مطالعه فعالیت ضدمیکروبی نانوذرات بیوسنتزشده با دو روش متفاوت توسط سیانوباکتری آب شیرین Nostoc sp.

مقدمه.

امروزه نقش سیانوباکتری‌ها در سنتز نانوذرات فلزی مانند کادمیوم، طلا و نقره بسیار حائز اهمیت است (1-3). عصاره سیانوباکتری‌ها منبعی از ترکیب‌های با ارزش مانند کاروتنوئیدها، اسیدهای چرب، پلی‌ساکاریدها، لیپوپپتیدها و سایر ترکیب‌های زیست فعال هستند که به سنتز ترکیب‌هایی با ارزش در محیط کشت منجر می‌شوند (4)؛ برای مثال، گونه‌های جنس Nostoc از سیانوباکتری‌های مهم در بیوتکنولوژی‌اند؛ زیرا این گونه‌ها سم تولید نمی‌کنند و در محیط کشت ارزان و ساده رشد می‌کنند. همچنین دیگر گونه‌های سیانوباکتری رشته‌ای نظیرAnabaena ، Calothrix و Leptolyngbya توانایی تشکیل نانوذرات با اندازه کنترل‌شده را دارند (5). سیانوباکتری‌ها با توانایی تثبیت نیتروژن اتمسفر (N₂) و کاهش گاز نیتروژن به آمونیاک با استفاده از آنزیم‌های نیتروژن ردوکتاز منجر به تبدیل زیستی فلزات به نانوذرات می‌شوند و به این گونه فلزات سنگین را از محیط حذف می‌کنند (6). علاوه بر این، سیانوباکتری‌ها حاوی مولکول‌های زیستی مختلفی ازجمله متابولیت‌های ثانویه، پروتئین‌ها، آنزیم‌ها و رنگدانه‌ها هستند که خواص زیستی مهمی مانند فعالیت ضدمیکروبی و ضدسرطانی را به همراه دارند.

به‌طور کلی روش‌های بیوسنتز نانوذرات می‌توانند به سنتز داخل سلولی و خارج سلولی تقسیم شوند. تشکیل درون سلولی نانوذرات، به مواردی گفته می‌شود که کاهش مواد حجیم به نانوذرات در داخل سلول‌های میزبان تحت کنترل عوامل زیستی مختلف انجام می‌شود (7-۹). سنتز خارج سلولی نانوذرات، در خارج از سلول اتفاق می‌افتد و مولکول‌های زیستی تراوش‌شده مانند رنگدانه‌ها، یون‌ها، پروتئین‌ها، آنزیم‌ها، هورمون‌ها و آنتی‌اکسیدان‌ها نقش مهمی در فرایند کاهش نانوذرات را به عهده دارند (10).

نانوذرات نقره، متداول‌ترین نانوذرات مغناطیسی استفاده‌شده در زمینه‌های مختلف‌اند و می‌توانند در بسیاری از محصولات صنعتی و پزشکی ازجمله پانسمان‌ها، ابزارهای جراحی و ماسک‌ها، مواد شوینده و محصولات مراقبتی یافت شوند. با توجه به معایبی مانند هزینه بالا و تولید محصولات جانبی سمی، روش‌های سنتز سبز برای تولید نانوذرات توسعه یافته‌اند؛ به همین دلیل است که تحقیقات سنتز سازگار با محیط زیست برای کشف ارگانیسم‌های جدید با ظرفیت هیدرولیتیک برای سنتز نانوذرات به سرعت گسترش یافته‌اند. در میان موجودات مختلف، سیانوباکتری‌ها، مسیر ساده‌ای را برای تولید نانوذرات نقره مدنظر فراهم می‌کنند. مطالعات فراوانی در زمینة تولید زیستی نانوذرات به کمک میکروارگانیسم‌های مختلف انجام شده‌اند؛ اما مطالعات کمی روی سنتز نانوذرات با استفاده از سیانوباکتری‌ها انجام شده‌اند (11-13).

در مطالعه حاضر، سنتز نانوذرات نقره با فعالیت بالقوه ضدمیکروبی توسط سیانوباکتریوم بومی نوستوک آب شیرین انجام شده است. این پژوهش، جزء نخستین کار‌های انجام‌شده در ایران است. در این بررسی علاوه بر سنتز نانوذرات نقره و تأیید آنها به کمک تکنیک‌های آزمایشگاهی، از روش‌های مولکولی به‌منظور شناسایی سویه بررسی‌شده استفاده شده است.

مواد و روش‌ها

الف- کشت سیانوباکتری Nostoc sp.: کشت نمونه‌های خالص‌شده در محیط کشت BG-11₀ در اتاقک رشد با دمای 2±28 درجه سانتی‌گراد و روشنایی ممتد فلورسنت با شدت 300 میکروانشتین در متر مربع در ثانیه برای ۱۴ روز انجام و درنهایت عکس میکروسکوپی تهیه شد (شکل ۱) (14).

شکل ۱- نمونه سیانوباکتری Nostoc sp. تلقیح‌شده در محیط کشت A) مایع و B) جامد BG-11₀ در اتاقک رشد با دمای 2± 28 درجه سانتی‌گراد و روشنایی ممتد فلورسنت

.ب- شناسایی مولکولی سویه‌های سیانوباکتریایی بر‌اساس توالی 16S rRNA.

استخراج DNA: استخراج DNA به روش دستی CTAB انجام و برای تعیین کیفیت DNA از روش کیفی به کمک لودکردن روی ژل الکتروفورز و روش کمی به کمک دستگاه نانودراپ (Thermo spectrophotometer Scientific) استفاده شد.

تکثیر توالی ژن 16S rRNA: به‌منظور تکثیر توالی ژن 16S rRNA، از پرایمرهای 27FI: 5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (15) و23S30Ra:  5`-CTTCGCCTCTGTGTGCCTAGGT (۱۶) استفاده شد. برنامه PCR برای تکثیر ژن 16S rRNA، در ۹۴ درجه سانتی‌گراد به مدت ۵ دقیقه، ۹۴ درجه سانتی‌گراد به مدت ۳۰ ثانیه، ۵۶ درجه سانتی‌گراد به مدت ۳۰ ثانیه، ۷۲ درجه سانتی‌گراد به مدت ۲ دقیقه و ۷۲ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵ دقیقه انجام شد؛ درنهایت، محصول PCR روی ژل آگارز، لود و سایز باند به‌دست‌آمده با مارکر مقایسه شد.

.پ- آنالیزهای بیوانفورماتیک و رسم درخت فیلوژنتیک: توالی‌های به‌دست‌آمده با کمک نرم‌افزار BioEdit، هم‌ردیف‌سازی شدند. توالی اجماع به‌دست‌آمده در سایت NCBI،Blast N شد و با توالی ژن‌های ثبت‌شده در بانک ژن، مقایسه و درصد تشابه آنها با سایر ژن‌های ثبت‌شده بررسی شد. صد سویه‌ای که بیشترین شباهت را با ژن مدنظر داشتند، به کمک سایت MAFFT VERGEN7 هم‌ردیف‌سازی شدند و درنهایت پس از انتخاب بهترین مدل، رسم درخت فیلوژنتیک به کمک برنامه آنلاین Iq tree web server انجام شد. علاوه بر آن، از سویه Gloeobacter violaceus VP3-01 (FR798924) به‌عنوان ریشه استفاده شد.

ت- بیوسنتز نانوذرات نقره

روش استفاده از بیومس تر: در این روش، کشت‌های 15 روزه سیانوباکتری‌ها که در اواسط فاز لگاریتمی به سر می‌برند، به‌منظور استخراج DNA استفاده شدند. گفتنی است سویه‌های سیانوباکتری با توجه به سویه و محیط کشت، روزهای مختلفی را در فازهای مختلف رشد می‌گذراند؛ در سویه مطالعه‌شده با توجه به اینکه مدام کشت‌ها با اضافه‌کردن محیط جدید در فاز لگاریتمی نگه داشته می‌شدند، 5 تا 7 روز را در فاز تأخیری می‌گذراند، بلافاصله با تکثیر سریع وارد سویه لگاریتمی می‌شود و اگر با محیط کشت جدید تلقیح نشود بعد از 15 روز وارد فاز ایستایی می‌شود.

به‌منظور استخراج DNA، کشت‌های 15 روزه با سانتریفیوژ در rpm 5000 برای 10 دقیقه در 20 درجه سانتی‌گراد جدا شدند و سوپرناتانت دور ریخته شد و بیومس، سه مرتبه با آب مقطر (دیونیزه) شسته و هربار سانتریفیوژ شد. سه گرم بیومس تر در فلاسک‌های 500 میلی‌لیتر با 100 میلی‌لیتر محلول نیترات نقره به‌طور جداگانه با غلظت‌های 1، 2 و 3 میلی‌مولار در 7=pH تلقیح و در 25 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند (14, 17).

روش جوشاندن: در روش جوشاندن، کشت‌های سیانوباکتری، در rpm 2500 در 10 دقیقه سانتریفیوژ شد تا بیومس جلبکی حاصل شود. بعد از سانتریفیوژ، بیومس حاصل بعد از 3 بار شستشو در آون 60 درجه سانتی‌گراد خشک شد. یک گرم وزن خشک در 10 میلی‌لیتر آب دو بار تقطیر، برای 15 دقیقه در 100 درجه سانتی‌گراد در ارلن (بن ماری جوش) جوشانده شد. بعد از جوشیدن، مخلوط حاصل، سرد و در rpm 10000 برای 15 دقیقه سانتریفیوژ شد. سوپرناتانت، جمع‌آوری و در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. عصاره‌های فاقد سلول (سوپرناتانت) سویه‌های سیانوباکتری برای سنتز نانوذرات نقره استفاده شدند. سپس 2 میلی‌لیتر از عصاره، درون 10 میلی‌لیتر محلول نیترات نقره 1 میلی‌مولار درون ارلن‌های 100 میلی‌لیتر ریخته شد. مخلوط واکنش در 100 درجه سانتی‌گراد قرار داده و تکان‌دادن به‌طور مداوم انجام شد. محلول بی‌رنگ به تدریج به زرد مایل به قهوه‌ای و سپس بعد از چرخش مداوم بعد از 45 دقیقه به آرامی به قهوه‌ای تیره تبدیل شد. نانوذرات نقره سنتزشده، به کمک سانتریفیوژ در rpm 15000 و 20 دقیقه در 4 درجه سانتی‌گراد جمع‌آوری شدند. بیومس به‌دست‌آمده با آب مقطر دو مرتبه شستشو داده و از اتانول 90 درصد برای حذف ناخالصی‌ها استفاده شد. بعد از شستشو و سانتریفیوژ خشک شد تا درنهایت، پودر نانوذره نقره خالص به دست آمد. درواقع به‌دلیل استفاده از اتانل 90 درصد، بعد از مدتی ماندن در جریان هوا، خشک خواهد شد؛ درنهایت، طیف‌سنجی در فواصل زمانی 0، 12، 24 و 48 ساعت بین 200 تا 800 نانومتر با استفاده از طیف‌سنجی نوری انجام شد (18).

.ث- بررسی ویژگی‌های نانوذرات نقره تولیدشده: برای تأیید حضور نانوذرات نقره،‌ از آنالیزهای SEM، FT-IR و DLS استفاده شد. ابتدا نانوذرات به‌دست‌آمده برای تصویربرداری با دستگاه میکروسکوپ الکترونی روبشی، با دستگاه اولتراسونیک، پردازش و درنهایت با بهره‌گیری از نرم‌افزار Image J واکاوی شدند و میانگین اندازه نانوذرات موجود در شکل‌ها به دست آمد و جدول فراوانی نانوذرات نیز با نرم‌افزار Excel تهیه شدند (14). از آنالیز FT-IR برای تعیین ساختار نانوذرات نقره و همچنین بررسی گروه‌های عملکردی استفاده شد. برای این منظور، از روش تهیه قرص پتاسیم برماید (KBr) با مخلوط نانوذرات استفاده شد (19). برای بررسی پراکندگی نور دینامیک، نمونه‌ با جذب ویژه نانوذرات نقره بدون ته‌نشینی و دارای پایداری کلوئیدی، برگزیده و سنجش پراکندگی نور دینامیک انجام شد (20).

.ج- فعالیت آنتی‌باکتریال نانوذرات نقره (ارزیابی سنجش حساسیت ضدمیکروبی (AST))^[1]: ارزیابی ویژگی‌های ضدمیکروبی با روش انتشار دیسک براساس روش نوروزی و همکاران انجام گرفت (21). این روش بر دیدن هاله بدون رشد در پیرامون دیسک‌های دارای خاصیت ضدمیکروبی استوار است. در این پژوهش سویه‌های باکتریایی E.coli ATCC 25922، S.aureus ATCC 25923 و P.aeruginosa ATCC 27853 سنجش شدند. سویه‌های خالص میکروبی به گونة لیوفیلیزشده، بسترهای کشت آماده مولر هینتون آگار، TSB و همچنین محلول استاندارد نیم مک‌فارلند از شرکت زیست رویش خریداری شدند. دیسک‌های آنتی‌بیوتیک و دیسک‌های خام نیز از شرکت پادتن طب فراهم شدند. سویه‌های لیوفیلیزه بر پایة آیین‌نامه شرکت زیست رویش برای بازیابی‌شدن در بسترهای کشت مایع TSB نهاده شدند و برای 24 ساعت در انکوباتور 35 درجه سانتی‌گراد جای گرفتند. پس از گذشت 24 ساعت با استفاده از لوپ، از بسترهای کشت مایع TSB به روی بسترهای کشت‌های بلاد آگار کشت شدند و برای 24 ساعت در انکوباتور 35 درجه سانتی‌گراد جای گرفتند. تعداد اندکی از کلنی‌های ناب از پلیت‌های آگار خوندار، برداشت و در لوله‌های تمیز و سترون سرم فیزیولوژیک پراکنده شدند. تیرگی این محلول‌های دارای باکتری‌های ناب با استاندارد نیم مک‌فارلند سنجش و با آن برابر شدند. پس از آماده‌شدن محلول‌های باکتریایی با غلظت نیم مک‌فارلند با سوآپ‌های استریل از محلول نیم مک‌فارلند، برداشت و به گونه کشت چمنی روی بسترهای مولر هینتون آگار کشت داده شدند.

روی هر پلیت مورد آزمون در کنار شعله با استفاده از پنس استریل، 3 دیسک جایگذاری شد. یک دیسک آنتی‌بیوتیک به‌عنوان شاهد مثبت، یک دیسک آغشته‌شده به نانوذره و یک دیسک برای کنترل منفی و بدون نانوذره بود. برای ارزیابی نانوذرات سنتزشده از دیسک دارای عصاره بدون نانوذرات نقره برای کنترل منفی بهره‌گیری شد. دیسک‌های سیپروفلوکساسین 5 میکروگرم برای آزمون با سویه‌های E.coli و aeruginosa Pseudomonas و دیسک آمپی‌سیلین 10 میکروگرم برای آزمون با سویه Staphylococcus aureus به کار رفتند.

ح- روش‌های آماری: واکاوی داده‌های آماری به‌دست‌آمده از هر آزمایش با نرم‌افزار SPSS (نسخه 24) و Excel انجام شد. همه داده‌ها از سه بار تکرار آزمون به دست آمده‌اند. معنی‌داربودن تفاوت‌ها بین موارد اندازه‌گیری‌شده با آنالیز واریانس یک‌طرفه با حدود اطمینان 95 درصد و مقایسه میانگین‌ها با آزمون ANOVA و tukey در مدت زمان ۴۸ ساعت برای 3 سویه باکتری گرم مثبت Staphylococcus aureus و سویه باکتری گرم منفی Escherichia coli و Pseudomonas aeruginosa انجام شد و یافته‌های مربوط به مقایسه‌ها به‌صورت نمودار با برنامه Excel نشان داده شدند.

نتایج.

.الف- نتایج حاصل از شناسایی مولکولی سویه مطالعه‌شده: درخت فیلوژنتیک، روابط فیلوژنتیک بین سویه مطالعه‌شده و سویه‌های مشابه را براساس توالی ژن 16S rRNA نشان داده است. سویه مطالعه‌شده با رنگ قرمز مشخص شده است. نمونه Gloeobacter violaceus VP3-01 (FR798924) به‌عنوان ریشه انتخاب شده است. اعداد کنار هر گره انشعابی نشان‌دهندة فراوانی حاصل از آنالیز Bootstrap حاصل از 1000 تکرار است. با توجه به درخت فیلوژنتیک رسم‌شده، هر شاخه روابط بین آرایه‌ها ازنظر نسل یا جد (نیاکان) را معین می‌کند. طول شاخه بیان‌کنندة میزان تفاوت‌ها نسبت به نیای مشترک است (شکل ۲). درخت رسم‌شده با روش Iq tree web server نشان داد سویه  Nostoc sp.با قرابت فیلوژنتیکی 5/97 درصد همراه با سایر سویه‌های Nostoc درون یک کلاد قرار گرفته است (شکل ۲).

.ب) نتایج ارزیابی سنتز نانوذرات نقره توسط بیومس تر: نتایج حاصل از طیف‌سنجی نشان دادند در غلظت‌های 1، 2 و 3 میلی‌مولار نیترات نقره، در زمان صفر پیک در ناحیه 420 نانومتر ایجاد شد که نشان‌دهندة سنتز نانوذرات نقره درست در همان زمان تلقیح با سلول‌های سیانوباکتریایی است؛ اما در زمان‌های 12، 24 و 48 ساعت تغییر رنگی مشاهده نشد (شکل ۳). عدم تغییر رنگ نشان‌دهندة عدم پایداری نانوذرات نقره در طول زمان است. علاوه بر آن، نتایج نشان دادند در ارلن‌های فاقد عصاره سیانوباکتری که به‌عنوان کنترل در نظر گرفته شده بودند، هیچ تغییر رنگی مشاهده نشد.

پ) نتایج ارزیابی تولید نانوذرات نقره با روش جوشاندن:در سنتز نانوذرات نقره ازطریق روش جوشاندن، با غلظت 1 میلی‌مولار نیترات نقره در زمان صفر، تغییر رنگ به قهوه‌ای تیره دیده شد که نشان‌دهندة سنتز نانوذرات نقره در این زمان بود؛ اما در زمان‌های 12، 24 و 48 ساعت، عدم تغییر رنگ در این غلظت، نشان‌دهندة ناپایداری نانوذرات نقره سنتزشده بود (شکل ۴).

.ت) نتایج حاصل از طیف‌سنجی تبدیل رامان و فوریه به مادون قرمز (FTIR): در این روش از نانوذره‌ای که با روش بیومس تر در غلظت 1 میلی‌مولار نیترت نقره در زمان صفر سنتز شده بود به‌منظور طیف‌سنجی تبدیل رامان و فوریه به مادون قرمز (FTIR) استفاده شد. آنالیز داده‌های مربوط به تولید نانوذره نقره در شکل ۵ نشان داده شده است. پروتئین به‌عنوان عامل تثبیت کننده نانوذرات نقره را احاطه کرده است. طیف به‌دست‌آمده حضور گروه‌های عاملی مختلف را برای نانوذرات نقره سنتزشده مشخص کرد که نقش مهمی در احیای یون‌های نقره به نانوذرات نقره و پایداری نانوذرات حاصل دارند (شکل ۵ و ۶).

شکل ۲- روابط فیلوژنتیک بین سویه مطالعه‌شده و سویه‌های مشابه براساس توالی ژن 16S rRNA. سویه مطالعه‌شده با رنگ قرمز نشان داده شده است. نمونه Gloeobacter violaceus VP3-01 (FR798924) به‌عنوان ریشه انتخاب شده است. سویه  Nostoc sp.با قرابت فیلوژنتیکی 5/97 درصد همراه با سایر سویه‌های Nostoc درون یک کلاد قرار گرفته است.

شکل ۳- تغییر رنگ قهوه‌ای تیره؛ A) غلظت 1 میلی‌مولار B) ۲ میلی‌مولار و C) ۳ میلی‌مولار نیترات نقره در حضور بیومس تر در زمان صفر. نمودار طیف‌سنجی UV-Vis غلظت 1، 2 و 3 میلی‌مولار نیترات نقره تولیدی توسط بیومس تر در زمان‌های 0، 12، 24 و 48 ساعت. نمودار نشان‌دهندة بیشترین جذب در 420 نانومتر در زمان صفر است.

.

شکل 4- تغییر رنگ قهوه‌ای تیره غلظت 1 میلی‌مولار نیترات نقره در روش جوشاندن به همراه نمودار طیف‌سنجی نانوذرات نقره تولیدی با روش جوشاندن در غلظت 1 میلی‌مولار در زمان‌های 0، 12، 24 و 48 ساعت نشان داده شده است. نمودار نشان‌دهندة پیک جذبی در 420 نانومتر در زمان صفر است.

طیف IR دو پیام برای ارتعاش کششی پیوند (C_sp³ –H) آلکان در ناحیه 2918 بر سانتی‌متر و 2849 بر سانتی‌متر و یک پیام دیگر برای (C_sp2 –H) آلکن در 3027 بر سانتی‌متر نشان می‌دهد. پیک‌هایی متوسط در ناحیه حدود 1380 مربوط به CH₂ و CH₃ خمشی است. همچنین دو جذب در ناحیه 1466 بر سانتی‌متر و 1633 بر سانتی‌متر نشان‌دهندة حلقه آروماتیک‌اند. در ناحیه 1039 پیک مربوط به C–N کششی به‌صورت یک پیک متوسط دیده می‌شود. همچنین جذب مشاهده‌شده در ناحیه 1694 پیک مربوط به C=N و گروه آمیدی است. جذب‌های مربوط به ارتعاش کششی گروه NH و OH در ناحیه 3146 بر سانتی‌متر و 3250 بر سانتی‌متر نشان داده شده‌اند.

شکل ۵- تجزیه و تحلیل طیف‌سنجی تبدیل رامان و فوریه به مادون قرمز از نوع TABLLET مربوط به نانوذرات نقره تولیدی به روش بیومس تر در غلظت 1 میلی‌مولار در زمان 48 ساعت. گروه‌های عاملی مشخص‌شده توسط پیک‌ها، وجود پوشش پروتئینی برای کاهش یون‌های نقره را نشان می‌دهند.

شکل ۶- تجزیه و تحلیل طیف‌سنجی تبدیل رامان و فوریه به مادون قرمز از نوع ATR مربوط به نانوذرات نقره تولیدی به روش بیومس تر در غلظت 1 میلی‌مولار در زمان 48 ساعت. گروه‌های عاملی مشخص‌شده توسط پیک‌ها، وجود پوشش پروتئینی برای کاهش یون‌های نقره را نشان می‌دهند.

.ث) بررسی تصایر میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM): با توجه به تصویر میکروسکوپ الکترونی، مشخص شد با افزودن بیومس تر به نیترات نقره با غلظت 1 میلی‌مولار، رسوب نانوذرات نقره در سطوح سلولی ایجاد شد (شکل ۷) و نانوذرات نقره کروی کوچک با اندازه‌های 28 تا 50 نانومتر در سطوح سلولی رسوب کردند.

شکل ۷- تصاویر میکروسکوپ الکترونی SEM. اندازه نانوذرات به روش بیومس تر در غلظت 1 میلی‌مولار در زمان صفر، 28 تا 50 نانومتر بود و نانوذرات کروی شکل بودند.

.ج) طیف‌سنجی پراکندگی انرژی (اشعه ایکس) (EDS): نتایج حاصل از طیف‌سنجی پراکندگی انرژی، وجود ذرات نقره را به میزان بیشتری با ردیابی عناصر مختلفی مانند منیزیم، سدیم، پتاسیم، کلسیم و کلرید نشان دادند. در این تجزیه و تحلیل توسط طیف‌سنجی پراکندگی انرژی (اشعه ایکس) نانوذرات نقره سنتزشده به روش بیومس ‌تر سویه سیانوباکتری Nostoc sp. در غلظت 1 میلی‌مولار نیترات نقره در زمان 48 ساعت، وجود سیگنال عنصری نقره تأیید شد (شکل ۸).

چ) آنالیز پراکندگی نور دینامیکی (DLS): قطر هیدرودینامیکی نانوذرات نقره سنتزشده با استفاده از بیومس تر در غلظت 1 میلی‌مولار در زمان 48 ساعت با دستگاه پراکندگی نور دینامیکی (DLS) مدل Sympatec Helos H2396 اندازه‌گیری شد. نتایج مشخص کردند نانوذرات نقره سنتزشده اندازه‌ای در حدود 9/0 تا 87 نانومتر دارند و میانگین اندازه نانوذرات نقره 1/16 نانومتر بود (شکل ۹).

شکل ۸- طیف‌سنجی پراکندگی انرژی (اشعه ایکس) (EDS) نانوذرات نقره سنتزشده در روش بیومس تر سویه سیانوباکتری Nostoc sp.، با غلظت 1 میلی‌مولار نیترات نقره در زمان 48 ساعت

شکل ۹. تجزیه و تحلیل پراکندگی نور پویا (DLS) نانوذرات نقره سنتزشده در روش بیومس تر سویه سیانوباکتری Nostoc sp.، با غلظت 1 میلی‌مولار نیترات نقره در زمان صفر

ح) نتایج فعالیت آنتی‌باکتریال نانوذرات نقره ()ارزیابی سنجش حساسیت ضدمیکروبی (AST))^[2]: نتایج حاصل از آزمون واریانس یک‌طرفه و آزمون Tukey نشان دادند تفاوت معناداری در قطر ممانعت از رشد بین باکتری‌های S. aureus، E. coli و P. aeruginosa وجود دارد. میانگین هاله عدم رشد بعد از 3 تکرار و بررسی‌های آماری برای E.coli، S.aureus و p. aeruginosa به‌ترتیب برابر 33/15، 33/19 و 33/22 میلی‌متر بود (شکل ۱۰. A-C).

شکل 10- تست آنتی‌بیوگرام. در این پژوهش سویه‌های باکتری E.coli ATCC 25922، S.aureus ATCC 25923 و P.aeruginosa ATCC 27853 سنجش شدند. پلیت‌های A تا C به‌ترتیب نشان‌دهندة A) سودوموناس آئروژینوزا، B) استافیلوکوکوس اورئوس و C) اشریشیا کلی،‌ به همراه 3 تکرار N= دیسک حاوی نانوذرات نقره، + نشان‌دهندة کنترل مثبت و – نشان‌دهندة دیسک بدون آنتی‌بیوتیک هستند. دیاگرام نشان‌دهندة واکاوی داده‌های آزمون میکروبی است. تفاوت حروف روی ستون‌ها (a,b,c) نشان‌دهندة تفاوت معنادار در قطر ممانعت از رشد باکتری‌های مطالعه‌شده توسط نانوذره تولیدشده است.

بحث و نتیجه‌گیری

سیانوباکتری نوستوک به‌علت داشتن رنگدانه‌های فتوسنتزی فیکوسیانین^[iii] و فیکواریترین^[iv] و آنزیم‌های اکسید و ردوکتازی قوی می‌تواند به‌عنوان یک میکروارگانیسم مناسب برای تولید نانوذرات استفاده شود. در این پژوهش سنتز نانوذرات نقره به‌صورت خارج سلولی با روش زیستی انجام گرفت. در روش خارج سلولی، یون‌های فلزی، روی سطح سلول‌ها به دام می‌افتند؛ به همین دلیل در مقایسه با تولید داخل سلولی، به استخراج نانوذرات تولیدشده از درون سلول نیاز نیست و این سبب شده است روش مطالعه‌شده در این پژوهش نسبت به روش تولید داخل سلولی نانوذرات نقره مقرون‌به‌صرفه‌تر باشد (22). در این پژوهش تغییر رنگ محلول حاوی نیترات نقره به قهوه‌ای تیره به‌دلیل ارتعاشات پلاسمون سطحی در نانوذرات نقره است و این تغییر رنگ به‌طور واضح از نشانه‌های اولیه تشکیل نانوذرات نقره است که با نتایج مطالعات کومار و همکاران مطابقت دارد (23). در حقیقت، الکترون‌های آزاد در نانوذرات نقره با جذب نور مرئی برانگیخته می‌شوند و به یک تراز انرژی بالاتر می‌روند؛ اما به‌علت ناپایداری الکترون در حالت برانگیخته دوباره به تراز انرژی پایه برمی‌گردند و به همین دلیل فوتون از خود ساطع می‌کند. از آنجایی که برانگیختگی الکترون‌های آزاد وقتی در معرض نور قرار می‌گیرند به شکل رزونانسی است، نوری که ساطع می‌کنند در محدوده مرئی و به رنگ خاصی دیده می‌شود (24)؛ مثلاً نانوذرات طلا، نور قرمز مایل به بنفش و نانوذرات نقره، نور قهوه‌ای ساطع می‌کنند (25). این پدیده کمک می‌کند از لحاظ ماکروسکوپی به تشکیل نانوذرات پی برده شود. باکتری‌هایی که قادر به احیای یون نقره هستند، رنگ محلول نقره را به صورتی، قهوه‌ای، زرد، ارغوانی و خاکستری تغییر می‌دهند. علت به وجود آمدن رنگ‌های مختلف، ناشی از شرکت عوامل زیستی متفاوت از باکتری‌ها برای احیای یون‌های نقره به نانوذرات نقره است که به تولید نانوذرات با اشکال و ابعاد مختلف منجر می‌شود و درنهایت، رنگ‌های مختلفی از نانوذرات ایجاد می‌شوند (26). در پژوهش حاضر تغییر رنگ مشاهده‌شده به قهوه‌ای تیره در اثر برهمکنش بیومس و محلول نیترات نقره با نتایج حاصل از پژوهش جیوان و همکاران در سال 2012، بارابادی و هناری در سال 2014 و فقری زوناس و همکاران در سال 2011 مشابهت داشت و نخستین نشانه‌های تولید نانوذرات نقره محسوب می‌شود (25, 27, 28).

در زمینة تولید نانوذرات فلزی با استفاده از میکروارگانیسم‌ها طی چندین سال مطالعاتی صورت گرفته است؛ در همه این تحقیقات نانوذرات بعد از تولید، تعیین ویژگی شده و هریک از ویژگی‌های نانوذرات با دستگاه‌هایی بررسی شده‌اند. در پژوهش حاضر، نانوذرات نقره بعد از تولید، با استفاده از آنالیز‌های دستگاهی بررسی شدند. یکی از ساده‌ترین روش‌ها برای تعیین ویژگی نانوذرات و نخستین گام در تأیید تولید نانوذرات فلزی، استفاده از طیف‌سنجی UV-vis است. پیک جذبی نانوذرات سنتزشده در پژوهش حاضر با پیک جذب نانوذرات سنتزشده در مطالعات سینگ و همکاران در سال ۲۰۱۴ (29, 30) و آل‌طیب و همکاران در سال 13۹۶ (31) مشابهت داشت. مهدیه و همکاران در سال 2012 نیز توانستند نانوذرات نقره را با سیانوباکتری Spirulina Platensis سنتز کنند (32). همچنین، در مطالعه حسین و همکاران در سال 2015، عصاره سیانوباکتری‌های آبی برای سنتز نانوذرات نقره جدا شد و با پژوهش حاضر تقریباً همخوانی داشت (20). در مطالعه احمد و همکاران در سال 2015، بیوسنتز نانوذرات نقره توسط Spirulina platensis و Nostoc sp. بررسی شد. در این تحقیق نتایج حاصل از طیف‌سنجی UV-Visible، رزونانس پلاسمون سطح را در 402 نانومتر نشان داد که با نتایج پژوهش حاضر مغایرت داشت (17).

از میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) برای تأیید تولید نانوذرات نقره استفاده شد. کنترل اندازه و ساختار نانوذرات تولیدشده، مربوط به برهمکنش بین ترکیبات زیستی مانند پلی‌ساکاریدها، پروتئین، پلی‌فنلی‌ها و اتم‌های فلزی می‌تواند باشد (33). پژوهش حاضر با نتایج آنالیز SEM نانوذرات نقره تولیدشده توسط راجشکومار و همکارانش در سال 2013 مشابهت دارد (34). حمیدا و همکاران در سال ۲۰۲۰ دریافتند Desertifilum IPPAS B-1220 sp. می‌تواند نانوذرات نقره‌ای کروی با اندازه‌های 5/4 تا 26 نانومتر تولید کند که با نتایج حاصل از پژوهش حاضر مغایرت داشت (35).

در این پژوهش، آنالیز پراکندگی نور دینامیک (DLS) برای تعیین قطر هیدرودینامیک انجام گرفت. اختلاف اندازه نانوذرات آبدار در سنجش پراکندگی نور دینامیک و نانوذرات بدون پوشش در تصاویر میکروسکوپ الکترونی به این معنی است که نانوذرات نقره سنتزشده در این مطالعه، یک پوشش آبدار و پروتئینی داشته‌اند. پروتئین‌ها با متصل‌شدن به نانوذرات نقره و ایجاد یک تاج پروتئینی از توده‌ای‌شدن و آگلومریزه‌شدن نانوذرات جلوگیری می‌کنند و این پدیده نیز بر پایداری نانوذرات نقره می‌افزاید (36). ناهمسان‌بودن اندازه نانوذرات در پراکندگی نور دینامیک و میکروسکوپ الکترونی روبشی، یک روند به هنجار و همیشگی است؛ زیرا همان‌طور که پیش از این نیز بررسی شد، سنجش پراکندگی نور دینامیک براساس اندازه‌گیری قطر هیدرودینامیک و ساختار چندلایه است که نانوذرات نقره، مانند هسته‌ای در کانون و درون پوششی از تاجی آبدار و بیشتر پروتئینی قرار گرفته‌اند؛ بنابراین یافته‌های به‌دست‌آمده از سنجش‌های پراکندگی نور دینامیک ازنظر ساختاری و شیمی سطحی با اندازه بنیادین و بدون پوشش نانوذره، یکسان نیست (37). این در حالی است که میکروسکوپ الکترونی روبشی از نانوذرات بدون پوشش و بدون تاج تصویربرداری می‌کند و اندازه دقیق و اصلی نانوذرات را نشان داده است. متفاوت‌بودن اندازه‌های به‌دست‌آمده از آنالیز‌های پراکندگی نور دینامیک و شکل‌های فراهم‌شده با میکروسکوپ الکترونی روبشی در مطالعات دیگر سیانوباکتریایی نیز مشاهده می‌شود.

سینگ و همکاران ناهمسان‌بودن اندازه نانوذرات نقره سنتزشده با سیانوباکتری‌ها در آنالیزهای پراکندگی نور دینامیک در برابر اندازه حاصل از میکروسکوپ الکترونی را به پوشیده‌شدن نانوذرات و پیچیده‌شدن آنها درون پوششی از مولکول‌های زیستی نسبت دادند (30). میانگین قطر هیدرودینامیک نانوذرات نقره تولیدی در مطالعه سیانوباکتریایی روی چو هوری و همکاران در سال ۲۰۱۶، 149 نانومتر بود؛ اما اندازه نانوذرات در تصویرهای میکروسکوپ نیروی اتمی از 20 تا 50 نانومتر و در شکل‌های میکروسکوپ الکترونی عبوری از 5 تا 50 نانومتر گزارش شد (38). کومار و همکاران نیز در سال2016 ، اندازه و پراکنش کمتر نانوذرات سنتزشده با سیانوباکتری‌ها را به بنیان سنجش پراکندگی نور دینامیک پیوسته دانستند. آنها بیان کردند سنجش پراکندگی نور دینامیک علاوه بر نانوذره، مولکول‌های زیستی پوشاننده نانوذره را سنجش کرده و بنابراین اندازه بزرگ‌تری را فراهم کرده است (39).

طیف‌سنجی تبدیل رامان و فوریه به مادون قرمز ابزار مهمی برای شناسایی گروه‌های عاملی و برهمکنش‌های بین مولکول‌ها است. در مطالعات دیگر نیز نتایجی همچون نتایج این پژوهش ذکر شده است؛ برای مثال، ال کاساس و همکاران در سال 2014 نشان دادند گروه عاملی هیدروکسیل از پلی‌فنل‌ها و گروه کربونیل از پروتئین‌های عصاره Corallina officinalis می‌توانند در تشکیل و تثبیت نانوذرات طلا کمک کنند (40). حمیدا و همکاران در سال ۲۰۲۰ برای نخستین‌بار sp. Desertifilum IPPAS B-1220 را برای ساخت نانوذرات نقره بررسی کردند. داده‌های طیف‌سنجی تبدیل رامان و فوریه به مادون قرمز پیک‌های IR مختلف را در 72/3453، 23/2353، 05/1626، 35/1042 و 81/601 بر سانتی‌متر برای نانوذرات نقره را نشان دادند. با توجه به طیف غالب طیف‌سنجی تبدیل رامان و فوریه به مادون قرمز، محققان گزارش کردند بیومولکول‌های اصلی مسئول فرایندهای کاهش زیستی و تثبیت پروتئین‌ها و پلی‌ساکاریدها هستند. همچنین، آنها دریافتند Desertifilum IPPAS B-1220 sp. می‌تواند نانوذرات نقره‌ای کروی با اندازه‌های 5/4 تا 26 نانومتر تولید کند (35). نتایج آنالیز طیف‌سنجی تبدیل رامان و فوریه به مادون قرمز در این مطالعه نیز با نتایج مطالعات جیوان و همکاران در سال 2012 مطابقت داشتند و تمامی این مطالعات بیان‌شده حضور پروتئین‌ها را به‌عنوان عوامل پایدارکنندة نانوذرات نقره سنتزشده تأیید می‌کنند (27).

از گذشته تاکنون، از فلزات به‌عنوان عوامل ضدباکتریایی استفاده شده است. مطالعات لین و همکارانش در سال 2007 نشان دادند یون‌های نقره آزادشده از نانوذرات نقره به عوامل با بار منفی دیواره سلولی باکتری متصل شده‌اند و باعث پاره‌شدن و به هم ریختن ساختمان پروتئین و درنهایت مرگ سلولی می‌شوند (41). سوندی و سالوپک در سال 2004، تجمع نانوذرات نقره در دیواره سلولی باکتری‌ها و نفوذ به درون سلول را علت مرگ باکتری دانستند. آنها همچنین اندازه و شکل نانوذرات نقره را در خاصیت باکتری‌کشی آن مؤثر می‌دانند. به این صورت که نانوذرات نقره با ابعاد کوچک‌تر و کروی شکل اثرات میکروب‌کشی بیشتری دارند (26).

کاهش اندازه نانوذرات نقره باعث افرایش رهایش یون نقره از سطح می‌شود و خاصیت ضدباکتریایی بیشتری را فراهم می‌کند. علاوه بر اندازه نانوذرات، شکل آنها مؤثر است و نانوذرات با شکل کروی، توانایی بیشتری در درگیری با باکتری و انهدام باکتری دارند (42). نانوذرات نقره تولیدشده در پژوهش حاضر کروی بودند و مطالعات نشان داده‌اند شکل نانوذرات نقره بر خاصیت ضدباکتریایی آن مؤثر است؛ به این صورت که بهترین شکل نانوذرات نقره برای جلوگیری از رشد باکتری به‌ترتیب نانوذرات گوشه‌دار و بی‌شکل، نانوذرات کروی و نانوذرات میله‌ای شکل هستند؛ زیرا به‌ترتیب توانایی درگیری بیشتری با باکتری‌ها دارند (43). در مطالعه حاضر، خاصیت ضدباکتریایی نانوذرات نقره سنتزشده با استفاده از بیومس تر سیانوباکتری Nostoc sp. آب شیرین روی 3 مورد باکتری هاله عدم رشد مشخصی را نشان داد. نتایج پژوهش حاضر با نتایج بسیاری از مطالعات همخوانی داشتند که نمونه‌هایی از این مطالعات در ادامه این مطابقت را نشان داده‌اند.

نتایج مربوط به آنالیزهای طیف‌سنجیUV-Vis، میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM)، طیف‌سنجی تبدیل رامان و فوریه به مادون قرمز (FTIR) و پراکندگی نور دینامیک (DLS) در تحقیق حاضر، تولید موفق نانوذرات نقره را با استفاده از بیومس تر سیانوباکتری  Nostoc sp.در غلظت 1 میلی‌مولار نیترات نقره در زمان صفر به‌صورت یک روش ایمن و زیستی سریع، سازگار با محیط زیست، کم‌هزینه و منطبق با اصول شیمی سبز نشان می‌دهد و با توجه به اثبات فعالیت ضدمیکروبی این نانوذره، از آن در زمینه‌های مختلف برای پیشگیری از آلودگی و انتشار عوامل عفونت می‌توان استفاده کرد. استفاده از سیانوباکتری‌ها می‌تواند به‌عنوان یک روش بالقوه در تولید نانوذرات نقره با خواص و کارایی منحصربه‌فرد برای کاربردهای مختلف در پزشکی، صنایع و غیره به شمار آید.

[1]- Antimicrobial Suceptibility Test

[2]- Antimicrobial Suceptibility Test

[iii]- Phycocyanin

[iv]- Phycoerythrin