پیوندهای مفید
اخبار و اعلانات
آمار
| تعداد نشریات | 42 |
| تعداد شماره‌ها | 1,510 |
| تعداد مقالات | 12,450 |
| تعداد مشاهده مقاله | 24,648,258 |
| تعداد دریافت فایل اصل مقاله | 10,412,902 |
اثر فتانترن بر شاخص‌های فیزیولوژیک و القای تنش اکسیداتیو درگیاه آفتابگردان (Helianthus annuus) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| نشریه زیست‌شناسی گیاهی ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مقاله 3، دوره 13، شماره 2 - شماره پیاپی 48، شهریور 1400، صفحه 23-38 اصل مقاله (849.59 K) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| نوع مقاله: مقاله پژوهشی | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| شناسه دیجیتال (DOI): 10.22108/ijpb.2021.125100.1229 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| نویسندگان | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مریم نعمتی؛ سید یحیی صالحی لیسار* ؛ علی موافقی؛ روح اله متفکرآزاد | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| گروه علوم گیاهی، دانشکده علوم طبیعی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| چکیده | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| درحال‌حاضر، یکی از مشکلات زیست‌‌محیطی ورود ترکیبات آلاینده آلی پایدار نظیر ترکیبات آروماتیک چندحلقهای مانند فنانترن به محیط‌زیست است. در این پژوهش اثر غلظت‌های 0، 5 و100 میلی‌گرم بر لیتر از فنانترن بر شاخص‌های رشد، رنگیزه‌های فتوسنتزی، فعالیت برخی آنزیم‌های پاداکساینده و برخی فعالیت‌های بیوشیمیایی گیاهچه‌های 50 روزه آفتابگردان بررسی شد. بذرهای آفتابگردان در گلدان‌های حاوی پرلیت دارای غلظت‌های مختلف از فنانترن کشت شدند. سپس، گلدان‌ها به حد ظرفیت مزرعه‌ای توسط آب مقطر آبیاری شدند و به‌مدت 1 هفته در تاریکی قرار گرفتند. پس از جوانه‌زنی، دانه‌رست‌ها در فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی، دمای oC30-25، رطوبت 50-60 درصد و شدت نور 80 میکرومول بر مترمربع بر ثانیه قرار گرفتند و پس از 50 روز برداشت شدند. شاخص‌های رشدی گیاه آفتابگردان در سطح 100 میلی‌گرم بر لیتر فنانترن کاهش معنی‌داری نشان دادند. تیمار فنانترن باعث افزایش غلظت کلروفیل a و b و همچنین، کارتنوئیدها در گیاهان تیمارشده نسبت به نمونه‌های شاهد شد. غلظت ترکیبات پاداکسانیده غیرآنزیمی نیز در گیاهان تیمارشده با فنانترن تغییرات معنی‌داری نشان داد. فعالیت آنزیم‌های پاداکساینده سوپراکسیددیسموتاز، آسکوربات‌پراکسیداز و پراکسیداز به‌ویژه در ریشه افزایش معنی‌داری داشت. در مجموع، به نظر می‌رسد که سمیّت فنانترن باعث القای تنش اکسیداتیو در آفتابگردان می‌شود و گیاه سیستم پاداکسایشی آنزیمی را به منظور تعدیل شرایط تنش افزایش می‌دهد. همچنین، فنانترن از طریق آسیب رساندن به غشاهای سلولی در ریشه به تضعیف سیستم ریشه‌ای منجر می‌شود و باعث اختلال در جذب آب و مواد غذایی می‌گردد و در نهایت موجب کاهش شاخص‌های رشدی در گیاه آفتابگردان می‌شود. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| کلیدواژه‌ها | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| پراکسیداز؛ پراکسیداسیون لیپیدی؛ کاتالاز؛ هیدروکربن‌های آروماتیک چندحلقهای | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| اصل مقاله | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
مقدمه. آلودگی آب و خاک یکی از عوامل ایجاد اختلال در محیط‌زیست به شمار می‌رود (Naderi et al., 2012). هیدروکربن‌های نفتی گروه بزرگ و خطرناکی از آلاینده‌ها در محیط‌زیست هستند که تجمع آنها در زنجیره‌های غذایی نگرانی وسیعی را در سطح جهانی ایجاد کرده است. ازطرف‌دیگر، برخی از این ترکیبات حتی در مقادیر کم نیز سمّی هستند (Abd-elsalam et al., 2009) و دارای آثار منفی شناخته‌شده بر موجودات زنده از جمله توان سرطان زایی می‌باشند (Nikolaeva et al., 2021). هیدروکربن‌های آروماتیک چندحلقهای (PAHs) از جمله آلاینده‌های آلی هستند که عمدتاً از احتراق ناقص ترکیبات آلی تولید می‌شوند (Arslan et al., 2017). غلظت این ترکیبات در خاک 500 میلی‌گرم درکیلوگرم نیز گزارش شده است (Naderi et al., 2012). در میان آنها، 16 ترکیب به‌علت سرعت کم تجزیه توسط میکروارگانیسم‌ها و ایجاد سمیّت در محیط‌زیست، بیشتر مطرح هستند و به‌عنوان شاخص آلودگی برای این ترکیبات مطرح شده‌اند که از بین آنها می‌توان به نفتالین، فنانترن، پیرن و آنتراسن اشاره کرد (Tolosa et al., 2004). فنانترن در ساختار خود 3 حلقه آروماتیک دارد و نسبت به برخی دیگر از انواع PAHs دارای وزن ملکولی پایین‌تر و سمیّت کمتری است. این ترکیب ماده‌ای جامد و بی‌رنگ و تقریباً در آب نامحلول است، اما در تعدادی از حلال‌های آلی از قبیل اتانول، بنزن، متانول، تتراکلرید کربن و اسید استیک سرد حل می‌شود (Pradhan et al., 2003). تنش‌های زیستی و غیرزیستی با القای تولید و انباشت گونه‌های فعال اکسیژن سبب ایجاد آسیب‌های اکسیداتیو به پروتئین‌ها، اسیدهای نوکلئیک و سیستم‌های غشایی می‌شوند و با مهار انتقال الکترون و کاهش فعالیت فتوسنتزی باعث سمیّت در گیاه می‌گردند. بنابراین، سازوکارهای کاهش تنش اکسیداتیو در گیاهان نقش مهمی در ایجاد تعادل میان تولید و حذف گونه‌های فعال اکسیژن دارند (Anil-kumar et al., 2009). بافت‌های گیاهی به منظور بقا در شرایط تنش‌زا، در طول تکامل سیستم دفاعی آنزیمی و غیرآنزیمی خود را برای مقابله با تنش‌های اکسیداتیو گسترش داده‌اند (Esrefoglu, 2012). ترکیبات فنلی از اجزای سیستم پاداکساینده غیرآنزیمی با وزن مولکولی کم جزء متابولیت‌های ثانویه هستند و نقش مهمی در بر‌هم‌کنش بین گیاه و محیط ایفا می‌کنند. در مطالعه Posmyk و همکاران (2007) مشخص شده است که تولید این ترکیبات تحت تنش‌های شدید افزایش می‌یابد و آنها احتمالاً از گیاه محافظت می‌کنند. اما در برخی گونه‌ها، تیمار گیاهان با غلظت‌های بالای ترکیبات سمّی می‌تواند تولید متابولیت‌های ثانویه را کاهش دهد. این کاهش می‌تواند به‌علت سرکوبی آنزیم فنیل‌آلانین آمونیالیاز باشد (Creasy, 1976). فلاونوئیدها عمده‌ترین ترکیبات پلی‌فنلی هستند که از مسیر فنیل پروپانوئید سنتز می‌شوند و تولید آنها در شرایط تنش اکسیداتیو افزایش می‌یابد و نقش حفاظتی مهمی را در مقابل رادیکال‌های آزاد ایفا می‌کنند (Rice-evans et al., 1996). در تمام ارگانیسم‌های هوازی سوپراکسیددیسموتاز می‌تواند با تبدیل رادیکال سوپراکسید به هیدروژن‌پراکسید نقش حیاتی در سازوکارهای دفاعی سلول ایفا کند (Bowler et al., 1992). آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز با استفاده از آسکوربیک اسید در کلروپلاست، سیتوزول، میتوکندری و پراکسی‌زوم سلول‌های گیاهی واکنش تبدیل هیدروژن‌پراکسید به آب را کاتالیز می‌کند. این آنزیم هیدروژن لازم برای احیای هیدروژن‌پراکسید را از آسکوربات تأمین می‌کند و به‌ترتیب موجب تشکیل مونودهیدروآسکوربات اسید و دهیدروآسکوربات می‌گردد و آسکوربیک اسید برای شروع چرخه توسط آسکوربات‌ردوکتاز احیا می‌شود (Mittler, 2002). تحقیقات Liu و همکاران (2009) بر گونه آرابیدوپسیس (Arabidosis thaliana) نشان داده است که تیمار فنانترن سبب افزایش فعالیت آنزیم‌های آسکوربات‌پراکسیداز، سوپراکسیددیسموتاز و پراکسیداز می‌شود، ولی اثری بر فعالیت آنزیم کاتالاز ندارد. همچنین، ترکیبات آروماتیک چندحلقهای در غلظت‌های 02/0 تا 2 میکرومولار موجب کاهش جوانه‌زنی در گیاهان خردل، گندم و لوبیا می‌گردند (Banaszkiewicz et al., 2011). گیاهان می‌توانند هیدروکربن‌های آروماتیک چندحلقهای را از محیط جذب کنند (Yin et al., 2021) و تحقیقات نشان داده است گیاهانی که در حضور ترکیبات آروماتیک در داخل یا خارج از مناطق صنعتی رشد یابند از لحاظ تکوینی و فیزیولوژیک دچار اختلالاتی از قبیل تغییر شکل کرک‌ها، کاهش رشد ریشه و ساقه، تأخیر در گل‌دهی، رنگ‌پریدگی و پدیدار شدن نقطه‌های سفید رنگ روی برگ‌ها می‌شوند (Zhang et al., 2010). عدم وجود سیستم پاداکسایندگی قوی در گیاه سبب می‌شود که گیاهان به‌شدت تحت تأثیر آثار زیانبار هیدروکربن‌های آروماتیک چندحلقهای قرار گیرند (Kummerova et al., 2012). افزایش روز افزون فعالیت‌های صنعتی سبب آزاد‌سازی این ترکیبات به محیط‌زیست و موجب آسیب به گونه‌های گیاهی و در نهایت محصولات کشاورزی در آینده خواهد شد. هدف از این مطالعه، بررسی تأثیر غلظت‌های مختلف فنانترن، به‌عنوان یکی از فراوانترین PAHs در محیط‌های آلوده، بر رشد و پاسخ‌های بیوشیمیایی و فیزیولوژیک گیاه آفتابگردان است.
مواد و روش‌ها تهیه بذر: بذر گیاه آفتابگردان (Helianthus annuus L. رقم هیبرید فرخ) از مؤسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر کرج تهیه شد. برای جلوگیری از آلوده‌شدن گیاهان به قارچ به‌هنگام کشت در پرلیت، ابتدا بذرها با قارچ‌کش توپسین ام 70% آغشته شدند و تا زمان کاشت در دمای 4 درجه یخچال نگه‌داری گردیدند (Salehi-lisar et al., 2015). تیماردهی پرلیت و کشت و برداشت گیاهان: برای تهیه غلظت‌های مورد نظر از فنانترن (0، 50 و100 میلی‌گرم بر لیتر)، مقدار لازم از آن در اتانول حل شد و سپس محلول‌های به‌دست آمده به پرلیت اسپری گردیدند. پس از مخلوط کردن، پرلیت به‌مدت 48 ساعت در هوای آزاد قرار گرفت تا اتانول موجود در آن تبخیر شود. عمل تیمار کردن تنها یک‌بار و در شروع آزمایش انجام شد. بذرهای آفتابگردان ضدعفونی‌شده در گلدان‌های حاوی پرلیت تیمارشده با فنانترن و شاهد کشت شدند. پس از جوانه‌زنی، دانه‌رست‌ها در شرایط فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی، دمای 30- 25 درجه سانتیگراد، رطوبت 50-60 درصد و شدت نور 80 میکرومول بر مترمربع بر ثانیه قرار داده شدند. گیاهان پس از 50 روز برای انجام سنجش‌های مورد نظر برداشت شدند (Salehi-lisar et al., 2015). اندازه‌گیری شاخص‌های رشد: وزن تر اندام‌های هوایی و ریشه گیاهان آفتابگردان به‌وسیله ترازوی دیجیتال با دقت میلی‌گرم اندازه‌گیری شد و وزن خشک آنها با ترازوی دیجیتال حساس اندازه‌گیری شد. سنجش رنگیزه‌های فتوسنتزی: 1/0 گرم از بافت اندام هوایی گیاهان در 5 میلی‌لیتر استون 80% در هاون چینی له شد تا عصاره تهیه شود. سپس طیف جذب نوری عصاره‌ها، پس از صاف‌کردن با کاغذ صافی، در طول موج‌های 662، 645 و 470 نانومتر نسبت به شاهد توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل Spekol، شرکت Analytic Jena، آلمان) قرائت شد (Lichtenthaler, 1987). سنجش مالوندیآلدئید: عصاره گیاهی در محلول 1/0% (W/V) از تری‌کلرو‌استیک اسید (TCA) استخراج گردید و به‌مدت پنج دقیقه در g10000 سانتریفیوژ شد. همزمان، محلول‌های استاندارد با استفاده از 1 و1 و3 و3-تترا اتوکسی پروپان تهیه شد و جذب نمونه‌ها در طول موج 532 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر مورد سنجش قرار گرفت (Boominathan and Doran, 2003). اندازه‌گیری فنل و فلاونوئید کل: 1/0 گرم از نمونه گیاهی در 5 میلی‌لیتر متانول در یک هاون چینی ساییده شد. سپس به‌مدت 5 دقیقه در g10000 سانتریفیوژ گردید و روشناور برای سنجش فنل کل (Meda et al., 2005) و فلاونوئید کل بر اساس روش رنگ‌سنجی آلومینیوم کلرید (Chang et al., 2002)، مورد استفاده قرار گرفت. سنجش فعالیت آنزیم‌های پاداکساینده (پراکسیداز، کاتالاز، سوپراکسیددیسموتاز و آسکوربات‌پراکسیداز): برای تهیه عصاره آنزیمی نمونه‌های گیاهی با استفاده از بافر فسفات‌پتاسیم 50 میلی‌مولار و اسیدیته 7 هموژن شدند و به‌مدت 10 دقیقه در g10000 سانتریفیوژ گردیدند. فعالیت آنزیم پراکسیداز (EC1.11.1.7) مطابق روش Chance وMehly (1995) و از طریق تست گایاکول و اندازه‌گیری میزان تبدیل آن به تتراگایاکول سنجش شد. در نهایت فعالیت آنزیم بر اساس ضریب خاموشی تتراگایاکول (mM-1cm-1 5/25) محاسبه گردید. فعالیت آنزیم کاتالاز (EC1.11.1.6) مطابق روش Chance وMehly (1995) و بر اساس کاهش جذب نوری پراکسیدهیدروژن در طول موج240 نانومتر سنجش شد. در نهایت فعالیت آنزیم بر اساس ضریب خاموشی پراکسیدهیدروژن تجزیه و تحلیل آماری داده‌ها: تجزیه داده‌ها (تجزیه واریانس و مقایسه میانگین‌ها) توسط نرم‌افزار SPSS نسخه 16 با استفاده از روش دانکن با ضریب اطمینان 95 درصد (05/0p≤) انجام گرفت و برای رسم نمودارها از نرم‌افزار Excel نسخه 2016 استفاده شد.
نتایج و بحث شاخص‌های رشدی: تیمار فنانترن موجب کاهش رشد گیاه آفتابگردان شد (جدول 1) به‌طوری‌که کاهش 4/44 درصدی در طول اندام‌های هوایی در غلظت100 میلی‌گرم بر لیتر در مقایسه با گیاه شاهد مشاهده شد. وزن تر اندام‌های هوایی نیز تحت تأثیر غلظت‌های مختلف فنانترن کاهش نشان داد و در تیمارهای 50 و 100 میلی‌گرم بر لیتر از فنانترن کاهش معنیدار به‌ترتیب 3/85 و 9/92 درصدی نسبت به گیاهان شاهد مشاهده شد (05/0p≤). وزن خشک اندام‌های هوایی نیز کاهش معنی‌داری در گیاهان تیماریافته با فنانترن نشان داد. بیشترین کاهش در وزن خشک اندام‌های هوایی در غلظت 100 میلی‌گرم بر لیتر به میزان 9/38 درصد مشاهده شد (جدول 1). افزایش غلظت فنانترن باعث کاهش وزن تر، وزن خشک و طول ریشه شد (جدول 1). بیشترین کاهش طول ریشه در غلظت 100 میلی‌گرم بر لیتر فنانترن به میزان 45 درصد مشاهده شد. هرچند بین دو تیمار فنانترن اختلاف معنیدار وجود نداشت. وزن تر ریشه با افزایش غلظت فنانترن، کاهش معنی‌داری نشان داد و بیشترین کاهش در غلظت 100 میلی‌گرم بر لیتر (6/71 درصد) مشاهده شد (05/0p≤) (جدول 1). درباره وزن خشک ریشه نیز کاهش معنیدار 3/68 و 4/85 درصدی به ترتیب در تیمارهای 50 و 100 میلی‌گرم بر لیتر فنانترن نسبت به گیاه شاهد مشاهده شد (05/0p≤) (جدول 1). یکی از نخستین پاسخ‌های گیاهان به تنش‌های محیط کاهش رشد است (.(Zhang et al., 2011 در این مطالعه مشخص شد که فنانترن باعث کاهش درخور توجه رشد گیاه آفتابگردان می‌شود و بیشترین کاهش شاخص‌های رشد در غلظت100 میلی‌گرم بر لیتر مشاهده شد. در این میان کاهش طول ریشه‌چه حاکی از اثر بازدارندگی در جذب آب توسط بذر آفتابگردان است. در حقیقت، فنانترن ممکن است با اختلال تدریجی در رشدونمو و متابولیسم گیاه باعث کاهش طول ریشه‌چه و جذب آب و مواد غذایی شود (Askari-mehrabadi et al., 2011). تأثیر منفی فنانترن، پیرن و نفتالین با دوز بالا بر گیاه (سازو) (Juncus subsecundus) پیش از این توسط سایر محققان گزارش شده است (Askari-mehrabadi et al., 2011). در مطالعه دیگری تأثیر هیدروکربن‌ها بر چندین گیاه مختلف (کاهو، گندم، جو، لوبیا و شبدر) بررسی شد و مشخص گردیده است که خواص آبگریزی هیدروکربن‌های نفتی باعث کاهش فراهمی آب و مواد غذایی برای گیاه و نهایتاً کاهش طول ریشه‌چه می‌شود (Meudec et al., 2007). به نظر می‌رسد فنانترن نیز با کاهش طول ریشه‌چه باعث کاهش سایر شاخص‌های رشدی نظیر وزن خشک، وزن تر ریشه‌چه و ساقه‌چه شده است. کاهش نرخ رشد در گیاهان جو، ماشک و سورگوم تحت تیمار آنتراسن نیز گزارش گردیده است (Ahmadi et al., 2013). همچنین، سبحانی و همکاران (2020) کاهش شاخص‌های رشدی تحت تیمار فنانترن و پیرن را در گیاهان گندم گزارش کرده‌اند (Sobhani et al., 2020).
جدول 1- تأثیر فنانترن بر شاخص‌های رشدی گیاه آفتابگردان. Table 1- Effect of phenanthrene on growth parameters of sunflower.
داده‌ها میانگین سه تکرار ± خطای استاندارد هستند. حروف یکسان در هر ستون نشان‌دهنده عدم تفاوت معنیدار در سطح احتمال 5% است. Data are the mean of 3 replications ± standard error. Similar letters in each column indicate no significant difference (p ≤ 0.05).
رنگیز‌های فتوسنتزی: تیمار فنانترن در حالت کلی باعث افزایش غلظت رنگیزه‌های فتوسنتزی در گیاه آفتابگردان نسبت به گیاهان شاهد شد (جدول 2). بالاترین غلظت کلروفیل a در تیمار100 میلی‌گرم بر لیتر مشاهده شدکه نسبت به شاهد 9/118 درصد بیشتر بود. غلظت کلروفیل b افزایش 38/18 درصدی در تیمار50 میلی‌گرم بر لیتر نسبت به گیاهان شاهد نشان داد. محتوای کلروفیل کل در تیمار 50 میلی‌گرم بر لیتر از فنانترن تفاوت چندانی با گیاهان شاهد نداشت، اما در تیمار 100 میلی‌گرم بر لیتر افزایش معنی‌داری نشان داد. محتوای کاروتنوئید کل در تیمارهای 50 و 100 میلی‌گرم بر لیتر از فنانترن به‌ترتیب افزایش 43/136 و35/81 درصدی نسبت به گیاهان شاهد نشان داد (جدول2 ). تغییرات در محتوای رنگیزه‌ها به‌ویژه کلروفیل، اطلاعات ارزشمندی در مورد وضعیت فیزیولوژیک گیاهان می‌دهد (Shen et al., 2019) و یکی از عمومی‌ترین آثار ناشی از آلودگی‌ها در گیاهان، زرد شدن برگ‌ها است (Liu et al., 2009). در این پژوهش، تیمار با فنانترن موجب افزایش غلظت رنگیزه‌های فتوسنتزی شد که با نتایج پژوهش Ali و El-Yemeni (2010) بر گیاه قیچ که در پاسخ به آلودگی هوا مقدار کلروفیل a، b و کل افزایش یافت، همسو بود. افزایش غلظت رنگیزه‌های فتوسنتزی احتمالاً به‌علت کاهش رشد گیاهان تیمارشده با فنانترن است (Alidadi-Khaliliha et al., 2016). کارتنوئیدها علاوه بر نقش ساختاری وظایف دیگری از قبیل حفاظت از سیستم فتوسنتزی، کمک به پایداری پروتئین جمع‌کننده نور و همچنین، حفاظت در مقابل رادیکال‌های آزاد را بر عهده دارند (Joshi and Swami, 2009). در این پژوهش، میزان کارتنوئیدها در گیاهان تحت تیمار در مقایسه با شاهد روند افزایشی داشت که می‌تواند بهترین توجیه برای حفاظت رنگیزه کلروفیل باشد.
جدول 2- اثر غلظت‌های مختلف فتانترن بر غلظت رنگیزه‌های فتوسنتزی گیاه آفتابگردان. Table 2- Effect of different phenanthrene concentrations on photosynthetic pigments contents of sunflower.
داده‌ها میانگین سه تکرار ± خطای استاندارد هستند. حروف یکسان در هر ستون نشان‌دهنده عدم تفاوت معنیدار در سطح احتمال 5% است. Data are the mean of 3 replications ± standard error. Similar letters in each column indicate no significant difference (p ≤ 0.05).
غلظت مالوندیآلدئید: غلظت مالوندیآلدئید در اندام‌های هوایی گیاهان تیمارشده با فنانترن به‌صورت معنی‌داری کاهش یافت (05/0p≤). میزان این کاهش در تیمارهای 50 و 100 میلی‌گرم بر لیتر به‌ترتیب 06/52 و 9/86 درصد بود. فنانترن در ریشه باعث افزایش معنیدار 45/99 درصدی غلظت مالوندیآلدئید در تیمار100 میلی‌گرم بر لیتر نسبت به گیاهان شاهد شد (05/0p≤) (شکل 1). اکسیداسیون لیپیدها از جمله آسیب‌هایی است که در اثر تنش اکسیداتیو ایجاد می‌شود و یکی از محصولات نهایی آن یعنی مالوندیآلدئید، به‌عنوان شاخصی برای ارزیابی شدت تنش در نظر گرفته می‌شود. اختلال در متابولیسم که به عدم تعادل در تولید و مصرف رادیکال‌های آزاد در سلول‌ها منجر می‌شود، به‌تدریج باعث افزایش غلظت این ترکیبات می‌گردد (Panda and Choudhury, 2005). در این پژوهش، مشاهده شد که تغییر غلظت مالوندیآلدئید در ریشه و اندام‌های هوایی گیاهان آفتابگردان تیمارشده با فنانترن کاملاً متفاوت است. به‌عبارت‌دیگر، در ریشه با افزایش غلظت فنانترن محتوای مالوندیآلدئید افزایش یافت و در اندام‌های هوایی کاهش نشان داد (شکل 1). این نتایج مؤید این مطلب است که سیستم پاداکسایشی ریشه گیاه آفتابگردان در غلظت پایین فنانترن به‌خوبی توانایی از بین بردن رادیکال‌های آزاد را داراست و مانع از خسارت اکسیداتیو به گیاه می‌شود، درحالی‌که تجمع بالای گونه‌های فعال اکسیژن آزاد در غلظت‌های بالای فنانترن بر سیستم پاداکسایشی گیاه غلبه کرده و به پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی منجر شده است. نتایج مشابهی در مطالعه تأثیر فنانترن روی گل‌سرخ گزارش شده است (Bhuyan et al., 2020).
شکل1- محتوای مالوندیآلدئید در ریشه (الف) و اندام هوایی (ب) گیاه آفتابگردان. داده‌ها میانگین سه تکرار ± خطای استاندارد هستند. حروف یکسان در هر ستون نشان‌دهنده عدم تفاوت معنیدار در سطح احتمال 5% است. Figure 1- Malondialdehide content in roots (A) and shoot (B) of sunflower. Data are the mean of 3 replications ± standard error. Similar letters on each column indicate no significant difference (p ≤ 0.05).
محتوای فنل کل: محتوای ترکیبات فنلی به‌طور معنی‌داری در گیاهان تیمارشده با فنانترن کاهش یافت (05/0p≤) به‌طوری‌که در ریشه و اندام‌های هوایی گیاهان تیمارشده با100 میلی‌گرم بر لیتر از فنانترن محتوای آنها به‌ترتیب 73/27 و 35/22 درصد نسبت به شاهد کاهش یافت (شکل 2). محتوای فلاونوئید کل: تیمار فنانترن باعث کاهش معنیدار محتوای فلاونوئید کل در ریشه و اندام‌های هوایی گیاهان تیمارشده نسبت به گیاهان شاهد شد (05/0p≤)، به‌طوری‌که در تیمار 100 میلی‌گرم بر لیتر از فنانترن محتوای این ترکیبات در ریشه 75 درصد و در اندام‌های هوایی50 درصد کاهش یافت (شکل 3). ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی از متابولیت‌های ثانویه هستند که به فراوانی در بافت‌های گیاهی یافت می‌شوند و دارای نقش‌هایی از قبیل شرکت در مکانیسم‌های دفاعی گیاه، دخیل در ساخت دیواره‌ی سلولی و در ویژگی‌هایی مانند رنگ، عطر و طعم مؤثر هستند .(Hernandez et al., 2006) در شرایط تنش اکسیداتیو، فلاونوئیدها می‌توانند به تولید ترکیبات جاروب‌کننده مانند سمی‌کوئینون‌ها منجر شوند و کاتالیز واکنش فوق در گیاهان بر عهده آنزیم‌های پلی‌فنل‌اکسیداز است. در واقع ترکیبات فنلی به‌عنوان سوبسترای آنزیم‌های پاداکساینده مانند پراکسیدازها مورد مصرف قرار می‌گیرند (Paskova et al., 2006). در پژوهش حاضر، تنش فنانترن سبب افزایش فعالیت آنزیم پراکسیداز در اندام هوایی و ریشه گیاه آفتابگردان شده است و این افزایش به موازات کاهش ترکیبات فنلی است. احتمالاً آنزیم پراکسیداز برای مقابله با گونه‌های فعال اکسیژن آزاد ناشی از تنش فنانترن، از اکسیداسیون ترکیبات فنلی به‌عنوان سوبسترا استفاده کرده و به کاهش این ترکیبات منجر شده است.
شکل 2- محتوای فنل کل در ریشه (الف) و اندام‌های هوایی (ب) گیاه آفتابگردان. داده‌ها میانگین سه تکرار ± خطای استاندارد هستند. حروف یکسان در هر ستون نشان‌دهنده عدم تفاوت معنیدار در سطح احتمال 5% است. Figure 2- Total phenol content in roots (A) and shoot (B) of sunflower. Data are the mean of 3 replications ± standard error. Similar letters on each column indicate no significant difference (p ≤ 0.05).
شکل3- محتوای فلاونوئید کل در ریشه (الف) و اندام‌های هوایی (ب) گیاه آفتابگردان. داده‌ها میانگین سه تکرار ± خطای استاندارد هستند. حروف یکسان در هر ستون نشان‌دهنده عدم تفاوت معنیدار در سطح احتمال 5% است. Figure 3- Total flavonoids content in roots (A) and shoot (B) of sunflower. Data are the mean of 3 replications ± standard error. Similar letters on each column indicate no significant difference (p ≤ 0.05).
فعالیت آنزیم‌های پاداکساینده: فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز در اندام‌های هوایی و ریشه گیاه آفتابگردان به‌صورت معنی‌داری با تیمار فتانترن افزایش یافت، به‌طوری‌که فعالیت آن در ریشه و اندام‌های هوایی گیاهان تیمارشده با 100 میلی‌گرم بر لیتر از فنانترن نسبت به گیاهان شاهد به‌ترتیب 1/74 و 3/171 درصد بیشتر بود (شکل 4). آنزیم پراکسیداز در ریشه و اندام‌های هوایی گیاه آفتابگردان تیمارشده با فنانترن در مقایسه با گیاهان شاهد افزایش معنی‌داری نشان داد ولی بین تیمارها (در اندام هوایی) اختلاف معنیدار وجود نداشت (05/0p≤). در تیمار 100 میلی‌گرم بر لیتر فنانترن فعالیت آنزیم در ریشه و اندام هوایی گیاهان تیمارشده نسبت به گیاهان شاهد به‌ترتیب 59/53 و 81/70 درصد افزایش یافت (شکل 5). فنانترن باعث کاهش معنیدار در فعالیت آنزیم کاتالاز ریشه و اندام هوایی گیاهان آفتابگردان شد، به‌طوری‌که کمترین فعالیت آنزیم در تیمار 100 میلی‌گرم بر لیتر از فنانترن مشاهده شد که در مقایسه با گیاهان شاهد در ریشه 5/96 درصد و در اندام‌های هوایی 5/93 درصد کاهش داشت (شکل 6).تیمار فنانترن در غلظت 50 میلی‌گرم بر لیتر باعث افزایش معنیدار فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز ریشه و اندام‌های هوایی گیاهان آفتابگردان نسبت به گیاهان شاهد شد که به‌ترتیب 4/93 و 4/50 درصد بود (05/0p≤) (شکل7). اما غلظت 100 میلی‌گرم بر لیتر فنانترن باعث کاهش فعالیت این آنزیم در ریشه و اندام‌های هوایی گیاهان تیمارشده گردید که در اندام‌های هوایی معنیدار بود (05/0p≤). سوپراکسیددیسموتاز یکی از مهم‌ترین آنزیم‌های فعال در سیستم دفاعی پاداکسایندگی برای مقابله با تنش اکسیداتیو است (Shahid et al., 2014). در این پژوهش، میزان فعالیت آنزیم در اثر تیمار فنانترن در ریشه و اندام‌های هوایی گیاه افزایش نشان داد و به نظر می‌رسد افزایش فعالیت این آنزیم در گیاهان تیمارشده با فنانترن یک مکانیسم دفاعی مهم در گیاه آفتابگردان باشد. افزایش فعالیت این آنزیم در گیاهان برنج تیمارشده با فنانترن و پیرن نیز گزارش شده است که مؤید نتایج کار این پژوهش است (Lin et al., 2009). تنش‌ها عموماً باعث تجمع پراکسیدهیدروژن در گیاهان می‌شوند که در غلظت‌های بالا برای سلول‌ها سمّی است (Unyayar et al., 2005). در گیاهان سمیّت‌زدایی از پراکسیدهیدروژن نیاز به فعالیت گروه بزرگی از آنزیم‌های پاداکساینده از قبیل پراکسیدازها دارد که واکنش‌های اکسیداسیون-احیا را کاتالیز می‌کنند (Ghanati and Nemati, 2010). بنابراین، با افزایش سطح فعالیت این آنزیم‌ها که در پراکسی‌زوم، کلروپلاست، واکوئل و آپوپلاست حضور دارند، از آثار سمّی گونه‌های اکسیژن آزاد بر گیاه جلوگیری می‌شود (Foyer and Noctor, 2005). ازاین‌رو، در این پژوهش افزایش فعالیت پراکسیدازها که در راستای تجزیه پراکسیدهیدروژن عمل می‌کنند، منطقی است. دراین‌میان، تمایل آسکوربات‌پراکسیداز به پراکسیدهیدروژن زیاد است، زیرا حتی در غلظت 50 میلی‌گرم بر لیتر فنانترن، پراکسیدهیدروژن تولیدی که طی فعالیت کاتالاز حذف نشده است را جاروب می‌کند (Ghanati and Nemati, 2010). در پژوهش حاضر، افزایش معنیدار فعالیت آسکوربات‌پراکسیداز در اندام هوایی و همچنین، ریشه گیاه به‌ویژه در تیمار50 میلی‌گرم بر لیتر فنانترن بیانگر این است که فعالیت آنزیم کاتالاز در پراکسی‌زوم نتوانسته است بر میزان پراکسیدهیدروژن تولیدی توسط سوپراکسیددیسموتاز غلبه کند و گیاه با بالابردن میزان فعالیت آسکوربات‌پراکسیداز حتی در غلظت کم به منظور سمیّت‌زدایی مؤثر پراکسیدهیدروژن عمل کرده است. در گندم، یونجه و آفتابگردان تحت تیمار فنانترن، کاهش فعالیت کاتالاز گزارش شده است (Salehi-lisar and Deljoo, 2015).
شکل4- فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز در ریشه (الف) و اندام هوایی (ب) گیاه آفتابگردان. داده‌ها میانگین سه تکرار ± خطای استاندارد هستند. حروف یکسان در هر ستون نشان‌دهنده عدم تفاوت معنیدار در سطح احتمال 5% است. Figure 4- Superoxide dismutase (SOD) activity in roots (A) and shoot (B) of sunflower. Data are the mean of 3 replications ± standard error. Similar letters on each column indicate no significant difference (p ≤ 0.05).
شکل5- فعالیت آنزیم پراکسیداز در ریشه (الف) و اندام هوایی (ب) گیاه آفتابگردان. داده‌ها میانگین سه تکرار ± خطای استاندارد هستند. حروف یکسان در هر ستون نشان‌دهنده عدم تفاوت معنیدار در سطح احتمال 5% است. Figure 5- Peroxidase (POD) activity in roots (A) and shoot (B) of sunflower. Data are the mean of 3 replications ± standard error. Similar letters on each column indicate no significant difference (p ≤ 0.05).
شکل6- فعالیت آنزیم کاتالاز در ریشه (الف) و اندام هوایی (ب) گیاه آفتابگردان. داده‌ها میانگین سه تکرار ± خطای استاندارد هستند. حروف یکسان در هر ستون نشان‌دهنده عدم تفاوت معنیدار در سطح احتمال 5% است. Figure 6- Catalase (CAT) activity in roots (A) and shoot (B) of sunflower. Data are the mean of 3 replications ± standard error. Similar letters on each column indicate no significant difference (p ≤ 0.05).
شکل7- فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز در ریشه (الف) و اندام هوایی(ب) گیاه آفتابگردان. داده‌ها میانگین سه تکرار ± خطای استاندارد هستند. حروف یکسان در هر ستون نشان‌دهنده عدم تفاوت معنیدار در سطح احتمال 5% است. Figure 7- Ascorbate peroxidase (APX) activity in roots (A) and shoot (B) of sunflower. Data are the mean of 3 replications ± standard error. Similar letters on each column indicate no significant difference (p ≤ 0.05).
جمع‌بندی: افزایش فعالیت آنزیم‌های پاداکساینده در اثر تیمار فنانترن، نشان‌دهنده تنش اکسیداتیو ناشی از این ترکیب است. اما کاهش میزان فعالیت کاتالاز و از بین نرفتن پراکسیدهیدروژن تولیدی در اثر تنش حاکی از کاهش مقاومت گیاه آفتابگردان نسبت به این ترکیب است. ازطرف‌دیگر، کاهش میزان پراکسیداسیون لیپیدها در اندام هوایی و به دنبال آن افزایش میزان آن در ریشه نیز نشان‌دهنده‌ی تجمع بیشتر فنانترن در ریشه است که با تضعیف سیستم ربشه‌ای گیاه، در جذب آب و مواد غذایی اختلال ایجاد کرده است و در نهایت به کاهش شاخص‌های رشد گیاه آفتابگردان منجر شده است.
سپاسگزاری: نگارندگان از دانشگاه تبریز برای تأمین مالی و امکانات آزمایشگاهی در اجرای این پژوهش صمیمانه قدردانی می‌نمایند. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مراجع | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Abd-elsalam, H. E., Hafez, E. E., Hussain, A. A., Ali, A. G. and El-Hanafy, A. A. (2009) Isolation and identification of three-ring polycyclic aromatic hydrocarbons (Anthracene and Phenanthrene) degrading bacteria. American-Eurasian Journal of Agriculturaland Environmental Science 5: 31-38.
Ahmadi, M., Alipour, Z. T. and Farrokhian-Firuzi, A. (2013) Investigation of the possibility of phytoremediating a soil contaminated with Anthracene. Journal of Chemical Health Risks 3(3): 69-76.
Alidadi-Khaliliha, M., Dordipour, E. and Barani-Motlagh, M. (2016) Interactive effect of iron and lead on growth and their uptake in Cress (Lepidium sativum L.). Journal of Soil Management and Sustainable Production 5(4): 41-59.
Ali, A. A. and El-Yemeni, M. N. (2010) Atmospheric air pollution effects on some exhibited plants at Aljubail industrial City, Ksa. I-physiological characteristics and antioxidant enzymes. Australian Jounal of Basic and Applied Science 4(16): 1251-1263.
Anil-Kumar, K., Varaprasad, P. and Vijaya-Bhaskarroa, A. (2009) Effect of fluoride on catalase, guiacol peroxidase and ascorbate oxidase activities in two verities of mulberry leaves (Morus alba L.). Journal of Earth Science 1(2): 69-73.
Arslan, M., Imran, A., Mahmood-Khan, Q. and Afzal, M. (2017) Plant-bacteria partnerships for the remediation of persistent organic pollutants. Environmental Science and Pollution Research 24: 4322-4336.
Askari-Mehrabadi, M., Noori, M., Amini, F. and Beigi, F. (2011) Evaluation of germination, growth and chlorophyll content of (Rubinia pseudoacacia L.) as affected by petroleum pollution. Iranian Journal of Plant Biology 7(3): 41-56. (in Persian).
Banaszkiewicz, T., Szarek, J. and Wysocki, K. (2011) Biological evaluation of soil contamination around a non-operating pesticide tomb. Journal of Environmental Studies 1(20): 485-488.
Bhuyan, K., Patar, A., Singha, U., Giri, S. and Giri, A. (2020) Phenanthrene alters oxidative stress parameters in tadpoles of Euphlyctis cyanophlyctis (Anura, Dicroglossidae) and induces genotoxicity assessed by micronucleus and comet assay. Environmental Science and Pollution Research 27(17): 20962-20971.
Boominathan, R. and Doran, P. M. (2003) Ni induced oxidative stress in roots of the Ni hyper accumolator, (Alyssum bertoloni). New Phytologist 101(2): 131-146.
Bowler, C., Montagu, M. V. and Inez, D. (1992) Superoxide dismutase and stress tolerance. Annual Review of Plant Biology and Plant Molecular Biology 43(1): 83-116.
Chanes, B. and Mahely, A. C. (1995) Assay of catalase and peroxidase. Methods in Enzymology 2: 764-791.
Chang, C. C., Yang, M. H, Wen, H. M. and Chern, J. C. (2002) Estimation of total flavonoid content in propolis by two complementary colorimetric methods. Journal of Food and Drug Analysis 10: 178-182.
Creasy, L. L. (1976) Phenylalanine ammonium lyase inactivating system in sunflower system in sunflower leaves. Phytochemistry 15(5): 673-675.
Esrefoglu, M. (2012) Experimental and clinical evidence of antioxidant therapy in acute pancreatitis. World Journal of Gastroenterology 18(39): 5533-5541.
Foyer, C. H. and Noctor, G. (2005) Redox homeostis and antioxidant signaling. A metabolicinterface between stress perception and physiological responses. Plant Cell 17(7): 1866-1875.
Ghanati, F. and Nemati, F. (2010) The positive effect of aluminum on activating the antioxidant system of lisianthus (Eustoma grandiflora L.) roots. Iranian Journal of Plant Biology 2(2): 41-53. (in Persian).
Hernandez, I., Alegre, L. and M-Bosch, S. (2006) Enhanced oxidation of Flavan-3-ols and pro anthocyanidin accumulation in water stressed tea plants. Photochemistry 67(11): 1120-1126.
Joshi, P. C. and Swami, A. (2009) Air pollution induced changes in the photosynthetic pigments of selected plant species. Journal of Environmental Biology 30(2): 295-298.
Kummerova, M., Zezulka, S., Vanova, L. and Fiserova, H. (2012) Effect of organic pollutant treatment on the growth of pea and maize seedlings. Open Life Science 7(2): 159-166.
Lichtenthaler, H. K. (1987) Chlorophylls and carotenoids, the pigments of photosynthetic biomembranes. Methods in Enzymology 148: 350-382.
Lin, C. C., Liu, J., Liu, L., Zhu, T. C., Sheng, L. X. and Wang, D. L. (2009) Soil amendment application frequency contributes to phytoextraction of lead by sunflower at different nutrient levels. Environmental and Experimental Botany 65(2-3): 410-416
Liu, H. D., Weisman, Y. B., Ye, B., Cui, Y. H., Huang, A. and Colon-Carmona, Z. H. (2009) An oxidative stress response to polycyclic aromatic hydrocarbon exposure is rapid and complex in (Arabidopsis thaliana). Journal of Plant Science 176(3): 375-382.
Meda, A., Lamien, C. E., Romito, M., Millogo, J. and Nacoulma, O. G. (2005) Determination of the total phenolic, flavonoid and pralin contents in Burkina fasan honey, as well as their scavenging activity. Food Chemistry 91(3): 571-577.
Meudec, A., Poupart, N., Dussauze, J. and Deslandes, E. (2007) Relationship between heavy fuel oil phytotoxicity and polycyclic aromatic hydrocarbon contamination in Salicornia Fragilis. Science of the Total Environment 381(1-3): 146-156.
Mittler, R. (2002) Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends in Plant Science 7(9): 405-410.
Naderi, M., Danesh-shahraki, A. and Naderi, R. (2012) An overview of the phytoremediation of soils contaminated with heavy metals. Journal of Human Environment 22: 26-38. Nikolaeva, O., Karpukhin, M., Streletskii, R., Rozanova, M., Chistova, O. and Panina, N. (2021). Linking pollution of roadside soils and ecotoxicological responses of five higher plants. Ecotoxicology and Environmental Safety 208: 1-9.
Panda, S. K. and Choudhury, S. (2005) Changes in nitrate reductase activity and oxidative stress response in the moss polytrichum commune subjected to chromium, copper and zinc toxicity. Brazilian Journal of Plant Physiology 17(2): 191-197.
Paskova, V., Hilscherova, K. Felmannova, M. and Blaha, L. (2006) Toxic effects and oxidative stress in higher plants exposed to polycyclic aromatic hydrocarbons and their n-heterocyclic derivatives. Environmental Toxicology and Chemistry 25(12): 3238-3245.
Posmyk, M. M., Kontek, R. and Janas, K. M. (2007) Effect of anthocyanin-rich red cabbage extract on cytological injury induced by copper stress in plant and animal tissues. Environmental Protection of Natural of Sources 33: 50-56.
Pradhan, J. R., Conrad, J. R. and Paterek, S. (2003) Potential of phytoremediation for treatment of PAHs in soil at MGP sites. Soil and Sediment Contamination 7: 467-48.
Rice-Evans, C. A., Miller, J. M. and Paganga, G. (1996) Structure antioxidant activity relationship of flavonoids and phenolic acids free radical. Biology and Medicine 20: 933-956.
Salehi-Lisar, S. Y., Deljoo, S. and Harzandi, A. M. B. (2015) Fluorene and phenanthrene uptake and accumulation by wheat, alfalfa and sunflower from the contaminated soil. International Journal of Phytoremediation 17: 1145-1152.
Salehi-Lisar, S. Y. and Deljoo, S. (2015) Physiological effect of phenanthrene on Triticum aestivum, Helianthus annuus and Medicago sativa. Eurasian Journal of Biosciences 9(1): 29-37.
Shahid, M., Pourrut, B., Dumat, C., Nadeem, M., Aslam, M., and Pinelli, E. (2014) Heavy-metal induced reactive oxygen species: phytotoxicity and physicochemical changes in plants. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology 232: 1-44.
Shen, Y., Li, J., Gu, R., Zhan, X. and Xing, B. (2019) Proteomic analysis for phenanthrene-elicited wheat chloroplast deformation. Environment International 123: 273-281.
Sobhani, A., Salehi, L. S. and Movafeghi, A. (2020) Comparative study of the phenanthrene and pyrene effects on germination, growth and antioxidant enzymes activity on wheat seedlings (Triticum aestivum L.). Journal of Plant Ecophysiology 39(11): 136-137.Tolosa, I. D. E., Mora, S. J., Fowler, S. W., Villeneuve, J., Bartocci, J. and Cattini, C. (2004) Aliphatic and aromatic hydrocarbons in marine biota and coastal sediments from the Persian Gulf and the Gulf of Oman. Marine pollution Bulletin 50: 1619-1633.
Unyayar, S., Kel, Y. and Cekic, F. O. (2005) The antioxidative response of two tomato specieswith different drought tolerances as a result of drought and cadmium stress combinations. Plant Soil and Environment 51: 57-64.
Wang, Y., Tian, Z., Zhu, H., Cheng, Z., Kang, M., Luo, C., Li, j. and Zhang, G. (2012) Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in soils and vegetation near an e-waste recycling site in south china: concentration, distribution, source, and risk assessment. Science of Total Environment 439: 187-93.
Yin, S., Tian L., Ma, Y. Tan, H., Xu, L., Sun, N., Meng, H. and Liu, C. (2021) Sources and sinks evaluation of PAHs in leaves of Cinnamomum camphorain megacity: From the perspective of land-use types. Journal of Cleaner Production 279: 1-9.
Zhang, Zh., Rengel, Z. and Meney, K. (2010) Polynuclear aromatic hydrocarbons (PAHs) differentially influence growth of various emergent wetland species. Journal of Hazardous Materials 182: 689-695.
Zhang, X. X., Liu, S., Liu, F., Liu, L., Chen, G., Xu, C., Zhong, P. and Cao, S. U. Z. (2011) Responses of (Scirpus triqueter), soil enzymesand microbial community during phytoremediation of pyrene contaminated soil in simulated wetland. Journal of Hazardous. Materials 193: 45-51.
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
آمار تعداد مشاهده مقاله: 233 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 130 |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||