فیلوژنی مولکولی خفاش‌ گوش‌پهن مصری (Barbastella leucomelas) براساس ژن میتوکندریایی COI: گزارشی جدید از ایران

مقدمه

راستۀ خفاش‌ها (Chiroptera) با 21 خانواده، 237 جنس و 1446 گونه بعد از جوندگان، بزرگ‌‌ترین و متنوع‌ترین راستۀ‌ پستانداران است (Burgin et al., 2018; https://mammaldiversity.org). در ایران تاکنون حضور 52 گونه خفاش متعلق به 9 خانواده گزارش شده است (Yusefi et al., 2019; Khajeh et al., 2020). اگرچه به‌طور سنتی راستۀ خفاش‌ها به دو زیر‌راستۀ کلان‌‌خفاش‌ها (Megachiroptera) و خرد‌خفاش‌ها (Microchiroptera) رده‌بندی می‌شود، به‌تازگی براساس تجزیه و تحلیل‌های فیلوژنتیکی، این رده‌بندی تغییر کرده است. براساس رده‌بندی قدیم در ایران تنها دو گونه خفاش میوه‌خوار مصری (Rousettus aegyptiacus) و خفاش میوه‌خوارLeschenault's  (Rousettus leschenaultii) متعلق به زیر‌راستۀ کلان‌‌خفاش‌ها بود و بقیه به زیر‌راستۀ خرد‌خفاش‌ها تعلق داشت؛ در حالی که در رده‌بندی جدید، خانواده‌های خفاش‌‌ میوه‌خوار، خفاش‌ دم‌موشی، خفاش‌ بینی‌برگه‌ای، خفاش‌ نعل‌اسبی و خانوادۀ جدید Rhinonycteridae در زیر‌راستۀ Pteropodiformes یا Yinpterochiroptera و خانواده‌های خفاش‌ دم‌آزاد، خفاش‌ دم‌غلاف‌دار، خفاش‌ شامگاهی و خفاش‌ بال‌خمیده در زیر‌راستۀ Vespertilioniformes یا Yangochiroptera قرار می‌گیرد (Eick et al., 2005; Foley, et al, 2015)؛ همچنین گسترش مطالعات فیلوژنی در سال‌های اخیر منجر به کشف گونه‌های پنهان (Cryptic) بسیاری در این راسته شده است (Altringham, 2011; Burgin et al., 2018). خفاش‌های گوش‌پهن (Barbastelle) متعلق به جنس Barbastella از خانوادۀ خفاش‌های شامگاهی (Vespertilionidae) هستند. خانوادۀ خفاش‌های شامگاهی متعلق به زیرراستۀ Yangochiroptera و بزرگ‌‌ترین خانوادۀ‌ این زیر‌راسته است که تا‌کنون مطالعات بوم‌شناختی، رده‌بندی و فیلوژنی گسترده‌ای دربارۀ آن انجام شده است (Mayer et al., 2007). جنس Barbastella پراکندگی بسیار گسترده‌ای در نواحی معتدل و نیمه‌گرمسیری در منطقۀ پالئارکتیک از انگلستان در غرب اروپا تا ژاپن و تایوان در شرق آسیا، شمال و شمال شرقی آفریقا و همچنین شمال هند و چین در منطقۀ اورینتال دارد (شکل 1) (Simmons, 2005). اعضای این جنس در گسترۀ پراکنش خود به‌‌ندرت جابه‌جا می‌‌شوند و به‌طور معمول گسترۀ خانگی محدودی دارند (Zeale et al., 2012). خفاش‌های گوش‌‌پهن به‌طور عمده در مناطق جنگلی و در زیستگاههای با اقلیم به‌‌نسبت سرد، بناهای انسان‌ساخت از قبیل اماکن مسکونی و متروک، زیر پل‌ها، تونل‌ها و داخل غارها به سر می‌برند. جنس Barbastella در ایران ازجمله خفاش‌های بسیار کمیاب به شمار می‌آید و نیچ غذایی بسیار تخصصی دارد؛ به گونه‌‌ای که به‌طور عمده از بیدها تغذیه می‌کند (Benda et al., 2012). محدودۀ حضور خفاش گوش‌پهن آسیایی براساس شش گزارش به‌دست‌‌آمده فقط از نوار شمالی ایران است (Benda et al., 2012). تمام نقاط حضور گونۀ آسیایی در ایران در منطقۀ استپ‌های خشک و نیمه‌خشک قرار دارد و از شمال شرق ایران تا رشته‌‌کوه زاگرس مرکزی امتداد می‌یابد؛ همچنین تاکنون به تعداد کم تنها از استان‌های خراسان رضوی، مرکزی، تهران، سمنان و لرستان گزارش شده است (Benda et al., 2012).

خفاش‌های بارباستل ازنظر تنوع تا 10 سال اخیر جنس کوچکی به شمار می‌آمد (Zhang et al., 2007) که تنها از دو گونۀ خفاش گوش‌پهن غربی یا اروپایی B. barbastellus (Schreber 1774) و خفاش گوش‌پهن شرقی یا آسیایی B. leucomelas (Cretzschmar, 1826) تشکیل می‌شد. این طبقه‌بندی در سال‌های اخیر به‌‌کلی دگرگون شده و درحال حاضر تعداد گونه‌های آن به شش گونه رسیده است؛ به طوری که الگوی توزیع و پراکنش این جنس را در محدودۀ پالئارکتیک تغییر داده است (شکل 1). به‌طور خاص در سال 2007 گونه‌ای جدید با نام خفاش گوش‌پهن پکنی (B. beijingensis) توسط Zhang و همکارانش در شمال شرق چین توصیف شد؛ همچنین فرم مصری (عربی) گونۀ B. leucomelas که به‌‌طور عمده در مصر، شبه‌جزیرۀ سینا، عربستان صعودی و اریتره در شمال آفریقا زندگی می‌کند، در سطح گونه از سایر جمعیت‌های آسیایی آن جدا شد (Benda and Mlikovsky, 2008). در سال 2015 Kruskop با بررسی داده‌های ریخت‌شناسی و ژنتیک جمعیت‌های باقی‌ماندۀ آسیای مرکزی و قفقاز جنوبی که در قالب نام خفاش گوش‌پهن آسیایی (B. darjelingensis) شناخته می‌شد، گونه‌ای جدید را با نام خفاش گوش‌پهن خزری توصیف کرد. نتایج این بررسی نشان داده است افراد جمعیت‌های آسیای مرکزی را نمی‌شود گونۀ B. darjelingensis در نظر گرفت؛ بلکه آنها متعلق به گونه‌ای جداگانه است که شباهت بیشتری با گونۀ مصری B. leucomelas دارد؛ اما ازنظر ریخت‌شناسی با آن متفاوت است. جثه و اندازۀ خفاش گوش‌پهن خزری بزرگ‌‌تر از گونۀ مصری است. Kruskop (2015) براساس مجاورت جغرافیایی جمعیت‌های این گونه در محدودۀ دریای خزر و قفقاز جنوبی نام آن را Barbastella caspica Satunin, 1998 انتخاب کرد.

یافته‌های اخیر در رده‌بندی اعضای این جنس سبب شده است تا لزوم بازنگری در روابط تبارشناختی جمعیت‌های ایرانی آن، بیش از پیش احساس شود. براساس مطالعات Kruskop (2015) وBenda  و همکاران (2008) جمعیت‌های مختلف خفاش‌های گوش‌پهن در ایران به دو گونۀ خفاش گوش‌پهن خزری (Barbastella caspica Satunin, 1908) و خفاش گوش‌پهن اروپایی (Barbastella barbastellus Schreber, 1774) منصوب می‌شود. با توجه به اینکه خفاش‌های گوش‌پهن ازنظر جغرافیایی دارای جمعیت‌های منزوی هستند، احتمال وجود گونه‌های پنهان (Cryptic) در میان جمعیت‌های مختلف آن زیاد است؛ همچنین فرآیند گونه‌زایی (Speciation) در این جنس در مطالعات پیشین مطرح شده است (Kruskop, 2019)؛ علاوه‌بر این برنامه‌ریزی‌های حفاظتی براساس نیازهای اکولوژیک گونه‌هایی انجام می‌شود که ازنظر تکاملی جدا شده‌اند (Behrooz et al., 2018)؛ بنابر‌این شناسایی گونه‌های پنهان نقش به‌سزایی در مدیریت و حفاظت از گونه‌های کمیاب خفاش‌هایی خواهد داشت که به‌‌تازگی توصیف شده‌اند (Bickford et al., 2007; Pellens et al., 2016). این مطالعه با هدف رفع ابهامات رده‌بندی و همچنین بازسازی درخت تبارشناختی جمعیت‌های جنوبی گسترۀ توزیع و پراکنش (شمال و غرب ایران) خفاش گوش‌پهن خزری انجام شد (شکل 1). در این پژوهش تلاش شد با استفاده از ژن میتوکندریایی COI که ژنی متداول در مطالعات آرایه‌شناسی مولکولی جانوران است و از آن در مطالعات قبلی فیلوژنی گونه‌های این جنس استفاده شده است (Kruskop, 2015)، ابهامات موجود بررسی شود.

شکل 1- نقشۀ توزیع گونه‌های مختلف جنس Barbastella. 1. خفاش گوش‌پهن اروپایی (قرمز)؛ 2. خفاش گوش‌پهن مصری (آبی روشن)؛ 3. خفاش گوش‌پهن خزری (آبی تیره)؛ 4. خفاش گوش‌پهن هندی (بنفش)؛ 5. خفاش گوش‌پهن پکنی (سبز)؛ 6. خفاش گوش‌پهن ژاپنی (قهوه‌ای)(Kruskop, 2019) .

نتایج

روش کار

نمونه‌برداری

کلنی بررسی‌‌شده در نیمۀ شمالی کشور ایران و در محدودۀ منطقۀ حفاظت‌شدۀ الموت شرقی در استان قزوین قرار دارد. نمونه‌برداری و صید خفاش‌ها با مجوز شمارۀ 20054/420/99 و با هماهنگی معاونت محیط طبیعی سازمان حفاظت محیط زیست انجام شده است. زنده‌گیری با استفاده از تور دستی (Mist net) در محل‌ استراحت افراد (دیوارۀ سنگی داخل تونل شیرکوه) انجام شد (شکل 2). سعی شد از آسیب‌‌رساندن به حیوان جلوگیری شود و تا حد امکان کمترین میزان استرس به آن وارد شود (Sikes, 2016). نمونه‌های صیدشده تعیین جنسیت و بخش کوچکی از بال هر فرد به قطر سه میلی‌متر توسط بایوپسی پانچ (Biopsy punches) برداشته (Zhang et al., 2007) و در الکل 96 درصد برای مطالعات مولکولی در آزمایشگاه حیات وحش دانشگاه تهران نگهداری شد. از آنجایی که خفاش‌ها توانایی بازسازی بافت آسیب‌دیدۀ بال خود را دارند، به‌‌طور تقریبی یک‌‌ماه بعد محل نمونه‌برداری ترمیم می‌شود. این شیوه از نمونه‌برداری (غیر تهاجمی) آسیب جدی به حیوان وارد نخواهد کرد (Gannon, 2011). نمونه‌ها در محل صید و در همان وضعیت اولیه رهاسازی شد.

شکل 2- تصاویر خفاش‌‌های گوش‌پهن مصری که روی دیوارۀ تونل شیرکوه معلم‌کلایه درحال استراحت هستند.

استخراج و توالی‌یابی DNA

در این مطالعه، سه فرد از یک کلنی هشت‌تایی خفاش‌ گوش‌پهن حاضر در داخل تونل شیر‌کوه شهرستان معلم‌کلایه در محدودۀ منطقۀ حفاظت‌‌شدۀ الموت شرقی استان قزوین، برای استخراج DNA استفاده شد. برای استخراج DNA، نمونه در بافر هضم‌کنندۀ حاوی دو درصد SDS، 500 میکرولیتر بافر STE (pH = 8) و 20 میکرولیترآنزیم پروتئیناز K به مدت سه ساعت در دمای 56 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شد. فرآیند جداسازی با فنل / کلروفرم / ایزوآمیل الکل (25/24/1) در دو مرحله (هربار 500 میکرولیتر اضافه و بعد از سانتریفوژ لایۀ رویی حاوی DNA جداسازی شد) و عملیات رسوب  DNAبا اضافه‌‌شدن 500 میکرولیتر اتانول مطلق صورت گرفت. درنهایت،  DNA در 50 میکرولیتر آب مقطر عاری از هرگونه آلودگی محلول شد. ارزیابی کیفی DNA با استفاده از دستگاه نانودراپ (Thermo2000c, USA) و خوانش طول موج‌‌های 260 و 280 نانومتر صورت گرفت؛ همچنین برای بررسی یکپارچگی DNA از روش الکتروفورز ژل آگاروز یک درصد در بافر TAE1x با ولتاژ 100 ولت به مدت 30 دقیقه استفاده شد.

فرآیند تکثیر با حجم نهایی 30 میکرولیتر با استفاده از پرایمرهای جدول 1 در دستگاه ترموسایکلر PeQlab, Germany)) با مواد آورده‌‌شده و کیت PCR 2x (Ampliqon, Denmark) انجام شد. شرایط دمایی شامل واسرشت اولیه 95 درجۀ سانتی‌گراد به مدت پنج دقیقه، 35 چرخه شامل دمای 94 درجۀ سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه، دمای 57 درجۀ سانتی‌گراد به مدت 40 ثانیه و دمای 72 درجۀ سانتی‌گراد به مدت 90 ثانیه بود. در‌نهایت، بسط آنزیمی 72 درجۀ سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه انجام گرفت. مقدار چهار میکرولیتر از محصول PCR روی ژل آگاروز 5/1 درصد در بافرTBE 0.5X  در حضور رنگ فلورسنت Greenviwer (شرکت آریاطوس، ایران) رنگ‌‌آمیزی شد. در کنار نمونه‌ها از نشانگر وزن مولکولی DM2300 (SMOBIO, Tailand) استفاده شد.

جدول 1- لیست پرایمرهای استفاده‌‌شده در فرآیند تکثیر

محصول به‌دست‌‌آمده با استفاده از کیت ستونی (Combo GenAll, Korea) شستشو داده شد و توالی‌یابی به روش سنگر در دستگاه توالی‌یاب ABI3730xl (Macrogene, Korea) از دو طرف (F و R) صورت گرفت. توالی‌های ab1 در نرم‌افزار geneious IR9 ارزیابی شد (Kearse et al,. 2012).

آنالیزهای ژنتیکی و آماری

با توجه به مطالعات انجام‌‌شده در آسیا (Benda et al., 2008; Kruskop, 2015)، برای تعیین روابط تبارشناختی درون این جنس از 657 جفت باز (bp) ژن میتوکندریایی COI استفاده شد. سکانس‌‌های مربوط به افراد گونه‌های جنسBarbastella  در خارج از ایران که توسط سایر پژوهشگران جمع‌آوری شده و در مرکز ژنومیک تنوع زیستی کانادا، در سامانۀ دادۀ بارکد حیات (BOLD; www.boldsystems.org) موجود است، به ماتریس دادۀ ما اضافه و برای مقایسه با نمونه‌های داخلی استفاده شد (جدول 2). از 31 سکانس‌ مربوط به خفاش‌های جنس گوش‌بلند (Plecotus) شامل خفاش گوش‌بلند اوگنوی (Plecotus ognevi) با 28 سکانس و سه سکانس از خفاش گوش‌بلند آسیای میانه (P. strelkovi) درجایگاه تاکسون خواهری جنس Barbastella استفاده و برای ریشه‌دارکردن تبارنمای فیلوژنی درجایگاه گروه خارجی (Outgroup) به دسته دادۀ ما اضافه شد (Kruskop, 2015). سکانس‌های استخراج‌‌شده با استفاده از افزونۀ Clustal W در نرم‌افزار (10.0.5) MEGA X هم‌ردیف شد (Kumar et al., 2018) و به‌صورت چشمی تنظیم نهایی توالی‌ها صورت گرفت. به‌منظور تعیین احتمالات مختلف جایگزینی نوکلئوتیدی و انتخاب بهترین مدل تکاملی برای دسته داده‌های مختلف (جنس Barbastella با 19 توالی و جنس Plecotus با 31 توالی) و همچنین جلوگیری از نبود قطعیت نرم‌افزاری، از ModelTest-NG v0.1.7 در نرم‌افزار raxmlGUI 2.0.5 و نرم‌افزار MEGA X استفاده شد (Kozlov et al., 2019; Darriba et al., 2020).

برآورد میزان واگرایی تکاملی بین توالی‌ها با استفاده از فاصلۀ ژنتیکی جفتی (Pairwise distances) انجام شد (Tamura and Nei., 1993). ماتریس فاصلۀ جفتی بین توالی‌ها با استفاده از مدل تامورا و نئی (Tamura and Nei) (TrN) با نرخ‌های جایگزینی هم‌خانواده و غیر هم‌خانواده (transition + transversions) مشخص شد. از توزیع یکنواخت (Uniform rate) برای تعیین نرخ تغییر بین جایگاهها با الگوی ناهمگن بین دودمان‌ها (Heterogeneous) با احتمال مقادیر مشتق‌‌شده از 10 هزار تکرار بوت‌استرپ استفاده شد (Kruskop, 2019).

به‌‌منظور استنباط روابط تبارشناختی جمعیت ایرانی خفاش گوش‌پهن در ارتباط با سایر گونه‌های مختلف جنس Barbastella و مقایسۀ درخت فیلوژنی آن با درخت فیلوژنی Kruskop (2015) از روش Neighbor-Joining با استفاده از مدل دوپارامتری کیمورا (Kimura 2-parameter) با نرخ‌های جایگزینی هم‌خانواده و غیر هم‌خانواده (transition + transversions) و از توزیع یکنواخت (Uniform rate) برای تعیین نرخ تغییر بین جایگاهها با احتمال مقادیر مشتق‌شده از 10 هزار تکرار بوت‌استرپ استفاده شد. تمام موقعیت‌های دربردارندۀ گپ و داده‌های ازدست‌رفته (Gaps and missing data) با استفاده از گزینۀ حذف کامل (Complete deletion) از آنالیز حذف شد. در‌نهایت، به‌منظور یافتن محتمل‌ترین درخت فیلوژنی که روابط تبارشناختی در داده‌ها را بهتر از سایر درخت‌ها توصیف کند، از روش بیشینۀ درست‌نمایی (Maximum likelihood) و مدل هاسه گاوا کیشینو و یانو (HKY85) در ترکیب با مدل G و I استفاده شد. برای ترسیم تبارنمای ML از برنامه اجرایی raxmlHPC-PTHREADS-SSE3.exe در نرم‌افزار RAxML GUI 2.0.5 استفاده شد ((Edler et al., 2020.

نتایج

در این مطالعه، 657 جفت باز از ژن میتوکندریایی COI مربوط به سه نمونه از خفاش‌های Barbastella در دامنۀ جنوبی رشته‌کوه البرز (در استان قزوین) توالی‌یابی شد. توالی‌های به‌دست‌‌آمده با 16 توالی از شش تاکسون متفاوت این جنس تجزیه و تحلیل فیلوژنتیکی شد. ماتریس فاصلۀ TrN و خطای استاندارد (Standard error) برآوردشده بین هر جفت از توالی‌ها در جدول 2 نشان داده شده است. در این مطالعه، بیشترین فاصلۀ ژنتیکی مشاهده‌‌شده، بین جمعیت ایرانی با گونۀ B. darjelingensis ویتنام به میزان تقریبی 21 درصد، بعد از آن با گونۀ B. darjelingensis جزایر کوریل (مجمع‌الجزایری آتشفشانی در استان ساخالین در روسیه با طول تقریبی ۱۳۰۰ کیلومتر که از شمال شرقی هوکایدو در ژاپن تا کامچاتکا در روسیه کشیده‌ شده ‌است) به میزان 20 درصد و بعد از آن با گونۀ B. barbastellus به میزان تقریبی 19 درصد بود. کمترین فاصلۀ ژنتیکی جمعیت‌های ایرانی با گونۀ B. leucomelas از مصر با میزان تقریبی یک درصد و بعد از آن با گونۀ B. caspica به میزان تقریبی شش درصد برآورد شده است.

جدول 2- ماتریس فاصلۀ TrN و خطای استاندارد 19 توالی از جنس خفاش‌های گوش‌پهن براساس ژن COI

تبارنمای تکاملی با استفاده از روش Neighbor-Joining استنباط شد. فاصلۀ تکاملی با استفاده از مدل K₂P محاسبه شده است. درخت بهینه با مجموع طول شاخۀ برابر با 70/0 نشان داده شده است. درصد تکرار مرتبط با خوشه‌بندی هر تاکسون در 10 هزار تکرار بوت‌استرپ در مجاورت هر شاخه نشان داده شده است. توپولوژی حاصل از ترسیم تبارنمای Neighbor-Joining به روش فاصلۀ K₂P، وجود دو کلاد اصلی و شش خوشۀ فرعی را نشان داد. در کلاد اول جمعیت‌های ویتنام و جزایر کوریل و بقیۀ جمعیت‌ها در کلاد دوم قرار گرفته است. جمعیت‌های ایرانی در خوشۀ مربوط به گونۀ B. leocmelas قرار گرفته است.

شکل 3- درخت فیلوژنتیک Neighbor-Joining مربوط به خفاش‌های جنس Barbastella براساس ژن میتوکندریایی COI

به‌منظور یافتن محتمل‌ترین درخت فیلوژنی که روابط تبارشناختی در داده‌ها را بهتر از سایر درخت‌ها توصیف کند، رابطۀ تبارشناختی تاکسون‌های ایرانی در ارتباط با سایر تاکسون‌های این جنس با استفاده از روش ML و مدل HKY استنباط شد. در بین مجموع داده‌های مشاهده‌‌شده، تبار‌نمای با بیشترین مقدار احتمال در شکل 4 نشان داده شده است.

شکل 4- درخت فیلوژنتیک ML مربوط به خفاش‌های جنس Barbastella براساس ژن میتوکندریایی COI

تغییرات درون‌‌گونه‌ای برای سه فرد از این کلنی براساس فواصل ژنتیکی محاسبه‌‌شده برابر با صفر درصد به دست آمده است (جدول 2)؛ همچنین در بین نمونه‌های این کلنی، نمونۀ شمارۀ 3 تغییرات تکاملی بیشتری را نسبت به نمونه‌های شمارۀ 1 و 2 از خود نشان داده است. نمونه‌های شمارۀ 1 و 2 ازنظر تبارشناختی شباهت بیشتری با یکدیگر داشتند و به‌‌طور احتمالی نسبت خویشاوندی نزدیک‌‌تری با یکدیگر دارند (براساس کلادوگرام این جنس، توالی شمارۀ 1 و 2 که از یک جد مشترک مشتق شده نسبت به توالی شمارۀ 3 جدیدتر است). این تفاوت‌ها در تبارنمای NJ محسوس‌تر از تبارنمای ML است.

بحث

به‌منظور جلوگیری از ناپایداری جمعیت، استنباط فیلوژنی تنها با استفاده از داده‌های مولکولی انجام شد. وظیفۀ اصلی فیلوژنی مولکولی تبدیل اطلاعات توالی‌های نوکلئوتیدی به تبارنمای تکاملی است (Nazemi-Rafie, 2010). استنباط فیلوژنتیک، سنگ‌بنای اساسی در پژوهش‌‌های زیست‌شناسی تکاملی است و مبنایی برای تفکر و پاسخ‌گویی به طیف گسترده‌ای از پرسش‌‌ها را، از پویایی جمعیت تا طبقه‌بندی گونه‌ای به‌صورت آماری فراهم می‌کند (Felsenstein, 2003; Edler et al., 2020). نتایج نشان داد استنباط فیلوژنتیک به‌دست‌‌آمده از مجموعۀ توالی‌های جنس خفاش‌های گوش‌پهن توسط روش‌ها و مدل‌های مختلف، تبارنماهای متفاوتی ایجاد کرده است؛ اما الگوی خوشه‌بندی مشابهی بین کلاد‌های B. caspica و B. leucomelas با کلاد ایرانی (Barbastella. Qazvin) ایجاد کرده است که مطمئن خواهیم شد هر دو تبارنما روابط تبارشناختی مشابهی را منعکس می‌کند. بر‌خلاف فرضیات پیشین (Kruskop, 2015)، الگوی‌ شاخه‌بندی (توپولوژی) تبارنما‌های استنباط‌‌شده با استفاده از روش‌های آماری و مدل‌های تکاملی مختلف حاکی از این است که درجۀ خویشاوندی جمعیت‌های خفاش‌های گوش‌پهن ساکن در محدودۀ شمال و به‌‌طور احتمالی غرب ایران به گونۀ B. leucomelas این جنس شباهت بیشتری دارد و ازنظر ژنتیکی تاریخچۀ تکاملی متفاوتی را نسبت به B. caspica سپری کرده است. براساس طول انشعاب بین تبارنمای به‌دست‌‌آمده با استفاده از روش NJ و تبار‌نمای به‌دست‌‌آمده با استفاده از روش ML، در مقدار تغییرات تکامل بین نمونه‌های ایران و خفاش گوش‌پهن مصری تفاوت چشمگیری وجود دارد. طول انشعاب در تبار‌نمای ML برای نمونه‌های ایرانی مقدار تغییرات تکاملی بیشتری را نسبت به تبارنمای NJ نشان می‌دهد؛ در صورتی که طول انشعاب در تبار‌نمای NJ نسبت به ML برای گونۀ خفاش گوش‌پهن مصری بیشتر از نمونه‌های ایرانی است. به نظر می‌رسد این تفاوت ناشی از ماهیت روش‌های آماری استفاده‌‌شده در ترسیم تبارنما است. براساس طول انشعاب تبار‌نمای ML، این احتمال وجود دارد که جریان ژن‌های این جمعیت ازطریق مهاجرت (انتشار تدریجی) از ناحیۀ جنوبی توزیع و پراکنش گونۀ B. leucomelas از مصر و جزیرۀ سینا منشأ گرفته و به‌طور تدریجی به نواحی شمالی گسترش یافته باشد تا زیستگاههای کنونی خود را در ایران اشغال کند. براساس طول انشعاب تبار‌نمای NJ این احتمال وجود دارد که جریان ژن از سمت جمعیت‌های ایرانی به سمت مصر و جزیرۀ سینا سرازیر شده باشد که در مطالعات آتی باید آزمون شود. درنهایت، استنباط می‌‌شود که مکان اولیۀ سرچشمه‌‌گرفتن از مرکز انتشار (Center of origin) این جمعیت به‌‌طور احتمالی متفاوت از جمعیت‌های شمال شرقی ایران است. پیش‌بینی می‌شود مرکز انتشار جریان ژن جمعیت‌های شمال شرقی ایران با توجه به مجاورت جغرافیایی آن با منطقۀ قفقاز، از طرف جمعیت‌های خفاش گوش‌پهن خزری در این ناحیه باشد. تمام گونه‌های شناخته‌شده از این جنس، آلوپاتریک یا حداقل پاراپاتریک هستند؛ به‌جز اینکه در منطقۀ قفقاز و ایران دو گونۀ متمایز ازنظر مورفولوژیک به‌صورت سیمپاتریک حضور دارند. در سطح سیمای سرزمین، این دو گونه در زیستگاههای متفاوتی دیده می‌شود (Benda et al., 2012; Kruskop, 2019). با توجه به مجاورت جغرافیایی بین جمعیت‌های مختلف این جنس در بخش شمالی ایران، پیشنهاد می‌شود در مطالعات آتی رابطۀ تبارشناسی و جغرافیای زیستی این جنس بررسی شود.

خفاش‌های گوش‌پهن در میان سایر خفاش‌ها منحصر به فرد هستند و شناسایی آنها براساس صفات ظاهری در هر بخش از محدودۀ توزیع این جنس کار مشکلی نیست؛ اما تفکیک گونه‌های مختلف این جنس (به‌‌جز گونۀ اروپایی یا بارباستل غربی) به‌‌دلیل شباهت مورفولوژیک کار بسیار مشکلی است (DeBlase, 1980). وضعیت طبقه‌بندی مشاهده‌شده در جنس بارباستل به‌‌ویژه بارباستل‌های شرقی بازتابی از مشکلات رایج مورفولوژیکی (صفات ریختی ظاهری) در علم رده‌بندی است؛ همچنین استفاده از ژن میتوکندریایی COI به‌‌تنهایی برای ارزیابی دقیق و طبقه‌بندی گونه‌ای یا نام‌‌گذاری‌ جدید کافی نیست (Kruskop, 2015). به‌طور معمول برای معرفی گونه‌ها یا زیر‌گونه‌های جدید و دستیابی به روابط تبارشناختی دقیق‌تر از روش‌های مورفومتریک (Akmali et al., 2017) همراه با نشانگرهای میتوکندریایی یا نشانگرهای هسته‌ای استفاده می‌شود (Akmali, 2017). متأسفانه استفاده از داده‌های ریختی (صفات جمجمه‌ای و دندانی) در مطالعات مربوط به طبقه‌بندی گونه‌های کمیاب به‌‌دلیل تهاجمی‌‌بودن این نوع روش، باعث حذف برخی از افراد جمعیت خواهد شد (Yaghoubirostami et al., 2020). حذف یک یا چند فرد از یک کلنی کوچک منجر به از دست رفتن تنوع ژنتیکی می‌شود. کاهش تنوع ژنتیکی تأثیر زیادی بر پایداری جمعیت در بلند‌مدت خواهد داشت؛ از این رو به‌منظور دستیابی به تبارنمای جامع و معتبر پیشنهاد می‌شود در مطالعات آتی از سایر نشانگرهای ژنتیکی مثل Cytb و ND1 (استفاده‌‌شده در مطالعات قبلی (Kruskop, 2019; Zhang et al., 2007))، در ترکیب با نشانگر COI، استفاده شود. با توجه به اینکه هدف اصلی در فیلوژنی مولکولی، بازیابی تبارنمایی واقعی برای مجموعه‌ای از توالی‌هاست (Nazemi-Rafie, 2010)، پیشنهاد می‌شود استنباط فیلوژنتیکی با استفاده از روش‌های آماری جدیدتر مثل آمار بیزین و با تعداد نمونۀ بیشتر برای ارزیابی دقیق روابط بین تاکسون‌های این جنس و سایر جمعیت‌های ساکن در ایران استفاده شود.

جمع‌بندی

درمجموع، براساس ماتریس فاصلۀ TrN و مقایسۀ دو تبارنمای ML و NJ با استفاده از مدل HKY و K₂P، این‌‌طور جمع‌بندی می‌‌شود که تمام این روش‌ها و مدل‌های مختلف آن دلالت بر این دارند که کلنی نمونه‌برداری‌‌شده در محدودۀ منطقۀ حفاظت‌شدۀ الموت شهرستان معلم‌‌کلایه استان قزوین ازنظر تبارشناختی به گونۀ B. leucomelas تعلق دارد. این گونه برای نخستین‌‌بار در ایران گزارش و توصیف می‌شود. بر این اساس، تعداد گونه‌های جنس بارباستل در ایران که تا پیش از این شامل دو گونۀ خفاش گوش‌پهن اروپایی و خزری (با فرض اینکه جمعیت‌های شمال شرق ایران متعلق به گونۀ B. capsica است) بود، به سه گونه ارتقاء پیدا می‌کند. با‌ توجه به اینکه کلنی ساکن در داخل و مجاور تونل شیرکوه، مهم‌‌ترین کلنی شناخته‌‌شده از جمعیت حال حاضر خفاش گوش‌پهن مصری در ایران است، حفاظت از زیستگاه خوراک‌جویی و زایشگاه آن در اولویت قرار دارد. با توجه به فعال‌‌بودن این تونل و ایجاد آلودگی صوتی توسط خودروهای عبوری و همچنین وجود فعالیت‌های راه‌سازی در محدودۀ زیستگاه خوراک‌جویی آن، احتمال بقای کلنی ساکن در تونل و سایر خوابگاههای (Roost) شناسایی‌‌شده در این زیستگاه، در معرض تهدید جدی قرار دارد. به‌‌منظور حفاظت از این گونۀ کمیاب، مدیران محیط زیست هرچه سریع‌تر باید برنامۀ حفاظتی ویژه‌ای برای این کلنی طراحی و اجرا کنند.

سپاسگزاری

نویسند‌گان از معاونت محیط طبیعی سازمان حفاظت محیط زیست به‌‌ویژه جناب آقای سید‌محمدرضا حسینی، از ادارۀ محیط زیست شهرستان آبیک به‌‌ویژه جناب آقای محسن خسرو‌آبادی، از جناب آقای عبدالحسین مظفری از بخش معاونت فنی، جناب آقای سیاوش رضازاده از ادارۀ حیات وحش، کارشناسان محترم سرمحیط‌بانی شهرستان معلم‌کلایه آقایان کیومرث قاسمی و حامد مرادی و همچنین از مدیر کل وقت ادارۀ ‌کل حفاظت محیط زیست استان قزوین جناب آقای حسن عباسی‌نژاد و مدیر ‌کل پیشین جناب آقای دکتر صدرالدین علیپور برای تسهیل در اخذ مجوز‌های مطالعه و فرآیند نمونه‌گیری سپاسگزاری و قدردانی می‌کنند؛ همچنین از آقایان مصطفی نور استانبولی، میثم مشایخی و دانیال نیری که در مرحلۀ نمونه‌برداری همکاری داشتند و آقای کاوه خسرویانی از شرکت سلول کاوشگر برای همکاری در مرحلۀ استخراج و توالی‌یابی نمونه‌ها سپاسگزاری می‌شود.