تأثیر ارتفاع بر تغییرات روزانه ظرفیت آنتی اکسیدانی و مهار نوری موقتی در گیاه Marrubium vulgare

مقدمه.

عصارۀ گیاه دارویی فراسیون (Marrubium vulgare L.) در درمان سرفه، زکام، آسم، ناراحتی‌های مجاری تنفسی فوقانی، اسهال مزمن و تب‌های مخاطی کاربرد دارد و فعالیت ضدالتهابی عصارۀ این گیاه بیشتر به‌علت وجود استرهای فنیل‌پروپانوئیدی است. گیاه دارویی فراسیون در شیب ارتفاعی مشخصی در میشوداغ واقع در شمال‌غرب ایران یافت می‌شود. این گیاهان در شرایط طبیعی، به‌ویژه در ارتفاعات، به‌طور اجتناب‌ناپذیری در معرض تابش نور مرئی و پرتوی فرابنفش شدید قرار می‌گیرند (Habibi and Ajory, 2015)؛ با افزایش شدت تابش، ظرفیت زنجیرۀ انتقال الکترون اشباع می‌شود و احتمال تنش اکسیداتیو افزایش می‌یابد. تنش اکسیداتیو با آسیب‌رساندن به بخش آزاد‌کنندۀ اکسیژن و تجزیۀ اجزای پلی‌پپتیدی فتوسیستم II سبب غیرفعال‌شدن فتوسیستم II می‌شود (Takahashi and Badger, 2011)؛ این تغییر با تحریک تولید گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) سبب ممانعت نوری و بروز آسیب اکسیداتیو در اجزای درونی سلول‌ها می‌‌شود (Habibi, 2014). گیاهان برای جلوگیری از آسیب‌رسیدن به فتوسیستم II، سازوکارهایی با عنوان سازوکارهای حفاظت نوری را در پیش می‌گیرند که ازجملۀ این سازوکارها می‌توان به حرکت برگ و کلروپلاست، انباشت فنل در اپیدرم برگ به‌منظور جذب پرتوی فرابنفش، فعال‌سازی سیستم دفاع آنتی‌اکسیدان آنزیمی و غیرآنزیمی (مانند انباشت کاروتنوئید، گلوتاتیون و ...)، افزایش عملکرد سازوکار خاموش‌شدگی غیرفتوشیمیایی فلورسانس کلروفیل طی انتقال الکترون و تنفس نوری اشاره کرد (Takahashi, 2010; Takahashi and Badger, 2011). در نورهای شدید، گیاهان از طریق جابه‌جایی کلروپلاست‌ها از شدت آسیب‌های نوری می‌کاهند و محل کلروپلاست‌ها در گیاهان، سرخس‌ها، خزه‌ها و جلبک‌های سبز به‌شکلی تغییر می‌یابد که شدت نور بهینه را جذب کند (Takahashi and Badger, 2011). در این گیاهان، کلروپلاست‌ها هنگام تابش نور ضعیف عمود بر راستای نور قرار می‌گیرند تا نور مؤثر را جذب کنند و در نور شدید، موازی با راستای نور قرار می‌گیرند تا از جذب مضاعف نور جلوگیری کنند (Tholen, 2008)؛ همچنین ترکیبات فیلترکننده و جاذب پرتوی فرابنفش در شرایط نور شدید و فرابنفش افزایش می‌یابند و همراه با افزایش انباشت کاروتنوئیدها، مانع تجزیۀ پروتئین D1 و آسیب به فتوسیستم II می‌شوند (Magaña et al., 2019). فعالیت سیستم جارو‌کنندۀ گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) از دیگر سازوکارهای حفاظت نوری در گیاهان است. گیاهان دو سیستم پاسخ‌دهندۀ آنتی‌اکسیداتیو شامل سیستم آنزیمی (آنزیم‌های آسکوربات‌پراکسیداز، کاتالاز، سوپراکسید دیسموتاز، پراکسیداز و ...) و سیستم غیر‌آنزیمی (آسکوربات، گلوتاتیون احیا‌شده و توکوفرول) علیه ROS دارند. مهار نوری شامل دو نوع مهار نوری بلندمدت و مزمن (Chronic photoinhibition) و مهار نوری موقتی یا دینامیک (Dynamic photoinhibition) است (Hopkins, 2008). مهار نوری بلندمدت و مزمن در نهایت سبب بروز آسیب نوری می‌شود، ولی مهار نوری دینامیک نوعی سازگاری و یکی از سازوکارهای حفاظت نوری برای جلوگیری از آسیب بیشتر فتوسیستم‌ها محسوب می‌شود (Murchie and Niyogi, 2011; Betancor et al., 2015).

پاسخ به افزایش ارتفاع و سازگاری گونه‌های مختلف بر اساس سازوکارهای متفاوتی انجام می‌شود و در برخی گیاهان، حتی برگ‌های مختلف یک گیاه پاسخ‌های متفاوتی به شرایط متغیر محیطی می‌دهند که با ریخت‌شناسی آن برگ‌ها ارتباط دارد (Habibi and Ajory, 2015). تاکنون مطالعه‌ای انجام نشده است که تفاوتظرفیت آنتی‌اکسیدانی و مهار نوری دینامیک را در اکوتیپ‌های یک گونۀ دارویی در ارتفاع‌های مختلف رویشگاه طبیعی مشخص کند. در پژوهش حاضر، تفاوت سازوکارهای حفاظت نوری و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی اکوتیپ‌های گیاه فراسیون در دو ارتفاع مختلف از طریق اندازه‌گیری فعالیت فتوشیمیایی فتوسنتز و سیستم جارو‌کنندۀ ROS مطالعه شد.

مواد و روش‌ها

جمع‌آوری گیاه: دراواسط خردادماه سال 1396، نمونه‌های برگی اکوتیپ‌های مختلف گیاه Marrubium vulgareپس‌از اندازه‌گیری فلورسانس کلروفیل برگ‌ها، از ارتفاع‌های 1100 و 2200 متری کوه میشوداغ واقع در بخش یام مرند در فاصلۀ 65 کیلومتری جنوب شهر تبریز (45 درجه و 38 دقیقۀ شرقی و 38 درجه و 22 دقیقۀ شمالی) جمع‌آوری و بی‌درنگ به نیتروژن مایع منتقل شدند. انواع سنجش‌ها در آزمایشگاه و با استفاده از نمونه‌های ذخیره‌شده در نیتروژن مایع انجام شدند. برداشت نمونه‌های دو اکوتیپ به‌طور هم‌زمان و پیش ‌از آغاز فاز زایشی در ساعت‌های 8، 11، 14، 17 و 20 انجام شد.

.سنجش شاخص‌های فلورسانس کلروفیل وآزمون JIP: دستگاه فلورسانس‌سنج (PEA, Hansatech Instruments Ltd., King’s Lynn, Norfolk, PE 32 1JL, Engl) برایتعیین فلورسانس کلروفیل استفاده شد و شاخص‌های فلورسانس کلروفیل در برگ‌های سازش‌یافته با تاریکی (به‌مدت دست‌کم 20 دقیقه) شامل F₀(فلورسانس پایه) و F_m(فلورسانس بیشینه) اندازه‌گیری شدند. به‌منظور رسم منحنی فلورسانس از آزمون JIP بهره گرفته شد. آزمون JIP داده‌های ثبت‌شدۀ اولیه با دستگاه فلورسانس‌سنج را به شاخص‌های بیوفیزیکی تبدیل و کمیت مراحل جریان انرژی طی فتوسیستم II را تعیین می‌کند. در این دستگاه از نور قرمز با طول موج 627 نانومتر و شدت 3500 میکرومول بر مترمربع بر ثانیه (به‌منظور اطمینان از رسیدن به پیک F_m) برای تولید منحنی فلورسانس OJIP (O-J-I-P rise) استفاده می‌شود. شاخص‌های زیر در اندازه‌گیری‌های فلورسانس اولیه استفاده شدند:

شدت فلورسانس بیشینه (F_m)، شدت فلورسانس در 50 میکروثانیه (فلورسانس پایه)، شدت فلورسانس در 300 میکروثانیه (F_300µs)، نسبت فلورسانس متغیر (V) و شدت فلورسانس در 2 میلی‌ثانیه (مرحلۀ J) که نشان‌دهندۀ F_J است؛ سپس محاسبه‌های لازم برای به‌دست‌آوردن سایر شاخص‌ها شامل شاخص کارایی فتوسیستم‌ها (PI_abs)، بیشینه عملکرد کوانتومی فتوسیستم II (F_v/F_m)، عملکرد مراکز واکنش فتوسیستم (RC/CS)، توان به‌دام‌انداختن انرژی تهییج‌شده (TR_o/CS)، میزان انتقال الکترون در واحد تهییج‌شدۀ برگ‌ها (ET_o/CS)، جذب انرژی نورانی در هر مرکز واکنش (ABS/RC)، جریان انرژی نورانی در هر مرکز واکنش (DI/RC)، عملکرد کوانتومی انتقال الکترون (φE_o)، ضریب فروکش غیرفتوشیمیایی (k_N)، ضریب فروکش فتوشیمیایی (k_P)، نسبت فلورسانس متغیر در فاز J منحنی فلورسانس (V_j) و فعالیت کمپلکس فتولیزکنندۀ آب (F_v/F_o) انجام شدند (Strasser et al., 2004). به‌منظور رسم منحنی گذار فلورسانس کلروفیل از نرم‌افزار PEA Plus V1.10 استفاده شد. در منحنی گذار فلورسانس OJIP برگ‌ها، گذار فلورسانس کلروفیل از سطح پایه «O» (فلورسانس کمینه) به سطح «J» که حدود 2 میلی‌ثانیه طول می‌کشد، به احیای QA به‌وسیلۀ فتوسیستم II مربوط می‌شود. تداوم فلورسانس از سطح «J» به سطح «I» که حدود 30 میلی‌ثانیه طول می‌کشد، با احیای کامل ذخایر پلاستوکوئینونی (PQ) مرتبط است. گذار فلورسانس از سطح «I» به سطح «P» نتیجۀ احیای جایگاه گیرندۀ الکترون PSI است (Kalaji et al., 2011).

سنجش رنگیزه‌های برگ: به‌منظور سنجش مقدار رنگیزه‌ها، نمونه‌های گیاهی با آب دوبار تقطیر شستشو و روی کاغذ صافی خشک شدند. پس‌از اندازه‌گیری وزن تر (تقریباً 200 میلی‌گرم)، نمونه‌ها درون ورقۀ آلومینیومی قرار گرفتند و تا زمان سنجش در ازت مایع نگهداری شدند. استخراج رنگیزه با حلال استون روی یخ و به کمک هاون چینی سرد انجام شد. غلظت کلروفیـل‌ها و کاروتنوئیدها پس‌از 24 ساعت استخـراج در استون 100 درصد با دستگاه اسپکتروفتومتر تعییـن شد؛ به‌این‌ترتیب که جذب در 662، 645 و 470 نانومتر اندازه‌گیـری و غلظت کلروفیل‌های a، b و کاروتنوئیدها مطابق روابط زیر به دست آمد (Lichtenthaler and Wellburn, 1985).

C_a = 11.75 A₆₆₂ - 2.350 A₆₄₅

C_b = 18.61 A₆₄₅ - 3.960 A₆₆₂

C_x+c = 1000 A₄₇₀ - 2.270 C_a - 81.4 C_b/22

C_a= کلروفیل a، C_b= کلروفیل b، C_x+c= کاروتنوئید کل، A= جذب در طول موج مدنظر

سنجش فعالیت آنزیم‌ها و متابولیت‌های سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانی: فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز (SOD) مطابق روش Giannopolitis و Ries (1977) و بر اساس درصد ممانعت از احیای NBT (nitro blue tetrazolium) به ترکیب ارغوانی‌رنگ دی‌فورمازان به‌وسیلۀ رادیکال سوپراکسید (O₂^•-) حاصل از فتولیز ریبوفلاوین به‌واسطۀ آنزیم موجود در عصاره اندازه‌گیری شد. نمونه‌های برگ پس‌از برداشت بی‌درنگ در نیتروژن مایع پودر شدند و عصارۀ آنزیمی در بافر 25 میلی‌مولار HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) با اسیدیتۀ 8/7 و حاوی EDTA با غلظت 1/0 میلی‌مولار استخراج شد. عصاره‌ها به‌مدت 15 دقیقه در g15000 سانتریفیوژ شدند و روشناور برای سنجش فعالیت استفاده شد. مقدار 100 میکرولیتر از روشناور به 1 میلی‌لیتر از محلول واکنشی شامل HEPES 25 میلی‌مولار با اسیدیتۀ 6/7، EDTA 1/0 میلی‌مولار، Na₂CO₃ 50 میلی‌مولار با اسیدیتۀ 2/10، L- متیونین 12 میلی‌مولار، NBT 75 میکرومولار و ریبوفلاوین 1 میکرومولار اضافه شد و به‌منظور انجام واکنش، مخلوط حاصل به‌مدت 20 دقیقه در شدت نور تقریباً 8000 لوکس قرار گرفت. به‌منظور تهیۀ نمونه‌های شاهد، مخلوط یادشده بدون افزودن عصارۀ آنزیمی تهیه و جذب نمونه‌ها در 560 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد. یک واحد فعالیت آنزیم بر اساس مقدار پروتئین آنزیمی لازم برای القای 50 درصد ممانعت از احیای NBT در مقایسه با نمونه‌های شاهد بدون عصارۀ آنزیمی محاسبه و به‌شکل Unit mg^-1 protein بیان شد.

فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) مطابق روش Simon و همکاران (1974) و بر اساس کاهش جذب پراکسیدهیدروژن (H₂O₂) در 240 نانومتر تعیین شد. پس‌از پودر‌شدن نمونه‌ها در نیتروژن مایع، عصارۀ آنزیمی در بافر فسفات‌پتاسیم با غلظت 50 میلی‌مولار و اسیدیتۀ 7 استخراج و به‌مدت 10 دقیقه در g10000 سانتریفیوژ شد. به‌منظور سنجش فعالیت آنزیم، مقدار مناسبی از عصاره به محلول واکنش شامل بافر فسفات 50 میلی‌مولار با اسیدیتۀ 7 و H₂O₂ 10 میلی‌مولار افزوده و تغییرات جذب به‌مدت دو دقیقه با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد؛ درنهایت، فعالیت آنزیم بر اساس ضریب خاموشی H₂O₂ (mM^-1 cm^-1 041/0( بر حسب μM H₂O₂ mg^-1 protein min^-1  محاسبه شد.

غلظت پراکسیدهیدروژن (H₂O₂) بر اساس روش Velikova و همکاران (2000) به دست آمد. محلول استخراج برگ‌ها، محلول 1/0 درصد (وزنی/حجمی) تری‌کلرواستیک‌اسید (TCA) بود. عصاره‌ها به‌مدت 15 دقیقه در g12000 سانتریفیوژ شدند و روشناور استفاده شد. مقدار 500 میکرولیتر از عصاره به 1 میلی‌لیتر محلول واکنشی شامل بافر فسفات‌پتاسیم 10 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 7) و یدید‌پتاسیم 1 مولار اضافه و به‌منظور انجام واکنش، مخلوط حاصل به‌مدت 60 دقیقه در تاریکی قرار داده شد. جذب نمونه‌ها در390 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد. مقادیر بر اساس منحنی استاندارد H₂O₂ در محدودۀ صفر تا 50 نانومول محاسبه شدند.

سنجش مالون‌دی‌آلدئید (MDA) (معیاری برای بررسی میزان پراکسیداسیون لیپیدها) بر اساس روش Boominathan و Doran (2002) انجام شد. عصارۀ گیاهی در محلول 1/0 درصد (وزنی/حجمی) تری‌کلرواستیک‌اسید (TCA) استخراج و به‌مدت 5 دقیقه در g10000 سانتریفیوژ شد. روشناور با محلول 20 درصد TCA حاوی 5/0 درصد تیوباربیتوریک‌اسید با نسبت 1 به 4 در لولۀ آزمایش مخلوط شد و به‌مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 95 درجۀ سانتی‌گراد قرار گرفت؛ سپس لوله‌ها به‌سرعت در یخ سرد و به‌مدت 15 دقیقه در g10000 سانتریفیوژ شدند. هم‌زمان با عصاره‌های گیاهی، محلول‌های استاندارد نیز در محدودۀ صفر تا 100 نانومول از 1،1،3،3- تترا اتوکسی‌پروپان تهیه شدند و جذب نمونه‌ها در 532 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد؛ درنهایت، مقدار MDA نمونه‌ها بر حسب nmol g^-1 FW محاسبه شد.

به‌منظور اندازه‌گیری پروتئین کل، عصارۀ پروتئینی در بافر فسفات‌سدیم با غلظت 50 میلی‌مولار و اسیدیتۀ 8/6 استخراج و به‌مدت 20 دقیقه در g15000 سانتریفیوژ شد؛ روشناور حاصل برای سنجش پروتئین کل به روش Bradford (1976) استفاده شد.

سنجش فعالیت آنزیم فنیل‌آلانین‌آمونیا‌لیاز: فعالیت آنزیم فنیل‌آلانین‌آمونیا‌لیاز (PAL) مطابق روش Zucker (1965) اندازه‌گیری شد؛ به‌این‌ترتیب که ابتدا عصارۀ آنزیمی در بافر سدیم‌فسفات 50 میلی‌مولار با اسیدیتۀ 8/7 و حاوی اتیلن‌دی‌آمین‌تترااستیک‌اسید (EDTA) با غلظت 2 میلی‌مولار، مرکاپتواتانول 18 میلی‌مولار و 1/0 درصد تریتون X-100 استخراج شد. عصاره‌ها به‌مدت 15 دقیقه در g15000 سانتریفیوژ شدند و روشناور برای سنجش فعالیت استفاده شد. مقدار 100 میکرولیتر از عصاره به 1 میلی‌لیتر محلول واکنشی شامل بافر سدیم‌بورات 50 میلی‌مولار (اسیدیتۀ 8/8) و L- فنیل‌آلانین 5 میلی‌مولار اضافه و به‌منظور انجام واکنش، مخلوط حاصل به‌مدت 60 دقیقه در دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد قرار گرفت. جذب نمونه‌ها در 290 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر تعیین شد. یک واحد فعالیت آنزیم بر اساس غلظت پروتئین آنزیمی لازم برای تولید 1 نانومول سینامیک‌اسید محاسبه شد.

سنجش فنل کل: ازآنجاکه بیشترین ترکیبات فنلی گیاهان از نوع پلی‌فنل‌ها هستند، روش معرف فنلی فولین‌سیو‌کالتیو (Mavi et al., 2004) برای سنجش فنل کل استفاده شد؛ به این منظور، 5 گرم برگ به کمک هاون پودر و سپس به‌مدت 30 دقیقه در 100 میلی‌لیتر آب مقطر جوشانده شد؛ درنهایت، نمونه با کاغذ واتمن شمارۀ 42 صاف شد. مقدار 250 میکرولیتر معرف فولین با 25 میکرولیتر عصاره و 500 میکرولیتر محلول آبی کربنات‌سدیم 20 درصد مخلوط شد. نمونه‌های شاهد بدون عصاره بودند. پس‌از قرار‌دادن نمونه‌ها به‌مدت 30 دقیقه در دمای آزمایشگاه، جذب نمونه‌ها در طول موج 765 نانومتر اندازه‌گیری شد و غلظت فنل کل بر اساس منحنی استاندارد گالیک‌اسید به دست آمد. سنجش برای هر عصاره چهار بار تکرار شد و میانگین فنل کل موجود در عصارۀ تیمارها به‌شکل میلی‌گرم گالیک‌اسید در گرم بافت بیان شد.

به‌منظور سنجش فلاونوئیدها، نمونه‌های برگ در متانول حاوی آلومینیوم‌کلرید 2 درصد استخراج شدند و پس‌از سانتریفیوژ، روشناور برداشت و جذب آن در طول موج 415 نانومتر خوانده شد. غلظت‌های مختلف کوئرستین (صفر تا 16 میلی‌گرم‌در‌لیتر) برای استاندارد استفاده شدند و مقدار فلاونوئیدها بر اساس mg quercetin g^-1 FW محاسبه شد (Sarikurkcu et al., 2008).

سنجش مهار رادیکال‌های دی‌فنیل ‌پیکریل‌هیدرازین توسط ژل برگ: به‌منظور سنجش فعالیت آنتی‌اکسیدانی عصاره به روش مهار 2، 2- دی‌فنیل-1- پیکریل‌هیدرازین (DPPH) (Lee et al., 1998)، ابتدا عصارۀ 10 گرم وزن تر در 100 میلی‌لیتر متانول به‌مدت 8 ساعت و با هم‌زن مغناطیسی در دمای آزمایشگاه استخراج شد. مقدار 250 میکرولیتر از غلظت‌های مختلف عصاره (رقیق‌شده بین 1/0 تا 2 میلی‌گرم‌در‌میلی‌لیتر) با 450 میکرولیتر بافر تریس- کلریدریک‌اسید (اسیدیتۀ 4/7) و 1 میلی‌لیتر محلول متانولی دی‌فنیل‌پیکریل‌هیدرازین (1/0 میلی‌مولار) مخلوط شد. نمونه‌های شاهد متانول را به‌جای عصاره دریافت کردند. پس‌از گذشت 30 دقیقه در دمای آزمایشگاه و تاریکی، جذب نمونه‌ها در 517 نانومتر اندازه‌گیری شد و فعالیت آنتی‌اکسیدانی عصاره‌ها بر اساس درصد مهار رادیکال‌های دی‌فنیل‌پیکریل‌هیدرازین از رابطۀ زیر به دست آمد:

جذب شاهد/(جذب نمونه-جذب شاهد)×100=درصد مهار (I%)

بررسی آماری نتایج: هر تیمار دارای چهار تکرار مستقل بود. نمونه‌برداری از طبیعت برای هر دو اکوتیپ به‌طور هم‌زمان و یک بار انجام شد. باتوجه‌به وجود دو رویشگاه و چند مرحله نمونه‌برداری، تجزیه واریانس دوطرفه برای تجزیه‌وتحلیل آماری داده‌‌ها استفاده شد. میانگین و انحراف معیار (SD) داده‌ها و رسم نمودارها با نرم‌افزار Excel 2007 انجام شد. به‌منظور تجزیه‌و‌تحلیل آماری از نرم‌افزار Sigma Stat 3.5 استفاده و برای مقایسۀ میانگین تیمارها (معادل اکوتیپ‌ها) از آزمون Tukey در سطح احتمال 05/0≥P بهره گرفته شد.

نتایج

سنجش شدت تابش نور در ارتفاعات میشوداغ در اواسط خردادماه نشان داد در بازۀ زمانی ساعت‌ 14 تا 17 عصر، گیاهان در معرض بیشترین شدت تابش قرار دارند (شکل 1). مقایسۀ محتوای رنگیزه‌های فتوسنتزی در برگ‌های گیاهان ارتفاع پایین و بالا نشان داد برگ‌های گیاهان ارتفاع بالا نسبت به برگ‌های گیاهان ارتفاع پایین مقادیر کلروفیل b و کاروتنوئید بیشتری دارند. بررسی رنگیزه‌های فتوسنتزی طی ساعت‌های مختلف روز نشان داد مقدار رنگیزه‌های فتوسنتزی برگ‌های گیاهان ارتفاع پایین و بالا نوسان روزانه ندارد (شکل 1).

شکل 1- تغییرات روزانۀ شدت تابش نور (میکرومول بر مترمربع بر ثانیه) (A)، نسبت کلروفیل a به b (B) و کاروتنوئیدهای (C)اکوتیپ‌های Marrubium vulgare در رویشگاه طبیعی. اعداد میانگین 4 تکرار ± StD (انحراف معیار) هستند و میانگین‌هایی که حداقل یک حرف مشترک دارند، اختلاف معنا‌داری با یکدیگر در سطح احتمال 95 درصد با آزمون توکی ندارند.

بررسی شاخص کارایی فتوسیستم‌ها (PI_abs) و بیشینه عملکرد کوانتومی فتوسیستم II (F_v/F_m) در برگ‌های گیاهان ارتفاع پایین و بالا نشان داد اگرچه مقدار بیشینه عملکرد کوانتومی فتوسیستم II در برگ‌های ارتفاع بالا تفاوت معناداری با برگ‌های ارتفاع پایین ندارد، مقدار این شاخص در برگ‌های ارتفاع بالا در ساعت‌های 14 و 17 کاهش معناداری نسبت به ساعت‌های صبح نشان می‌دهد (شکل 2). کاهش مقدار بیشینه عملکرد کوانتومی فتوسیستم II در برگ‌های ارتفاع بالا در ساعت‌های 14 و 17 کوتاه‌مدت و گذرا بود و در ساعت 20 به مقدار اولیه بازگشت؛ همچنین شاخص کارایی فتوسیستم‌های برگ‌های گیاهان ارتفاع پایین و بالا کاهش معناداری در ساعت‌های بعدازظهر نشان داد.

بررسی تغییرات منحنی فلورسانس OJIP با استفاده از آزمون JIP در گیاه Marrubium در شرایط طبیعی نشان داد برگ‌های ارتفاع بالا افزایش شدت فلورسانس را در فاز J‒O نشان می‌دهند (شکل 3). شدت فلورسانس در فاز IP تغییر محسوسی را در برگ‌های ارتفاع پایین و بالا نشان نداد.

بررسی تأثیر ارتفاع بر شاخص‌های مختلف فلورسانس کلروفیل در ساعت 14 ظهر نشان داد برگ‌های گیاهان ارتفاع بالاتر در مقایسه با برگ‌های گیاهان ارتفاع پایین‌تر دارای عملکرد کوانتومی انتقال الکترون (φE_o)، فعالیت کمپلکس فتولیزکنندۀ آب (F_v/F_o) و شاخص کارایی فتوسیستمی (PI_abs) کمتری هستند (شکل 4). کاهش شاخص‌های یادشده با افزایش شاخص‌های جریان انرژی نورانی در هر مرکز واکنش (DI/RC)، جذب انرژی نورانی در هر مرکز واکنش (ABS/RC)، فلورسانس متغیر در فاز J منحنی فلورسانس (V_j) و ضریب فروکش غیرفتوشیمیایی (k_N) در برگ‌های گیاهان ارتفاع بالاتر همراه بود.

مقایسۀ متابولیسم فنلی در برگ‌های گیاهان ارتفاع پایین و بالا نشان داد برگ‌های گیاهان ساکن ارتفاع بالا در مقایسه با برگ‌های گیاهان ساکن ارتفاع پایین دارای مقادیر زیادی فنل کل و فلاونوئید هستند (شکل 5). افزایش مقدار فنل کل و فلاونوئید در برگ‌های گیاهان ارتفاع بالا با افزایش فعالیت آنزیم فنیل‌آلانین‌آمونیالیاز (PAL) همراه بود؛ هرچند افزایش شدت تابش در طول روز و طی ساعت‌های 14 و 17 تغییر معناداری در مقادیر فنل کل و فلاونوئید و فعالیت آنزیم PAL ایجاد نکرد (شکل 5).

شکل 2- تغییرات روزانۀ شاخص‌های بیشینه عملکرد کوانتومی فتوسیستم II (F_v/F_m) (A) و شاخص کارایی فتوسیستم‌های (PI_abs) (B) اکوتیپ های Marrubium vulgare در رویشگاه طبیعی. اعداد میانگین 4 تکرار ± StD (انحراف معیار) هستند و میانگین‌هایی که حداقل یک حرف مشترک دارند، اختلاف معنا‌داری با یکدیگر در سطح احتمال 95 درصد با آزمون توکی ندارند.

شکل 3- تغییرات منحنی فلورسانس OJIP(محور عمودی شدت فلورسانس و محور افقی زمان بر اساس میکروثانیه است) در اکوتیپ‌های Marrubium vulgare در رویشگاه طبیعی در ساعت 14 ظهر. به‌منظور تولید منحنی فلورسانس OJIP، از نور قرمز با طول موج 627 نانومتر و شدت 3500 میکرومول بر مترمربع بر ثانیه (برای اطمینان از رسیدن به پیک F_m) استفاده شد.

شکل 4- تأثیر ارتفاع بر نمودار راداری تغییرات شاخص‌های مختلف فلورسانس کلروفیل در اکوتیپ‌های Marrubium vulgare در رویشگاه طبیعی در ساعت 14 ظهر

بررسی فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی سوپراکسیداز و کاتالاز در برگ‌های گیاهان ساکن ارتفاع‌های مختلف گیاه Marrubium vulgare در رویشگاه طبیعی نشان داد مقدار فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی سوپراکسیداز و کاتالاز در برگ‌های ساکن ارتفاع بالا در مقایسه با برگ‌های ساکن ارتفاع پایین بیشتر است (شکل 6)؛ همچنین بررسی تغییرات روزانۀ فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی سوپراکسیداز و کاتالاز در برگ‌های گیاهان ساکن ارتفاع‌های مختلف گیاه Marrubium vulgare در رویشگاه طبیعی نشان داد بیشترین فعالیت آنزیم آنتی‌اکسیدانی سوپراکسیداز به نمونه‌های برداشت‌شده در ساعت 14 و بیشترین فعالیت آنزیم آنتی‌اکسیدانی کاتالاز به نمونه‌های برداشت‌شده در ساعت‌های 14 و 17 تعلق دارد.

شکل 5- تغییرات روزانۀ مقدار فنل (A)، فلاونوئید (B) و فعالیت آنزیم فنیل‌آلانین‌آمونیالیاز (PAL) (C) در اکوتیپ‌های Marrubium vulgare در رویشگاه طبیعی. اعداد میانگین 4 تکرار ± StD (انحراف معیار) هستند و میانگین‌هایی که حداقل یک حرف مشترک دارند، اختلاف معنا‌داری با یکدیگر در سطح احتمال 95 درصد با آزمون توکی ندارند.

شکل 6- تغییرات روزانۀ فعالیت آنزیم‌های سوپراکسید‌دیسموتاز (SOD) (A) و کاتالاز (CAT) (B) در اکوتیپ‌های Marrubium vulgare در رویشگاه طبیعی. اعداد میانگین 4 تکرار ± StD (انحراف معیار) هستند و میانگین‌هایی که حداقل یک حرف مشترک دارند، اختلاف معنا‌داری با یکدیگر در سطح احتمال 95 درصد با آزمون توکی ندارند.

بیشترین فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز که به نمونه‌های برداشت‌شده در ساعت 14 تعلق داشت، با افزایش مقدار انباشت پراکسیدهیدروژن در برگ‌های گیاهان ارتفاع بالا همراه بود (شکل 7)؛ هرچند افزایش مقدار انباشت پراکسیدهیدروژن در برگ‌های گیاهان ارتفاع بالا طی ساعت‌های بعدازظهر سبب افزایش معنادار مقدار مالون‌دی‌آلدئید (شاخص پراکسیداسیون لیپیدها) نشد (شکل 7).