ارزیابی آثار غلظت و زمان کاربرد نانو اکسید گرافن بر عملکرد فتوسنتزی و آنتی‌اکسیدانی خیار در شرایط گلخانه‌ای

نانومواد کربنی به‌علت داشتن ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی خاص، نقش زیادی در صنایع مختلف، حذف آلاینده‌ها از آب‌آلوده، صنایع غذایی و کشاورزی ایفا می‌کنند. نانو مواد کربنی شامل فولرن‌ها (Fullerene)، نانو‌لوله‌های تک‌دیواره و چند‌دیواره، نانوذرات کربنی و گرافن‌ها هستند. یکی از جدیدترین شکل نانومواد کربنی، گرافن است که خود دارای فرم‌های مختلفی از جمله فرم اکسیدی است. نانو اکسید گرافن دارای ساختاری لایه‌ای از جنس کربن است که به‌علت داشتن خواص فوق‌العاده سطحی توانایی بالایی در جذب، انتقال و رهایش الکترون و ترکیبات یونی و ملکولی دارد. این خواص باعث‌شده تا نانو اکسید گرافن به ماده‌ای منحصر‌به‌فرد در صنایع مختلف از جمله کشاورزی (ژنتیک و اصلاح، کنترل آفات و بیماری‌ها، تغذیه گیاهی و صنایع غذایی و غیره) تبدیل شود (Wang et al., 2010).

تاکنون درمقایسه با سایر نانومواد کربنی، مطالعات اندکی درباره تأثیر گرافن و نانو اکسید گرافن در کشاورزی صورت پذیرفته است و تنها تأثیر این مواد بر جوانه‌زنی، رشد گیاه و توسعه گونه‌های مختلف گیاهی ارزیابی شده است(Liu et al., 2010; Begum et al., 2011; Lee et al., 2012; Hu et al., 2014; Wang et al., 2014; Zhao et al., 2015; Cheng et al., 2016). گزارش شده است که گرافن می‌تواند از پوسته بذر گوجه‌فرنگی عبور کند و باعث افزایش جذب آب و به دنبال آن افزایش جوانه‌زنی گیاه شود (Khodakovskaya et al., 2009). مطالعات نشان داده است که تیمار نانو اکسید گرافن در غلظت‌های میکروگرم بر لیتر تأثیر مثبت بر جوانه‌زنی و رشد ریشه و اندام هوایی داشته است، اما افزایش غلظت آن به 100 میلی‌گرم بر لیتر باعث کاهش شدید رشد ریشه شده است (Wang et al., 2014; Zhao et al., 2015).

از سوی دیگر، Nair و همکاران (2012) به این نتیجه رسیدند که گیاه‌چه‌های برنج تیمارشده با گرافن رشد بهتری در مقایسه با گیاهان شاهد داشته‌اند. غلظت‌های پایین گرافن می‌تواند باعث افزایش جوانه‌زنی بذر شود. درحالی‌که در غلظت‌های بیشتر از 50 میلی‌گرم بر لیتر، نانو اکسید گرافن باعث کاهش سرعت و میزان جوانه‌زنی گیاه برنج شد (Nair et al., 2012). بر اساس مطالعات گذشته تأثیر نانوصفحات اکسید گرافن بر گیاهان وابسته به غلظت، زمان و گونه گیاهی است (Liu et al., 2010; Begum et al., 2011; Lee et al., 2012; Hu et al., 2014; Wang et al., 2014; Zhao et al., 2015; Cheng et al., 2016).

نانوصفحات اکسید گرافن دارای ضخامت زیر 10 نانومتر می‌توانند از ریشه‌ها به ساقه انتقال پیدا کنند و وارد سیتوپلاسم و کلروپلاست گیاه شوند (Chen et al., 2018; He et al., 2018). سایر مطالعات نشان دادند که نانو اکسید گرافن به‌راحتی توسط ریشه‌ها جذب می‌شود و در تارهای کشنده و سلول‌های پارانشیم ریشه تجمع می‌یابد ولی نمی‌توانند به اندام‌های هوایی گیاه انتقال یابند (Chen et al., 2017; Zhang et al., 2015). این نانوصفحات می‌توانند به بافت‌های گیاهی و سلول‌ها وارد شده و بر سیستم آنزیمی آنتی‌اکسیدانی (Moller et al., 2007) و متابولیسم سلولی گیاه (Hu et al., 2014) تأثیر گذارند. در مطالعه‌ای که توسط Begum و همکاران (2011) انجام شد، غلظت بیش از 500 میلی‌گرم بر لیتر نانو اکسید گرافن باعث کاهش اندازه و تعداد برگ‌های گیاهان کلم، گوجه‌فرنگی و اسفناج شد که این موضوع با تولید گونه‌های فعال اکسیژن، مرگ سلولی و نکروزه شدن برگ‌ها همراه بود.

به‌علت نتایج ضد و نقیضی که درباره تأثیر نانو اکسید گرافن به‌عنوان یکی از مهمترین و جدیدترین اجزای خانواده نانومواد کربنی بر گیاهان وجود دارد، در این مطالعه تأثیر نانو اکسید گرافن بر میزان کلروفیل و فعالیت آنتی‌اکسیدانی گیاه خیار در شرایط گلخانه‌ای بررسی شد.

مواد و روش‌ها

این تحقیق در دانشگاه لرستان با طول جغرافیایی 48 درجه و 22 دقیقه شرقی و عرض جغرافیایی 33 درجه و 29 دقیقه شمالی به‌صورت گلخانه‌ای انجام شد. نانو اکسید گرافن استفاده‌شده در این تحقیق از شرکت نانومواد گستران پارس تهیه شد. ویژگی‌های نانو اکسید گرافن مورد‌استفاده در شکل (1) نشان داده شده است که بیانگر ساختار صفحه‌ای و ترکیب شیمیایی دارای اکسیژن و کربن بوده و تنها از لحاظ ضخامت دارای قطر کمتر از 20 نانومتر است. این موضوع، نفوذ این ذرات را به درون گیاه محدود می‌کند.

شکل 1- الف. تصویر TEM نانو اکسید گرافن، ب. طیف رامان نانو اکسید گرافن، ج. تصویر XRD، د. اسپکتروسکوپی UV-VIS.

Figure 1. A. TEM image of nano graphene oxide, B. Raman spectra of nano graphene oxide, C. XRD image, D. UV-VIS spectroscopy.

بذرهای خیار، ابتدا توسط هیپوکلریت‌سدیم ١٥ درصد به‌مدت ٣٠ ثانیه ضدعفونی گردید و سپس سه‌بار با آب‌مقطر به‌دقت شستشو شد. 10 بذر ضدعفونی‌شده با اندازه یکسان انتخاب و روی کاغذ صافی 40 واتمن به‌فاصله یک سانتیمتر در پتری‌دیش‌های 100 میلی‌متری کشت شد. سپس 10 میلی‌لیتر محلول هوگلند به هر پتری‌دیش اضافه گردید. ظروف حاوی بذرها برای جوانه‌زنی به ژرمیناتور با دمای ١±٢٥ درجه سانتیگراد و رطوبت ٧٠ درصد منتقل و به مدت ده روز در این شرایط نگهداری شدند.

در این پژوهش، ریشه‌های نشاء خیار (Cucumis sativuss L.) رقم سلطان در محلول حاوی غلظت‌های مختلف نانو اکسید گرافن در 5 سطح (0، 4/0، 8/0، 2/1، 6/1 و 2 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) (Zhang et al., 2016) در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار در زمان‌های مختلف (30 و 60 دقیقه) قرارگرفتند (Nair et al., 2012; Gao et al., 2015). قابل‌ذکر است که ریشه‌های نشاء خیار پیش از انتقال به محیط‌کشت، به‌مدت 30 و 60 دقیقه با محلول نانو اکسید گرافن با غلظت‌های مختلف بر اساس الگوی طرح آزمایشی پیش‌تیمار شدند. عدم قرارگیری در محلول نانو اکسید گرافن به‌عنوان تیمار شاهد در نظر گرفته شد. این نشاها در شرایط هیدروپونیک به‌صورت شناور و به‌مدت 1 ماه با محلول غذایی هوگلند تغذیه شدند و پس از 30 روز گیاهان برداشت شدند (Chen et al., 2018). همچنین، محلول غذایی هر هفته تعویض شد. دما و رطوبت گلخانه در طول مدت آزمایش در 4±26 درجه سانتیگراد و 70 درصد رطوبت نسبی حفظ گردید.

گیاهان تیمار‌شده با نانوذرات اکسید گرافن در طول مدت کشت هیدروپونیک به‌روش کشت فیلم غذایی (Nutrient Film Technique-NFT) توسط محلول غذایی با ترکیب نهایی (نیتروژن 190، فسفر 42، پتاسیم 260، کلسیم 145، منیزیم 35، آهن 2، منگنز 75/0، روی 5/0، بُر 4/0، مس 1/0 و مولیبدن 05/0 میلی‌گرم بر لیتر) تغذیه شد (Peyvast and Barzegar, 2005). غلظت عناصر و نمک‌های استفاده‌شده در محلول غذایی در جدول (1) نشان داده شده است. قابل‌ذکر است که در ده روز اول محلول غذایی با قدرت یک‌سوم هوگلند و پس از آن از محلول با قدرت یک‌دوم هوگلند کامل استفاده شد. اسیدیته محلـول غـذایی بــا افــزودن 025/0 میلــی‌لیتــر در لیتــر فســفریک‌اســید و 062/0 میلی‌لیتر در لیتر نیتریک‌اسید، در محدوده 5/6 تنظیم شد و سایر مراقبت‌های لازم طبق معمول پرورش خیار گلخانه‌ای انجام شد.

جدول 1- غلظت عناصر و نمک‌های استفاده‌شده در محلول غذایی

Table 1. Concentration of elements and salts used in the nutrient solution

در پایـان آزمایش بــرای انــدازه‌گیــری وزن تــر اندام هوایی، بوته از طوقـه قطـع گردیـد و وزن خشـک نیز با قرار دادن نمونـه‌هـا به مدت ۴۸ ساعت در آون با دمـا ی ۷۰ درجـه سانتیگراد اندازه‌گیری شد.

اندازه‌گیری شاخص‌های فتوسنتزی

میزان کلروفیل نسبی برگ با استفاده از دستگاه کلروفیل‌متر دستی (SPAD، مدل Minolata 502) با نمونه‌های غیرتخریبی در دو مرحله اندازه‌گیری شد. میزان کلروفیل نسبی در برگ‌های توسعه‌یافته و درحال توسعه اندازه‌گیری شد و میانگین اعداد به‌دست‌آمده در هر بوته ثبت شد. قابل‌ذکر است که میزان کلروفیل نسبی در تمام گیاهان هر تیمار اندازه‌گیری شد و میانگین تمام گیاهان در هر تیمار به‌عنوان عدد نهایی گزارش شد. تعیین عملکرد فتوشمیایی (Fv/Fm) PSII به‌وسیله دستگاه کلروفیل فلوریمتر (Pocket PEA, Hansatech, Instruments Ltd., King’s Lynn, Norfolk, England) انجام شد. این دستگاه نسبت Fv/Fm را به‌صورت اتوماتیک محاسبه می‌کند که در آن Fm فلورسانس بیشینه، F₀ فلورسانس کمینه و Fv فلورسانس متغیر است (Nogues and Baker, 2000). بدین‌صورت‌که ابتدا با استفاده از گیره‌های مخصوص دستگاه، سطح برگ‌های جوان توسعه‌یافته به‌مدت 20 دقیقه در شرایط تاریکی قرار گرفت. سپس با اتصال رابط دستگاه به برگ، نسبت Fv/Fm در هر تیمار 6 بار خوانده شد و میانگین کل به‌عنوان عدد مورد نظر یادداشت گردید.

سنجش میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشا

میزان آسیب به غشا‌ها با اندازه‌گیری مقدار مالون‌دی‌آلدئید (MDA) به‌عنوان فرآورده نهایی پراکسیداسیون لیپیدهای غشاها تعیین شد. به‌منظور اندازه‌گیری مقدار مالون‌دی‌آلدئید، میزان 200 میلی‌گرم از نمونه‌های منجمد‌شده با 3 میلی‌لیتر تری‌کلرو‌استیک‌اسید 10% سائیده شد. نمونه‌ها پس از همگن‌سازی، سانتریفیوژ (BECKMAN MODEL J2-21M) (rpm12000، به‌مدت 15 دقیقه و دمای 4 درجه سانتیگراد) شدند. به یک میلی‌لیتر از نمونه‌های صاف‌شده، یک میلی‌لیتر تیو‌باربیتوریک‌اسید 5/0% اضافه گردید و نمونه‌ها به‌مدت 30 دقیقه در دمای 70 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. پس از این مدت نمونه‌ها بلافاصله بر روی یخ سرد قرار داده شدند و مقدار مالون‌دی‌آلدئید با اندازه‌گیری جذب در طول موج‌های 440، 532 و 600 نانومتر با استفاده از ضریب خاموشی )^1-cm^1-mM 157= ε) محاسبه شد (Hajnorouzi et al., 2011).

استخراج و سنجش آنزیمی

به‌منظور استخراج و اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌ها، برگ‌های فریزشده در هاون چینی ریخته و نیتروژن مایع به آن اضافه شد. سپس، برگ‌ها به‌خوبی کوبیده شد تا کاملاً خرد شوند. 5/0 گرم از پودر برگ آسیاب‌شده به میکروتیوب‌های 2 میلی‌لیتری منتقل شد و با افزودن یک میلی‌لیتر از بافر استخراج، نخست ورتکس شده و سپس به‌مدت 15 دقیقه با دور rpm 14000 در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شدند. قابل‌ذکر است که برای تهیه 50 میلی‌لیتر بافر استخراج، 607/0 گرم تریس را با 05/0 گرم PVP در 40 میلی‌لیتر آب مقطر به‌خوبی حل شد و سپس با کلریدریک‌اسید، اسیدیته محلول روی 8 تنظیم و پس از آن محلول به حجم نهایی 50 میلی‌لیتر رسانده شد و از آن برای عصاره‌گیری آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی استفاده شد. پس از اتمام سانتریفیوژ، عصاره رویی با استفاده از سمپلر برداشته شد و به میکروتیوب‌های 5/1 میلی‌لیتری منتقل شد و دوباره به‌مدت 10 دقیقه با دور rpm14000 در دمای 4 درجه سانتیگراد، سانتریفیوژ شدند. پس از اتمام سانتریفیوژ، عصاره رویی با استفاده از سمپلر به میکروتیوب‌های با همان حجم منتقل شدند. میکروتیوب‌های حاوی عصاره در زمان سایش برگ‌ها و سانتریفیوژ نمونه‌های دیگر در داخل ظرف یخ نگهداری شده و در صورت عدم استفاده، به فریزر 80- درجه سانتیگراد انتقال داده شد (Beauchamp and Fridovich, 1971). از این عصاره برای سنجش آنزیم‌های سوپراکسیددسموتاز و پراکسیداز استفاده شد.

ارزیابی میزان پروتئین کل محلول در عصاره (روش برادفورد)

برای محاسبه فعالیت اختصاصی آنزیم‌های مورد آزمون و تعمیم فعالیت آنزیم به میلی‌گرم پروتئین موجود در بافت، میزان پروتئین کل موجود در نمونه‌ها به روش برادفورد تعیین شد (Bradford, 1976). این روش بر مبنای اتصال رنگ کوماسی بریلیانت‌بلو موجود در معرف برادفورد به مولکول پروتئین استوار است.

تهیه محلول پایه پروتئین استاندارد

برای تهیه منحنی استاندارد ابتدا محلول پایه پروتئین تهیه شد. پنج میلی‌گرم از پروتئین استاندارد (ساخت کارخانه Fluka) در پنج میلی‌لیتر بافر فسفات‌سدیم 50 میلی‌مولار با اسیدیته 7 حل گردید و در دمای 20- درجه سانتیگراد نگهداری شد. پروتئین استاندارد استفاده‌شده آلبومین سرم گاوی BSA فراکسیون پنج بود.

سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسیددسموتاز (SOD, EC 1.15.1.1)

مخلوط واکنش برای سنجش فعالیت آنزیم شامل بافر فسفات 50 میلی‌مولار، متیونین 013/0 مولار، EDTA 1/0 میکرومولار و ریبوفلاوین 2 میکرومولار است که در تاریکی کامل نگهداری می‌شود. بلافاصله پس از اضافه کردن ریبوفلاوین، 3 میلی‌لیتر از مخلوط واکنش را درون لوله آزمایش ریخته و به هر لوله 100 میکرولیتر نمونه عصاره پروتئینی اضافه شد. لوله‌های آزمایش به مدت 16 دقیقه در فاصله 30 سانتی‌متری از منبع نور قرار گرفتند و در این فاصله دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 560 نانومتر و توسط محلول تاریکی به‌عنوان شاهد تنظیم شد. پس از 16 دقیقه جذب نمونه‌ها در طول موج مذکور خوانده شد (Giannopolitis and Ries, 1997).

سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز (POD, EC 1.11.1.7)

برای استخراج پراکسیداز محلول، 200 میلی‌گرم از نمونه منجمدشده را همرا با بافر فسفات‌سدیم mM 60 (با اسیدیته 1/6) در هاون روی یخ سائیده و سپس سانتریفیوژ (rpm15000، به‌مدت 30 دقیقه) شد. مخلوط واکنش شامل بافر فسفات‌سدیم mM60 (با اسیدیته 1/6)، گایاکول mM 28 و هیدروژن پراکسید mM 5 و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. جذب نمونه‌ها درطول زمان یک دقیقه در طول موج 470 نانومتر قرائت گردید (Sahebjamei et al., 2007).

اندازه‌گیری غلظت عناصر

غلظت عناصر غذایی نیتروژن، فسفر، پتاسیم، آهن، روی و مس با استفاده از روش خشک‌سوزانی انجام شد. فسفر به‌صورت رنگ‌سنجی و با استفاده از رنگ زرد وانادات‌مولیبدات با استفاده از اسپکتروفتومتر در طول موج 470 نانومتر، آهن، مس و روی توسط دستگاه جذب اتمی (Rayan et al.,2001)، پتاسیم به‌وسیله دستگاه فلیم فتومتر و به‌روش نشر شعله‌سنجی (Yazdanpanah and Motalebifard, 2016) و نیتروژن موجود نیز از روش تیتراسیون بعد از تقطیر در دستگاه کجلدال (Yazdanpanah and Motalebifard, 2016) اندازه‌گیری شد.

تجزیه و تحلیل داده‌ها

داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار آماری SPSS (نسخه 16) تجزیه و تحلیل شد. مقایسۀ میانگین‌ها با آزمون LSD در سطح احتمال 5 درصد و رسم نمودارها با نرم‌افزار Excel (نسخۀ 2007) انجام شد.

نتایج و بحث

تأثیر نانو اکسید گرافن بر طول ریشه و برگ

در این آزمایش دو هدف پیگیری می‌شود، هدف نخست ارزیابی تأثیر مقادیر مختلف نانو اکسید گرافن جذب سطحی‌شده در سطح ریشه بر کارایی جذب عناصر غذایی در زمان‌های مختلف و تأثیر بر شاخص‌های فیزیولوژیک و فتوسنتزی گیاه در شرایط بهینه تغذیه‌ای است. لذا به‌منظور نیل به این هدف، تمامی تیمارها با شاهد که شامل نشاهای بدون جذب سطحی نانو اکسید گرافن بودند، مقایسه گردید. در ادمه برای ارزیابی میزان تنش اکسیداتیو وارده بر گیاه در اثر جذب نانو اکسید گرافن درسطح ریشه، تغییرات میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشا و فعالیت آنزیم‌های سوپراکسیددسموتاز و پراکسیداز ارزیابی شد.

تأثیر غلظت‌ها و زمان‌های مختلف بر طول ریشه و طول برگ در جدول (2) نشان داده شده است. نتایج نشان داد که در زمان 30 دقیقه با افزایش غلظت نانو اکسید گرافن، طول ریشه به‌طور معنی‌داری افزایش یافت، درحالی‌که در زمان 60 دقیقه تفاوت معنی‌داری در طول ریشه بین غلظت‌های مختلف نانو اکسید گرافن مشاهده نشد. اما به‌طور کلی تیمار نانو اکسید گرافن باعث افزایش معنی‌دار طول ریشه نسبت به تیمار شاهد شد (جدول 2).

کاهش شدید طول ریشه کلم، گوجه‌فرنگی و اسفناج نسبت به گیاهان شاهد در غلظت‌های 500 و 1000 میلی‌گرم بر لیتر گرافن توسط Begum و همکاران (2011) گزارش شده است.همچنین، Jiao و همکاران (2016) تأثیر منفی غلظت‌های بیشتر از 20 میلی‌گرم بر لیتر نانو اکسید گرافن بر رشد طولی ریشه برنج را گزارش نمودند. البته این تفاوت در نتایج ممکن است به‌علت تفاوت در روش‌های مختلف کشت و شیوه استفاده از نانو اکسید گرافن (تلقیح بذر با نانو اکسید گرافن و یا تیمار ریشه گیاهچه با نانو اکسید گرافن) باشد.

با استفاده از تصاویر میکروسکوپی نشان داده شده است که نانو اکسید گرافن با جلوگیری از تشکیل تارهای کشنده در ریشه باعث افزایش طولی رشد ریشه می‌شود (Zhang et al., 2016). در واقع می‌توان فرض کرد که نانو اکسید گرافن باعث طویل شدن دیواره سلولی و پس آن باعث افزایش طول ریشه می‌گردد. افزایش طول ریشه گیاه با افزایش نانو اکسید گرافن را می‌توان به افزایش سنتز جیبرلیک‌اسید نسبت داد؛ به‌طوری‌که جیبرلیک‌اسید در بافت‌های در حال رشد و نمو گیاه سنتز شده و باعث افزایش طولی سلول‌های گیاه می‌شود (Yamaguchi, 2008).

جدول 2- تأثیر غلظت‌های مختلف نانو اکسید گرافن بر ویژگی‌های رشدی گیاه خیار. مقادیر میانگین 3 تکرار ± SD است. حروف متفاوت بیانگر اختلاف معنی‌دار در سطح 05/0p≤ است.

Table 2- The effect of different concentrations of nano graphene oxide on the growth characteristics of cucumber plant. Values are given as means ± SD from three replicates. Different letters indicate significant differences at p≤0.05.

تأثیر نانو اکسید گرافن بر وزن تر اندام هوایی و وزن خشک ریشه و اندام هوایی

نتایج نشان داد که اگرچه با افزایش غلظت نانو اکسید گرافن طول ریشه و برگ افزایش یافته است، ولی با افزایش غلظت این نانومواد، وزن خشک اندام هوایی ابتدا شروع به افزایش و سپس شروع به کاهش نموده است (جدول 2). به‌طوری‌که بیشترین وزن خشک اندام هوایی به‌ترتیب در تیمار 2/1 میلی‌گرم بر لیتر نانو اکسید گرافن مشاهده شد. همچنین، وزن خشک ریشه نیز با افزایش غلظت نانو اکسید گرافن ابتدا افزایش و سپس کاهش یافت (جدول 2). نتایج حاصل از تغییرات جذب عناصر غذایی از محلول غذایی (جدول 2) با الگوی افزایش وزن خشک اندام گیاهی در خیارهای تحت تیمار نانو اکسید گرافن مطابقت دارد و به‌نظر می‌رسد جذب سطحی نانو اکسید گرافن در ریشه با غظت و زمان بهینه توانسته است موجب بهبود جذب و انتقال عناصر غذایی در گیاه گردد. در واقع تغییرات در وزن تر و خشک پس از 60 دقیقه محسوس‌تر بود. وزن تر و خشک ریشه و اندام هوایی در غلظت‌های زیاد کاهش یافت که این نتایج با یافته‌های Begum و همکاران (2011) مطابقت داشت. آنها نشان دادند وزن تر و خشک اسفناج پس از 20 روز تیمار با غلظت 2000 میلی‌گرم بر لیتر گرافن به‌ترتیب 39% و 75% نسبت به شاهد کاهش یافته است. همچنین غلظت‌های بیشتر از 50 میلی‌گرم بر لیتر نانو اکسید گرافن باعث کاهش طول ریشه و وزن تر کلزا شده است (Cheng et al., 2016).

علت کاهش وزن تر و خشک ریشه و اندام هوایی (کاهش رشد گیاه) در غلظت‌های بالای نانو اکسید گرافن (3-5 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) به کمبود عناصر غذایی در محیط‌کشت نسبت داده شده است (Zhao et al., 2017). در واقع، نانو اکسید گرافن به‌علت دارا بودن گروه‌های عامل سطحی می‌تواند عناصری مثل کلسیم، منیزیم، فسفر و نیتروژن را جذب کند و باعث کاهش شدید آنها در محیط‌کشت شود. به‌عبارت‌دیگر، تغییرات متابولیک یا فیزیولوژیک گیاه در اثر وجود نانو اکسید گرافن ممکن است شدیدتر از سمیّت مستقیم نانو اکسید گرافن بر سلول‌های ریشه باشد که همین امر می‌تواند علت تأثیر منفی این ترکیبات بر تولید زیست‌توده ریشه و اندام هوایی باشد (He et al., 2016).

تأثیر نانو اکسید گرافن بر ویژگی‌های فتوسنتزی گیاه

نتایج نشان داد که به‌طور‌کلی، میزان کلروفیل نسبی در زمان 60 دقیقه کاهش بیشتری نسبت به زمان 30 دقیقه داشته است. بیشترین میزان کلروفیل نسبی مربوط به غلظت‌های 2/1 و 8/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر مربوط به زمان 30 دقیقه و کمترین میزان کلروفیل نیز پس از 60 دقیقه و در غلظت 2 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر مشاهده شد (شکل2). در واقع می‌توان گفت به کارگیری نانو اکسید گرافن اثر معنی‌داری بر میزان سنتز و بقای کلروفیل برگ در خیار دارد و به‌نظر می‌رسد میزان این اثرگذاری بستگی به غلظت نانو اکسید گرافن و زمان تماس دارد. به‌طوری‌که تا غلظت 2/1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر موجب افزایش سنتز کلروفیل در گیاه شده و پس از آن سنتز و پایداری کلروفیل کاهش می‌یابد که این امر با نتایج حاصل از جذب و انتقال عناصر متحرک در گیاه هم راستا است.

نتایج مطالعات پیشین نشان داد که با کاربرد 10 میلی‌گرم بر لیتر نانو اکسید گرافن، میزان کلروفیل هویج به‌طور معنی‌داری افزایش یافت (Siddiqui et al., 2019). همچنین، Hu و همکاران (2014) گزارش کردند که گرافن (200 میلی‌گرم بر لیتر) باعث تحریک تولید گلایکونیت‌اسید (glyconic acid) و آکونیتیک‌اسید (aconitic acid) می‌شود که این متابولیت‌ها همبستگی منفی معنی‌داری با بیوسنتز کلروفیل دارند. همچنین، Mousavi و همکاران (2019) گزارش کرده‌اند که کاهش محتوای کلروفیل ساقه‌های کشت‌شده بادرنجوبه در تیمار با آبسیزیک‌اسید پاسخی به شرایط تنش‌زا است که ممکن است به‌علت کاهش وزن تر یا سنتز کندتر یا نقص در سیستم فتوسنتزی گیاه طی تیمار آبسیزیک‌اسید رخ دهد. در واقع، تغییرات میزان کلروفیل از شاخص‌های مهمی است که تحمل گیاهان به تنش را توصیف می‌کند.

شکل 2- تأثیر غلظت‌های مختلف نانو اکسید گرافن در دو زمان 30 و 60 دقیقه بر میزان کلروفیل نسبی گیاه خیار. مقادیر میانگین 3 تکرار ± SD است. حروف متفاوت بیانگر اختلاف معنی‌دار در سطح 05/0p≤ است.

Figure 2- The effect of different concentrations of nano graphene oxide in 30 and 60 minutes on the chlorophyll content of cucumber. Values are given as means ± SD from three replicates. Different letters indicate significant differences at p≤0.05.

بازده کوانتومی PSII از مهم‌ترین شاخص‌های فلورسانس کلروفیل است که در گیاهان از طریق تعیین نسبت فلورسانس متغیر به فلورسانس بیشینه (Fv/Fm) اندازه‌گیری می‌شود. نتایج نشان داد که به استثنای تیمار 8/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر نانو اکسید گرافن، به‌طور‌کلی این نسبت در زمان 60 دقیقه در تمام تیمارها کمتر از 30 دقیقه بود. بیشترین میزان این نسبت به‌ترتیب در غلظت‌های 2/1 و 8/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر نانو اکسید گرافن برای هر دو زمان قرارگیری مشاهده شد (شکل 3). مطالعات نشان داده است که نانومواد کربنی از جمله گرافن توانایی نفوذ به سلول‌های اپیدرم و انتقال از طریق اندوسیتوز به دیواره سلولی، میتوکندری و کلروپلاست را دارند (Zhao et al., 2017). از‌آنجاکه نانوذرات گرافنی با‌توجه‌به ساختار لایه‌‌ای دارای محدودیت ابعادی بیشتری در جذب نسبت به سایر اشکال نانومواد کربنی هستند و الگوی تغییرات کلروفیل و کارایی فتوسنتزی با نتایج حاصل از تغییرات جذب و انتقال عناصر غذایی (جدول 2) مطابقت دارد، بنابراین به‌نظر می‌رسد نانو اکسید گرافن با کنترل جذب و انتقال عناصر غذایی گیاه بر عملکرد فتوسنتزی و گیاهی مؤثر بوده است.

تأثیر نانو اکسید گرافن بر میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشا

میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشا به‌منظور ارزیابی میزان تنش اکسیداتیو وارده به گیاه در این مطالعه ارزیابی شد. هنگامی‌که گیاه در معرض تنش قرار می‌گیرد، گونه‌های اکسیژن واکنش‌گر بیشتری تولید شده و باعث خسارت جدی به پروتئین‌ها و غشاها می‌شود. تأثیر نانو اکسید گرافن بر میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشا در شکل (4) نشان داده شده است. نتایج نشان داد که در غلظت‌های بیشتر از 2/1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر، غلظت‌ مالون‌دی‌آلدئید در ریشه‌های گیاه افزایش پیدا کرد و شدت این افزایش در تیمارهای 60 دقیقه بیشتر بود (شکل 4). این نتایج می‌تواند بر اثر تجمع بیشتر نانو اکسید گرافن در غلظت‌های بیشتر باشد. همچنین Hu و همکاران (2014) گزارش کردند که غلظت 200 میلی‌گرم بر لیتر نانو اکسید گرافن به تولید گونه‌های فعال اکسیژن منجر می‌شود که به دنبال آن باعث ایجاد خسارت جدی به ساختار سلولی و کلروپلاست می‌گردد. با‌وجوداین، Chen و همکاران (2017) و Lia و همکاران (2018) کاهش غلظت مالون‌دی‌آلدئید را در ریشه های گندم (1000 میلی‌گرم بر لیتر) و نشا درخت سیب (10 میلی‌گرم بر لیتر) تحت تیمار نانو اکسید گرافن مشاهده کردند.

شکل 3- تأثیر غلظت‌های مختلف نانو اکسید گرافن در دو زمان 30 و 60 دقیقه بر بیشینه کارایی فتوسنتز گیاه خیار. مقادیر میانگین 3 تکرار ± SD است. حروف متفاوت بیانگر  اختلاف معنی‌دار در سطح 05/0p≤ است

Figure 3- The effect of different concentrations of nano graphene oxide in 30 and 60 minutes on the maximum photosynthetic efficiency of cucumber plant. Values are given as means ± SD from three replicates. Different letters indicate significant differences at p≤0.05.

شکل 4- تأثیر غلظت‌های مختلف نانو اکسید گرافن در زمان 30 و 60 دقیقه بر غلظت مالون‌دی‌آلدئید ریشه. مقادیر میانگین 3 تکرار ± SD است. حروف متفاوت بیانگر اختلاف معنی‌دار در سطح 05/0p≤ است.

Figure 4- The effect of different concentrations of nano graphene oxide in 30 and 60 minutes on the concentration of malondialdehyde in the root. Values are given as means ± SD from three replicates. Different letters indicate significant differences at p≤0.05.

تأثیر نانو اکسید گرافن بر فعالیت آنزیم‌های سوپراکسیددیسموتاز و پراکسیداز

سیستم آنتی‌اکسیدانی، سیستمی دفاعی در مقابل تنش‌های محیطی است. بنابراین، فعالیت آنزیم‌های سوپراکسیددیسموتاز و پراکسیداز به‌منظور سنجش تأثیر نانو اکسید گرافن بر عملکرد سیستم آنتی‌اکسیدانی گیاه اندازه‌گیری شد. نتایج نشان داد که فعالیت هر دو آنزیم با افزایش غلظت نانو اکسید گرافن افزایش یافته است (شکل 5). در این مطالعه فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز و پراکسیداز به‌ترتیب در غلظت‌های بیشتر از 6/1 و 2/1 کاهش پیدا کرد (شکل 3). نتایج مشابه درباره کاهش فعالیت این دو آنزیم به‌وسیله سایر تنش‌های غیرزیستی مانند تنش خشکی، کم‌آبی و غیره در مطالعات پیشین نشان داده شده است (Liu et al., 2015; Jung, 2004). همچنین، Mazarie و همکاران (2019) نشان دادند که با افزایش میزان مصرف نانو دی‌اکسیدتیتانیوم فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز، آسکوربات‌پراکسیداز، کاتالاز و سوپراکسیددیسموتاز در گیاه مریم‌گلی افزایش یافت. در لوبیا (Phaseolus vulgaris) کاربرد غلظت‌های 400-800 میلی‌گرم بر لیتر نانو اکسید گرافن باعث افزایش فعالیت آنزیم آسکوربات‌پراکسیداز و کاتالاز شد، اما در غلظت‌های بیشتر (1600 میلی‌گرم بر لیتر) نتایج کاملاً برعکس بود (Anjum et al., 2014).

در واقع، گیاهان با افزایش فعالیت آنزیم‌هایی مانند سوپراکسیددیسموتاز و پراکسیداز، اثر تنش را تعدیل می‌کنند. در مطالعه Hu و همکاران (2014) نیز غلظت‌های بیشتر از 200 میلی‌گرم بر لیتر گرافن باعث کاهش فعالیت آنزیم‌های سوپراکسیددیسموتاز و پراکسیداز شد. مطالعات مختلف نشان داده است که نانو اکسید گرافن باعث تولید گونه‌های فعال اکسیژن و کاهش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی می‌شود. همچنین، نانو اکسید گرافن در غلظت‌های بالا به‌عنوان عاملی تنش‌زا باعث ایجاد اختلالات متابولیک مانند مهار سوخت و ساز کربوهیدارت‌ها و اسیدهای آمینه و افزایش نسبت اسیدهای چرب غیراشباع به اشباع می‌شود (Zhang et al., 2016; Chen et al., 2017). همچنین نتایج مطالعات Sun و همکاران (2007) نشان داده است که فعالیت آنزیم‌های آسکوربات‌پراکسیداز، کاتالاز و پراکسیداز با افزایش جذب نیتروژن و آهن از محیط‌کشت افزایش مــــی‌یابــــد.

کاهش فعالیت این دو آنزیم تحت تأثیر تنش‌های غیرزیستی به‌علت کاهش در بیوسنتز پروتئین‌ها در سطح ترجمه یا رونویسی است (Sandalio et al., 2001). همچنین، تولید بیش از اندازه گونه‌های فعال اکسیژن در مواجه با تنش‌های غیرزیستی گزارش شده است که علت این امر کاهش فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز و سوپراکسیددیسموتاز به‌واسطه تغییر اکسیداتیو آمینو اسید هیستیدین یا سایر آمینو اسیدها در مکان‌های فعال این دو آنزیم است (Romero-Puertas et al., 2002). غلظت و زمان تماس عوامل اصلی بر میزان و نوع تأثیر ترکیبات بر اندام‌های زیستی است. به‌نظر می‌رسد که کاربرد نانو اکسید گرافن توانست در غلظت‌های کمتر از 2/1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر و زمان تماس 30 دقیقه، با بهبود جذب و انتقال عناصر غذایی در خیار ضمن افزایش فتوسنتز گیاهی موجب تغییرات در فعالیت آنزیم‌های اکسیداتیو در خیار گردد. اگرچه هنوز مکانیسم دقیق تأثیر نانو اکسید گرافن بر فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان مشخص نیست، اما بر اساس مطالعه سان و همکاران (2007) افزایش فعالیت آنزیم‌های آسکوربات‌پراکسیداز، کاتالاز و پراکسیداز با افزایش جذب نیتروژن و آهن از محیط‌کشت افزایش می‌یابـد. مشاهده کردند. به‌نظر می‌رسد غلظت‌های بالای نانو اکسید گرافن در محیط‌کشت تأثیر منفی روی ساختار و عملکرد ریشه دارد که باعث کاهش مکان‌های جذب و افزایش تنش اکسیداتیو در گیاه، درنتیجه ایجاد گونه‌های اکسیژن واکنش‌گر می‌شود. افزایش تجمع گونه‌های اکسیژن واکنش‌گر در پاسخ به غلظت‌های بالای نانو اکسید گرافن از رونویسی ژن‌های مرتبط با تشکیل و رشد ریشه‌های مویین جلوگیری می‌کند (Moller et al., 2007).

شکل 5- الف. تأثیر غلظت‌های مختلف نانو اکسید گرافن در زمان 30 و 60 دقیقه بر فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز (الف) و آنزیم پراکسیداز (ب). مقادیر میانگین 3 تکرار ± SD است. حروف متفاوت بیانگر اختلاف معنی‌دار در سطح 05/0p≤ است.

Figure 5- The effect of different concentrations of nano graphene oxide in 30 and 60 minutes on superoxide dismutase activity (A) and peroxidase activity (B). Values are given as means ± SD from three replicates. Different letters indicate significant differences at p≤0.05.

تأ‌ثیر نانو اکسید گرافن بر غلظت عناصر غذایی اندام هوایی

بر اساس نتایج جدول شماره (2) نانو اکسید گرافن با تغییر میزان جذب عناصر از محلول غذایی موجب تغییر در غلظت عناصر در گیاه می‌گردد و نوع این تأثیر به شکل قابل جذب، بار سطحی، غلظت و زمان تماس این نانو مواد در محیط‌کشت وابسته است (Ghafariyan et al., 2013). در این تحقیق غلظت و زمان تیمار با نانو اکسید گرافن تأثیر معنی‌داری بر غلظت عناصر نیتروژن، پتاسیم، کلسیم و آهن داشت، اما تأثیر معنی‌داری بر غلظت فسفر و روی اندام هوایی نداشت. با افزایش غلظت نانو اکسید گرافن تا 6/1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر، روند افزایشی در غلظت نیتروژن در هر دو زمان 30 و 60 دقیقه مشاهده شد و با افزایش غلظت، روند کاهشی نیتروژن مشاهده گردید. بیشترین غلظت پتاسیم و آهن نیز در غلظت 2/1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر در هر دو زمان 30 و 60 دقیقه مشاهده شد. افزایش معنی‌داری در غلظت کلسیم در تیمار شاهد نسبت به تیمارهای نانو اکسید گرافن در هر دو زمان 30 و 60 دقیقه وجود داشت. به‌طور‌کلی نتایج نشان داد که 60 دقیقه تیمار ریشه گیاه خیار باعث کاهش بیشتری در غلظت عناصر غذایی در اندام هوایی نسبت به 30 دقیقه شده است.

به‌طور‌ویژه، گرافن می‌تواند بخشی از سطح ریشه را پوشانده و ورود عناصر معدنی به ریشه را مسدود کرده (Hu et al., 2014)، مانع هدایت هیدرولیکی ریشه شده و از تشکیل تارهای کشنده جلوگیری کند و باعث ایجاد تنش اکسیداتیو شود (Miralles et al., 2012). این تأثیرات نانو اکسید گرافن بر ریشه‌ها در نهایت می‌تواند سبب مهار جذب عناصر غذایی شود. همچنین، Hu و همکاران (2014) نشان دادند که نانو اکسید گرافن به‌طور معنی‌داری باعث تغییر در فراوانی متابولیت‌هایی همچون کربوهیدارت‌ها، اسیدهای آمینه و اسیدهای چرب در اندام هوایی گندم می‌شود. در واقع، نانو اکسید گرافن به‌علت دارا بودن گروه‌های عامل سطحی می‌تواند عناصری مانند کلسیم، منیزیم، فسفر و نیتروژن را جذب کند. میزان جذب و رهاسازی از سطح این ذرات به ایزوترم‌های جذب و رهاسازی، غلظت و نوع یون‌های محلول و تراکم بار سطحی ذرات وابسته است (Zhao et al., 2017).

به‌نظر می رسد مدت زمان تماس و غلظت نانو اکسید گرافن بر میزان جذب سطحی این ذرات در سطح ریشه مؤثر است. در زمان تماس30 دقیقه نسبت به 60 دقیقه سطح ریشه خیار جذب عناصر و رشد گیاه افزایش بیشتری داشته است. نتایج جدول شماره (3) نشان می‌دهد که نانو اکسید گرافن می‌تواند میزان و نوع جذب عناصر را کنترل کنند، چنانچه سطوح جذب ریشه بیش از حد توسط نانومواد پوشیده شود، رقابت در جذب مواد غذایی باعث کاهش جذب، انتقال و تعادل عناصر غذایی در گیاه می‌شود (Ratnikova et al.,2015).

نتایج جدول (3) نشان می‌دهد که افزایش بیش از 2/1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر نانو اکسید گرافن به محیط‌کشت باعث کاهش جذب، انتقال و تعادل تغذیه‌ای در خیار شده است. روند کاهشی غلظت عناصر در برگ و ریشه گیاه و نتایج جدول شماره (1) نشان می‌دهد که افزایش غلظت و زمان تماس نانو ذرات اکسیدگرافن می‌تواند با تغییر ویژگی‌های سطح ریشه (طول ریشه و ...) بر جذب و انتقال عناصر غذایی تأثیر گذارد. همچنین رانیکو و همکاران (2015) نشان دادند که اشکال مختلف نانوذرات کربنی در غلظت‌های مختلف می‌توانند بر جذب آب و عناصر غذایی در گوجه‌فرنگی مؤثر باشند (Ratnikova et al.,2015). نتایج مطالعه غفاریان مقرب و همکاران (2013) نشان داد که جذب نانوذرات آهن توسط سویا به شکل، اندازه و بارسطحی ذرات وابسته است (Ghafariyan et al.,2013).

جدول 3- تأ‌ثیر نانو اکسید گرافن بر غلظت عناصر غذایی. مقادیر میانگین 3 تکرار ± SD است. حروف متفاوت بیانگر اختلاف معنی‌دار در سطح 05/0p≤ است.

Table 3- Effect of nano graphene oxide on nutrient concentrations. Values are given as means ± SD from three replicates. Different letters indicate significant differences at p≤0.05.

جمع‌بندی

برای شناخت آثار غلظت و زمان‌های تماس مختلف نانوصفحات اکسید گرافن بر خیار تحقیقی در شرایط هیدروپونیک انجام شد. نتایج نشان داد که افزایش نانوصفحات اکسید گرافن به محیط‌کشت تا غلظت‌های 2/1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر موجب افزایش عملکرد و جذب عناصر غذایی و در غلظت‌های بیشتر از این مقدار موجب تغییر روند افزایش به کاهشی شد. کاهش عملکرد در غلظت‌های بیش از 2/1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر نانو اکسید گرافن را می‌توان به‌علت عدم تناسب بین مقدار جذب‌شده عناصر و نیاز گیاه و کاهش بیوسنتز کلروفیل و جذب فعال عناصر دانست. مدت زمان تماس نانو اکسید گرافن بر میزان جذب سطحی این ذرات در سطح ریشه مؤثر بود، به‌طوری‌که در زمان تماس30 دقیقه نسبت به 60 دقیقه سطح ریشه خیار به میزان مناسب‌تری توسط نانوذرات پوشش داده شد و جذب عناصر و رشد گیاه افزایش بیشتری داشت. بر اساس نتایج این تحقیق به‌نظر می‌رسد جذب سطحی نانو اکسید گرافن در غلظت و زمان مناسب توانسته موجب افزایش جذب و انتقال عناصر معدنی و در نتیجه افزایش زیست‌توده گردد که بر اساس مطالعات سان و همکاران (2007) افزایش فعالیت سیستم آنتی‌اکسیدانی دلالت بر این موضوع دارد. ازآنجاکه میزان و نوع بار سطحی ریشه‌های گونه‌های مختلف گیاهی متفاوت است، مطالعات بیشتری برای بررسی تأثیر این نانوصفحات نوظهور بر گیاهان مختلف نیاز است.