جداسازی و شناسایی اکتینوباکترهای تولیدکنندة آنتی‌بیوتیک از ساحل خلیج فارس

مقدمه

محیط زیست دریایی یک منبع تا حد زیادی ناشناخته برای جداسازی میکروب‌های جدید مانند باکتری‌ها، قارچ‌ها، اکتینوباکتری‌ها، جلبک‌های ریز، سیانوباکتری‌ها و دیاتومه‌ها محسوب می‌شود که تولیدکنندة مهم متابولیت‌های ثانویه فعال زیستی‌اند (1). مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌ها به دنبال مصرف بی‌رویه آنها به شدت درحال گسترش است؛ بنابراین، همین موضوع ضرورت کشف ترکیبات دارویی جدید را پیشنهاد می‌کند. تقریباً نیمی از تنوع زیستی کره زمین مربوط به موجودات دریایی است؛لذا، گفتنی است دریا منبع غنی از ترکیبات جدید است. به‌منظور پیشرفت در زمینة فعالیت‌های داروسازی، دریا مخزنی از مولکول‌های طبیعی با ارزش به شمار می‌آید؛ بنابراین، می‌توان اذعان کرد محیط‌های دریایی به‌طور عمده منبع مناسبی برای جداسازی میکروارگانیسم‌های جدید با توانایی تولید متابولیت‌های فعال ثانویه‌اند. از میان این میکروارگانیسم‌ها، اکتینوباکتری‌ها اهمیت ویژه‌ای دارند؛ زیرا تولیدکنندة ترکیبات شیمیایی متنوعی با طیف وسیعی از فعالیت‌های زیستی‌اند (2). واکسمن^[1] کشف کرد باکتری‌های خاک مورد مطالعة او تولیدکنندة اکتینومایسین هستند و اولین آنتی‌بیوتیک خالص از یک اکتینوباکتریوم به نام استرپتومایسس آنتی‌بیوتیکوس^[2] به دست آمدگذاشته شود. بعدها واکسمن و آبراهام^[3] کشف کردند استرپتومایسین توسط استرپتومایسس گریزئوس^[4] تولید می‌شود و برای نخستین‌بار این دارو برای درمان سل استفاده شد (3). اکتینوباکتری‌ها، باکتری‌های رشته‌ای و گرم مثبت‌اند که ازنظر اقتصادی و زیست فناوری ارزشمندترین پروکاریوت‌ها محسوب می‌شوند. این میکروارگانیسم‌ها قادر به تولید طیف گسترده‌ای از ترکیبات فعال زیستی مانند عوامل ضدتومور، عوامل سرکوب‌کنندة ایمنی، آنزیم‌ها و آنتی‌بیوتیک‌ها هستند (4، 5، 6)؛ برای مثال، بوناکتین^[5] یک ترکیب جدید است که از محیط کشت مایع استرپتومایسس سویة ^[6]BD21-2 جداسازی‌شده از نمونة رسوبات کم عمق ساحل کائوآئی^[7]، اواهو^[8] و هاوایی^[9] به دست آمده است. این ترکیب فعالیت ضدباکتریایی علیه هر دو گروه باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی نشان داده است و فعالیت ضدقارچی نیز دارد (7). تریواکساکارسین‌های^[10]A ، B و C از استرپتومایسس اوکراسئوس^[11] و استرپتومایسس بوتروپنسیس^[12] به دست آمده‌اند. این ترکیبات علیه رده‌های سلول‌های سرطانی مختلف فعالیت سیتوتوکسیک داشته و همچنین فعالیت علیه باکتری‌های گرم مثبت و منفی نیز نشان داده‌اند. تریواکساکارسین A1 و A2 فعالیت ضدقارچی را هم نشان داده‌اند. پس از انجام بررسی‌ها مشخص شد برخی تریواکساکارسین‌ها فعالیت ضدمالاریایی زیادی به نمایش می‌گذارند که تاکنون ناشناخته بوده است (8). در همین راستا این مطالعه به‌منظور جداسازی و شناسایی اکتینوباکتری‌های تولیدکنندة آنتی‌بیوتیک ناحیه شمالی خلیج فارس (سواحل بوشهر) و بررسی کارایی متابولیت‌های ثانویه جداشده از آنها علیه سویه‌های بیماری‌زا و سویه‌های استاندارد انجام گرفت. علاوه بر این، انتخاب و گزارش چندین سویة برتر تولید‌کنندة آنتی‌بیوتیک از بین سویه‌های جداشده انجام شد.

مواد و روش‌ها.

نمونه‌برداری: نمونه‌برداری از ساحل انرژی اتمی بندر بوشهر (اسکله صیادی بندرگاه) با طول جغرافیایی 49ˊ38°28 و عرض جغرافیایی 54ˊ44°05 صورت گرفت. با استفاده از مولتی‌متر، pH، میزان اکسیژن محلول، دما و شوری آب اندازه‌گیری شد. مشخصات محل نمونه‌برداری (ساحل سازمان انرژی اتمی بوشهر) این پروژه در جدول شماره 1 آورده شده است.

جدول 1- وضعیت محل نمونه‌برداری

برای نمونه‌برداری از آب از واتر سمپلر و برای رسوب از گرپ^[13] استفاده شد. نمونه‌برداری از 4 ایستگاه و در چهار عمق مختلف (5/1، 5/2، 3 و 5 متر) صورت گرفت. در مجموع 30 نمونه آب و رسوب (21 نمونه آب و 9 نمونه رسوب) جمع‌آوری شدند (جدول 2).

.جداسازی باکتری‌ها از نمونه‌های آب و رسوب: جداسازی باکتری‌ها از نمونه‌ها طی مراحلی ازجمله تیمار حرارتی، تیمار شیمیایی، رقت‌سازی و غنی‌سازی انجام شد.

الف. تیمار حرارتی: برای تیمار حرارتی، نمونه‌های رسوب به مدت یک ساعت در آون 55 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند تا خشک شوند. سپس با کوبیدن، به‌صورت پودر درآورده و از الک عبور داده شد. این کار با هدف آزادشدن اسپورهای متصل به ذرات انجام شد. سپس 5 گرم از نمونه خشک‌شده به همراه کربنات کلسیم (CaCO₃) در 45 میلی‌لیتر آب دریای فیلترشده، حل و به مدت یک ساعت مخلوط شد. درنهایت، بعد از ته‌نشینی، 100 میکرولیتر از مایع رویی به محیط‌های جامد ساخته‌شده تلقیح شد (9، 10).

جدول 2- نوع نمونه‌ها و عمق برداشت آنها

ب‌. تیمار شیمیایی: به‌منظور تیمار شیمیایی، کربنات کلسیم به میزان 100 میلی‌گرم بر گرم به نمونه‌ها اضافه شد (9).

ج. رقت‌سازی: یک گرم از نمونه‌های رسوب تهیه‌شده به روش بالا به ارلن‌مایرهای 250 میلی‌لیتری حاوی 50 میلی‌لیتر آب دریای استریل اضافه شد و ارلن‌مایرها به مدت نیم ساعت برای جداسازی زنجیره‌های اسپور مخلوط شدند. بعد از ته‌نشینی ذرات معلق، از مایع رویی رقت‌های ^1-10 تا ^6-10 تهیه شد. درنهایت، 1 میلی‌لیتر از مایع رویی هریک از رقت‌ها کشت داده شد (11).

د. غنی‌سازی: قبل از کشت نمونه‌ها در محیط جامد، غنی‌سازی در محیط مایع با هدف جداسازی میکروارگانیسم‌های کم تراکم انجام شد. برای این منظور در ارلن‌مایرهای 250 میلی‌لیتری، 50 میلی‌لیتر محیط نشاسته - کازئین براث  (SCB)و عصاره مخمر - عصاره مالت براث ((ISP2 ریخته شد. سپس 5 میلی‌لیتر از هرکدام از نمونه‌ها (نمونه‌های آب و سوسپانسیون رسوب) به محیط‌های غنی‌سازی تلقیح شد. کلیه نمونه‌های تلقیح‌شده به مدت 3 روز تا 3 هفته در دمای 28 درجه سانتی‌گراد و سرعت 130 دور در دقیقه شیک انکوبه شدند (9، 10). از تمامی نمونه‌های غنی‌سازی‌شده 1 میلی‌لیتر به‌صورت مستقیم و بدون تهیه رقت (با چندین تکرار با فاصله زمانی) روی محیط‌های زیر (SCA،ISP2  آگار ISP3، ISP4، ISP5، ISP6، ISP7) به روش کشت چمنی با استفاده از سواب کشت داده شد.

• محیط نشاسته - کازئین آگار SCA (casein 0.3 g, KNO₃ 2 g, K₂HPO₄ 2 g ، starch 10 g، MgSO₄7H₂O 0.05 g, CaCO₃ 2 g, FeSO₄7 H₂O 0.01 g, agar 20 g, seawater 1,000 ml وpH 7.0 ± 0.2 ) (12).
• محیط عصاره مخمر - عصاره مالت ISP2(Yeast Extract-4g/l, Malt Extract-10g/l, Soya meal-30g/l, Agar-18g/l, Dis. Water-700ml, Sea water-300ml and pH-7.5). (13).
• محیط Oatmeal Agar یا ISP3 (Oatmeal (Malt extract) 20 g، Agar 18 g و pH 7.2 ) (14).

* شایان ذکر است برای تهیه محیط ISP3 ابتدا Oatmeal با 1 لیتر آب به مدت 20 دقیقه جوشانده شد. محلول به‌دست‌آمده، صاف و حجم آن اندازه‌گیری شد. حجم نهایی به 1 لیتر رسانیده و سپس آگار اضافه شد. pH محیط روی 2/7 تنظیم و سپس اتوکلاو شد (14).

4- محیط Starch- Inorganic salt Agar یا ISP4 (soluble starch 10g، K₂HPO₄(anhydrous) 1g، MgSO₄.7H₂O 1g، NaCL 1g، (NH₄)₂SO₄ 2g، CaCO₃ 2g ، Trace salts solution 1g، Agar 20gو PH 7-7/2)

*دربارة تهیه محیط ISP4، دو محلول نشاسته (10 گرم نشاسته در 500 میلی‌لیتر آب مقطر جوشانده شد تا کامل حل شود) و محلول نمکی (عناصر نمکی در 500 میلی‌لیتر آب مقطر) به‌صورت جداگانه تهیه و با هم مخلوط شدند. pH محیط روی 7 تا 4/7 تنظیم و سپس اتوکلاو شد (13).

5- محیط گلیسرول- آسپارژین آگار یا ISP5 (L-asparagine 1g، Glycerol 10g، g1 K₂HPO₄ (anhydrous)، Trace salts solution 1ml، agar 20g و pH 7-7.4)

* ال-آسپارژین نسبت به حرارت حساس است و بعد از اتوکلاو اضافه شد (14)

* ترکیب Trace Salts Solution: ZnSO₄.7H₂O 0.1 ، FeSO₄.7H₂O 0.1 و MnCl₂.4H₂O 0.1

6- محیط Peptone Yeast Extract Iron Agar یا ISP6 (Peptone 20g ،0.5 Ferricammonium citrate، K₂HPO₄ 1g، Na₂S₂O₃5H₂O 0.08، Yeast Extract 1g، agar 15g و PH 7- 7/5) (13).

7- تیروزین آگار یا ISP7 (Glycerol 15 g، L-Tyrosine 0.5g، L-Asparagine 1g، 0.5 K₂HPO₄، 0.5 MgSO₄ ،NaCl 0.5، 0.01 FeSO₄.7H₂O، Trace element solution 1ml و agar 20g) (15).

.کشت و خالص‌سازی: به‌منظور جداسازی، ابتدا از تمامی نمونه‌های غنی‌سازی‌شده رقت‌های ^1-10، ^2-10 ،^3-10 و^4-10 تهیه شد. سپس 100 میکرولیتر از رقت‌های تهیه‌شده روی محیط‌های SCA و ISP2 agar به روش کشت چمنی با استفاده از سوآب کشت داده شد. علاوه بر این، هر نمونه غنی‌شده به‌صورت مستقیم و بدون تهیه رقت (با چندین تکرار با فاصله زمانی) روی محیط‌های SCA، ISP2 agar، ISP3، ISP4، ISP5، ISP6 و ISP7 کشت شد. کلیه محیط‌های کشت به مدت 7 تا 21 روز در دمای 28 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شدند (16، 17). برای جلوگیری از آلودگی قارچی از آنتی‌بیوتیک‌های سیکلوهگزامید (20 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) و آمفوتریسین B (50 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) استفاده شد. برای جداسازی و تشخیص اولیه اکتینومیست‌ها، از روش‌های رنگ‌آمیزی گرم، بوی خاک و مشاهده کلنی‌های پودری و خشک استفاده شد. برای خالص‌سازی از هریک از کلنی‌ها چندین‌بار روی همان نوع محیطی که جدا شده بودند، کشت خطی انجام شد (9، 11).

بررسی اثر ضدباکتریایی: به‌منظور سنجش فعالیت ضدباکتریایی جدایه‌های جداشده از سویه‌های دارای شاخص استاندارد شامل استافیلوکوکوس اورئوس^[14]، اشریشیا کلی^[15]، لیستریا مونوسایتوژنز^[16] سویة 1298 (ATCC 19115)، شیگلا دیسنتری^[17] سویة 1188 (RI 366)، سالمونلا تیفی^[18] سویة 1609، استرپتوکوکوس پیوژنز^[19] سویة 1762 (ATCC19615) و سودوموناس آئروژینوزا^[20] سویة 1076 (ATCC 9027) استفاده شد. همچنین اثر ضدباکتریایی این جدایه‌ها علیه تعدادی باکتری بیماری‌زای جداشده از نمونه‌های کلینیکی شامل چند سویة استافیلوکوکوس اورئوس (141، 131، 121، 113)، استافیلوکوکوس مقاوم به متی‌سیلین (MRSA)^[21]، باسیلوس سوبتیلیس^[22]، اشریشیا کلی و استافیلوکوکوس اپیدرمیس^[23] نیز سنجیده شد. علاوه بر این، اثر آنها علیه کاندیدا آلبیکنس^[24] نیز بررسی شد. به‌منظور غربال‌گری باکتری‌های تولیدکنندة آنتی‌بیوتیک از روش کشت دولایه^[25] استفاده شد. در این روش ابتدا تمام ایزوله‌های جداشده به‌صورت کشت نقطه‌ای در محیط نشاسته - کازئین آگار کشت داده و به مدت 10-7 روز در دمای 28 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند. سپس باکتری‌های پاتوژن مدنظر در محیط مولر هینتون براث، تلقیح و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شدند تا زمانی که غلظت نهایی سلولی آنها به کدورت معادل 5/0 مک‌فارلند برسد. از هر سوسپانسیون باکتری بیماری‌زا به میزان 500 میکرولیتر در 3 میلی‌لیتر محیط مولر‌هینتون حاوی 6/0 درصد آگار، تلقیح و روی محیط رشد اکتینومیست‌ها ریخته شد. پس از 48-24 ساعت گرماگذاری هاله‌های عدم رشد در اطراف کلنی باکتری‌های تولیدکنندة ماده ضدمیکروبی نمایان شد (10، 18). شناسایی جدایه‌های باکتریایی به‌دست‌آمده از رسوبات و آب براساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی میکروسکوپی و ماکروسکوپی و ویژگی‌های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی انجام گرفت و درنهایت با استفاده از روش مولکولی PCR برای تأیید نهایی هویت جدایه‌ها اقدام شد. اینکار طی مراحل زیر انجام شد.

.تعیین ویژگی‌های مورفولوژیکی جدایه‌ها

رنگ‌آمیزی گرم: به‌منظور تشخیص ابتدایی جدایه‌ها، رنگ‌آمیزی گرم انجام شد. شکل میکروسکوپی جدایه‌ها با استفاده از عدسی 10 و 100 میکروسکوپ زمینه روشن بررسی شد (19).

مورفولوژی زنجیره اسپور و شکل میسلیوم: برای بررسی مورفولوژی زنجیره اسپور، اسپورانژیوم و آرایش میسلیوم‌های هوایی و سطحی از روش کشت اسلاید و میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM) استفاده شد (15). در این روش بعد از ریختن محیط ISP2 در پلیت، لامل‌های استریل به‌صورت مورب در محیط فرو برده شدند و بعد از بسته‌شدن محیط کشت، جدایه‌ها با لوپ در فاصله بین لامل و محیط کشت به‌صورت یک خط مستقیم کشت داده و محیط‌های کشت‌شده به مدت 10 تا 15 روز در دمای 28 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند. درنهایت، با استفاده از پنس استریل لامل‌ها خارج و به مدت نیم ساعت با لایه‌ای از طلا پوشیده شدند و عکس‌برداری از آنها با بزرگنمایی‌های مختلف توسط میکروسکوپ الکترونی انجام شد (2 ،20، 21).

رنگ تودة اسپوری: رنگ تودة اسپوری روی محیط‌های مختلف براساس 7 رنگ اصلی توسط ترسنر^[26] و باکوس^[27] (قرمز، زرد، سبز، آبی، بنفش، خاکستری و سفید) به همان صورت عنوان‌شده در مقاله ISP و طبق سیستم رنگ (ISCC-NBS) گزارش شد (14).

رنگ میسلیوم رویشی: برای مشاهدة رنگ میسلیوم رویشی، قسمتی از کشت بالغ رشدکرده روی آگار توسط اسکالپل، بریده و به‌صورت معکوس روی لام قرار داده شد. سپس رنگ کلنی براساس استاندارد ISCC-NBS تفسیر شد (14).

رنگدانه‌های محلول: تولید رنگدانه‌های محلول روی محیط‌هایISP2 agar  و ISP5 بعد از 14-10 روز گرمخانه‌گذاری در دمای 28 درجه سانتی‌گراد بررسی شد (15).

تست‌های بیوشیمیایی.

ویژگی‌های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی شامل توانایی مصرف منابع مختلف کربنی و نیتروژنی، توانایی رشد در دما و pH مختلف و غلظت‌های مختلف نمک، تولید هیدروژن سولفید، تولید اندول، تست حرکت، هیدرولیز اسکولین، تست کاتالاز، تست اوره‌آز، احیای نیترات، پیگمان‌های ملانوئیدی، تست لیپاز، تولید آنزیم آمیلاز، تست DNase، تولید آنزیم پروتئاز، تولید آنزیم ژلاتیناز، تولید آنزیم کربوکسی متیل سلولاز بودند که بررسی شدند (2، 14، 21).

توانایی مصرف منابع مختلف کربنی: منابع کربنی مانند سلولز، آرابینوز، مانیتول، فروکتوز، سوکروز، اینوزیتول، گزیلوز و دکستروز به‌صورت استریل با غلظت 1 درصد بعد از اتوکلاو به محیط پایه^[28] اضافه شدند که ترکیب آن در جدول 3 ذکر شده است و از گلوکز به‌عنوان کنترل مثبت استفاده شد. منابع کربن به‌صورت استریل با غلظت 1 درصد بعد از اتوکلاو اضافه شدند، کشت ایزوله‌ها روی آن انجام شد و پس از گذشت 7، 14 و 21 روز گرماگذاری در دمای 28 درجه سانتی‌گراد توانایی رشد آنها روی این محیط‌ها بررسی شد (22، 23).

جدول 3- ترکیب محیط پایه

.توانایی مصرف منابع مختلف نیتروژن: توانایی استفاده از منابع نیتروژن (ازجمله ال-آسپاراژین، تریپتوفان، D-آلانین، تیروزین، سیستئین، آرژنین و پتاسیم نیترات) بررسی شد که به‌صورت جداگانه به میزان 1/0 درصد به محیط پایه افزوده شد. گفتنی است ال-آسپاراژین به‌عنوان کنترل مثبت استفاده شد. سویه‌ها روی این محیط‌های مذکور کشت شدند و پس از گذشت 14 روز، توانایی رشد یا عدم رشد سویه‌ها بررسی شد (14).

توانایی رشد در دما و pH مختلف و غلظت‌های مختلف نمک: توانایی رشد سویه‌های برتر ازنظر تولید آنتی‌بیوتیک در دماهای مختلف (4، 28، 35 و 45)، pHهای متفاوت (5، 6، 7، 8، 9 و 10) و توانایی تحمل سدیم کلرید در غلظت‌های 0، 5 و10 درصد بررسی شد. علاوه بر انجام این تست‌ها و شناسایی سویه‌های برتر برای تعیین نهایی هویت آنها مطالعات مولکولی PCR نیز انجام گرفت (15، 25).

مطالعات مولکولی: از بین 24 ایزولة جداشده، 20 سویة تولیدکنندة آنتی‌بیوتیک برای مطالعات مولکولی انتخاب شد. برای تعیین ترادف 16SrRNA و بررسی فیلوژنی، ابتدا از کلیه سویه‌ها روی محیط‌های مناسب کشت داده و بیومس سلولی جمع‌آوری شد. در مرحله بعد، جداسازی DNA سلولی با استفاده از روش‌های مختلف شکست سلولی، پیگیری و DNA خالص سلولی استخراج شد؛ درنهایت، توالی 16SrRNA با استفاده از پرایمر‌های مناسب، تکثیر و برای تعیین توالی فرستاده شد.

الف. کشت و تهیه بیومس: سویه‌های مدنظر در مرحله اول روی محیط آگاردار عصاره مخمر - عصاره مالت (ISP2) کشت شده و در دمای 28 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 تا 7 روز گرماگذاری شده‌اند. بعد از حصول اطمینان از خلوص آن با بررسی ماکروسکوپی (نبود آلودگی در پلیت) و میکروسکوپی (تهیه اسمیر از سویه و رنگ‌آمیزی گرم) یک لوپ از باکتری در محیط ISP2 Broth کشت داده شد و به مدت 5-3 روز در دمای 28 درجه سانتی‌گراد در انکوباتور شیکر با دور rpm220 گرماگذاری شد.

ب. استخراج DNA: برای استخراج DNA از روش Salting out استفاده شد (20). برای تأیید استخراج انجام‌شده، الکتروفورز ژل آگارز صورت گرفت. به این صورت که 5 میکرو‌لیتر نمونه روی ژل (w/v) 5/1 درصد بارگذاری شد. سپس به مدت 50 دقیقه در جریان ولتاژ 80 میلی‌ولت در تانک الکتروفورز قرار گرفت و بعد از آن، رؤیت باندها در دستگاه ژل‌داک انجام شد. همچنین برای بررسی کیفیت DNA ژنومی استخراج‌شده و تعیین میزان خلوص آن، غلظت محصول استخراج و میزان جذب نوری آن در دو طول موج 260 و 280 با استفاده از دستگاه نانودراپ اندازه‌گیری شد.

پ. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز[29]: تکثیر ژن 16S rRNA با استفاده از پرایمرهای عمومی پروکاریوتی 27F و 1492R صورت گرفت. توالی پرایمرها به همراه تعداد بازها در جدول 4 آمده است.

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با روش استاندارد و مواد تهیه‌شده از شرکت سیناژن انجام شد. برای انجام واکنش، مخلوط واکنش با توجه به تعداد نمونه‌ها و حجم مورد نیاز (حجم نهایی برای هر واکنش 25 میکرولیتر) مطابق جدول 5 تهیه و ورتکس شد تا مخلوط یکنواخت شود. سپس ژنوم و نیز مخلوط واکنش به میکروتیوب‌های 200 میکرولیتری اضافه شدند؛ درنهایت، پس از میکروفیوژ نمونه‌ها آنزیم تک - پلیمراز به هر میکروتیوب اضافه شد.

جدول 4- پرایمرهای استفاده‌شده در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز

جدول 5- مواد و مقادیر استفاده‌شده در مخلوط واکنش زنجیره‌ای پلیمراز

جدول 6- برنامة دمایی تنظیم‌شده برای واکنش زنجیره‌ای پلیمراز

برای بررسی درستی عمل واکنش انجام‌شده و تأیید دستیابی به باند 16SrRNA باکتری مدنظر، الکتروفورز انجام شد. دربارة نمونه‌هایی که باند آنها ضعیف بود، با استفاده از چندین روش بهینه‌سازی PCR انجام گرفت تا زمانی که باند پررنگ مشاهد شد. پس از مشاهدة تک باندهای مشخص و بدون گستردگی و فقدان دایمر پرایمر، خالص‌سازی و تعیین توالی محصولات PCR توسط شرکت توپاژن انجام شد. داده‌های حاصل از توالی‌خوانی 16SrRNA با استفاده از نرم‌افزار Finch TV مرتب شدند و شناسایی نزدیکان فیلوژنیک باکتری با برنامة Blast در پایگاه اینترنتی NCBI انجام شد. به این ترتیب، نزدیک‌ترین باکتری‌ها با توالی ژنومی مشابه سویه‌های مدنظر تعیین شدند.

نتایج

به‌طور کلی 24 جدایة اکتینوباکتر از نمونه‌های مختلف جمع‌آوری‌شده (شامل آب ساحلی، آب سطحی، آب عمقی، رسوب ساحلی و رسوب عمقی) جداسازی شد.

فراوانی جدایه‌ها با توجه به نوع نمونه، نوع محیط کشت استفاده‌شده و عمق نمونه‌برداری به شرح زیر هستند. از مجموع 24 جدایه، 13 جدایه (54 درصد) از آب و 11 جدایه (46 درصد) از رسوب جدا شدند. 46 درصد جدایه‌ها با استفاده از محیط ISP5، 5/41 درصد با استفاده از محیط SCA و 5/12 درصد با استفاده از محیط ISP3 جدا شدند. این در حالی است که با استفاده از محیط‌های ISP4، ISP2، ISP6 و ISP7 هیچ نوع اکتینوباکتری جداسازی نشد. همچنین، 71 درصد از جدایه‌ها از عمق 5 متر، 21 درصد از عمق 3 متر و 8 درصد از عمق 5/2 متر از سطح دریا جداسازی شدند (جدول 5). (جدول 7).

بررسی فعالیت ضدمیکروبی جدایه‌ها: ارزیابی تولید مواد ضدمیکروبی در باکتری‌های جداسازی‌شده به‌صورت کیفی (ازطریق کشت نقطه‌ای و بررسی وجود و عدم وجود هاله عدم رشد) انجام گرفت. از میان 24 جدایة اکتینوباکتری، 18 جدایة تولیدکنندة آنتی‌بیوتیک براساس قطر هاله عدم رشد غربالگری شدند (شکل 1). گفتنی است جدایه‌ها توانایی تولید مواد ضدمیکروبی علیه طیف وسیعی از باکتری‌های بیماری‌زا شامل باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی را داشتند. نتایج نشان دادند هرکدام از 18 جدایة مولد آنتی‌بیوتیک، حداقل علیه یکی از باکتری‌های بیماری‌زا مؤثر بود (جدول 8 و 9).

جدول 7- جدایه‌ها و نوع محیط جداسازی و عمق جداسازی آنها

شکل 1- ویژگی‌های ماکروسکوپی جدایه‌ها روی محیط‌های مختلف

جدول 8- میزان فعالیت ضدباکتریایی اکتینوباکتری‌های مولد آنتی‌بیوتیک علیه باکتری‌های بیماری‌زای استاندارد

-: عدم فعالیت آنتی‌باکتریال؛ +: فعالیت آنتی‌باکتریالی ضعیف؛ ++: فعالیت آنتی‌باکتریالی متوسط؛ +++: فعالیت آنتی‌باکتریالی عالی

تعیین هویت سویه‌های منتخب با استفاده از .مشاهدة برخی از ویژگی‌های ماکروسکوپی و میکروسکوپی: ویژگی‌های ماکروسکوپی سویه‌های برتر در محیط کشت مختلف بررسی شدند (شکل 1). برخی از ویژگی‌های میکروسکوپی سویه‌ها با استفاده از میکروسکوپ الکترونی نگاره SEM)) و با میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی‌های مختلف تعیین شدند (شکل 2).

.تأیید هویت جدایه‌های به‌دست‌آمده به روش مولکولی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR): به‌منظور اطمینان از هویت جدایه‌های به‌دست‌آمده به روش خصوصیات مورفولوژیکی و بیوشیمیایی، از روش PCR نیز استفاده شد. پس از استخراج ژنوم سویه‌های منتخب با روش استخراج  Salting out به‌منظور تأیید خالص‌بودن DNA ژنومی، نسبت جذب نوری در طول موج 260/280 نانومتر انجام گرفت که باید بین 65/1 تا 85/1 باشد. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز به‌منظور تکثیر قطعه‌ای16SrRNA  برای 10 نمونة انتخابی انجام و محصول این واکنش روی ژل آگارز الکتروفورز شد. پس از تعیین توالی و مشخص‌شدن ترادف قطعه‌های ژنومی 16SrRNA  مربوط به سویه‌های منتخب، توالی‌های مربوط به آنها توسط نرم‌افزار finch TV مرتب شدند؛ درنهایت، با برنامة BLAST در پایگاه اینترنتی NCBI ارزیابی شدند و درخت فیلوژنتیکی رسم شد (شکل 3). نتایج به‌دست‌آمده در جدول شماره 12 آورده شده است.

جدول 9- فعالیت ضدباکتریایی نمونه‌های مولد آنتی‌بیوتیک علیه باکتری‌های بیماری‌زای جداشده از نمونه‌های کلینیکی

-: عدم فعالیت آنتی‌باکتریال؛ +: فعالیت آنتی‌باکتریالی ضعیف؛ ++: فعالیت آنتی‌باکتریالی متوسط؛ +++: فعالیت آنتی‌باکتریالی عالی

شکل 2- آرایش زنجیره‌ای سویه‌های 4 و 7

جدول 10- ویژگی‌های ماکروسکوپی سویه‌های منتخب در محیط کشت‌های مختلف

جدول 11 – نتایج تست‌های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی

شکل 3- درخت فیلوژنی 5 سویة برتر

جدول 12- نتایج تعیین توالی جدایه‌های منتخب

بحث و نتیجه‌گیری.

پس از معرفی پنی‌سیلین، گروه‌های زیادی از آنتی‌بیوتیک‌ها، کشف و بیشتر بیماری‌های عفونی کنترل شدند. با این حال، به دنبال افزایش مصرف بی‌رویة آنتی‌بیوتیک‌ها در بخش‌های کلینیکی، مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌ها روزبه‌روز افزایش یافت. درواقع مقاومت در میکروارگانیسم‌ها طی چند سال بعد از معرفی آنتی‌بیوتیک‌ها به حرفه پزشکی شروع شد و ثابت کرد امکان پیداکردن درمان نهایی برای تمام بیماری‌های باکتریایی یک رویاء است؛ بنابراین، به‌طور مدام بشر درگیر مبارزه با مقاومت باکتریایی است و نیاز به توسعة پایدار و تأمین آنتی‌بیوتیک‌های جدید برای مقابله با عوامل بیماری‌زای مقاوم است. اخیراً بسیاری از آنتی‌بیوتیک‌هایی که استفاده می‌شوند از فراورده‌های طبیعی مشتق شده‌اند. این ترکیبات ساختار متنوع و پیچیده‌ای با گروه‌های عملکردی فشرده‌ای دارند که سنتز شیمیایی آنها را بسیار مشکل می‌کند. سیستم‌های طبیعی، یک منبع بزرگ برای ترکیبات فعال بیولوژیکی‌اند (26). همان‌طور که قبلاً ذکر شد اکتینومیست‌ها یکی از تولیدکننده‌های مهم آنتی‌بیوتیک‌های جدید هستند و با توجه به گسترش تحقیقات انجام‌شده دربارة اکتینومیست‌های خاک، مشخص شده است بیشتر ترکیبات زیستی فعال جداشده، قبلاً شناسایی شده‌اند؛ بنابراین، جستجو برای منابع جدید به سمت محیط‌های آبی جهت‌دهی شد. ماگاروی^[xxx] و همکاران (2004) از رسوبات سواحل پاپوا گینه‌آ، 102 اکتینوباکتر جدا کردند که بیشتر جدایه‌ها فعالیت ضدباکتریایی نشان دادند (27). رِمیا^[xxxi] و همکاران (2008)، 173 اکتینوباکتر از سواحل غربی در هند جدا کردند که 47 درصد آنها به‌عنوان استرپتومایسس شناسایی شدند و 21 سویه از آنها توانایی تولید آنتی‌بیوتیک داشتند (28).

باسکاران^[xxxii] و همکاران (2010) گزارش دادند از 42 سویة اکتینوباکتر جداشده، 4/52 درصد فعالیت ضدباکتریایی نشان داده‌اند (2). کفیل‌زاده^[xxxiii] و همکاران (2011)، 83 سویة اکتینوباکتر جدا کردند که 80 درصد آنها فعالیت ضدباکتریای نشان دادند (29). گبریوهانس^[xxxiv] و همکاران در سال 2013، 31 سویة اکتینومیست را از آب و رسوبات دریاچه تانا جدا کردند که 13 جدایه، حداقل علیه یک باکتری مورد آزمایش، فعالیت ضدباکتریایی نشان دادند (10). در این مطالعه اثر مواد به‌دست‌آمده از مواد تولیدی سویه‌های جداشده علیه باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی آزمایش شد. نتایج نشان دادند 95 درصد آنتی‌بیوتیک‌های به‌دست‌آمده از این سویه‌ها علیه باکتری‌های گرم مثبت، 60 درصد علیه باکتری‌های گرم منفی، 60 درصد علیه هر دو گروه از باکتری‌ها مؤثرند. اکتینوباکتری‌های جداشده توسط والیس^[xxxv] و همکاران (2012)، فعالیت آنتاگونیستی بیشتری علیه باکتری‌های گرم مثبت مانند استافیلوکوکوس اورئوس و باسیلوس سوبتلیس نسبت به باکتری‌های‌گرم مثبت دیگر نشان دادند (6). ویجایاکامار^[xxxvi] و همکاران (2010)، 192 اکتینوباکتر از نمونه‌های دریایی جدا کردند که 8/36 درصد آنها فعالیت ضدمیکروبی نشان دادند. از جدایه‌های مولد آنتی‌بیوتیک، 88 درصد فعالیت ضدباکتریایی، 64 درصد فعالیت ضدقارچی و 52 درصد نیز فعالیت ضدباکتریایی و ضدقارچی نشان دادند (30). در مطالعة منادی^[xxxvii] و همکاران (1393)، 5/48 درصد از اکتینوباکتری‌های جداشده تولیدکنندة آنتی‌بیوتیک بودند، 94 درصد جدایه‌های مولد آنتی‌بیوتیک فعالیت ضدباکتریایی علیه باکتری‌های گرم مثبت داشتند، 64 درصد علیه باکتری‌های گرم منفی و 58 درصد علیه هر دو گروه باکتری‌ها فعالیت نشان دادند (20). در پژوهش فتاح‌زاده و همکاران (1391)، 38 درصد اکتینوباکتری‌های جداسازی‌شده توانایی تولید آنتی‌بیوتیک داشتند و 9/78 درصد از اکتینوباکتری‌های مولد آنتی‌بیوتیک، علیه باکتری‌های گرم مثبت مؤثر بودند؛ اما هیچ‌کدام از سویه‌های مولد آنتی‌بیوتیک روی باکتری‌های گرم منفی تأثیر بازدارندگی نداشتند (31). در همین راستا این تحقیق به جداسازی اکتینومیست‌ها از خلیج فارس پرداخت که همچنان محیط بکری برای تحقیقات میکروبیولوژی محسوب می‌شود و 24 جدایه از شاخة اکتینوباکتر از نمونه‌های آب و رسوب جدا شدند که 18 جدایه یا به عبارتی 75 درصد آنها فعالیت ضدباکتریایی داشتند. یافته‌های این تحقیق نشان می‌دهند اکتینوباکتری‌های دریایی مفید و متنوعی برای تولید ترکیبات آنتی‌بیوتیکی از آب‌های خلیج فارس قابل جداسازی‌اند و همچنین با توجه به گستردگی سواحل خلیج فارس در جنوب ایران، این منبع می‌تواند جایگاه جدید و مهمی برای تحقیق در زمینة دستیابی به آنتی‌بیوتیک‌های جدید باشد.

[1]- Vaxman

[2]- Streptomyces antibioticus

[3]- Abraham

[4]- Streptomyces griseus

[5]- Bonactin

[6]- Streptomyces sp. BD21-2

[7]- Kauai

[8]- Oahu

[9]- Hawaii

[10]- Trioxacarcins A ,B and C

[11]- Sreptomyces ochraceus

[12]- Streptomyces bottropensis

[13]- Grap

[14]- Staphylococcus aureus

[15]- Escherichia coli

[16]- Listeria monocytogenes 1298

[17]- Shigella dysenteriae 1188

[18]- Salmonella typhi 1609

[19]- Streptococcus pyogenes 1762

[20]- Pseudomonas aeruginosa 1076

[21]- Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

[22]- Bacillus subtilis

[23]- Staphylococcus epidermidis

[24]- Candida albicans

[25]- Over Layer

[26]- Tresner

[27]- Backus

[28]- Basal medium

[29]- Polymerase Chain Reaction

[xxx]- Magarvey

[xxxi]- Remya

[xxxii]- Baskaran

[xxxiii]- Kafilzadeh

[xxxiv]- Gebreyohanes

[xxxv]- Vallis

[xxxvi]- Vijayakumar

[xxxvii]- Monadi