج حاصل از مطالعۀ Zarrabian و همکاران (2015) همخوانی دارد که اظهار می‌‌کند گونه‌‌های Onobrychis با عدد پایۀ کروموزومی x=7 با گونۀ O. viciifolia در مقایسه با گونه‌‌هایی با عدد پایۀ کروموزومی x=8، قرابت بیشتری دارند.

1. viciifolia دارای پراکنش وسیعی از آسیای مرکزی تا روسیه و مناطق مدیترانه است. در مطالعۀ مورفولوژیکی و شمارش کروموزومی Ranjbar و همکاران (2010) پیشنهاد شد که به‌‌دلیل شباهت ریخت‌‌شناختی و خاستگاه جغرافیایی و پراکنش نزدیک به هم، سه گونۀ O. transcaucasica دیپلویید، O. viciifolia و O. altissima (براساس شواهد دارای تقسیم میوز آلوتتراپلویید) با یکدیگر قرابت دارند. در مطالعۀ حاضر نیز این سه گونه براساس داده‌‌های هسته‌‌ای در یک گروه و البته در کنار تعدادی گونۀ دیگر واقع شده‌‌اند و قرابت آنها تأیید می‌‌شود؛ با این حال به‌‌دلیل کشت زیاد در جایگاه محصولات علوفه‌‌ای، گسترۀ توزیع O. viciifolia مشخص نیست (Hedge, 1970). این گونۀ تتراپلوئید شباهت‌‌‌‌های مورفولوژیکی چشمگیری با گونۀ دیپلوئیدی O. transcaucasica Grossh دارد.

Onobrychis armena Boiss  و O. gracilis Besser در یک کلاد قرار می‌‌گیرند. این دو گونه از ماورای قفقاز تا آناتولی و جنوب شرقی اروپا دارای ویژگی‌‌های مورفولوژیکی مشابهی هستند (Hedge, 1970; Grossheim, 1972). ازنظر مورفولوژیکی، O. gracilis بسیار نزدیک به & Balansa O. elata Boiss است(Hedge, 1970) ؛ با این حال با کمال تعجب، براساس مطالعۀ مورفولوژیکی Safaei Chaei Kar و همکاران (2014)، گونۀ دوم در بخشۀ Hymenobrychis قرار گرفته است که ممکن است به شناسایی نادرست نمونه یا آلودگی حین PCR ارتباط داشته باشد.

Onobrychis avanakensis Amirahm.، O. bungei Boiss.، O. cyri Grossh و O. transcaspica V.Nikitin در یک زیرکلاد با پشتیبانی متوسط قرار می‌‌گیرند و در آسیای مرکزی، ایران و ماورای قفقاز توزیع شده‌‌اند. براساس مطالعۀ Lewke Bandara و همکاران (2013)،  O. Cyriدر موقعیت‌‌های مختلف قرار می‌‌گیرد؛ با این حال این گونه دارای شباهت ریخت‌‌شناختی چشمگیری به O. bungei، مانند طول ساقه، اندازه و رنگ گلبرگ، کاسۀ گل و ویژگی‌‌های میوه است (Rechinger, 1984).

برخی گونه‌‌های بال کوتاه این بخشه در اروپا و برخی در فلات ایران و آناتولی و آسیای مرکزی یافت می‌‌شوند.

براساس داده‌‌های حاصل از nrDNA ITS، زیرکلاد سوم از کلاد B خود به سه گروه تقسیم می‌‌شود.

زیرکلاد سوم شامل O. luristanica، O. carduchorum، O. fallax، O. shahpurensis و O. avanakensis است که با حمایت قوی در یک گروه قرار می‌‌گیرند، ویژگی‌‌های مورفولوژیکی مشابهی نیز دارند (ازجمله طول جام 7 تا 10 میلی‌‌متر، داشتن میوۀ بزرگ با طول میوۀ 6 میلی‌‌متر و دارابودن شکل میوۀ مشابه) و در غرب ایران، ترکیه، سوریه و عراق پراکنش دارند. O. carduchorum مربوط به O. fallax است؛ اما برگچه‌‌های بزرگ‌‌تر، موهای بلندتر پخش‌‌شده روی کاسۀ گل و میوه‌‌های بزرگ‌‌تر دارد (Hedge, 1970) و توسط مطالعۀ حاضر تأیید شده است.

Onobrychis argentea Boiss.، O. ebenoides Boiss & Spruner، O. ferganica (Slrjaev) Grossh.، O. minata Steven ex Boiss.، O. montana DC و O. pindicola Hausskn در یک کلاد با حمایت متوسط قرار گرفته‌‌اند. گروه مورفولوژیکی بسیار یکنواختی از این گونه‌ها، گیاهان چندساله با گل‌های صورتی در گل‌آذین‌های پرگل از آسیای مرکزی تا جنوب اروپا است(Ball, 1968; Hedge, 1970; Rechinger, 1984) .

زمان تخمینی واگرایی گونه‌‌های Onobrychis چندساله، که بیشتر به فلات ایران محدود می‌‌شود، با برخی از رویدادها شامل بالاآمدن فلات ترکیه - ایران (12 تا 5/14 میلیون سال قبل) و تشکیل رشته‌‌کوه در میوسن (8 تا 10 میلیون سال قبل) مطابقت دارد؛ همچنین با سازماندهی مجدد صفحات تکتونیک و بالاآمدن بیشتر فلات ایران در حدود 4 تا 6 میلیون سال قبل همخوانی دارد (Djamali et al., 2012). در منطقۀ ایران و تورانی، رشته‌‌کوههای ایران (برای مثال البرز و زاگرس) با نواحی کوهسری و فلور متنوع مختص مناطق کوهسری مشخص می‌‌شود (Noroozi et al., 2007). زیستگاههای کوهسری، میزبان تعداد شایان توجهی از گونه‌‌های اندمیک شناخته‌‌شده است (Noroozi et al., 2018)؛ همچنین ممکن است از نوسان‌‌های آب و هوایی پس از خشک‌‌شدن دریای مدیترانه در اواخر میوسن تأثیر گرفته باشد (Görür and Sakinc, 1995)؛ علاوه‌‌بر این در همان دوره، گونه‌‌های یک‌‌ساله که از قبل با نام بخشۀ Lophobrychis یاد می‌‌شدند با x=7 و x=8 دوبار به‌‌طور مستقل، در قاعدۀ کلادهای اصلی در درخت، تکامل یافته‌‌اند که با یافته‌‌های Amirahmadi و همکاران (2016) مطابقت دارد.

به نظر می‌‌رسد گونه‌‌های یک‌‌ساله با عدد پایۀ کروموزومی x=8 از آسیای مرکزی و شمال غربی آسیا، در فلات ایران متحمل گونه‌‌زایی دگرجایی (Allopathric speciation) در غرب (آذربایجان، ترکیه، ارمنستان، عراق و شمال غرب ایران) و شرق (خراسان، افغانستان، ترکمنستان و آسیای مرکزی) شده باشند. گونه‌‌های بال بلند شمال غربی و شمال شرقی به‌‌طور تقریبی موازی با یکدیگر در دو ناحیۀ جغرافیایی مختلف تکامل یافته‌‌اند؛ درنتیجه به‌‌صورت گونه‌‌های جانشین (vicariant) هستند. گونه‌‌های بال بلند غربی (O. densijuga، O. stenostachya، O. saxatilis، O. araxina و O. sosnovskyi) در کلاد «A» متحمل کاهش در تعداد عدد پایۀ کروموزومی شده‌‌اند. گونۀ O. saxatilis تنها گونۀ این گروه است که در غرب اروپا مشاهده می‌‌شود و درواقع تنها گونۀ چندسالۀ بال بلند اروپایی است.

جمع‌‌بندی

گروه‌‌بندی بخشۀ Onobrychis براساس طول بال و عدد کروموزومی با داده‌‌های مولکولی نسبت به سایر صفات ریخت‌‌شناسی مانند گل و میوه یا صفات رویشی مطابقت بیشتری دارد. با توجه به طول بال، بخشۀ Onobrychis به دو گروه تقسیم می‌‌شود که گونه‌‌های بال کوتاه تک‌‌تبار است؛ اما گونه‌‌های بال بلند پیراتبار است. گونه‌هایی که عدد پایۀ کروموزومی x=7 دارند، مستقل از هم تکامل یافته‌‌اند؛ همین‌‌طورگونه‌های یک‌‌ساله، یک گروه تک‌تبار تشکیل نداده‌‌اند و تکامل موازی نشان می‌‌دهند.

ظهور بخشۀ Onobrychis به 95/11 میلیون سال پیش در میوسن میانی بازمی‌‌گردد و وقوع هر دو کلاد اصلی در زمان‌‌های تقریبیِ مشابهی رخ داده است. گونه‌زایی و تنوع‌‌یابی گونه‌های بال کوتاه با سرعت بیشتر رخ داده است و جوان‌‌تر هستند؛ بنابراین فرصت کافی برای اشتقاق کامل کل ژنوم وجود نداشته است؛ همچنین گفتنی است که دورگ‌‌گیری‌‌های مکرر در بین گونه‌‌های بال کوتاه منجر به ایجاد گونه‌‌های آلوپلی‌‌پلوئید شده است؛ بنابراین باوجود تفاوت‌‌های ریخت‌‌شناسی، گروه‌‌بندی براساس داده‌‌های مولکولی تاحدودی متفاوت است. پدیدارشدن گونه‌‌های چندسالۀ بال بلند شمال غرب و گونه‌‌های چندسالۀ بال بلند شمال شرق به‌‌طور تقریبی در زمان‌‌های مشابه و به‌‌صورت جداگانه در نواحی جغرافیایی مجزا ازطریق تکامل موازی است.

سپاسگزاری

نویسندگان از معاونت محترم پژوهشی و فناوری دانشگاه تربیت مدرس برای حمایت مالی از این پژوهش قدردانی می‌‌کنند.