سنتز نانوذرات طلا با استفاده از اگزوپلی‌ساکارید لاکتوباسیلوس پاراکازئی و ارزیابی خصوصیات ضدباکتریایی، ضدبیوفیلمی و آنتی‌اکسیدانی آنها

مقدمه.

در علم نانوتکنولوژی سنتز نانومواد مختلف در زمینه‌های مختلف از قبیل پزشکی (هدف‌گیری دارو، تصویربرداری و بیوسنسورها) علوم غذایی و علوم محیطی کاربرد دارد (1 و 2). با توجه به غلبه و افزایش میکروارگانیسم‌های مقاوم به چند آنتی‌بیوتیک و همچنین افزایش هزینه‌های مراقبت‌های بهداشتی، بسیاری از محققان علاقمند به توسعة روش‌های ضدمیکروبی مؤثر و جدید بدون مقاومت هزینه‌های بالا هستند (3). نانوذرات فلزی به‌عنوان یک نسل جدید از عوامل ضدمیکروبی و یک ابزار مقرون‌به‌صرفه برای غلبه بر مشکلات مقاومت دارویی به باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی تقسیم شده‌اند (4). در گذشته روش‌های شیمیایی و فیزیکی مختلف برای تولید نانوذرات استفاده شده‌اند. سنتز نانوذرات با استفاده از روش‌های شیمیایی و فیزیکی معمولی دارای عملکرد پایین و دشوار، به دما، فشار و زمان زیادی نیاز دارند و هزینه‌بر هستند و در این روش‌ها آماده‌کردن نانوذرات با یک اندازة مناسب دشوار است؛ بنابراین، امروزه برای تولید نانوذرات از روش‌های زیستی استفاده می‌شود. سنتز زیستی یک رویکرد سازگار با محیط زیست و مقرون‌به‌صرفه است که در آن از پلی‌مرهای تجزیه‌پذیر زیستی می‌توان برای احیای یون‌های فلزات، پایداری و تثبیت فلزات استفاده کرد (5). باکتری‌ها، قارچ‌ها و عصارة گیاهی مختلف پتانسیل تولید و سنتز نانوذرات را دارند. تاکنون از میکروارگانیسم‌ها برای سنتز نانوذرات مختلف مانند طلا، نقره، آهن، پلاتین، سولفید کادمیوم و تیتانیوم استفاده شده است (6). بین نانوذرات، نانوذرات طلا دارای کاربرد‌هایی در زمینة زیست پزشکی به‌عنوان عوامل آنتی‌باکتریال، آنتیHIV، آنتی‌بیوفیلم، آنتی‌تومور و آنتی‌مالاریا هستند (7). علاوه بر این، نانوذرات طلا به‌دلیل کم‌بودن سمیت، ثبات بالا و فعالیت کاتالیزوری توجه محققان را به خود جلب کرده‌اند (8). پلی‌ساکاریدها یک گروه متنوع از ماکرومولکول‌های زیستی‌اند که در ارگانیسم‌های مختلف یافت می‌شوند؛ آنها طبیعی، غیرسمی و تجزیه‌پذیرند و در فرایند‌های زیستی مختلف مانند پاسخ ایمنی، عفونت و انتقال سیگنال نقش دارند (9). پلی‌ساکاریدها به‌طور فزاینده‌ای به‌عنوان عوامل کاهش‌دهنده و تثبیت‌کننده برای تولید نانوذرات به کار می‌روند؛ زیرا مزایای متعددی دارند. زنجیرة ماکرومولکولی این پلی‌مرهای زیستی، گروه‌های هیدروکسیل بسیاری دارند که با یون‌های فلزی پیوند قوی برقرار می‌کنند و به احیای یون، کنترل شکل، اندازه و پراکندگی نانوذرات تشکیل‌شده منجر می‌شوند. علاوه بر این، پلی‌ساکاریدها دارای عملکرد با ارزشی از قبیل موکوادهسین هستند و یک پوشش خنثی با انرژی سطح پایین را فراهم و تشخیص گیرنده‌های غیراختصاصی پروتئین را محدود می‌کنند. همچنین، اگزوپلی‌ساکاریدها معمولاً شامل گروه‌های عملکردی مختلفی‌اند که نقش مهمی در پایداری نانوذرات فلزی دارند (10 و 11). باکتری‌های اسیدلاکتیک تولیدکنندة اگزوپلی‌ساکارید متعلق به گونه‌های استرپتوکوکوس، لاکتوباسیلوس، لاکتوکوکوس، لوکونوستوک و پدیوکوکوس هستند. مطالعات نشان دادند برخی از سویه‌های بیفیدیوباکتر توانایی تولید این بیوپلی‌مرها را دارند (12 و 13). نانوذرات فلزی سنتزشده توسط اگزوپلی‌ساکارید به‌دلیل خاصیت مغناطیسی، جذب، بی‌حرکتی و فعالیت‌های بیوکاتالیستی، قابلیت حلال‌بودن و واکنش‌پذیری سطح می‌توانند در کاربردهای مختلف صنعتی، زیست پزشکی و بیوتکنولوژیکی استفاده شوند (7). با ظهور نانوتکنولوژی و با توجه به خاصیت ضدمیکروبی طلا، از آنها در مبارزه با پاتوژن‌های مختلف نیز می‌توان بهره برد. نانوذرات طلا، ذراتی با تأثیرگذاری بالا و عمل سریع، غیرسمی و بی‌ضرر برای انسان‌اند. این ذرات با از بین بردن قارچ‌ها و باکتری‌ها بر خلاف سایر آنتی‌بیوتیک‌ها هیچ‌گونه مقاومتی در برابر باکتری‌ها ایجاد نمی‌کنند (10)؛ بنابراین، هدف اصلی از انجام این تحقیق، سنتز نانوذرات طلا با استفاده از اگزوپلی‌ساکارید لاکتوباسیلوس پاراکازئی (MN₈₀₉₅₂₈) و بررسی اثر ضدباکتریال، ضدبیوفیلمی و آنتی‌اکسیدانی آنها است. تاکنون تحقیق جامعی دربارة تولید اگزوپلی‌ساکاریدهای سویه‌های بومی باکتری‌های پروبیوتیک ازجمله لاکتوباسیلوس پاراکازئی و نیز استفاده از آنها به‌عنوان پلیمرهای حد واسط برای سنتز نانوذرات فلزی طلا با پایداری بیشتر و دارای اثرات ضدباکتریایی و ضدبیوفیلمی و آنتی‌اکسیدانی علیه عوامل باکتریایی بیماری‌زا در داخل کشور انجام نشده است.

مواد و روش‌ها

معرف‌ها و سویه‌ها: هیدروژن تترا کلرو آئورات[1]، اتانول، تری کلرو اسید استیک، اسید استیک و کلیه مواد شیمیایی از شرکت سیگما - آلدریج (Sigma–Aldrich) خریداری شدند. میکروارگانیسم‌های پاتوژن از قبیل اشریشیا کلی (ATCC 25922)، سودوموناس آئروژینوزا (ATCC 27853)، اسینتوباکتر بومانی (ATCC 17978) و استافیلوکوکوس اورئوس (ATCC 25923) از کلکسیون میکروبی انستیتو پاستور تهیه شدند. لاکتوباسیلوس پاراکازئی (MN₈₀₉₅₂₈) قبلاً طی مطالعه‌ای توسط آقای دکتر آقایی و همکاران از محصولات لبنی در استان قم جداسازی و شناسایی شد.

آماده‌سازی سویه: لاکتوباسیلوس پاراکازئی (MN₈₀₉₅₂₈) روی محیط MRS (De Man, Rogosa and Sharpe)[2] آگار (مرک، آلمان) کشت داده شد. سپس پلیت به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد درون جار بی‌هوازی گرمخانه‌گذاری شد.

.استخراج و خالص‌سازی اگزوپلی‌ساکارید از لاکتوباسیل پاراکازئی (MN₈₀₉₅₂₈): برای تولید اگزوپلی‌ساکارید، ابتدا باکتری لاکتوباسیلوس پاراکازئی (MN₈₀₉₅₂₈) در 500 میلی‌لیتر محیط کشت MRS براث (مرک، آلمان) تلقیح و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد (در شرایط جار بی‌هوازی) گرمخانه‌گذاری شد. بعد از گرمخانه‌گذاری کشت براث به‌منظور غیرفعال‌کردن آنزیم‌های تجزیه‌کنندة اگزوپلی‌ساکارید و آزادکردن اگزوپلی‌ساکارید به مدت 10 دقیقه در دمای 100 درجه سانتی‌گراد حرارت داده شد. بعد از 24 ساعت سوسپانسیون میکروبی درون فالکون‌های 50 میلی‌لیتری خالی شد و فالکون‌ها به مدت 10 دقیقه در سانتریفیوژ یخچال‌دار با 6000 دور در دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند. سپس با جمع‌آوری سوپرناتانت توده‌های سلولی باکتریایی دور ریخته شدند. پس از آن، به سوپرناتانت، اسید تری کلرو استیک با غلظت نهایی 14 درصد برای رسوب‌کردن پروتئین اضافه شد. برای اینکه پروتئین‌ها به‌طور کامل رسوب داده شوند، درون انکوباتور شیکردار در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 دقیقه قرار داده شدند. بعد از 30 دقیقه سوپرناتانت از انکوباتور خارج شد و مجدد درون فالکون‌ها ریخته و به مدت 20 دقیقه با دور 10000 و در 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شد. به این صورت، سوپرناتانت حاوی اگزوپلی‌ساکارید، جمع‌آوری و رسوب پروتئینی دور ریخته شد. برای استخراج اگزوپلی‌ساکارید از روش ترسیب با اتانول سرد استفاده شد؛ به این صورت که 2 برابر سوپرناتانت اتانول 96 درصد سرد، اضافه و به مدت 1 شبانه‌روز در دمای 4 درجه سانتی‌گراد در یخچال نگهداری شد. بعد از 24 ساعت ارلن حاوی سوپرناتانت و اتانول به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد با 12000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. به این ترتیب، اگزوپلی‌ساکارید رسوب کرد و رسوب آن دوبار با آب مقطر شسته شد (14 و 15).

.سنتز نانوذرات طلا با استفاده از اگزوپلی‌ساکارید: سنتز نانوذرة طلا با استفاده از اگزوپلی‌ساکارید طبق روش کیم و همکارانش با تغییرات جزئی انجام شد. 30 میلی‌لیتر محلول 1 درصد اگزوپلی‌ساکارید (1/0 گرم) در آب دیونیزه تهیه و سپس به حجم مساوی از محلول آبی  HAuCl₄1 میلی‌مولار اضافه شد. مخلوط اگزوپلی‌ساکارید و HAuCl₄ درون یک ارلن ریخته شد که کاملاً با آلومینیوم پوشانده شده بود. سپس ارلن به مدت 48 ساعت روی استیرر (180 دور در دقیقه) در دمای اتاق قرار گرفت. درنهایت، برای جداکردن ذرات نانو از باقی‌ماندة اگزوپلی‌ساکارید، 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد با 20000 دور در دقیقه سانتریفیوژ انجام شد (16).

بررسی ویژگی‌های نانوذرات طلا سنتزشده: برای تأیید حضور نانوذرات طلا، جذب نوری محلول با اسپکتروفتومتر UV-Vis[3] مدل CARY-100, Varian, Australia از طیف 200 تا 800 نانومتر بررسی شد. از آنالیز [4]FT-IR مدل FTIR-4200, Jasco, japan با محدودة طول موج cm^-1600-4200 برای تعیین ساختار نانوذرات طلا و همچنین بررسی گروه‌های عملکردی استفاده شد. برای این منظور نانوذرات خشک‌شده و پودرشدة طلا برای تولید قرص با برمید پتاسیم مخلوط شدند. توزیع و پراکندگی نانوذرات طلا سنتزشده در محلول توسط آنالیز دستگاهی DLD[5] بررسی شدند. اسپکتوفتومتری XRD[6] مدل Ultima IV XRD, Rigaku, Japan و EDX[7] مدل BRUKER flash 6/10 به‌ترتیب برای بررسی ساختار نانوذرات و تأیید حضور نانوذرات طلا در محلول استفاده شد. با استفاده از میکروسکوپ الکترونی (FE-SEM)[8] مورفولوژی سطح و سایز نانوذرات طلا بررسی شدند (17).

بررسی مهار رشد باکتری‌های پاتوژن: فعالیت ضدباکتریایی در مقابل باکتری‌های گرم منفی و گرم مثبت با استفاده از روش انتشار در چاهک بررسی شد (18). باکتری‌های پاتوژن استاندارد اشریشیا کلی (ATCC 25922) سودوموناس آئروژینوزا (ATCC 27853)، اسینتوباکتربومانی (ATCC 17978)، استافیلوکوکوس اورئوس (ATCC 25923) در محیط نوترینت براث[9] (مرک، آلمان) به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد کشت داده شدند. سپس از کشت تازة باکتری‌ها نیم مک فارلند (CFU/mL 10⁸ ×1.5) تهیه شد. 100 میکرولیتر از سوسپانسیون میکروبی به‌صورت متراکم روی محیط مولر هینتون آگار (مرک، آلمان) کشت داده و بعد از ایجاد چاهک (6 میلی‌متر) در سطح محیط از نانوذرات طلا تهیه‌شده غلظت‌های مختلف (µg/mL 125/3، 25/6، 5/12، 25، 50) در چاهک‌ها ریخته شد. پلیت باکتری‌ها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد نگهداری و هالة عدم رشد باکتری‌ها بعد از مدت زمان گرمخانه‌گذاری بررسی شد.

تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی (MIC)[10]: تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی نانوذرات طلا سنتز شده با استفاده از روش میکرودایلوشن با پروتکل استاندارد انجام شد (19). در این روش ازمیکروپلیت‌های 96 خانه‌ای استفاده شد. ابتدا 100 میکرولیتر محیط مولر هینتون براث (مرک، آلمان) درون 96 چاهک میکروپلیت تلقیح شد، سپس به اولین چاهک هر ردیف 100 میکرولیتر نانوذرات طلا سنتز شده با غلظت‌های مختلف (µg/mL 125/3، 25/6، 5/12، 25، 50) اضافه شد و از چاهک دوم به سوم به همین ترتیب تا چاهک دهم نانوذرات تلقیح شده رقیق شد. در آخر به همه چاهک‌ها 100 میکرولیتر سوسپانسیون میکروبی رقیق شده معادل نیم مک فارلند اضافه گردید (یک چاهک به عنوان کنترل مثبت در نظر گرفته شد که شامل 100 میکرولیتر محیط مولر هینتون براث و 100 میکرولیتر سوسپانسیون میکروبی رقیق شده معادل نیم مک فارلند بود. یک چاهک به عنوان کنترل منفی که فقط حاوی 100 میکرولیتر محیط مولر هینتون براث بود). سپس میکروپلیت به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد گرمخانه‌گذاری شد بعد از مدت زمان گرمخانه‌گذاری، غلظت آخرین چاهکی که هیچ کدورتی در آن مشاهده نشده معادل حداقل غلظت مهارکنندگی در نظر گرفته شد.

حداقل غلظت کشندگی نانوذرات طلا سنتز شده (MBC)[11]: برای تعیین حداقل غلظت کشندگی نانوذرات طلا، 10 میکرولیتر از چاهک‌های فاقد کدورت به محیط مولر هینتون آگار تلقیح شد. سپس پلیت‌ها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. میزان حداقل غلظت کشندگی براساس حداقل غلظتی از مادة ضدمیکروبی تعیین می‌شود که از رشد باکتری در سطح پلیت جلوگیری می‌کند (20).

.بررسی فعالیت ضدبیوفیلمی نانوذرات طلا سنتزشده: تعیین فعالیت ضدبیوفیلمی نانوذرات طلا در برابر باکتری‌های گرم منفی (اشریشیا کلی، سودوموناس آئروژینوزا و اسینتوباکتر بومانی) و گرم مثبت (استافیلوکوکوس اورئوس) با استفاده از روش میکروتیتر پلیت سنجیده شد. ابتدا یک کشت 24 ساعته از میکروارگانیسم‌های مدنظر تهیه شد. 100 میکرولیتر از میکروارگانیسم‌های مورد آزمایش با OD=0.1 (در طول موج 600 نانومتر) و 50 میکرولیتر از نانوذرات طلای سنتزشده با غلظت کمتر از حداقل غلظت بازدارنده به میکروپلیت 96 خانه‌ای تلقیح شدند (یک چاهک به‌عنوان کنترل در نظر گرفته شد). سپس میکروپلیت به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد گرمخانه‌گذاری شد. بعد از مدت زمان گرمخانه‌گذاری محلول رویی میکروپلیت دور ریخته و با سرم فیزیولوژی سه بار شست و شو داده شد. سپس میکروپلیت به مدت 30 دقیقه در دمای آزمایشگاه خشک شد. 200 میکرولیتر کریستال ویولة 1 درصد به مدت 20 دقیقه روی چاهک‌ها اضافه شد، بعد از 20 دقیقه کریستال ویوله دور ریخته شد و با آب مقطر سه بار شستشو داده و رنگ اضافه خارج شد. برای تثبیت ساختار بیوفیلمی 220 میکرولیتر اسید استیک به مدت 15 دقیقه به چاهک‌ها اضافه شد. سپس جذب نوری هر چاهک با دستگاه الایزاریدر (Bio Tek, USA) در طول موج 570 نانومتر تعیین شد. درصد مهار تشکیل بیوفیلم با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد (21).

[1- (OD _sample / OD _control)] ×100 = درصد مهار بیوفیلم

فعالیت آنتی‌اکسیدانی نانوذرات طلا با استفاده از تست [12]DPPH: فعالیت آنتی‌اکسیدانی نانوذرات طلای سنتزشده با روش پتانسیل مهار رادیکال آزادDPPH  بررسی شد (22). به‌طور خلاصه یک محلول 1/0میلی‌مولار DPPH در متانول به‌عنوان استوک تهیه شد. 100 میکرولیتر از محلول DPPH 1/0 میلی‌مولار (در متانول) به غلظت‌های مختلف نانوذرات طلای (50- 125/3 میکروگرم در میلی‌لیتر) سنتزشده، اضافه و بعد از 30 دقیقه گرمخانه‌گذاری در تاریکی و در دمای اتاق، جذب نمونه‌ها در 517 نانومتر خوانده شد. اسید آسکوربیک به‌عنوان استاندارد استفاده شد. درصد فعالیت رادیکال آزاد ازطریق فرمول زیر محاسبه شد.

100×جذب کنترل/(جذب نمونه - جذب کنترل) = درصد جذب رادیکال.

نتایج

تعیین ویژگی نانوذرات طلای سنتزشده: سنتز نانوذرات طلا با مشاهدات چشمی با تغییر رنگ محلول از بی‌رنگ به قرمز یاقوتی تأیید شد (شکل 1، a). نتایج حاصل از آنالیز اسپکتروفتومتری با نور ماورای بنفش، یک پیک جذبی قوی را در 524 نانومتر نشان داد که سنتز نانوذرات طلا را تأیید می‌کند (شکل 1، b). سپس نانوذرات طلای سنتزشده برای آنالیز‌های بعدی خشک شدند (شکل 1، c). آنالیز FT-IR برای شناسایی ارتباط احتمالی بین یون‌های طلا و اگزوپلی‌ساکارید انجام شد؛ به‌طوری‌که اگزوپلی‌ساکارید می‌تواند برای کاهش یون‌های طلا و پایداری نانوذرات طلا استفاده شود. همان‌طور که در شکل 2 مشاهده می‌شود، پیک‌های جذبیcm^-1 3433،  cm^-1 2931،  cm^-12897،  cm^-11689 وcm^-11535 شناسایی شدند.

شکل 1- نانوذرات طلای سنتزشده (a) طیف اسپکتروفتومتری فرابنفش - مرئی نانوذرات طلا (b)، نمونة خشک‌شده نانوذرات طلای سنتزشده (c)

شکل 2- طیف FTIR نانوذرات طلای سنتزشده با استفاده از اگزوپلی‌ساکارید لاکتوباسیلوس پاراکازئی

با استفاده از گراف پراکندگی نور دینامیکی نشان داده شد که نانوذرات طلای سنتزشده به‌طور متوسط سایزی حدود 8/25 داشتند (شکل3،a ). الگوی پراش اشعه ایکس (XRD) برای ماهیت کریستالی نانوذرات استفاده می‌شود. الگوی XRD نانوذرات طلا (شکل3،b) پیک‌های شارپی در نواحی 9/37، 6/43، 6/63 و 1/77 نشان داد که سنتز نانوذرات طلا را تأیید می‌کند. آنالیز ساختاری نشان داد نانوذرات طلا دارای ساختار بلوری با شاخص‌های میلر 111، 200، 220 و 311 در شبکة مکعبی است. پیک 111 در مقایسه با سایر پیک‌ها شدیدتر است؛ درنتیجه، صفحات بلوری نانوذرات طلا بیشتر در این جهت تشکیل شده‌اند. آنالیز EDX حضور عنصر طلا را در نانوذرات سنتزشده به روش زیستی نشان داد (شکل 3، c).

شکل 3- گراف پراکندگی نور دینامیکی (a)، پراش پرتو ایکس نانوذرات طلای سنتزشده (b)، طیف سنجی پراش انرژی پرتو ایکس نانوذرات طلای سنتزشده با استفاده از اگزوپلی‌ساکارید (c)

علاوه بر پیک‌های جذبی قوی عناصر طلا، سیگنال‌های ضعیفی از اتم‌های کربن و اکسیژن در مقایسه با عناصر طلا گزارش شدند. نتایج به‌دست‌آمده از میکروسکوپ الکترونی (FE-SEM) در شکل 4 نشان دادند نانوذرات طلای سنتزشده توسط اگزوپلی‌ساکارید به شکل کروی و به‌طور متوسط سایزی حدود 20 تا 50 نانومتر دارند.

.نتایج مهار رشد باکتری‌های پاتوژن با استفاده از نانوذرات طلا: نتایج بررسی اثرات ضدباکتریایی نانوذرات طلا نشان داد نانوذرات طلای سنتزشده اثر مهارکنندگی قابل قبولی بر همه باکتری‌های مدنظر دارد؛ به‌طوری‌که با افزایش غلظت نانوذرات، این اثر مهارکنندگی، بیشتر و قطر هالة عدم رشد نیز بیشتر می‌شود. نتایج حاصل از تأثیر غلظت‌های مختلف نانوذرات طلای سنتزشده در جدول 1 نشان داده شدند. نتایج نشان می‌دهند نانوذرات طلای سنتزشده بیشترین اثر بازدارندگی را علیه باکتری‌های گرم منفی نسبت به باکتری گرم مثبت دارد. در میان باکتری‌های گرم منفی اسینتوباکتر بومانی (قطر هالة 20 میلی‌متر) و سودوموناس آئروژینوزا (قطر هالة 17 میلی‌متر) بیشترین مهار رشد را داشته‌اند. نتایج حاصل از مهار رشد باکتری‌های پاتوژن در شکل 5 نشان داده شدند.

شکل 4- تصویر میکروسکوپ الکترونی FE-SEM نانوذرات طلای سنتزشده

جدول 1- نتایج بررسی اثرات ضدباکتریایی نانوذرات طلای سنتزشده در مقایسه با آنتی‌بیوتیک سفکسیم / سفتریاکسون و نانوذرات طلای سنتزشده به روش شیمیایی

شکل 5- فعالیت آنتی‌باکتریال نانوذرات طلای سنتزشده با غلظت‌های مختلف (125/3، 25/6، 5/12، 25 و 50 میکروگرم بر میلی‌لیتر) و کنترل (نانوذرات طلای سنتزشده به روش شیمیایی، آنتی‌بوتیک سفکسیم / سفتریاکسون)

. نتایج بررسی MIC و MBC نانوذرات سنتزشده روی سویه‌های گرم منفی و گرم مثبت: نتایج مربوط به حداقل غلظت مهارکنندگی رشد (MIC) و حداقل غلظت کشندگی (MBC) نانوذرات طلای سنتزشده علیه باکتری‌های منتخب در جدول 2 نشان داده شده‌اند. بیشترین حساسیت بین باکتری‌های مورد آزمایش را باکتری اسینتوباکتر بومانی (125/3MIC) و کمترین حساسیت به نانوذرات طلای سنتزشده را باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (25(MIC دارد.

بررسی مهار بیوفیلم باکتری‌های پاتوژن با استفاده از نانوذرات سنتزشده: در تحقیق انجام‌شده بیوفیلم همه باکتری‌های پاتوژن توسط نانوذرات طلای سنتزشده مهار شد. تیمار باکتری‌های گرم منفی اشریشیا کلی، سودوموناس آئروژینوزا و اسینتوباکتر بومانی به مدت 24 ساعت با غلظت کمتر از حداقل غلظت بازدارندة نانوذرات طلای سنتزشده به‌ترتیب باعث کاهش تشکیل بیوفیلم 46 درصد، 65 درصد و 78 درصد شد. بیوفیلم باکتری گرم مثبت استافیلوکوکوس اورئوس 56 درصد مهار شد. نتایح حاصل از مهار بیوفیلم باکتری‌های پاتوژن در شکل 6 گزارش شده‌اند.

فعالیت آنتی‌اکسیدانی: در این مطالعه، فعالیت جذب رادیکال‌های DPPH نانوذرات طلای سنتزشده با اگزوپلی‌ساکارید بررسی شد. نتایج نشان دادند حذف رادیکال‌های DPPH با افزایش غلظت نانوذرات طلا افزایش یافت؛ بنابراین، یک فعالیت وابسته به غلظت است. درصد فعالیت مهار رادیکال آزاد در شکل 7 نشان داده شده است. همان‌طور که مشاهده می‌شود نانوذرات طلا در غلظت 50 میکروگرم در میلی‌لیتر حداکثر درصد مهار (81 درصد) را در مقایسه با نمونة استاندارد (اسید آسکوربیک 98 درصد) نشان می‌دهند.

جدول 2- MIC و MBC نانوذرات طلای سنتزشده توسط اگزوپلی‌ساکارید لاکتوباسیلوس پاراکازئی (MN₈₀₉₅₂₈) برای باکتری‌های تست

شکل 6- عکس SEM پاتوژن‌های مختلف اشریشیا کلی (A)، سودوموناس آئروژینوزا(B)، استافیلوکوکوس اورئوس (C)، اسینتوباکتر بومانی (D) قبل و بعد از تیمارشدن با نانوذرات طلای سنتزشده توسط EPS

شکل 7- فعالیت آنتی‌اکسیدانی نانوذرات طلای سنتزشده توسط اگزوپلی‌ساکارید

بحث و نتیجه‌گیری

امروزه توجه زیادی به نانوذرات ضدباکتریایی به‌عنوان وسیله‌ای برای غلبه بر مشکلات مقاومت دارویی در میکروارگانیسم‌های مختلف بیماری‌زا وجود دارد. در میان نانوذرات فلزی، نانوذرات طلا به‌دلیل شکل و اندازة خود، خصوصیات منحصربه‌فردی دارند؛ به همین علت در زمینه‌های مختلف تحقیقاتی ازجمله پزشکی، تکنولوژی و بیوشیمی کاربرد دارند (23). اگزوپلی‌ساکارید پروبیوتیک‌ها نقش مهمی در چسبندگی به سلول و اتصال به اپی‌تلیال دارند (24)؛ به همین دلیل می‌توانند اتصال باکتری‌های بیماری‌زا را به حداقل برسانند و به بهبود سیستم ایمنی کمک کنند. به‌طور کلی، کربوهیدرات‌ها به اندازة کافی قوی‌اند که کلرید طلا را کاهش دهند و به‌عنوان یک عامل پایدارکننده عمل کنند و درنهایت، تعامل سطح به سطح نانوذرات طلا را کاهش دهند. حضور چندین گروه کربوکسیل و انتهای کاهش‌دهندة همی‌استیل در بیوپلی‌مرها منجر به پایداری نانوذرات سنتزشده می‌شود (25 و 26)؛ بنابراین، در این تحقیق از اثرات سودمند اگزوپلی‌ساکارید سنتزشده توسط لاکتوباسیلوس پاراکازئی برای سنتز نانوذرات طلا استفاده شد. تحلیل نمونه‌ها با اسپکتوفتومتری نور ماورای بنفش، یک پیک جذبی مشخص را در طول موج 524 نانومتر نشان داد؛ ظهور رزونانس پلاسمون سطحی در این منطقه بیان‌کنندة وجود نانوذرات طلا است (27 و 28). در تحقیق انجام‌شده، نانوذرات سنتزشده سبب تغییر رنگ محلول از بی‌رنگ به قرمز ارغوانی شد و باند رزونانس پلاسمون سطحی قوی در 524 نانومتر نشان داد که وجود نانوذرات طلا را تأیید می‌کند. رنگ محلول نانوذرات طلای سنتزشده به‌دلیل نوسانات جمعی الکترون‌های آزاد القاشده به‌وسیلة تعامل با میدان الکترومغناطیسی است که برای هر نوع ذره با هر اندازه‌ای مخصوص به خود آن ذره است (29). در مطالعة نارایانان^[xiii] و همکاران (2010)، نانوذرات طلای سنتزشده طیف جذبی را در ناحیه 536 نانومتر نشان دادند (30). آنالیز طیف‌سنجی FT-IR برای شناسایی گروه‌های فعال و احیاکنندة یون‌های طلا انجام شد. در این مطالعه با استفاده از آنالیز FTIR پیک‌های جذبی cm^-1 3433 ارتعاشات کششی کربوکسیل در الکل‌ها و ترکیبات فنلی را نشان می‌دهند که قدرت قوی برای توانایی تعامل با نانوذرات دارند (31). باند‌ جذبی cm^-1 2931 ارتعاشات کششی C-H (غیرمتقارن) را نشان می‌دهد که مربوط به قله‌های کششی گروه آلکان‌ها است و باند‌ جذبی cm^-1 2897 ارتعاشات کششی C-H (متقارن) را نشان می‌دهد که مربوط به گروه ₃CH است (32). طیف‌های جذبی cm^-1 1689 و cm^-1 1535 به‌ترتیب مربوط به باند‌های آمیدی و باند‌های خموشی از گروه C-O-C هستند (33). در مطالعة ساتیانارایانان^[xiv] و همکاران (2014)، باند‌های جذبی cm^-1 3432، 2919، 2846 و 1578 توسط اسپکتوفتومتری FTIR شناسایی شدند (34). DLS یک تکنیک ارزشمند است که سایز ذرات و توزیع ذرات در محلول را بررسی می‌کند (35). در مطالعة حاضر، الگوی DLS نشان داد سایز نانوذرات طلای سنتزشده 8/25 نانومتر بود که نشان می‌دهد اگزوپلی‌ساکارید سنتزشده توانایی سنتز نانوذرات طلا با اندازة متوسط را دارد. اسپکتوفتومتری XRD یک ابزار اصلی و اولیه برای تعیین خصوصیات بلوری مانند اندازة کریستال نانوذرات طلا است (36). الگوی XRD پیک‌های مشخصی از کریستال‌های طلا را نشان می‌دهد که سنتز نانوذرات طلا را تأیید می‌کند (37). طبق نتایج به‌دست‌آمده، سنتز نانوذرات طلا با استفاده از اگزوپلی‌ساکارید لاکتوباسیلوس پاراکازئی تأیید می‌شود و با سایر تحقیقات دربارة سنتز نانوذرات طلا مشابه است (38). حضور عنصر طلا در محلول نانوذرات سنتزشده با استفاده از EDX تأیید شد. گراف EDX، پیک‌های قوی اطرافKeV  2 و KeV10 نشان داد که حضور نانوذرات طلا را تأیید می‌کند (39). ساختار و شکل نانوذرات با استفاده از میکروسکوپ الکترونی FE-SEM  تعیین شد (40). در مطالعة حاضر اندازة نانوذرات طلای سنتزشدة کروی، 50-20 نانومتر بود. در تحقیقی مشابه، از کیتوزان برای سنتز نانوذرات طلا استفاده کردند که نتایج نشان دادند نانوذرات طلای سنتزشده اندازة 10 تا 50 نانومتر دارند (41). مطالعات نشان داده‌اند به تازگی از نانوذرات طلا به‌عنوان یک ترکیب ضدباکتریایی قوی استفاده می‌شود و همچنین بررسی‌ها نشان دادند نانوذرات طلا نقش مهی در حذف باکتری‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک دارند (42). مطالعة حاضر نشان داد نانوذرات طلای سنتزشده با استفاده از اگزوپلی‌ساکارید باکتری لاکتوباسیلوس پاراکازئی با روش انتشار در چاهک روی 4 باکتری مؤثرند و فعالیت ضدمیکروبی بیشتری روی باکتری‌های گرم منفی نسبت به باکتری گرم مثبت استافیلوکوکوس اورئوس نشان می‌دهند. فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات طلا در برابر باکتری‌های گرم منفی مربوط به دیوارة سلولی نازک آنهاست که آنها را نسبت به عملکرد نانوذرات طلا حساس‌تر کرده است. مکانیسم دیگر فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات طلا به‌دلیل تولید گونه‌های واکنش‌دهندة اکسیژن در داخل سلول‌های باکتریایی است که باعث افزایش استرس اکسیداتیو سلول‌های میکروبی می‌شود (43). وانگ^[xv] و همکاران در سال 2019، مکانیسم ضدباکتریایی نانوذرات طلا را با استفاده از روش‌های ترانسکترومیک و پروتئومیک بررسی کردند. آنها دریافتند نانوذرات طلا فعالیت‌های ضدباکتریایی را با جلوگیری از ترکیب زیرواحد کوچک (s30) ریبوزومی با tRNA و فروپاشی پتانسیل غشایی انجام می‌دهند (44).

در تحقیقی آروگوئتا^[xvi] و همکاران (2010) نشان دادند نانوذرات طلا دارای خواص ضدمیکروبی‌اند (45). موتوکومار^[xvii] و همکاران (2016) نشان دادند نانوذرات طلا فعالیت ضدباکتریایی بیشتری در برابر باکتری‌های گرم منفی نسبت به باکتری‌های گرم مثبت دارند (46). در مطالعه‌ای مشابه توسط ساتیانارایانان و همکاران (2014)، نانوذرات طلا با استفاده از اگزوپلی‌ساکارید سنتز شدند و فعالیت ضدباکتریایی آنها در برابر اشریشیا کلی، سودوموناس آئروژینوزا، کلبسیلا پنومونیه، استافیلوکوکوس اورئوس، استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس بررسی شد (34). مهار بیوفیلم توسط نانوذرات طلا با استفاده از روش میکروتیتر پلیت انجام شد. با توجه به اینکه نانوذرات طلا اندازة کوچکی دارند، به راحتی می‌توانند وارد ماتریکس بیوفیلم شوند. بیشتر مطالعات نشان می‌دهند نانوذرات طلا می‌توانند باعث مهار بیوفیلم سودوموناس آئروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس شوند (47). بررسی‌ها نشان دادند نانوذرات طلا باعث کاهش چشمگیر در شکل‌گیری بیوفیلم توسط سودوموناس آئروژینوزا می‌شوند. این موضوع ممکن است به‌دلیل سمیت نانوذرات طلا برای سلول باکتریایی باشد (48). آنتی‌اکسیدان‌ها ماکرومولکول‌هایی‌اند که رادیکال آزاد گونه‌های اکسیژن واکنش‌پذیر از قبیل یون‌های سوپراکسید، پراکسید هیدروژن، یون‌های هیدرواکسید آزاد و اکسیژن منفرد را از بین می‌برند که با انتقال یک الکترون تولید می‌شوند و به این ترتیب از اکسیدشدن ماکرومولکول‌های زیستی جلوگیری می‌کنند (48). فعالیت آنتی‌اکسیدانی نانوذرات طلای سنتزشده با استفاده از روش سنجش رادیکال آزاد DPPH انجام شد. نتایج نشان دادند نانوذرات طلای سنتزشده با انتقال یک الکترون یا هیدروژن به رادیکال آزاد، آن را تبدیل به DPPH-H پایدار می‌کنند که با نتایج سایر مطالعات مشابه است (49). کیم^[xviii] و همکاران در سال 2007 فعالیت آنتی‌اکسیدانی نانوذرات طلای سنتزشده را بررسی کردند و نتیجه گرفتند نانوذرات طلای سنتزشده فعالیت آنتی‌اکسیدانی دارند و فعالیت آنتی‌اکسیدانی آنها با افزایش غلظت نانوذرات افزایش می‌یابد (16). اگزوپلی‌ساکارید تولیدشده توسط لاکتوباسیلوس پاراکازئی (MN₈₀₉₅₂₈) به‌عنوان منبع بسیار مناسبی برای سنتز و تولید زیستی نانوذرات طلا با اثرات ضدمیکروبی، ضدبیوفیلمی و آنتی‌اکسیدانی است؛ ازاین‌رو، مطالعات بیشتر در خصوص بهینه‌سازی شرایط تولید اگزوپلی‌ساکاریدهای سویه‌های بومی باکتری‌های لاکتیک‌اسید می‌توانند کاربرد مهم و گسترده‌ای در تولید انواع نانوذرات فلزی با کاربرد‌های زیست فناوری دارویی باشند.

[1]- HAuCl4

[2]- DeMan, Rogosa, and Sharpe

[3]- Ultraviolet-Visible Spectroscopy

[4]- Fourier – Transform Infrared Spectroscopy

[5]- Dynamic light scattering

[6]- X-ray diffraction

[7]- Energy Dispersive X-ray

[8]- Field Emission Scanning ElectronMicroscopy

[9]- Nutrient Broth

[10]- Determination of minimum inhibitory concentration

[11]- Determination of minimal bactericidal concentration

[12]- 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

[xiii]- Narayanan

[xiv]- Sathiyanarayanan

[xv]- Wang

[xvi]- Arugueta

[xvii]- Muthukumar

[xviii]- Kim