ارزیابی توان مخمر بومی یاروویا لیپولیتیکا به‌عنوان منبع زیستی ایمن در سنتز نانوذرة سلنیوم

مقدمه

نانو‌ذرات خوشه‌های اتمی‌اند که با توجه به خواص فیزیکوشیمیایی و ترمودینامیکی منحصربه‌فرد مانند نقطه ذوب، ترشوندگی، هدایت الکتریکی و حرارتی، فعالیت کاتالیستی، جذب نور و پراکندگی و درنتیجه، افزایش عملکرد نسبت به نمونه‌های اصلی خود، نقش مهم و برجسته‌ای در پیشرفت علم دارند (1). معمولاً دامنة اندازه نانوذرات 1 تا 100 نانومتر است. نانوذرات در مقایسه با ذرات بزرگ‌تر دارای سطح وسیع‌تر، جذب سلولی قوی‌تر، تحرک بیشتر و سمیت کمتر هستند (2). سلنیوم به‌عنوان سلنوسیستئین در محل فعال طیف وسیعی از پروتئین‌ها گنجانیده شده است. در شرایط فیزیولوژیک، سلنیوم در سلنوسیستئین تقریباً یونیزه می‌شود و درنتیجه، یک کاتالیست زیستی بسیار کارآمد در استرس اکسیداتیو است که آسیب سلولی ناشی از رادیکال‌های آزاد را کاهش و بدن را در برابر بیماری‌های قلبی و برخی سرطان‌ها محافظت می‌کند (3). نانوذرة سلنیوم با توجه ‌به قابلیت زیست‌پذیری خوب، اثر تحویل بالاتر و سمیت کمتر نسبت به سلنیوم آزاد توانایی حمل دارو را به خوبی دارد (4). همچنین نانوذرات سلنیوم فعالیت ضدسرطانی و ضدمیکروبی چشمگیری دارند و پتانسیل بالایی در درمان عفونت‌های میکروبی و شیمی‌درمانی سرطان نشان می‌دهند (5). طیف گسترده‌ای از روش‌های فیزیکی و شیمیایی ازجمله روش سل-ژل (6)، روش هیدروترمال (7)، رسوب بخار شیمیایی (8)، فرایند سایش لیزری (9) و روش‌های الکتروشیمایی (10) برای سنتز نانوذرات ازجمله سلنیوم عنصری وجود دارد؛ اما این روش‌ها معایبی ازجمله صرف انرژی بالا و همچنین استفاده از مواد شیمیایی خطرناک با قابلیت سرطان‌زایی، سمیت ژنی و سمیت سلولی دارند که همین موارد استفاده از نانوذرات مذکور را برای کاربردهای زیست‌پزشکی به‌دلیل سمیت، بی‌ثباتی و ناسازگاری با محیط زیست محدود کرده است (11). سنتز زیستی نانوذرات مزایای بی‌شماری ازجمله تولید بی‌خطر و سازگار با محیط زیست، مقرون‌به‌صرفه بودن و سازگاری زیستی دارد که یک ویژگی مطلوب برای کاربردهای زیست پزشکی است. مزیت دیگر روش سنتز زیستی این است که برخلاف روش‌های فیزیکی و شیمیایی به مرحله پوشش‌گذاری یا اتصال ترکیبات زیستی فعال به سطح نانوذره نیاز ندارد (12). به‌تازگی مطالعات انجام‌شده منابع مختلف زیستی را برای سنتز سبز نانوذرات سلنیوم پیشنهاد داده‌اند؛ ازجمله این منابع گیاهان، قارچ‌ها، باکتری‌ها و مخمر‌ها هستند که قادرند فرم‌های سمی را به فرم‌های کمتر سمی و نانوذرات تبدیل کنند (13). مخمر‌ها توانایی تجمع و سم‌زدایی فلزات سنگین را به‌دلیل وجود آنزیم‌های مختلف ردوکتاز دارند که نمک‌های فلزی را به نانوذرات فلزی با توزیع اندازه باریک و درنتیجه، پراکندگی کمتر کاهش می‌دهد. همچنین رشد سریع سویه‌های مخمر و استفاده از مواد مغذی ساده، مخمرها را به‌عنوان ابزاری ایمن و کارآمد برای سنتز زیستی نانوذرات مناسب کرده‌اند (11). گزارشاتی مبنی بر سنتز درون و برون سلولی نانوذرات فلزی توسط مخمرها وجود دارد که می‌توان به سنتز نانوذرات طلا توسط مخمر یاروویا لیپولیتیکا^[1] سویة NCIM3589 (14)، سنتز نانوذرات نقره در مخمر ساکارومایسس سرویزیه^[2] و مخمر رودوتورولا گلوتینیس^[3](15)، سنتز نانوذرات تیتانیوم توسط مخمر ساکارومایسس سرویزیه (16)، سنتز نانوذرات نقره توسط مخمر یاروویا لیپولیتیکا سویة DSM 3286 (17)، سنتز نانوذرات سلنیوم عنصری توسط مخمر ساکارومایسس سرویزیه (18) و همچنین سنتز نانوذرات سلنید کادمیوم توسط مخمر رودوتورولا موسیلاژینوزا^[4] سویة PA-1 (19) اشاره کرد. محققان در سال‌های اخیر به مخمر یاروویا لیپولیتیکا به‌عنوان یک مخمر هوازی غیرسمی و غیرمهاجم توجه کرده‌اند. این مخمر به‌دلیل توانمندی‌های ذاتی بالقوه، کاربردهای فراوانی در فناوری‌های نوین برای تولید متابولیت‌های غذایی و دارویی دارد. این مخمر همچنین ویژگی لازم برای تعامل با فلزات را دارد و به نظر می‌رسد یک کاندید امیدوارکننده در سنتز نانوذرات باشد (20). در این مطالعه قابلیت کاتالیستی سویة بومی مخمری یاروویا لیپولیتیکا در احیای زیستی اکسی‌آنیون سلنیت سدیم به نانوذرات سلنیوم عنصری بررسی شد.

مواد و روش‌ها

میکروارگانیسم، شرایط رشد و نگهداری: عامل زیستی استفاده‌شده در این پژوهش، مخمر بومی یاروویا لیپولیتیکا سویة MP10 جداسازی‌شده از پساب کارخانه روغن نباتی ناز اصفهان (شماره دسترسی در بانک اطلاعات ژنی JQ327042) بود که از کلکسیون میکروبی گروه علوم زیستی دانشکده علوم پایة دانشگاه کردستان تهیه شد. برای رشد و نگهداری کوتاه‌مدت مخمر مذکور از محیط کشت YPD آگار (20 گرم در لیتر گلوکز، 20 گرم در لیتر پپتون و 10 گرم در لیتر عصاره مخمر) استفاده شد. برای نگهداری طولانی‌مدت سویة مخمری مذکور، ابتدا کلنی خالصی از مخمر مذکور در محیط کشت YPD مایع، تلقیح و به مدت 48 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شد. سپس به میزان 700 میکرولیتر از این محیط به میکروتیوب‌های استریل انتقال داده شد و به مقدار 300 میکرولیتر گلیسرول استریل به آن اضافه و در فریزر منهای 20 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.

.تعیین الگوی مقاومت مخمر یاروویا لیپولیتیکا نسبت به اکسی‌آنیون سلنیت: از روش رقت در آگار برای تعیین الگوی مقاومت مخمر تست‌شده نسبت به اکسی‌آنیون سلنیت استفاده شد (21). برای این منظور، به ارلن‌های 125 میلی‌لیتری حاوی 25 میلی‌لیتر از محیط‌های کشت YPD آگار ذوب‌شده، غلظت‌های مشخصی از اکسی‌آنیون سلنیت (5/0، 1، 5/1، 2، 5/2، 3، 5/3، 4، 5/4، 5، 5/5، 6، 5/6، 7، 5/7، 8، 5/8، 9، 5/9، 10، 5/10 و 11 میلی‌مولار) اضافه و سپس داخل پلیت‌های شیشه‌ای به قطر 8 سانتی‌متر ریخته شدند. پس از خشک‌شدن سطح پلیت‌ها، یک کلنی از کشت تازه مخمر برداشته و به‌صورت خطی روی محیط‌های کشت ذکرشده، استریک شد و بعد از انکوبه‌شدن در دمای 30 درجه سانتی‌گراد به مدت 48 تا 96 ساعت، پلیت‌های مذکور بررسی شدند.

.رسم منحنی رشد مخمر یاروویا لیپولیتیکا سویة MP10: با هدف رسم منحنی رشد سویة مخمری مذکور، ابتدا کشت تازه از کلنی مخمر روی محیط کشت YPD آگار تهیه شد. سپس یک کلنی تازه مخمری به ارلن‌های 250 میلی‌لیتری حاوی 50 میلی‌متر محیط کشت YPD مایع، تلقیح و در شرایط دمایی 30 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شد. در فواصل زمانی هر 4 ساعت یک بار از ارلن‌های مذکور نمونه‌گیری و جذب نمونه‌ها ازطریق دستگاه اسپکتروفتومتری در طول موج 600 نانومتر اندازه‌گیری شد؛ درنهایت، نمودار رشد مخمر توسط دستگاه ایکسل ترسیم شد.

.سنتز نانوذرات سلنیوم تحت استراتژی سلول درحال استراحت: یک لوپ کامل از کلنی خالص مخمر یاروویا لیپولیتیکا در ارلن‌های 250 میلی‌لیتری حاوی 50 میلی‌لیتر محیط کشت YPD براث در دمای 30 درجه سانتی‌گراد روی شیکر انکوباتوردار (rpm 200)، به مدت 44 ساعت (رسیدن به انتهای فاز رشد لگاریتمی) گرما‌گذاری شد. سپس تودة زیستی مخمر به کمک سانتریفیوژ یخچالی (5000 دور به مدت 10 دقیقه و دمای 4 درجه سانتی‌گراد) جداسازی شد. پس از سه بار شستشو با آب دیونیزه استریل، 10 گرم در لیتر از تودة زیستی به ارلن‌های 250 میلی‌لیتری حاوی 50 میلی‌لیتر آب دیونیزه استریل غنی‌شده با 4 میلی‌مولار اکسی‌آنیون سلنیت استریل اضافه شد. سپس مخلوط واکنش در شرایط دمایی 30 درجه سانتی‌گراد و دور شیکر rpm200 گرما‌گذاری شد. وجود نانوذرات سلنیت تشکیل‌شده در مخلوط واکنش، ازطریق مشاهدات چشمی و اسپکتروفتومتری مرئی ماورای بنفش^[5] در طول موج‌های 200 تا 800 نانومتر بررسی شد (13).

.اثر غلظت‌های مختلف اکسی‌آنیون سلنیت بر سنتز نانوذرات سلنیوم: برای تعیین غلظت مطلوب اکسی‌آنیون سلنیت در سنتز نانوذرات سلنیوم تحت استراتژی سلول درحال استراحت، اثر غلظت‌های مختلف اکسی‌آنیون سلنیت شامل 1، 2، 3، 4 و 5 میلی‌مولار بر نانوذرات سنتزی در شرایط دمایی 30 درجه سانتی‌گراد، pH برابر 6 و پس از 72 ساعت گرماگذاری بررسی شد؛ درنهایت، جذب نمونه‌ها در محدودة مربوط به پیک جذبی نانوذرات سلنیوم عنصری با روش اسپکتروفتومتری بررسی شد.

.اثر دورة گرماگذاری بر اندازه و مورفولوژی نانوذرات سلنیوم: در این آزمایش با در نظر گرفتن غلظت بهینه سلنیت به‌دست‌آمده از مراحل قبل، اثرات دورة گرماگذاری شامل 24، 48 و 72 ساعت بر سایز و مورفولوژی نانوذرات سنتزی در شرایط دمایی 30 درجه سانتی‌گراد و pH برابر 6 بررسی شدند؛ درنهایت، سایز و مورفولوژی نانوذرات سنتزی ازطریق میکروسکوپ الکترونی روبشی بررسی شدند.

.تعیین ویژگی طیف‌سنجی و میکروسکوپی نانوذرات سلنیوم عنصری: سنتز زیستی نانوذرات سلنیوم تحت استراتژی سلول درحال استراحت مخمر یاروویا لیپولیتیکا سویة MP10، ازطریق مشاهدات چشمی (تغییر رنگ محلول واکنش پس از تیمار با سلول درحال استراحت) و طیف‌های جذبی اسپکتروفتومتری مرئی ماورای بنفش^[6] بررسی شد. آنالیزهای میکروسکوپ الکترونی روبشی^[7] مجهز به پرتوایکس پاشندۀ انرژی^[8] با هدف بررسی سایز، مورفولوژی و آنالیز عنصری انجام شدند. به‌منظور تعیین گروه‌های عاملی دخیل در احیای زیستی اکسی‌آنیون سلنیت سدیم و پایداری نانوذرات سنتزشده، از طیف‌سنجی تبدیل فوریه مادون قرمز^[9] استفاده شد. آنالیز پراش اشعه ایکس^[10] برای بررسی وجود ساختار کریستالی نانوذرات سنتزی استفاده شد. به‌‌منظور جداسازی، خالص‌سازی و رسوب نانوذرات سلنیوم عنصری، از سانتریفیوژ با دور بالا (سرعت 15000 دور به مدت 50 دقیقه) استفاده شد. نانوذرات رسوبی حاصل پس از چند بار شستشو با آب دیونیزه استریل، در دستگاه فریز درایر به مدت 24 ساعت خشک شدند (13 و 17).

نتایج.

.الگوی مقاومت مخمر یاروویا لیپولیتیکا سویة MP10 نسبت به اکسی‌آنیون سلنیت: با توجه به سمیت بالای اکسی‌آنیون سلنیت بر سلول‌های مخمری، مقاومت ذاتی این سویة مخمری نسبت اکسی‌آنیون سلنیت در محیط‌های کشت سنتتیک YPD آگار ازطریق روش رقت در آگار تعیین شد که نتایج در شکل 1 نشان داده ‌شده‌اند. براساس نتایج به‌دست‌آمده سویة مخمری مذکور قابلیت تحمل‌پذیری 10 میلی‌مولار اکسی‌آنیون سلنیت را داشت. مطابق شکل، مقاومت به‌صورت احیای اکسی‌آنیون سلنیت به سلنیوم عنصری همراه بود که با تشکیل کلنی‌های قرمز رنگ در محیط کشت تشخیص داده شد (12 و 13).

شکل 1- الگوی مقاومت مخمر بومی یاروویا لیپولیتیکا سویة MP10 نسبت به اکسی‌آنیون سمی سلنیت ازطریق روش رقت در آگار در محیط YPD براث غنی‌شده با غلظت‌های مختلف اکسی‌آنیون در شرایط دمایی 30 درجه سانتی‌گراد و پس از 96 ساعت گرماگذاری

.منحنی رشد مخمر بومی یاروویا لیپولیتیکا سویة MP10: به دنبال تعیین الگوی تحمل‌پذیری مخمر مذکور نسبت به اکسی‌آنیون سلنیت، نخستین گام در سنتز زیستی نانوذرات سلنیوم عنصری، دستیابی به اطلاعاتی دربارة فازهای رشد سویة مخمر مدنظر بود تا بتوان زمان ورود سویة مخمری به هریک از فازهای رشدی ازجمله انتهای فاز رشد لگاریتمی را تشخیص داد؛ زیرا این موضوع در تهیه سلول‌های درحال استراحت و استفاده از آنها به‌عنوان زیست کاتالیست در آزمایشات سنتز نانوذرات بسیار حائز اهمیت است. همان‌گونه که در شکل 2 آمده است، مخمر مذکور پس از سپری‌کردن 4 ساعت وارد فاز رشدی می‌شود و در ساعت 44 در انتهای فاز رشد لگاریتمی (بیشینه رشد) قرار می‌گیرد.

شکل 2- منحنی رشد مخمر بومی یاروویا لیپولیتیکا سویة MP10 در محیط کشت YPD براث در شرایط دمایی 30 درجه سانتی‌گراد و روی شیکر دورانی با دور rpm 200

.نتایج بررسی سنتز نانوذرات سلنیوم عنصری توسط .سلول درحال استراحت مخمر یاروویا لیپولیتیکا سویة MP10: براساس مشاهدات چشمی سلول درحال استراحت تیمارنشده با اکسی‌آنیون سلنیت دارای رنگ زرد روشن است؛ درحالی‌که در نمونه سلول درحال استراحت تیمارشده با اکسی‌آنیون سلنیت سدیم در غلظت 4 میلی‌مولار بعد از 72 ساعت واکنش زیست تبدیلی به‌دلیل تشکیل نانوذرات سلنیوم عنصری به قرمز تغییر رنگ داده است. با وجود این، بعد از سانتریفیوژکردن نمونه‌ها (5000 دور، 10 دقیقه)، رنگ قرمز تشکیل‌شده فقط بر سطح بیومس بود و در سوپرناتانت مشاهده نشد که نشان‌دهندة تشکیل نانوذرات سلنیوم عنصری بر سطح بیومس مخمری است. نتایج مرتبط با آنالیزهای مربوط به تأیید نانوذرات سلنیوم عنصری تشکیل‌شده بر سطح بیومس سلول درحال استراحت مخمر آزمایش‌شده در شکل 3 نشان داده شده‌اند. تصاویر FESEM و آنالیز EDX سطح بیومس مخمر در حالت کنترل (سلول درحال استراحت بدون حضور اکسی‌آنیون سلنیت) و نمونه سلول درحال استراحت تیمارشده با اکسی‌آنیون سلنیت در شکل 3 مشاهده می‌شود. براساس آنالیزهای به‌دست‌آمده از میکروسکوپ الکترونی روبشی در نمونه کنترل، اثری از حضور نانوذرات سلنیوم عنصری بر سطح بیومس مخمر دیده نمی‌شود (شکل 3 قسمت a1)؛ درحالی‌که در میکروگراف‌های حاصل از بیومس باکتری تیمارشده با اکسی‌آنیون سلنیت، حضور نانوذرات عنصری سلنیوم عنصری در سطح بیومس مخمر کاملاً مشهود است و نانوذرات با میانگین اندازة 8/130 نانومتر سنتز شده‌اند (شکل 3 قسمتa2 ). با هدف مشخص‌کردن ترکیب عنصری نانوذرات سنتزی، آنالیز EDX انجام شد. براساس نتایج به‌دست‌آمده در نمونه تیمارشده، حضور نانوذرات سلنیوم عنصری بر سطح زیست‌تودة مخمری مشاهده شد (شکل 3 قسمت b2). در نمونه کنترل اثری از حضور سلنیوم عنصری بر سطح بیومس مشاهده نشد (شکل 3 قسمت a2).

شکل 3- تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی (a1 و b1) مجهز به پرتو ایکس پاشندۀ انرژی (a2 و b2) که نشان‌دهندة سنتز نانوذرات سلنیوم عنصری بر سطح بیومس سلول درحال استراحت مخمر مورد آزمایش است.

.نتایج اثر غلظت اولیة اکسی‌آنیون سلنیت بر نرخ .سنتز نانوذرات سلنیوم عنصری جداشده از سطح بیومس مخمر یاروویا لیپولیتیکا سویة MP10: به‌منظور مطالعه بهتر نانوذرات سلنیوم سنتزی بر سطح بیومس مخمر، با استفاده از چندین‌بار شستشو با آب دومین استریل و سانتریفیوژکردن (6000 دور، 10 دقیقه)، نانوذرات مذکور از سطح تودة مخمری قابل تفکیک خواهند بود؛ بنابراین، اثر غلظت‌های مختلف سلنیت سدیم بر راندمان سنتز نانوذرات سلنیوم عنصری جداشده از سطح زیست‌تودة مخمر توسط آنالیزهای چشمی و طیف‌سنجی اسپکتروفتومتری بررسی شد. همان‌گونه که در شکل 4 مشاهده می‌شود، مخلوط واکنش حاوی مخمر تیمارشده با سلنیت سدیم در طول گرماگذاری 72 ساعت و دمای 30 درجه سانتی‌گراد یک تغییر رنگ وابسته به فاکتور غلظت داشت. در این مدت سوسپانسیون سلولی قادر به احیای اکسی‌آنیون سلنیت سمی به نانوذرات سلنیوم با پیک جذبی 248 نانومتر بود. در محیط کنترل تغییر رنگ و پیک جذبی مرتبط با نانوذرات سلنیوم عنصری مشاهده نشد. شدت رنگ و پیک جذبی نانوذرات سلنیوم در پاسخ به فاکتور غلظت افزایش یافت و در غلظت‌های بالاتر از 4 میلی‌مولار از شدت پیک کاسته شد. در غلظت‌های 1، 2 و 3 میلی‌مولار شدت رنگ و پیک نسب به غلظت 4 میلی‌مولار بسیار پایین‌تر بود که شاید به‌دلیل غلظت کمتر عوامل زیستی دخیل در احیای اکسی‌آنیون سلنیت به نانوذرات سلنیوم عنصری باشد (12).

شکل 4- نمودار مشاهدات چشمی (تغییر رنگ) و آنالیزهای اسپکتروفتومتری با هدف تعیین بهترین غلظت اکسی‌آنیون سلنیت سدیم برای بیوسنتز نانوذرات سلنیوم عنصری تحت استراتژی سلول درحال استراحت مخمر یاروویا لیپولیتیکا سویة MP10

.نتایج اثر زمان انکوباسیون بر اندازه، مورفولوژی و .پراکندگی نانوذرات سلنیوم عنصری جداشده از سطح بیومس مخمر یاروویا لیپولیتیکا سویة MP10: به‌منظور بررسی تأثیر دورة گرماگذاری بر اندازه، مورفولوژی و پراکندگی نانوذرات سلنیوم عنصری، با در نظر گرفتن غلظت‌ بهینه یون سدیم سلنیت (4 میلی‌مولار)، دمای بهینه رشد 30 درجه سانتی‌گراد و pH بهینه رشد برابر 5/6، اثر زمان گرماگذاری شامل 24، 48 و 72 ساعت آزمایش شد. تصاویر حاصل از میکروسکوپ الکترونی روبشی نشان دادند در زمان انکوباسیون 24 ساعت نانوذرات کروی شکل با میانگین اندازة 70 نانومتر سنتز شده‌اند. نانوذرات سلنیوم با تراکم بسیار بیشتر، کروی شکل و با میانگین اندازه 79 نانومتر در زمان انکوباسیون 48 ساعت سنتز شدند. در زمان‌های انکوباسیون 72 ساعت نانوذرات کروی شکل به یکدیگر نزدیک‌تر شده‌اند و از پراکندگی آنها کاسته شده است و میانگین اندازه 117 نانومتر حاصل شد (شکل 5).

شکل 5- اثر زمان گرماگذاری بر اندازه، مورفولوژی و پراکندگی نانوذرات سلنیوم عنصری جداشده از سطح بیومس مخمر یاروویا لیپولیتیکا سویة MP10 در محیط زیست تبدیلی حاوی 4 میلی‌مولار اکسی‌آنیون سلنیت در شرایط دمایی 30 درجه سانتی‌گراد و دور شیکر rpm 200

آنالیز XRD نانوذرات سلنیوم سنتزشده: نتایج آنالیز پراش اشعه ایکس نانوذرات سلنیوم عنصری سنتزی توسط سلول درحال استراحت مخمر یاروویا لیپولیتیکا سویة MP10 در شکل 6 نشان داده شده‌اند. نتایج آزمون XRD نشان‌دهندة پیک‌های قابل رؤیت در صفحات بلوری 100، 101، 110، 102 و 111 هستند که منطبق بر صفحات و زوایای پرش آنها با نمونة استاندارد نانوذرات سلنیوم عنصری‌اند (JCPDS card No. 06–0362)؛ این موضوع، کریستالی‌بودن نانوذرات سلنیوم عنصری سنتزشده توسط مخمر بومی مذکور را تأیید کرد (22).

شکل 6- الگوی پراش پرتو ایکس (XRD) نانوذرات سلنیوم عنصری سنتزشده تحت استراتژی سلول درحال استراحت مخمر یاروویا لیپولیتیکا سویة MP10

.آنالیز طیف‌سنجی مادون‌قرمز (FTIR) نانوذرات .سلنیوم سنتزشده توسط مخمر یاروویا لیپولیتیکا سویة MP10: طیف FTIR نانوذرات سلنیوم عنصری سنتزشده بر سطح بیومس مخمری پس از جداسازی و تخلیص در شکل 7 نشان داده ‌شده است. طیف FTIR بیان‌کنندة وجود گروه‌های عملکردی پوشاننده و احیاکننده روی سطح نانوذرات است. پیک پهن کشیده‌شده در محدوده 3418 معرف حضور ارتعاش کششی گروه هیدروکسیل و گروه N-H (آمید A در پروتئین‌ها) است که نشان‌دهندة برقراری ارتباطی ضعیف بین مولکول‌های زیستی مخمر و سدیم سلنیت به‌‌منظور تشکیل نانوذرات است (23). پیک ظاهرشده در محدوده 2925 مربوط به گروه C-H کششی موجود در ترکیبات آلی است. پیک ظاهرشده در محدوده 1651 نشان‌دهندة ارتعاش کششی پیوند کربونیل استر (C=O) رایج در لیپید‌ها است که در سنتز نانوذرات سلنیوم نقش داشته‌اند. گفتنی است به‌تازگی لیپید‌ها بخش مهمی از عوامل پوشانندة زیستی نانوذرات سلنیوم سنتزشده به روش میکروبی محسوب می‌شوند (24). به‌طور کلی براساس نتایج به‌دست‌آمده پروتئین‌ها و لیپیدها عوامل پوشاننده و پایدارکنندة این نانوذرات محسوب می‌شوند.

شکل 7- آنالیز FTIR نانوذرات سلنیوم عنصری سنتزشده تحت استراتژی سلول درحال استراحت مخمر یاروویا لیپولیتیکا سویة MP10.

بحث و نتیجه‌گیری.

میکروارگانیسم‌ها پتانسیل بالایی برای تولید نانوذرات دارند و باعث احیای زیستی پیش‌سازهای فلزی به نانوذرات سازگار با محیط زیست می‌شوند. همچنین نانوذرة تولیدشده پایدار، ارزان‌قیمت و عاری از هرگونه آلودگی شیمیایی و مناسب برای تولید انبوه است (25). نوع میکروارگانیسم و آنزیم‌های دخیل در فرایند احیا تعیین‌کنندة تولید داخل سلولی یا خارج سلولی نانوذرات است. در سنتز درون سلولی نانوذرات، دیواره سلولی میکروارگانیسم‌ها نقش مهمی بر عهده دارد. در روش سنتز درون سلولی تعادل الکترواستاتیکی بین بار‌های مثبت یون فلزی و بار منفی دیواره سلولی برقرار می‌شود و آنزیم‌های موجود در دیواره سلولی باعث احیای یون فلزی به نانوذره فلزی می‌شوند (26). احیای سلنیت به فرم سلنیوم عنصری به‌صورت برون و درون سلولی در طیف وسیعی از باکتری‌ها و برخی سویه‌های مخمری گزارش شده است. نانوذرات سلنیوم کروی با میانگین اندازه 90-70 نانومتر با عصاره عاری از سلول مخمر مگنوزیومایسس اینگنز^[xi] سویة LH-F1 سنتز شدند (27). در مطالعة زاو^[xii] و همکاران، باکتری میله‌ای گرم منفی با نام راهنیلا اکوالیتیس^[xiii] سویة HX2 با توانایی تحمل‌پذیری نسبت به غلظت‌های بالای فرم‌های ارگانیک و معدنی سلنیوم، قادر به سنتز نانوذرات سلنیوم کروی با اندازه 350-60 نانومتر بود (28).

مشرقی^[xiv] و شعیبی^[xv] نانوذرة سلنیوم کروی با اندازه متوسط 99 نانومتر را به روش سنتز برون سلولی و با استفاده از زیست‌تودة باکتری انتروکوکوس فکالیس^[xvi] تولید کردند (29). زارع و همکاران توانستند نانوذرة سلنیوم را با استفاده از قارچ آسپرژیلوس ترئوس^[xvii] به روش سنتز خارج سلولی تولید کنند. نانوذرات سلنیوم تولیدشده، نانوذرات کروی قرمز رنگ با اندازه قطر 47 نانومتر بودند که روش مناسبی برای تولید نانوذرات سلنیوم با اندازه کمتر از 100 نانومتر است (30). در پژوهش حاضر توانایی مخمر یاروویا لیپولیتیکا MP10 برای احیای زیستی سلنیت سدیم به نانوذرات سلنیوم بررسی شد. مخمر‌ها پتانسیل بالایی در جذب و تجمع یون‌های فلزی سمی دارند. مزایایی که کار با مخمر‌ها را جذاب کرده است شامل سادگی کار آزمایشگاهی، سهولت در دسترسی به مقادیر بالایی از بیومس، سطح بالای آنزیم‌های اکسیدوردوکتازی و استفادة مخمرها از مواد مغذی ساده است (11 و 20). اندازه نانوذرات به‌طور مستقیم بر خواص آنها تأثیر می‌گذارد؛ این خواص شامل ویژگی‌های شیمیایی، نوری و الکترونیکی منحصربه‌فردی است. در سنتز نانومواد به روش زیستی میزان اندازه و پراکندگی نانوذرات تولیدشده چالش‌برانگیز است که این موضوع را با توجه به نوع میکروارگانیسم و محیط رشد و شرایط سنتز تا حدودی می‌توان کنترل کرد؛ بین میکروارگانیسم‌ها مخمر توانایی خوبی در تولید نانوذره با اندازه مناسب دارد. به همین دلیل، سنتز زیستی نانوذرات سلنیوم تحت استراتژی سلول‌های درحال استراحت توسط مخمر یاررویا لیپولیتیکا سویة MP10 بررسی شد. نتایج به‌دست‌آمده نشان دادند سویة مخمری استفاده‌شده در شرایط بهینه در غلظت 4 میلی‌مولار اکسی‌آنیون سلنیت سدیم و پس از 72 ساعت گرمخانه‌گذاری و سانتریفیوژ در دور 5000 نانوذرات کروی بر سطح زیست‌تودة مخمری تولید کرده است که به نظر می‌رسد بیومس بستری مناسب برای تجمع نانوذرات باشد. فاکتور‌های مختلفی در فرایند تولید نانوذرات به روش سنتز زیستی مؤثر هستند که بر اندازه و شکل نانوذرات تولیدشده تأثیر می‌گذارند و محققان بر این مطلب توافق‌نظر دارند؛ ازجمله این فاکتور‌ها می‌توان به غلظت اکسی‌آنیون سلنیت، دما،pH ، دور شیکر و زمان انکوباسیون اشاره کرد. غلظت یکی از عوامل مؤثر است که در این پژوهش برای دستیابی به بهترین غلظت یون سلنیوم، با ثابت نگه‌داشتن عوامل دیگر، غلظت‌های مختلفی از اکسی‌آنیون سلنیت سدیم بررسی شدند که سویة مخمری بهترین نتیجه را در غلظت 4 میلی‌مولار ارائه داد. همچنین گزارشاتی مبنی بر تأثیرگذاری زمان انکوباسیون بر میزان نانوذرة تولیدشده وجود دارد که بر اندازه و شکل نانوذرات تأثیر می‌گذارد. ناضرالدین^[xviii] و همکاران در آزمایشات خود تفاوت اندازه نانوذرات نقره سنتزشده را توسط عصاره دانه گشنیز^[xix] در 1 تا 2 ساعت نسبت به 2 تا 4 روز بررسی کردند (31). دوویدی^[xx] و گوپال^[xxi] گزارش دادند در سنتز زیستی نانوذرات نقره و طلا با استفاده از گیاه سلمک^[xxii] با گذشت 15 دقیقه از شروع واکنش تولید می‌شوند که با گذشت زمان بیشتر اندازه و شکل نانوذرات تولیدشده تغییر می‌کنند (32). سویة مخمری مذکور پس از 24 ساعت گرماگذاری قابلیت سنتز نانوذرات سلنیوم کروی با میانگین اندازه 70 نانومتر را داشت. با افزایش زمان گرماگذاری، نانوذرات کروی شکل سلنیوم به یکدیگر نزدیک‌تر شدند و از پراکندگی آنها کاسته شد و میانگین اندازه نانوذرات به 117 نانومتر بعد از 72 ساعت افزایش یافت.

نانوذرات سلنیوم به‌دلیل سمیت کمتر در مقایسه با فرم‌های معدنی و ارگانیک سلنیوم و همچنین خواص آنتی‌اکسیدانی، ضدتوموری و کاربرد آنها به‌عنوان عامل ضدمیکروبی در صنایع پزشکی و غذایی درخور توجه‌اند. سنتز سبز نانوذرات سلنیوم با استفاده از مخمرها به‌عنوان جایگزینی برای سنتز فیزیکوشیمایی، در مسیری سازگار با محیط زیست، از نقطه‌نظر کاربردهای پزشکی و غذایی مفید است. موضوع چالش‌برانگیز در این روش پراکندگی و اندازه نانوذرات است که با بهینه‌سازی شرایط می‌توان این چالش را تا حدودی برطرف کرد و نانوذراتی در مقیاس گسترده تولید کرد. پژوهش حاضر گزارشی از عملکرد مخمر بومی یاروویا لیپولیتیکا در سنتز موفقیت‌آمیز نانوذرة سلنیوم عنصری تحت استراتژی سلول درحال استراحت و بهبود پراکندگی و اندازه نانوذرات در شرایط بهینه زمان گرماگذاری بود.

[1]- Yarrowia lipolyaztica

[2]- Saccharomyces cerevisiae

[3]- Rhodotorula glutinis

[4]- Rhodotorula mucilaginosa

[5]- UV-Visible spectrophotometer

[6]- UV-Vis spectrophotometer (Specord 210, Germany)

[7]- Field emission scanning electron microscopy (FESEM; TESCAN Mira 3-LMu, Czech Republic)

[8]- Energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDX)

[9]- Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR, Bruker Vector 22)

[10]- X-ray diffraction (XRD, Philips X'Pert-MPD)

[xi]- Magnusiomyces ingens

[xii]- Zhu

[xiii]- Rahnella aquatilis

[xiv]- Mashreghi

[xv]- Shoeibi

[xvi]- Enterococcus faecalis

[xvii]- Aspergillus terreus

[xviii]- Nazeruddin

[xix]- Coriandrum sativum

[xx]- Amarendra Dhar Dwivedi

[xxi]- Krishna Gopal

[xxii]- Chenopodium