اثر پرایمینگ با اسید سالیسیلیک و سدیم هیدروسولفید بر روی مراحل اولیه رشد یونجه (Medicago sativa L.) تحت تنش شوری

مقدمه.

شوری خاک و آب یکی از مهمترین تنش‌های غیرزیستی است که در بیشتر مناطق خشک، نیمه‌خشک و ساحلی رایج است. به‌علت مدیریت نامناسب آبیاری و زهکشی، بارندگی کم، بخار زیاد و آبیاری با آب شور، شور شدن خاک‌ها و آب‌ها در حال گسترش است و پیش‌بینی می‌شود که پنجاه درصد از اراضی قابل‌کشت تا اواسط قرن 21 از بین می‌رود (Munns and Tester, 2008; Shrivastava and Kumar, 2015). در بسیاری از گونه‌های گیاهی، فرآیند جوانه‌زنی و رشد اولیه گیاهچه‌ها مهمترین و حساس‌ترین مراحل در چرخه زندگی گیاه هستند که تحت تأثیر تنش‌های محیطی به‌ویژه شوری خاک و آب قرار می‌گیرند. تنش شوری از طریق کاهش سرعت و یکنواختی جوانه‌زنی، باعث استقرار نامناسب و کاهش تراکم گیاهچه‌ها شده و در نتیجه به کاهش چشمگیر رشد و نمو و همچنین میزان تولید محصول در اکثر گیاهان به‌ویژه گیاهان زراعی و علوفه‌ای منجر خواهد شد (Ansari and Sharif-Zadeh 2012; Javed et al., 2022). با توجه به افزایش روز افزون جمعیت جهان و نیز شوری خاک و آب در اکثر نقاط جهان به واسطه تغییرات آب و هوایی، بشر تا سال 2050 با مشکل جدی کمبود غذا روبه‌رو خواهد شد. بنابراین، استفاده از تکنیک‌هایی به‌منظور بهبود بنیه بذر در شرایط تنش شوری می‌تواند به افزایش عملکرد تولید محصول منجر گردد (Jisha et al., 2013). شوری فرآیند جوانه‌زنی را از طریق اختلال در جذب آب به واسطه کاهش پتانسیل اسمزی و از طریق تجمع سمی یون‌های سدیم و کلرید بقاء جنین را تحت تأثیر قرار می‌دهد (Daszkowska-Golec, 2011). همچنین، شوری تعادل و توازن هورمو‌ن‌های گیاهی را تغییر می‌دهد. افزایش شوری با کاهش اکسین، سیتوکینین، جیبرلین‌ها و اسید سالیسیلیک (SA) و افزایش اسید آبسیزیک و جاسمونات‌ها در بافت‌های گیاهی همراه می‌شود (Miransari and Smith, 2014; Yu et al., 2020). به‌این‌ترتیب، شوری از طریق مسیرهای متعددی مانند محدود کردن قابلیت دسترسی به آب، آسیب به ساختمان سازمان‌یافته پروتئین‌ها و اختلال قابلیت دسترسی به ذخایر غذایی ذخیره‌شده در بذر به فرآیند جوانه‌زنی آسیب وارد می‌کند (Machado et al., 2004; Zhao et al., 2020).

تکنیک‌های متعددی می‌توانند ظهور و استقرار گیاهچه‌ها را در شرایط تنش شوری بهبود دهند که پرایمینگ بذر یکی از رایج‌ترین این تکنیک‌ها است (.(Ibrahim, 2016 در پرایمینگ یا پیش‌تیمار بذر پیش از کاشت، به بذر اجازه داده می‌شود تا سطح معینی آبگیری را انجام دهد و باعث فعال شدن فعالیت‌های متابولیک پیش از جوانه‌زنی شود (فاز 1) ولی در فاز 2 جوانه‌زنی متوقف شده و از خروج ریشه‌چه از پوشش بذر جلوگیری می‌کند (فاز 3) (Paparella et al., 2015). پرایمینگ می‌تواند با آب، ترکیبات شیمیایی مختلف (نیترات پتاسیم، کلرید پتاسیم، فسفات پتاسیم و سولفات منیزیم)، یون‌ها، هورمون‌ها (اسید آبسیزیک، جیبرلیک اسید و (SA، ترکیبات تولیدکننده گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) و گونه‌های فعال نیتروژن مانند نیتریک اسید (NO) انجام گیرد (Jisha et al., 2013). از جمله اهداف پرایمینگ می‌توان به افزایش درصد و سرعت جوانه‌زنی بذر، خروج یکنواخت و سریع‌تر گیاهچه‌ها، بالا بردن مقاومت بذور برای جوانه‌زنی تحت شرایط نامساعد محیطی، اصلاح سلول‌های آسیب دیده، ضعیف کردن موانع رشد جنین، مقابله با آفات و بیماری‌ها، بهبود کیفیت محصول و غیره اشاره کرد ((Hussian et al., 2014. تأثیرات مثبت پرایمینگ روی شاخص‌های مختلف جوانه‌زنی و استقرار مناسب گیاهچه‌ها تحت شرایط تنش شوری در گونه‌های مختلف زراعی مانند گوجه‌فرنگی (Pradhan et al., 2014)، گندم (Feghhenabi et al., 2020) و ذرت (Tabatabaei, 2014) گزارش شده است.

فیتوهورمون‌ها و مولکول‌های علامتی به‌عنوان ابزار قدرتمندی برای تغییر دادن توانایی سازشی گیاه در مقابل تأثیرات مخرب تنش‌های محیطی پیشنهاد شده است. سولفید هیدروژن (H₂S) یک گاز فعال زیستی کوچک است که در سیستم‌های گیاهی به‌علت ارتباط با پاسخ‌های سازشی گیاه در مقابل تنش‌های محیطی شناسایی شده است (Toit, 2015). در مطالعات اخیر نشان داده شده است که پرایمینگ گیاه با سدیم هیدروسولفید (NaHS) به‌عنوان تولیدکننده H₂S باعث افزایش درخور توجه تحمل گیاه در برابر تنش‌های محیطی مانند شوری، خشکی و فلزات سنگین می‌شود (Shi et al., 2013; Antoniou et al., 2020; Valivand et al., 2019). تأثیرات مثبت H₂S در کاهش دادن اثرات مخرب تنش‌های محیطی با بهبود دادن عملکرد چندین سیستم دفاع آنتی‌اکسیدان مرتبط است (Mostofa et al., 2015). SA، تنظیم‌کننده رشدگیاهی است که به گروهی از ترکیبات فنلی تعلق دارد و در تنظیم برخی از فرآیندهای فیزیولوژیک مانند فتوسنتز، تنفس، تعرق و انتقال یون‌ها در گیاهان و نیز در بهبود تحمل گیاه در برابر تنش‌های محیطی مانند فلزات سنگین، شوری، گرما و تنش خشکی نقش دارد (Rhaman et al., 2020).

یونجه یکی از مهمترین گیاهان علوفه‌ای بومی ایران است که سطح بسیار وسیعی از مراتع و مزارع را به خود اختصاص داده است. این گیاه اهمیّت زیادی در تغذیه دام و افزایش فراورده‌های دامی بازی می‌کند. اهمیّت این گیاه همچنین، به‌علت همزیستی آن با باکتری‌های تثبیت‌کننده نیتروژن در خاک است که به ورود نیتروژن به خاک کمک می‌کند (Vasileva and Pachev 2015). به‌هرحال، این گیاه نیاز آبی بالایی دارد و تنش خشکی و شوری به‌عنوان مهمترین عوامل بازدارنده جوانه‌زنی و رشد گیاه به‌ویژه در مراحل نخستین رشد گیاهچه‌ها شناخته شده‌اند که استقرار مناسب گیاهچه‌های یونجه را تحت تأثیر قرار می‌دهند. در مطالعاتی تأثیر مثبت پرایمینگ بذرهای یونجه با ترکیباتی مانند ملاتونین (Yu et al., 2021) و اسید جیبرلیک (Younesi and Moradi, 2014) برای افزایش تحمل به شوری و با ترکیباتی مانند اسید آسکوربیک و پلی‌اتیلن‌گلیکول برای افزایش تحمل به تنش خشکی (Salemi et al., 2019) بررسی شده است. باتوجه‌به اینکه، پرایمینگ یک فناوری ارزان و پایدار است و پتانسیل بالایی برای افزایش تحمل به تنش‌های محیطی و افزایش بهره‌وری محصول دارد، بنابراین لازم است پرایمینگ بذر با ترکیبات مختلف برای کاهش اثرات نامطلوب تنش‌های محیطی بر عملکرد گیاه مورد آزمایش قرار گیرد و مؤثرترین ترکیب پرایمینگ انتخاب شود. در این پژوهش، تأثیر پرایمینگ بذرهای یونجه با سدیم هیدروسولفید (NaHS)، SA یا آب در افزایش تحمل و بهبود شاخص‌های جوانه‌زنی و رشد تحت شرایط تنش شوری بررسی شد.

مواد و روش‌ها

شرایط و مراحل انجام پرایمینگ بذرهای یونجه

این پژوهش روی بذر یونجه رقم اصفهانی تهیه ‌شده از شرکت پاکان بذر اصفهان انجام گرفت. در ابتدا، به‌منظور انتخاب بهترین غلظت NaHS و SA برای پرایمینگ بذور، در یک آزمایش مقدماتی بذرهای یونجه رقم اصفهانی با غلظت‌های 25/0، 5/0 و 75/0 میلی‌مولار NaHS یا SA برای مدت 4، 6 و 9 ساعت پرایم شدند و در نهایت بر اساس شاخص‌های جوانه‌زنی و عوامل رشد، غلظت 75/0 میلی‌مولار برای NaHS و SA و مدت زمان 4ساعت برای پرایمینگ بذور انتخاب شد. به‌منظورانجام پرایمینگ، ابتدا بذور سالم یونجه با قارچ‌کش ویتاواکس (2/0 درصد) به‌مدت 10 دقیقه ضدعفونی شدند. سپس بذرها پس از شستشو با آب مقطر در پتری‌دیش‌های دارای دو لایه کاغذ صافی قرار داده شده و10 میلی‌لیتر آب مقطر یا NaHS با غلظت 75/0 میلی‌مولار یا SA با غلظت 75/0 میلی‌مولار به پتری‌دیش‌ها اضافه شد. پتری‌دیش‌ها به‌مدت 4 ساعت در دمای 20 درجه سانتیگراد و در تاریکی قرار داده شدند. پس از پایان زمان پرایمینگ، بذرها چندین بار با آب مقطر شستشو داده شده و با دستمال کاغذی آبگیری شدند و تا رسیدن به وزن اولیه در دمای آزمایشگاه در تاریکی خشک شدند.

اعمال تنش شوری بر بذرهای پرایم شده و پرایم نشده

این آزمایش به‌صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با چهار تکرار اجرا شد. فاکتور اول شامل تیمارهای مختلف پرایمینگ (بدون‌پرایم، پرایم با آب، پرایم با NaHS و پرایم با (SA و فاکتور دوم سطوح مختلف شوری (صفر، 25، 50 و 100 میلی‌مولار کلرید سدیم) بود. 16 گروه تیمار در این مطالعه بررسی شد (جدول 1).

برای بررسی تأثیر پرایمینگ با آب، NaHS یا SA بر شاخص‌های جوانه‌زنی و مراحل نخستین رشد گیاهچه‌ها تحت شرایط تنش شوری، در مقایسه با بذرهای پرایم نشده، بذرها در داخل پتری‌دیش (با قطر 9 سانتی‌متر) دارای دو لایه کاغذ صافی قرار داده شدند و روزانه 10 میلی‌لیتر از محلول 25، 50 یا 100 میلی‌مولار کلرید سدیم به پتری‌دیش‌ها اضافه شد. کاغذ صافی پتری‌دیش‌های آبیاری شده با محلول‌های کلرید سدیم یک روز در میان تعویض شدند تا از افزایش غلظت کلرید سدیم جلوگیری شود. پتری‌دیش‌ها در دمای 2 ± 25 درجه سانتیگراد و فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار داده شدند. برای تعیین شاخص‌های جوانه‌زنی، تعداد بذر جوانه‌زده به‌طور روزانه در طی 12 روز بررسی شد و ظهور ریشه‌چه به‌طول 2 میلی‌متر به‌عنوان معیار جوانه‌زنی در نظر گرفته شد. شاخص‌های درصد نهایی جوانه‌زنی، میانگین زمان جوانه‌زنی و میانگین سرعت جوانه‌زنی نیز محاسبه شد (Ranal and Santana 2006). سرعت جوانه‌زنی توسط شاخص تیمسون (نسبت درصد جوانه‌زنی در هر روز آزمایش به تعداد کل روزهای آزمایش) تخمین زده شد (Pérez-Fernández et al., 2006). پس از اتمام زمان جوانه‌زنی، از هر پتری‌دیش 10 گیاهچه دوازده روزه به‌طور تصادفی انتخاب شدند و در آون با دمای 70 درجه سانتیگراد به‌مدت 48 تا 72 ساعت قرار گرفتند. سپس وزن خشک گیاهچه توسط ترازوی دیجیتال اندازه‌گیری شد.

جدول 1- تیمارهای مختلف پرایمینگ و سطوح مختلف شوری

Table 1- Different treatments of priming and different levels of salinity

برای اندازه‌گیری برخی شاخص‌های بیوشیمیایی (قند کل، قندهای احیاکننده، پراکسیدهیدروژن (H₂O₂)، مالون‌دی‌آلدئید ((MDA و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی کل در اولین، سومین، ششمین و دهمین روز پس از جوانه‌زنی، آزمایشی مجزا طراحی شد. در این آزمایش بذرهای پرایم نشده و بذرهای پرایم شده با آب، SA یا NaHS تحت تنش شوری 50 میلی‌مولار NaCl قرار داده شدند و بذرهای پرایم نشده به‌عنوان شاهد در نظر گرفته شدند. برداشت بذرها تحت تیمارهای مختلف در روزهای 1، 3، 6 و 10 پس از جوانه‌زنی انجام شد و برای آزمایش‌های بعدی در فریزر 70- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.

اندازه‌گیری میزان قند کل و قند احیاکننده

بافت تازه گیاهچه (1/0 گرم) با 5/1 میلی‌لیتر بافر فسفات پتاسیم 50 میلی‌مولار با اسیدیته 7 در هاون سائیده و به‌مدت 20 دقیقه توسط سانتریفیوژ با سرعت rpm14000 در دمای محیط سانتریفیوژ شد. محلول روشناور برای اندازه‌گیری قند کل و قند احیاکننده محلول استفاده شد.

برای اندازه‌گیری قند کل از روش اسید سولفوریک استفاده شد. به این صورت، 100 میکرولیتر از عصاره گیاهی به 300 میکرولیتر اسید سولفوریک غلیظ (98 درصد مرک) مخلوط گردید و پس از 30 ثانیه ورتکس سریعاً در حمام آب یخ قرار گرفت. سپس جذب محلول در طول موج 315 نانومتر قرائت شد و به کمک منحنی استاندارد گلوکز میزان قند کل محاسبه شد (Albalasmeh et al., 2013).

برای اندازه‌گیری قند احیاکننده، ابتدا معرف دی‌نیترو سالیسیلیک اسید (1 گرم دی‌نیترو سالیسیلیک اسید و 30 گرم تارتارات سدیم-پتاسیم) تهیه شد. 4/0 میلی‌لیتر معرف دی‌نیترو سالیسیلیک اسید به 1/0 میلی‌لیتر عصاره اضافه شد و به‌مدت 5 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. سپس جذب نمونه‌ها در طول موج 540 نانومتر خوانده شد و با کمک منحنی استاندارد مربوط میزان قند احیاکننده (گلوکز) محاسبه شد (Dubois et al., 1956).

اندازه‌گیری پراکسید هیدروژن (H₂O₂)، مالون‌دی‌آلدئید ((MDA و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی کل

بافت تازه گیاهچه (05/0 گرم) با 1 میلی‌لیتر تری‌کلرید سالیسیلیک اسید (TCA) 1/0 درصد (وزنی/حجمی) سائیده و سپس به‌مدت 15 دقیقه با سرعت  rpm14000 در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. در روش Velikova و همکاران (2000) میزان پراکسید هیدروژن با استفاده از 5/0 میلی‌لیتر عصاره، 5/0 میلی‌لیتر بافر فسفات 10 میلی‌لیتر با اسیدیته 7 و 1 میلی‌لیتر یدید پتاسیم 1 مولار در طول موج 390 نانومتر اندازه‌گیری شد. محتوای H₂O₂ با استفاده از منحنی استاندارد تهیه‌شده از غلظت‌های مختلف H₂O₂ محاسبه شد و بر اساس میکرومول H₂O₂ در گرم بافت تازه گیاهچه گزارش شد.

میزان MDA در نمونه‌ها مطابق روش Velikova و همکاران (2000) اندازه‌گیری شد. برای این منظور، 1/0 گرم از بافت تازه گیاهچه با 1 میلی‌لیتر تری‌کلرو استیک اسید 1/0 درصد (وزنی/حجمی) سائیده و به‌مدت 15 دقیقه توسط سانتریفیوژ با دور rpm14000سانتریفیوژ شد. عصاره رویی (5/0 میلی‌لیتر) به 1 میلی‌لیتر تیوباربیتوریک اسید 5/0 درصد (وزنی/حجمی) در تری‌کلرو استیک اسید 20 درصد (وزنی/حجمی) اضافه شد. مخلوط فوق به‌مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 95 درجه سانتیگراد حرارت داده و سپس در وان یخ سرد شد. پس از سانتریفیوژ محلول به‌مدت 10 دقیقه در سرعتrpm 10000، جذب روشناور حاصل آن در طول موج‌های 532 و 600 نانومتر ثبت و محتوای MDA با ضریب خاموشی
  mM^-1 cm^-1 155 با استفاده از فرمول زیر محاسبه گردید.

اندازه‌گیری ظرفیت آنتی اکسیدان کل

به‌منظور اندازه‌گیری ظرفیت آنتی‌اکسیدانی نمونه‌ها از روش مهار رادیکال‌های آزاد 2، 2- دی فنیل-1-پیکریل هیدرازیل (DPPH) استفاده شد (Vongsak et al., 2013). بدین منظور، به 50 میکرولیتر از عصاره‌های تهیه شده 950 میکرولیتر محلول 1/0 میلی‌مولار DPPH اضافه شد و به‌مدت 30 دقیقه در دمای اتاق و تاریکی نگهداری شدند ((Bakhshi and Arakawa 2006. سپس میزان جذب نمونه‌ها با استفاده از دستگاه اسپکترفتومتر و در طول موج 517 نانومتر تعیین شد. فعالیت آنتی‌اکسیدانی عصاره‌ها به‌صورت درصد بازدارندگی DPPH محاسبه شد (Vongsak et al., 2013).  

تحلیل داده‌ها

برای تحلیل داده‌ها از نرم‌افزار آماری SPSS نسخه 16 استفاده شد. مقایسه میانگین داده‌ها بر اساس آزمون چند دامنه‌ای دانکن در سطح آماری 5 درصد (P≤0.05) و رسم نمودارها با نرم‌افزار Excel انجام شد.

نتایج

پاسخ جوانه‌زنی و رشد گیاهچه‌ها به تنش شوری در بذرهای پرایم نشده و پرایم شده با آب، NaHS یا SA

جدول آنالیز واریانس نشان داد که تیمارهای پرایمینگ و تنش شوری بر شاخص‌های درصد نهایی جوانه‌زنی، میانگین زمان جوانه‌زنی، شاخص بُنیه، ضریب تیمسون و میانگین سرعت جوانه‌زنی تاثیر معنی‌داری داشتند (جدول 2). نتایج بررسی تاثیر تیمارهای پرایمینگ آب، SA و NaHS بر شاخص‌های جوانه‌زنی در یونجه رقم اصفهانی تحت شرایط تنش شوری نشان داد که درصد جوانه‌زنی بذرهای پرایم نشده در تیمارهای 50 و 100 میلی‌مولار کلرید سدیم به‌ترتیب 9/24 و 9/31 درصد در مقایسه با بذرهای شاهد (بذرهای پرایم نشده و جوانه زده در شرایط غیر تنش شوری) کاهش نشان داد. درصد جوانه‌زنی بذرهای پرایم شده با آب، SA و NaHS در شرایط تنش شوری (25، 50 و 100 میلی‌مولار) تفاوت معنی‌داری با درصد جوانه‌زنی در بذرهای پرایم نشده تحت شرایط غیر تنش شوری نشان ندادند (شکل 1 و جدول 3). میانگین زمان جوانه‌زنی در بذرهای پرایم نشده تحت تنش‌های شوری به میزان قابل ملاحظه‌ای در مقایسه با شاهد بیشتر بود، درحالی‌که میانگین زمان جوانه‌زنی در بذرهای پرایم شده با آب، SA و NaHS درمقایسه با بذرهای پرایم نشده کاهش معنی‌داری را تحت تنش شوری نشان دادند (جدول 3). نتایج نشان داد که تنش‌های شوری باعث کاهش معنی‌دار شاخص تیمسون، میانگین سرعت جوانه‌زنی، ضریب جوانه‌زنی و شاخص بُنیه در بذرهای پرایم نشده در مقایسه با شاهد شدند (جدول 3). نتایج تیمار‌های پرایمینگ با آب، SA و NaHS نشان داد که در بذرهای پرایم شده سطح کاهش یافته ضریب تیمسون، میانگین سرعت جوانه‌زنی، ضریب جوانه‌زنی و شاخص بنُیه در شرایط تنش شوری به میزان قابل ملاحظه‌ای در مقایسه با بذرهای پرایم نشده تحت تنش شوری افزایش پیدا کرد. بیشترین تأثیر تیمارهای پرایمینگ در بهبود شاخص‌های جوانه‌زنی تحت تنش شوری در بذرهای پرایم شده با NaHS و SA مشاهده شد (جدول 3). 

جدول 2- تجزیه آنالیز واریانس میانگین تأثیر سطوح مختلف تنش شوری و تیمارهای مختلف پرایمینگ بر شاخص‌های جوانه‌زنی، رشد گیاهچه‌ها، قند احیاکننده، قند کل، H₂O₂، مالون‌دی‌آلدئید و ظرفیت آنتی‌اکسیدان کل

Table 2- The analysis of variance of effects of salinity levels and priming treatments and interactions on germination indicators, seedling growth, reducing sugars, total sugars, H₂O₂, malondialdehyde and total antioxidant capacity

^*، ^** و ^*** نشان دهنده معنی‌داری به‌ترتیب در سطح 1/0، 1 و 5 درصد است.

^*, ^** and ^*** show significant differences at 0.1, 1 and 5% probability level, respectively.

نتایج مربوط به تغییرات شاخص‌های رشد در گیاهچه‌های یونجه تحت تیمارهای مختلف پرایمینگ نشان داد که طول گیاهچه‌ها در بذرهای پرایم شده با آب، SA و NaHS در مقایسه با شاهد بیشتر بود. تنش شوری 50 و 100 میلی‌مولار باعث شد طول گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم نشده در مقایسه با گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم نشده تحت شرایط غیر تنش شوری (شاهد) کاهش معنی‌داری پیدا کند (شکل‌های 1 وA 2). پرایمینگ با آب، SA و NaHS کاهش طول گیاهچه‌های تحت تنش شوری را به طور قابل ملاحظه‌ای در مقایسه با گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم نشده تحت تنش شوری بهبود داد و پرایمینگ با NaHS بیشترین تأثیر را در این مورد داشت (شکل‌های 1 و B2). وزن خشک ریشه‌چه در گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم شده با آب، SA و NaHS به ترتیب 7/29، 5/36 و 4/47 درصد در مقایسه با وزن خشک ریشه‌چه در گیاهچه‌های پرایم نشده در شرایط غیر تنش شوری بیشتر بود. به علاوه، در تنش‌های شوری 25، 50 و 100 میلی‌مولار NaCl، وزن خشک ریشه‌چه در گیاهچه‌های پرایم نشده به ترتیب 4/22، 5/34 و 9/47 درصد در مقایسه با گیاهچه‌های آبیاری شده با آب مقطر (شاهد) کاهش نشان داد. نتایج نشان داد وزن خشک ریشه‌چه درگیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم شده با آب، SA و NaHS از وزن خشک ریشه‌چه در گیاهچه های حاصل از بذرهای پرایم نشده تحت شرایط 25، 50 و 100 میلی‌مولار NaCl بالاتر بود (شکل‌های 1 و B2). 

جدول 3- تأثیر پرایمینگ با آب، اسید سالیسیلیک (SA) و سدیم هیدروسولفید ( (NaHSبر درصد جوانه‌زنی (FGP)، میانگین زمان جوانه‌زنی (MGT)، شاخص تیمسون، میانگین سرعت جوانه‌زنی (MGR)، شاخص جوانه‌زنی (GI) و شاخص بُنیه (VI) بذرهای یونجه تحت تنش شوری (0، 25، 50 و 100 میلی‌مولار). مقادیر میانگین چهار تکرار ±  SDاست. حروف غیرمشابه در هر ستون نشان دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد بین تیمارها بر اساس آزمون دانکن است.

Table 3- The effect of priming with water, SA and NaHS on germination percentage (FGP), mean germination time (MGT), timsone’s index, mean germination rate (MGR), germination index and vigour index (VI) in alfalfa seeds under salt stress (0, 25, 50 and 100 Mm). The data are mean of four replicates±SD. Different letter in each column indicates significant differences between treatments according to Duncan’s test. 

تأثیر پرایمینگ با آب، NaHS و SA بر میزان قند کل و قندهای احیاکننده گیاهچه‌های یونجه در مراحل اولیه رشد در شرایط غیر تنش و تنش شوری

نتایج جدول آنالیز واریانس نشان داد که تنش شوری تأثیر معنی‌داری بر سطح قند کل و تیمارهای پرایمینگ تأثیر معنی‌داری بر سطح قندهای احیاکننده داشتند (جدول 2). تجمع قند کل در گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم نشده در اولین روز جوانه‌زنی در شرایط تنش شوری (50 میلی‌مولار NaCl) 13 درصد درمقایسه با شاهد مربوطه افزایش نشان داد. درحالی‌که میزان قند کل در گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم نشده در روزهای 3، 6 و 10 پس از جوانه‌زنی افزایش معنی‌داری را در پاسخ به تنش شوری در مقایسه با شاهد مربوطه‌شان نشان ندادند (شکل A3)

شکل 1- گیاهچه‌های یونجه حاصل از بذرهای پرایم شده با تیمارهای مختلف. (A) گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم نشده تحت شرایط غیرشوری، (B)گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم شده با آب تحت شرایط غیرشوری، (C) گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم شده با SA تحت شرایط غیرشوری، (D) گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم شده با NaHS تحت شرایط غیرشوری، (E) گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم نشده تحت شرایط شوری 25 میلی‌مولار، (F) گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم شده با آب تحت شرایط شوری 25 میلی‌مولار، (G) گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم شده با SA تحت شرایط شوری 25 میلی‌مولار، (H) گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم شده با NaHS تحت شرایط شوری 25 میلی‌مولار، (I) گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم نشده تحت شرایط شوری 50 میلی‌مولار، (J) گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم شده با آب تحت شرایط شوری 50 میلی‌مولار، (K) گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم شده تحت شرایط شوری 50 میلی‌مولار، (L) گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم شده با NaHS تحت شرایط شوری 50 میلی‌مولار، (M) گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم نشده تحت شرایط شوری 100 میلی‌مولار، (N) گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم شده با آب تحت شرایط شوری 100 میلی‌مولار، (O) گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم شده تحت شرایط شوری 100 میلی‌مولار، (P) گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم شده با NaHS تحت شرایط شوری 100 میلی‌مولار.

Figure 1- Alfalfa seedlings obtained from seeds primed with different priming treatments.  (A) seedlings obtained from non-primed seeds under non-salinity, (B) seedlings obtained from water-primed seeds under non-salinity, (C) seedlings obtained from SA-primed seeds under non-salinity, (D) seedlings obtained from NaH-primed seeds under non-salinity, (E) seedlings obtained from non-primed seeds under 25 mM salinity, (F) seedlings obtained from water-primed seeds under 25 mM salinity, (G) seedlings obtained from SA-primed seeds under 25 mM salinity, (H) seedlings obtained from NaHS-primed seeds under 25 mM salinity, (I) seedlings obtained from non-primed seeds under 50 mM salinity, (J) seedlings obtained from water-primed seeds under 50 mM salinity, (K) seedlings obtained from SA-primed seeds under 50 mM salinity, (L) seedlings obtained from NaHS-primed seeds under 50mM salinity, (M) seedlings obtained from non-primed seeds under 100 mM salinity, (N) seedlings obtained from water-primed seeds under 100 mM salinity, (O) seedlings obtained from SA-primed seeds under 100 mM salinity, (P) seedlings obtained from NaHS-primed seeds under 100 mM salinity.

شکل 2- تأثیر پرایمینگ با آب، اسید سالیسیلیک (SA) یا سدیم هیدروسولفید ( (NaHSبر رشد گیاهچه یونجه تحت تنش شوری (0، 25، 50 و 100 میلی‌مولار). (A) طول گیاهچه (سانتی‌متر/گیاهچه)، (B) وزن خشک ساقه (میلی‌گرم/گیاهچه)، (C) وزن خشک ریشه (میلی‌گرم/گیاهچه). داده‌ها میانگین چهار تکرار ± SE است. حروف غیرمشابه در هر ستون نشان دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد بین تیمارها بر اساس آزمون دانکن است.

Figure 2- The effect of priming with water, SA and NaHS on seedling growth of alfalfa under salt stress (0, 25, 50 and 100 Mm NaCl). (A) Seedling length (Cm/seedling), (B) shoot dry weight (mg/seedling) and (C) root dry weight (mg/seedling). The data are means of four replications ± SE. Different letter in each column indicates significant differences between treatments according to Duncan’s test.  

نتایج مربوط به تأثیر تیمارهای پرایمینگ بر میزان قند کل در مراحل اولیه رشد در یونجه تحت تنش شوری نشان داد تجمع قند کل در اولین روز جوانه‌زنی در بذرهای پرایم شده با SA و NaHS (برخلاف بذرهای پرایم شده با آب) به ترتیب 15 و 18 درصد درمقایسه با بذرهای پرایم نشده در پاسخ به شوری (50 میلی‌مولار NaCl) افزایش یافت و در سومین روز پس از جوانه‌زنی، میزان قند کل در بذرهای پرایم شده با آب، SA و NaHS به‌ترتیب 8/42، 43 و 75 درصد در مقایسه با بذرهای پرایم نشده

تحت تنش شوری افزایش پیدا کرد (شکل A3).

شکل3- تأثیر پرایمینگ با آب، اسید سالیسیلیک (SA) و سدیم هیدروسولفید (NaHS) بر میزان قند کل (میلی‌گرم/گرم وزن تر) (A) و (B) قند احیاکننده (میلی‌گرم/گرم وزن تر) در 1، 3، 6 و 10 روز پس از جوانه‌زنی بذرهای یونجه در شرایط تنش شوری (50 میلی‌مولار). داده‌ها میانگین چهار تکرار ± SE است. حروف غیرمشابه مربوط به هر پارامتر در هر زمان (روز پس از جوانه‌زنی) نشان دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد بین تیمارها بر اساس آزمون دانکن است. 1) بذر پرایم نشده در شرایط غیرتنش؛ 2) بذر پرایم نشده در شرایط تنش شوری؛ 3) بذر پرایم شده با آب در شرایط غیرتنش؛ 4) بذر پرایم شده با آب در شرایط تنش شوری؛ 5) بذر پرایم شده با SA در شرایط غیرتنش؛ 6) بذر پرایم شده با SA در شرایط تنش شوری؛ 7) بذر پرایم شده با NaHS در شرایط غیرتنش؛ 8) بذر پرایم شده با NaHS در شرایط تنش شوری.

Figure 3- The effect of priming with water, SA and NaHS on the contents of total sugar (mg/g FW) and reducing sugar (mg/g FW) at 1, 3, 6 and 10 days after germination of alfalfa under salt stress (0 and 50 mM). The data are means of four replications ± SE. Different letter in each column indicates significant differences between treatments according to Duncan’s test. 1) unprimed seeds/non-salt stress; 2) unprimed seeds/salt stress; 3) water-primed seeds/non-salt stress; 4) water primed seeds/salt stress; 5) SA-primed seeds/non-salt stress; 6) SA-primed seeds/salt stress; 7) NaHS-primed seeds/non-salt stress; 8) NaHS-primed seeds/salt stress.

در روزهای ششم و دهم پس از جوانه‌زنی، محتوی قند کل در بذرهای پرایم شده با آب، SA و NaHS در مقایسه با بذرهای پرایم نشده افزایش معنی‌داری در پاسخ به تنش شوری نشان ندادند (شکل A3). میزان قند احیاکننده در اولین و سومین روز پس از جوانه‌زنی در گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم نشده تحت تنش شوری (50 میلی‌مولار NaCl) به‌ترتیب 25 و 50 درصد بالاتر از میزان آن در گیاهچه‌های شاهد مربوطه بود، درحالی‌که افزایش معنی‌داری در میزان قند احیاکننده در ششمین و دهمین روز پس از جوانه‌زنی در بذرهای پرایم نشده در مقایسه با شاهد مشاهده نشد (شکل B3). پرایمینگ بذرها با SA و NaHS باعث شد مقدار احیاکننده در اولین روز جوانه‌زنی به‌ترتیب 129 و 145 درصد در مقایسه با بذرهای پرایم نشده تحت تنش شوری بالاتر باشد، درحالی‌که در پرایمینگ با آب افزایش معنی‌داری در میزان قند احیاکننده در اولین روز جوانه‌زنی در پاسخ به تنش شوری مشاهده نشد (شکل B3). در سومین، ششمین و دهمین روز پس از جوانه‌زنی افزایش معنی‌داری در میزان قند احیاکننده در تیمارهای پرایمینگ با آب، SA و NaHS در پاسخ به تنش شوری مشاهده نشد (شکل B3).

تأثیر پرایمینگ با آب، NaHS و SA بر میزان H₂O₂، MDA و ظرفیت آنتی‌اکسیدان کل در مراحل اولیه رشدگیاهچه‌های یونجه در شرایط غیر تنش و تنش شوری

جدول آنالیز واریانس نشان داد که تنش شوری و تیمارهای پرایمینگ به‌ترتیب تأثیر معنی‌داری بر میزان H₂O₂ و سطح مالون‌دی‌آلدئید داشتند، درحالی‌که تنش شوری و تیمارهای پرایمینگ بر ظرفیت آنتی‌اکسیدان کل تأثیر معنی‌داری نداشتند (جدول 2). میزان H₂O₂ در بذرهای پرایم نشده در روزهای 1، 3، 6 و 10 پس از جوانه‌زنی در پاسخ به تنش شوری (50 میلی‌مولار NaCl) به‌ترتیب 82، 70، 112 و 89 درصد در مقایسه با شاهد افزایش معنی‌داری یافت (شکل A4). پرایمینگ بذرها با آب، SA و NaHS باعث شد تجمع H₂O₂ در گیاهچه‌ها در روزهای 1، 3، 6 و 10 پس از جوانه‌زنی در شرایط تنش شوری به میزان قابل ملاحظه‌ای در مقایسه با گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم نشده کاهش معنی‌داری پیدا کند که بیشترین کاهش در تجمع H₂O₂ در پاسخ به تنش شوری در تیمارهای پرایمینگ با SA و NaHS مشاهده شد (شکل A4). تنش شوری موجب افزایش تجمع MDA در گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم نشده در روزهای 1، 3، 6 و 10 پس از جوانه‌زنی به‌ترتیب 55، 40، 69 و 56 درصد در مقایسه با شاهد شد (شکل B4). مقایسه تجمع MDA درگیاهچه‌های به دست آمده از بذرهای پرایم شده با آب، SA و NaHS و نمونه‌های پرایم نشده نشان داد که پرایمینگ با آب، SA و NaHS باعث شد تجمع MDA در روزهای 1، 3، 6 و 10 پس از جوانه‌زنی در شرایط تنش شوری (50 میلی‌مولار NaCl) کاهش معنی‌داری نشان داد که بیشترین کاهش در تجمع MDA در گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم شده با SA و NaHS مشاهده شد (شکل B4). ظرفیت آنتی‌اکسیدان کل در پاسخ به تنش شوری (50 میلی‌مولار NaCl) در روزهای 1، 3، 6 و 10 پس از جوانه‌زنی در گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم نشده افزایش معنی‌داری را در مقایسه با شاهد نشان نداد (شکل C4). فعالیت آنتی‌اکسیدان کل در گیاهچه‌ها در روزهای 3 و 6 پس از جوانه‌زنی در پاسخ به تیمارهای پرایمینگ افزایش معنی‌داری را در مقایسه با گیاهچه‌های حاصل از بذرهای بدون پرایم تحت شرایط تنش شوری (50 میلی‌مولار NaCl) نشان ندادند، درحالی‌که فعالیت آنتی‌اکسیدان کل در روز اول (به‌ترتیب برای بذرهای پرایم شده با SA  و NaHS به میزان 5/43 و 1/32 درصد) و روز دهم ( به‌ترتیب برای بذرهای پرایم شده با آب، SA و NaHS به میزان 148، 6/77 و 203 درصد) پس از جوانه‌زنی در تیمارهای پرایمینگ در مقایسه با بذرهای پرایم نشده تحت شرایط تنش شوری افزایش معنی‌داری نشان داد (شکل C4).

بحث

فرآیند جوانه‌زنی و مراحل نخستین رشد گیاهچه‌ها مراحل کلیدی برای استقرار مناسب گیاه هستند و گیاهان در طی این مراحل نسبت به تنش‌های محیطی از جمله شوری بسیار حساس است (Li et al., 2011). تنش شوری شروع جوانه‌زنی را به تأخیر انداخته و شاخص‌های مختلف جوانه‌زنی از جمله سرعت جوانه‌زنی و نیز یکنواختی در ظهور گیاهچه‌ها را کاهش می‌دهد که به این ترتیب به کاهش در تولید محصول منجر می‌گردد (Jisha et al., 2013). در چندین مطالعه نشان داده شده است که تکنیک‌های پرایمینگ، درصد و سرعت جوانه‌زنی و نیز یکنواختی در ظهور گیاهچه‌ها را در شرایط تنش بهبود می‌بخشند (Abdel Latef and Tran, 2016). در این مطالعه، تأثیر پرایمینگ بذرها با آب، SA و NaHS بر شاخص‌های جوانه‌زنی و رشد ابتدایی گیاهچه‌ها در شرایط غیرتنش و تنش شوری بررسی شد. به منظور شناخت تغییرات بیوشیمیایی ایجاد شده در مراحل پس از جوانه‌زنی در تیمارهای پرایمینگ و به منظور پیدا کردن رابطه بین این تغییرات و تحمل به تنش شوری در مراحل ابتدایی رشد گیاهچه‌ها، میزان قند کل، قند احیاکننده، MDA، H₂O₂ و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی کل در روزهای 1، 3، 6 و 10 پس از جوانه‌زنی تحت تیمارهای پرایمینگ (آب، SA و NaHS) و تنش شوری مورد بررسی قرار گرفت.

نتایج این مطالعه نشان داد که شوری FGP را در بذرهای پرایم نشده یونجه کاهش داده و باعث کاهش سرعت جوانه‌زنی و طولانی شدن زمان جوانه‌زنی شده است، همان‌طورکه با شاخص‌های MGT، MGR، GI و شاخص تیمسون ارزیابی شد. این کاهش در میزان و سرعت جوانه‌زنی در بذرهای یونجه تحت تنش شوری می‌تواند به این علت باشد که به واسطه پتانسیل اسمزی بالا در شرایط شوری، بذرها قادر به جذب مقادیر آب کافی نیستند که به کاهش دادن و یا به تأخیر افتادن فرآیند جوانه‌زنی منجر می‌شود (Hayat et al., 2010). همچنین، کاهش محتوی آب بافتی به واسطه کاهش جذب آب به کاهش رشد و نمو سلولی منجر می‌شود. محدودیت جذب آب و پیامدهای آن برای رشد و نمو سلولی باعث شد طول گیاهچه‌ها و نیز وزن خشک ریشه‌چه و ساقه‌چه در یونجه در پاسخ به تنش شوری کاهش قابل ملاحظه‌ای نشان دهد. میزان H₂O₂ در روزهای 1، 3، 6 و 10 پس از جوانه‌زنی تحت شرایط تنش شوری افزایش قابل ملاحظه‌ای نشان داد که این افزایش با تجمع بالای MDA تحت شرایط شوری همراه بود. این نتایج تأیید کرد که تنش شوری باعث ایجاد تنش اکسیداتیو در بذرهای جوانه‌زده و گیاهچه‌های جوان شده است. نتایج این مطالعه نشان داد که پرایمینگ بذرها با SA باعث شد تأثیرات بازدارندگی تنش شوری روی درصد جوانه‌زنی و شاخص‌های جوانه‌زنی کاهش یابد (جدول 1، شکل 1). این یافته با مطالعات انجام‌شده درباره تأثیر SA بر جوانه‌زنی در شرایط تنش شوری هماهنگ است (Anaya et al., 2018; Rhaman et al., 2020). پرایمینگ بذرها با SA، رشد گیاهچه‌های یونجه را تحت شرایط شوری بهبود داد که احتمالاً با القاء فعالیت میتوزی توسط تیمار پرایمینگ مرتبط است (Boukari et al., 2019). نتایج نشان داد که درحالی‌که میزان قند کل در طی روزهای 1، 3، 6 و 10 روز پس از جوانه‌زنی تحت تنش شوری افزایش معنی‌داری پیدا نکرد، پرایمینگ با SA باعث شد تجمع قند کل در 1 و 3 روز پس از جوانه‌زنی در شرایط تنش شوری به میزان قابل ملاحظه‌ای افزایش یابد و در روزهای 6 و 10 تفاوت معنی‌داری را در مقایسه با شاهد نشان ندهد. این نتایج نشان می‌دهد که سطح افزایش‌یافته قند کل که به‌عنوان یک تنظیم‌کننده اسمزی یا اسمولیت در تنظیمات اسمزی مشارکت دارد، در روزهای نخستین پس از جوانه‌زنی به جذب کارآمدتر آب کمک می‌کند، ولی در روزهای 6 و 10 سنتز کربوهیدرات در مقایسه با روزهای 1 و 3 کاهش نیافته است و قند کل سنتز شده برای رشد گیاهچه به‌ویژه رشد ریشه‌چه مصرف می‌شود و به این ترتیب افزایش در تجمع قند کل در گیاهچه‌های 6 و 10 روزه مشاهده شد.

SA برخی تغییرات بیوشیمیایی و متابولیک مانند تغییرات در فعالیت آنزیم‌های سیستم آنتی‌اکسیدانی در بذرهای در حال جوانه زدن در شرایط تنش شوری القاء می‌کند که باعث بهبود تحمل گیاه در مقابل شرایط تنش‌زای محیطی مانند شرایط شوری می‌گردد ((Nazar et al., 2015. در مطالعه‌ای روی Torreya grandis بیان شد که SA تحمل به شوری را از طریق فعال کردن فرآیند فتوسنتز به واسطه افزایش دادن محتوی کلروفیل و کاهش دادن تنش اکسیداتیو به واسطه افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان افزایش می‌دهد (Li et al., 2014). SA تنش اکسیداتیو القاء شده توسط NaCl را در Vigna radiata به حداقل رسانده است، به‌طوری‌که در پاسخ به تیمار SA میزان MDA به‌عنوان یک مارکر پراکسیداسیون و تولید ROS (مانند H₂O₂) کاهش پیدا کرد (Khan et al., 2014). نتایج این مطالعه نیز نشان داد که افزایش میزان MDA و H₂O₂ در طی روزهای 1، 3، 6 و 10 پس از جوانه‌زنی در شرایط تنش شوری با پرایمینگ بذرها با SA به میزان قابل ملاحظه‌ای کاهش نشان داده است، این نتایج گواه آن است که SA تنش اکسیداتیو القاء شده توسط NaCl را در بذرهای یونجه جوانه‌زده و گیاهچه‌های یونجه به میزان درخور توجهی کاهش داده است. بنابراین، پرایمینگ بذر با SA به‌عنوان یک رویکرد مهم برای افزایش دادن فعالیت آنزیم‌های جاروب‌کننده H₂O₂ پیشنهاد می‌شود. تأثیر مثبت پرایمینگ با SA در کاهش تنش اکسیداتیو القاء شده توسط شوری در Triticum aestivum (Li et al., 2013) به اثبات رسیده است.

شکل4- تأثیر پرایمینگ با آب، اسید سالیسیلیک (SA) و سدیم هیدروسولفید (NaHS) بر میزان (A) پراکسید هیدروژن (میکرومولار/گرم بافت تازه گیاهچه)، (B) میزان مالون‌دی‌آلدئید (میکرومولار/گرم بافت تازه گیاهچه) و (C) ظرفیت آنتی‌اکسیدان کل (درصد بازدارندگی) در 1، 3، 6 و 10 روز پس از جوانه‌زنی یونجه رقم اصفهانی تحت تنش شوری (50 میلی‌مولار). مقادیر میانگین چهار تکرار ± SE است. حروف غیرمشابه مربوط به هر پارامتر و در هر روز پس از جوانه زنی نشان دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد بر اساس آزمون دانکن بین تیمارها است. ) بذر پرایم نشده در شرایط غیرتنش؛ 2) بذر پرایم نشده در شرایط تنش شوری؛ 3) بذر پرایم شده با آب در شرایط غیرتنش؛ 4) بذر پرایم شده با آب در شرایط تنش شوری؛ 5) بذر پرایم شده با SA در شرایط غیرتنش؛ 6) بذر پرایم شده با SA در شرایط تنش شوری؛ 7) بذر پرایم شده با NaHS در شرایط غیرتنش؛ 8) بذر پرایم شده با NaHS در شرایط تنش شوری.

Figure 4 The effect of priming treatments with water, SA and NaHS on the contents of hydrogen peroxide (µg/g FW) (A), malondialdehyde (µg/g FW) (C) and total antioxidant activity (% inhibition) at 1, 3, 6 and 10 days after germination of alfalfa under salt stress (0 and 50 mM). The data are means of four replications ± SE. Different letter in each column indicates significant differences between treatments according to Duncan’s test. 1) unprimed seeds/non-salt stress; 2) unprimed seeds/salt stress; 3) water-primed seeds/non-salt stress; 4) water primed seeds/salt stress; 5) SA-primed seeds/non-salt stress; 6) SA-primed seeds/salt stress; 7) NaHS-primed seeds/non-salt stress; 8) NaHS-primed seeds/salt stress.

سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانی نقش مهمی در پاسخ گیاه به شرایط تنش‌زا مانند شوری بازی می‌کند و گیاهان را در مقابل آسیب‌های اکسیداتیو محافظت می‌کند. مهار فعالیت رادیکال DPPH برای ارزیابی ظرفیت آنتی‌اکسیدانی کل استفاده می‌شود (Kaur et al., 2014). نتایج این مطالعه نشان داد که در پاسخ به تنش شوری درصد مهار فعالیت رادیکال DPPH درگیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم نشده در روزهای 1 و 3 پس از جوانه‌زنی تفاوت معنی‌داری با شاهد نشان نداد، درحالی‌که در روزهای 6 و 10 روز پس از جوانه‌زنی کاهش معنی‌داری در مقایسه با شاهد نشان داد (شکل C4). پرایمینگ با SA درصد مهار فعالیت رادیکال DPPH را در گیاهچه‌های حاصل از پرایم شده در مقایسه با گیاهچه‌های حاصل از بذرهای پرایم نشده تحت تنش شوری افزایش داد. سطح بالاتر مهار فعالیت رادیکال DPPH با ظرفیت بالاتر آنتی‌اکسیدانی کل مرتبط است. در این راستا تأثیر مثبت SA در افزایش ظرفیت آنتی‌اکسیدانی در گیاه بامیه گزارش شده است ((Youssef et al., 2022.  

H₂S یک مولکول علامتی است که برخی از فرآیندهای فیزیولوژیک (مانند سازماندهی ریشه، جوانه‌زنی و فتوسنتز) و پاسخ‌های بیوشیمیایی (مانند فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی) را در گیاهان تنظیم می‌کند (Ali et al., 2014; Liu et al., 2021). پرایمینگ با  NaHSباعث شد که میزان قند کل در روزهای 1 و 3 پس از جوانه‌زنی در پاسخ به تنش شوری به میزان معنی‌دار در مقایسه با بذرهای تیمار نشده با NaHS افزایش پیدا کند که این تجمع احتمالاً به جذب بیشتر آب به واسطه ایجاد پتانسیل اسمزی منفی‌تر در بذرها کمک می‌کند و به درصد جوانه‌زنی بیشتر و سرعت بالاتر جوانه‌زنی در شرایط تنش شوری منجر می‌گردد. پرایمینگ گیاه با دهنده H₂S ((NaHS تحمل گیاه را در مقابل شرایط تنش‌های غیرزیستی مانند شوری افزایش می‌دهد (Wang et al., 2012). تأثیر مثبت NaHS به‌عنوان دهنده H₂S بر کاهش دادن آسیب‌های ناشی از تنش‌های محیطی به مجموعه‌ای از مکانیسم‌های سیستم‌های دفاعی مانند فعال شدن سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانی و تغییر سیستم جاروب‌کننده ROS نسبت داده می‌شود (Fotopoulos et al., 2013). نتایج این مطالعه نشان داد که پرایمینگ بذرها با NaHS و بنابراین افزایش سطح  H₂Sباعث کاهش تأثیرات منفی شوری روی شاخص‌های جوانه‌زنی و رشد گیاهچه‌ها شد. در توافق با این یافته، مطالعه انجام‌شده روی تأثیر پرایمینگ بذرهای آفتابگردان با NaHS در شرایط تنش خشکی نشان داد که تیمار بذرها با NaHS شاخص‌های جوانه‌زنی و رشد گیاهچه‌ها را در شرایط تنش خشکی اعمال شده توسط پلی‌اتیلن‌گلیکول بهبود داده است (Ocvirk et al., 2021). تیمار بذرهای یونجه با NaHS باعث شد آسیب‌های اکسیداتیو ناشی از شوری به میزان قابل ملاحظه‌ای کاهش پیدا کند، به‌طوری‌که کاهش معنی‌دار در تجمع H₂O₂ و MDA در طی روزهای 1، 3، 6 و 10 روز پس از جوانه‌زنی در مقایسه با بذرهای تیمار نشده تحت شرایط تنش شوری مشاهد شد (شکل A-B4). تأثیر مثبت H₂S برای بالا بردن سطح تحمل گیاهان در مقابل تنش‌های محیطی در ذرت تحت تنش گرما (Li et al., 2013)، آرابیدوپسیس تحت تنش خشکی (Jin et al., 2011) و یونجه تحت تنش شوری (Lai et al., 2014) به اثبات رسیده است. نتایج مربوط به درصد مهار فعالیت رادیکال DPPH در بذرهای تیمارشده با NaHS نشان داد که درصد مهار فعالیت رادیکال DPPH در پاسخ به تنش شوری در روزهای 1، 6 و 10 روز پس از جوانه‌زنی در مقایسه با بذرهای تیمار نشده به میزان معنی‌داری بالاتر بود که این افزایش درصد مهار فعالیت رادیکال DPPH با سطح کاهش‌یافته H₂O₂ و MDA به‌عنوان شاخصی برای پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء در توافق است.

نتیجه‌گیری

نتایج این مطالعه نشان داد که پرایمینگ بذرهای یونجه با NaHS یا SA تحمل به شوری را در مراحل ابتدایی رشد گیاهچه‌های یونجه بهبود می‌دهد. تأثیر مثبت این تیمارهای پرایمینگ می‌تواند به کاهش تجمع گونه‌های فعال اکسیژن مانند H₂O₂ و افزایش ظرفیت آنتی‌اکسیدانی کل نسبت داده شود. علاوه‌براین، پرایمینگ بذر با NaHS یا SA که به افزایش محتوای قند کل و تاحدودی قند احیاکننده در گیاهچه‌هایی که تحت تنش شوری رشد می‌کنند منجر می‌شود، در تنظیم اسمزی مؤثر است و ممکن است به افزایش جذب و حفظ آب کمک کند. به‌طورکلی، پرایمینگ بذر با NaHS یا SA را می‌توان به‌عنوان پرایمینگ مؤثر برای استقرار بهتر گیاهچه‌های یونجه در محیط‌های شور توصیه کرد.