پیوندهای مفید
اخبار و اعلانات
آمار
| تعداد نشریات | 43 |
| تعداد شماره‌ها | 1,714 |
| تعداد مقالات | 14,051 |
| تعداد مشاهده مقاله | 34,027,073 |
| تعداد دریافت فایل اصل مقاله | 13,626,210 |
بررسی اثر مهارکنندگی کیتوزان بر سیستم حدّنصاب احساس باکتری Pseudomonas syringae pv. syringae 3289 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| زیست شناسی میکروبی | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مقاله 3، دوره 10، شماره 37، فروردین 1400، صفحه 13-24 اصل مقاله (637.49 K) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| نوع مقاله: پژوهشی- فارسی | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| شناسه دیجیتال (DOI): 10.22108/BJM.2020.122078.1284 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| نویسندگان | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| سیده لیلا اکبری کیارود1؛ کامران رهنما* 2؛ مرتضی گل محمدی3؛ سعید نصرالله نژاد4 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1دانشجوی دکتری گروه گیاه‌پزشکی، دانشکدۀ تولید گیاهی، دانشگاه علوم‌کشاورزی و منابع‌طبیعی گرگان، ایران | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2دانشیار گروه گیاه‌پزشکی، دانشکدۀ تولید گیاهی، دانشگاه علوم‌کشاورزی و منابع‌طبیعی گرگان، ایران | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 3استادیار مؤسسۀ تحقیقات علوم‌باغبانی، پژوهشکدۀ مرکبات و میوه‌های نیمه‌گرمسیری، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج‌کشاورزی، رامسر، ایران | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 4دانشیار گروه گیاه‌پزشکی، دانشکدۀ تولید‌گیاهی، دانشگاه علوم‌کشاورزی و منابع‌طبیعی گرگان، ایران | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| چکیده | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مقدمه: باکتری Pseudomonas syringae pv syringaeعامل چندین بیماری باکتریایی روی گیاهان زراعی و باغی علفی و چوبی است. افزایش مقاومت‌های آنتی‌بیوتیکی و عوارض جانبی نامطلوب ناشی از مصرف آنها تمایل به یافتن روش‌های جایگزین نظیر به‌کارگیری ترکیبات چون کیتوزان را که رویکردی بیخطر در مهار بیمارگرهای باکتریایی گیاهی است، افزایش داده است. مواد و روش‌‌ها: در پژوهش حاضر، اثر رقت‌های مختلف کیتوزان با وزن مولکولی پایین روی سیستم حدّنصاب احساس باکتری گزارشگر Pss B728a ارزیابی شد و درنهایت اثر کمترین رقت انتخابی مؤثر بر حرکت تجمعی و بیوفیلم باکتریPss 3289 بررسی شد. نتایج: غلظت 01/0 گرم بر لیتر کیتوزان با وزن مولکولی پایین نه‌تنها توانست سیستم حدّنصاب احساس در باکتری گزارشگر را مهار کند، بلکه میزان حرکت تجمعی و تشکیل بیوفیلم در باکتری Pss 3289 را که نقش مهمی در کلنیزاسیون گیاه دارد و تعیین‌کنندۀ قدرت بیماری‌زایی این باکتری است نیز در حدّ مطلوبی مهار کرد. بحث و نتیجه‌گیری: باتوجه‌به توانایی کیتوزان در مهار سیستم تنظیمی حدّنصاب احساس باکتری Pss، میزانحرکت تجمعی و تشکیل بیوفیلم در آن که دو خصوصیت مهم در بیماری‌زایی این باکتری است و با درنظرگرفتن روند افزایش مقاومت آنتی‌بیوتیکی در بیمارگرهای باکتریایی، به‌کارگیری ترکیباتی چون کیتوزان می‌تواند جایگزین مناسبی برای مهار این بیمارگرها باشد. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| کلیدواژه‌ها | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| کیتوزان؛ حدّنصاب احساس؛ Pss 3289؛ بیوفیلم؛ حرکت تجمعی | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| اصل مقاله | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
مقدمه کشف فرایند حدّنصاب احساس[1] در سال‌های اخیر، دیدگاه ما را دربارۀ نحوۀ زندگی باکتری‌ها تغییر داده است؛ بدین معنی که در گذشته، باکتری‌ها ریز‌موجوداتی منفرد به شمار می‌آمدند و اعتقاد بر این بود که بقای خود را ازطریق سازگارشدن با شرایط محیطی و بدون برقراری هیچ‌گونه ارتباطی، تضمین می‌کنند؛ ولی امروزه پژوهشگران به وجود علامتدهی و ارتباط سلول‌به‌سلول در باکتری‌ها و میان‌کنش آنها ازطریق تبادل اطلاعات با سایر سلول‌ها پی برده‌اند؛ بنابراین وجود شبکۀ علامتدهی در باکتری‌ها، جنبۀ ضروری و پیچیده در چرخۀ زندگی آنهاست؛ ازاین‌رو نیاز است پژوهش در این زمینه، بسیار پویا و فعال باشد؛ به‌طوری که از سال 1996 تا‌کنون، پژوهش دربارۀ سیستم حد‌نصاب احساس گسترش پیدا کرد و پیشرفت در کشف حقایق مربوط به آن، تا به امروز ادامه یافته است. درواقع حدّنصاب احساس را می‌توان مهم‌ترین مبحث زیست‌شناسی مولکولی در دهۀ اخیر معرفی کرد. طی دو دهۀ اخیر، دانسته‌های بشر از رفتار میکروارگانیسم‌ها بسیار افزایش یافته است و امروزه ثابت شده است موجودات تک‌سلولی، ظرفیت زیادی برای برقراری روابط هم‌زیستی دارند و این برقراری ارتباط سلولی و تشکیل تیم‌کاری، به‌اندازۀ رقابت بر سر استقرار در مناطق جدید، انتشار در مواد غذایی و مقابله با فرایند دفاعی میزبان اهمیت دارد (1). در بسیاری از باکتری‌های گرم‌منفی، سیستم حدّنصاب احساس به‌واسطۀ مولکول‌های علامت‌ده حفظ‌شده‌ای عمل می‌کند که اثر خود‌القایی دارد و اسیل هموسرین لاکتون[2] نامیده می‌شود (2). در جمعیت‌های زیاد باکتریایی، اسیل هموسرین لاکتون‌‌ها می‌توانند به گیرنده‌های اختصاصی متصل شوند که فعال‌کننده‌های رونویسی آبشارهای ژنی دخیل در بیماری‌زایی هستند؛ بنابراین ممانعت از عملکرد این سیستم می‌تواند روش جدید و امیدوار‌کننده‌ای در مهار بیمارگرهای باکتریایی و جایگزین مصرف آنتی‌بیوتیک‌ها باشد (3). در سال‌های اخیر، مطالعات مختلفی روی پلیمرهای کیتین، کیتوزان و مشتقات آنها به‌عنوانِ ترکیبات زیستی فعال صورت گرفته است (4). کیتین، پس از سلولز، فراوان‌ترین پلیمر زیستی در طبیعت است. مهم‌ترین مشتق کیتین، کیتوزان نام دارد که از استیلزدایی[3] کیتین به دست می‌آید. منابع عمدۀ کیتین، پوستۀ سخت‌پوستان دریایی مثل خرچنگ، میگو و کریل است (5). کیتوزان و مشتقات آن کاربردهای زیادی در صنایع غذایی، آرایشی، کشاورزی و پزشکی دارند (6). با وجودِ این، وزن مولکولی زیادِ کیتوزان باعث افزایش چسبندگی و کاهش حلالیت و درنتیجه محدودیت استفاده از آن در برخی صنایع می‌شود (7). خواص ضدمیکروبی کیتوزان به خصوصیات فیزیکوشیمیایی آن ازجمله وزن مولکولی و درصد استیلزدایی آن بستگی دارد. افزایش درصد استیلزدایی و کاهش وزن مولکولی در قالب الیگومرهای کیتوزانی باعث افزایش فعالیت ضدمیکروبی کیتوزان می‌شود (8). کیتوزان عامل سازگار زیستی با خاصیت ضد‌باکتریایی قوی است که اثر سمی ندارد (9) و می‌تواند بر سیستم حدّنصاب احساس باکتری‌ها اثر مهارکنندگی داشته باشد (10). این ترکیب در مقایسه با سایر ضدعفونی‌کننده‌ها فعالیت ضدمیکروبی بیشتر و گسترده‌تری دارد و اثر ضد‌بیوفیلمی و توانایی آن در تخریب بیوفیلم که عوامل میکروبی تولید کرده‌اند نیز به اثبات رسیده است (11). بررسی‌های پیشین حاکی از آن است که کیتوزان با وزن مولکولی زیاد میزان بیان سیستم حدّنصاب احساس در باکتری Chromobacterium violaceumراپس از 24 ساعت تا 67درصد کاهش می‌دهد؛ درحالی‌که اثر مهارکنندگی این ترکیب با وزن مولکولی کم پس از 24 ساعت 43درصد بوده است. از این یافته‌ها این‌طور استنباط شد که هردو نوع کیتوزان می‌توانند در غشای سلولی باکتری نفوذ کنند و از این طریق در عملکرد آن اختلال ایجاد می‌کنند (12). گزارش دیگر حاکی از آن است که کیتوزان با وزن مولکولی کم، به‌طورِ مشخصی جلوِ تشکیل بیوفیلم به‌وسیلۀ Candida parapsilosis را در شرایط آزمایشگاهی و زیستی می‌‌گیرد (13) و توانایی زیادی در کاهش تشکیل بیوفیلم توسط C. albicans وStaphylococcus epidermidisدارد (14). در پژوهشی دیگر مشخص شد کیتوزان به‌دست‌آمده از اسکلت خارجی میگو، به تخریب سلولهای باکتری P. syringae pv. tomato DC3000 (عامل لکۀ باکتریایی گوجه‌فرنگی) می‌انجامد؛ به‌طوری که با ایجاد تغییرات بیوشیمیایی در جمعیت انبوه سلولهای باکتریایی، در رشد آنها نیز اختلال ایجاد می‌کند. این امر به‌دلیلِ نفوذ کیتوزان به داخل غشای سلولی باکتری است که افزایش مرگ سلولهای باکتری را به همراه دارد. در نشاء‌های گوجه‌فرنگی مایه‌زنی‌شده با کیتوزان نیز میزان وقوع بیماری ناشی از باکتری Pto DC3000 کاهش یافت. این یافته بیانگر نقش کیتوزان به‌عنوانِ میکروب‌کش طبیعی بیخطر است (15). باکتری Pss از باکتری‌های گرم‌منفی بیماری‌زای گیاهی است که بر دامنۀ وسیعی از گیاهان زراعی و باغی علفی و چوبی با ایجاد علائمی چون لکۀ برگی، شانکر و نکروز پوستی خسارت‌زاست (16). این امر بیانگر نقش این باکتری به‌عنوانِ یکی از عوامل تهدیدکنندۀ امنیت غذایی است. ﺑﻴﻤﺎری ﺑﻼﺳﺖ که ﻳﻜﻲ از بیماریﻫﺎی ﺷﺎﻳﻊ در ﻣﻨﺎﻃﻖ ﮔﺮﻣﺴﻴﺮی و نیمه‌گرﻣﺴﻴﺮی ﻛﺸﺖ ﻣﺮﻛﺒﺎت ازﺟﻤﻠﻪ ﺷﻤﺎل اﻳﺮان است، ﻋﻤـﺪﺗﺎً به‌وسیلۀ ﺟﺪاﻳﻪﻫﺎی این ﺑﺎﻛﺘﺮی اﻳﺠﺎد می‌شود (17) که خسارت آن در سال‌های مختلف به‌دلیلِ تغییر شرایط اقلیمی متفاوت است و در سال‌هایی که شرایط آب‌وهوایی ازلحاظ رطوبت و دما برای فعالیت این باکتری مناسب باشد بسیار زیاد خواهد بود (18)؛ بنابراین در این بررسی، باکتری Pss نمونۀ هدف انتخاب شد و کارایی کیتوزان با وزن مولکولی کم در مهار سیستم تنظیمی حدّنصاب احساس آن بررسی شد.
مواد و روش‌‌ها. .جدایه‌های باکتریایی استفاده‌شده در این پژوهش: یک سویه از باکتری Pss با عنوان گزارشگر، PssB728 (pBQ9)، که ژن ahlI آن به ژن بدون پیش‌برنده[4] کدکنندۀ رنگ سبز فلورسنت[5] وابسته به وجود اسیل هموسرین لاکتون‌‌ها متصل است و از پروفسور استیون ای لیندو، بخش بیولوژی گیاهی و میکروبی دانشگاه کالیفرنیا، برکلی دریافت شده است. باکتری Pss3289 جدایۀ عامل بلاست مرکبات در مزرعه که از پژوهشکدۀ مرکبات و میوه‌های نیمه‌گرمسیری رامسر دریافت شد. تهیۀ کیتوزان و غلظتهای مختلف آن: کیتوزان استفاده‌شده در این پژوهش از نوع وزن کم[6] و با درجۀ استیلزدایی[7]90-85 بود که از شرکت نانو پویا پلیمر دریافت شد. برای تهیۀ یک محلول پایۀ دو گرم بر لیتر، دو گرم از این ترکیب به یک لیتر اسید استیک گلاسیال 99درصد اضافه شد و به‌مدتِ یک شبانه‌روز روی شیکر در دمای 40 درجۀ سلسیوس نگهداری شد تا محلول یک‌نواخت باهم و شفافی به دست آید (12). سپس از این محلول اولیه، غلظتهای 75/0، 5/0 ، 2/0 ، 05/0 ، 02/0 و 01/0 گرم بر لیتر و 2 ، 5/ 1 و 1 میلی‌گرم بر لیتر کیتوزان در محیط کشت کینگ ب[8] تهیه شد. ارزیابی تأثیر غلظتهای مختلف کیتوزان بر سیستم حدّنصاب احساس جدایۀ گزارشگر: برای انجام این بررسی، سوسپانسیون جدایۀ گزارشگر با غلظتcfu/ml 109 تهیه شد و در سطح ظروف پتری محتوی محیط کشت کینگ ب با غلظتهای مختلف کیتوزان پخش و مایه‌زنی شد. برای هر غلظت سه تکرار در نظر گرفته شد و ظروف پتری کشت‌شده به‌مدتِ سه روز در دمای 27 درجۀ سلسیوس نگهداری شدند و پس از آن میزان بازداری از بیان ژن کدکنندۀ رنگ سبز فلورسنت با استفاده از دستگاه ژل داک ارزیابی شد (12، 19). بررسی کمّی توان غیرفعال‌سازی بیان رنگ سبز فلورسنت جدایۀ گزارشگر توسط کیتوزان: برای بررسی نقش کیتوزان در مهار سیستم تنظیمی حدّنصاب احساسباکتری Pss 3289، به هر چاهک پلیت الیزا 5/1 میکرولیتر محلول کیتوزان دو گرم بر لیتر (غلظت 01/0 گرم بر لیتر) اضافه شد. سپس 5/293 میکرولیتر محیط کشت کینگ ب مایع بدون آگار[9] به هرکدام از آنها اضافه شد و درنهایت هر چاهک با 5 میکرولیتر جدایۀ گزارشگر Pss B728a(pBQ9) با غلظت cfu/ml 105 مایه‌زنی شد. شاهد منفی شامل محیط کشت کینگ ب مایع و شاهد مثبت شامل جدایۀ گزارشگر در محیط کشت بالا بود. پس از این مرحله، پلیت الیزا به‌مدتِ 72 ساعت روی دستگاه شیکر با دور rpm150در دمای 28 درجۀ سلسیوس نگهداری شد تا در مرحلۀ بعد میزان بیان ژن کدکنندۀ رنگ سبز فلورسنت در هرکدام از چاهک‌ها ارزیابی شود (19 و 12). میزان رنگ سبز فلورسنت تولیدی با دستگاه فلوریمتر[10] خوانش شد. درصد کاهش نور نسبت به شاهد برای هر تیمار با استفاده از معادلۀ (۱) محاسبه شد (20). آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار برای هر تیمار انجام شد.
.ارزیابی نقش کیتوزان در ممانعت از حرکت تجمعی[11]Pss 3289:برای این بررسی ابتدا ایزولۀ باکتری Pss 3289 پس از کشت روی محیط کینگ ب به‌مدتِ 48 ساعت در دمای 28 درجۀ سلسیوس نگهداری شد. سپس پرگنه‌های تشکیل‌شده از سطح پتری جمع‌آوری شد و در مخلوط 01/0 گرم بر لیتر کیتوزان در کینگ ب مایع ( cfu/ml107 ×1) به‌صورتِ سوسپانسیون درآمد. پس از آن، یک قطره از این مخلوط روی دیسک‌هایی از کاغذ صافی سترون که در مرکز ظروف پتری محتوی کینگ ب نیمه‌جامد (دارای 4/0درصد آگار) قرار داشت، مایه‌زنی شد و این ظروف به‌مدتِ 72 ساعت در دمای 26 درجۀ سلسیوس نگهداری شدند. سپس قطر حرکت گروهی سلول‌ها از مرکز هر دیسک کاغذی اندازه‌گیری شد. شاهد مثبت شامل یک قطره محیط کشت کینگ ب مایع مایه‌زنی‌شده با Pss 3289 بدون کیتوزان بود. این آزمایش در سه تکرار برای هر تیمار انجام گرفت (21) (با اندکی تغییر شامل افزودن کیتوزان به محیط کشت مایع برای بررسی اثر آن بر ممانعت از حرکت تجمعی).
بررسی تأثیر کیتوزان بر تشکیل بیوفیلم Pss 3289: در این بررسی از روش میکروتیترپلیت استفاده شد؛ بدین منظور ابتدا باکتری Pss 3289 روی محیط نوترینت[12] آگار کشت شد و پس از نگهداری به‌مدتِ 24 ساعت در دمای 48 درجۀ سلسیوس دوباره در محیط لوریا برتانی[13] کشت شد و به‌مدتِ 18 ساعت در دمای 28 درجۀ سلسیوس نگهداری شد. پس از این مدت، در محیط لوریا برتانی به‌صورتِ سوسپانسیون درآمد و پس از خواندن میزان چگالی با دستگاه اسپکتروفوتومتر رقت 8/0 OD620= انتخاب شد. برای شاهد منفی فقط به هر چاهک 300 میکرولیتر محیط لوریا برتانی اضافه شد. برای شاهد مثبت هر چاهک محتوی 5/293 میکرولیتر محیط لوریا برتانی، 5/1 میکرولیتر اسید استیک گلاسیال و 5 میکرولیتر سوسپانسیون باکتری بود. برای کیتوزان نیز هر چاهک محتوی 5/293 میکرولیتر محیط لوریا برتانی، 5/1 میکرولیتر کیتوزان دو گرم بر لیتر و 5 میکرولیتر سوسپانسیون باکتری بود. برای هر تیمار سه تکرار تعیین شد (22، 12). این میکروپلیت‌ها به‌مدتِ 48 ساعت در دمای 28 درجۀ سلسیوس بدون حرکت نگهداری شدند. پس از این مدت، سلولهای پلانکتونی برداشته شدند و تعداد آنها در OD620 با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد (23). باکتری‌های باقی‌مانده، با قراردادن در دمای 50 درجۀ سلسیوس به‌مدتِ 20 دقیقه در چاهک‌ها ثابت شدند و سپس به‌مدتِ یک دقیقه با 150 میکرولیتر کریستال ویولۀ 1/0درصد رنگ‌آمیزی شدند. رنگ اضافی با برگرداندن میکروپلیت‌ها خارج شد و با افزودن 250 میکرولیتر آب‌مقطر استریل به هرکدام از چاهک‌ها دو بار شست‌وشو شد. پس از این مرحله، میکروپلیت‌ها در دمای اتاق خشک شدند. سپس به هر چاهک 200 میکرولیتر اسید استیک گلاسیال 33درصد اضافه شد و چند بار با سمپلر به‌خوبی هم زده شد تا رنگ‌های متصل به چاهک که بیانگر میزان تشکیل بیوفیلم است به‌خوبی حل شود. پس از یک‌نواخت‌شدن محلول هر چاهک، میزان جذب در 630 نانومتر با استفاده از دستگاه الیزا ریدر خوانده شد (25، 24، 12). وضعیت تشکیل بیوفیلم در چاهک‌ها طبق روش براساسِ معادلۀ (۲) محاسبه شد (26) که در آن ODC میانگین جذب نوری چاهکهای شاهد منفی و ODT میانگین جذب نوری چاهکهای تیمار است.
قدرت تشکیل بیوفیلم ضعیف ODC<ODT≤(2×ODC)= قدرت تشکیل بیوفیلم متوسط (2×ODC)<ODT≤(4×ODC)= قدرت تشکیل بیوفیلم قوی (4×ODC)<ODT= میزان کارایی غلظت 01/0 گرم بر لیتر کیتوزان بر درصد کاهش تشکیل بیوفیلم، براساسِ معادلۀ (3 ) محاسبه شد (27). معادلۀ 3
پردازش و تحلیل دادهها: پردازش و تحلیل دادهها با استفاده از آزمون t مستقل با نرم‌افزار SPSS 16.0 انجام گرفت. نتایج بیان‌شده میانگین ± انحراف معیار میانگین برای 3 تکرار است.
نتایج. .ارزیابی غلظتهای مختلف کیتوزان روی سیستم حدّنصاب احساس جدایۀ گزارشگر: در این بررسی مشخص شد غلظتهای 2، 5/1 و 1 میلی‌گرم بر لیتر کیتوزان نقشی در بازداری از حدّنصاب احساس جدایۀ گزارشگر ندارند؛ ولی غلظتهای 75/0، 5/0 ، 2/0 ، 05/0 ، 02/0 و 01/0 گرم بر لیتر در بازداری مؤثرند؛ بنابراین از بین آنها کمترین غلظت برای انجام بررسی‌های بعدی انتخاب شد (شکل 1).
شکل 1- تأثیر غلظتهای مختلف کیتوزان در ممانعت از بیان پروتئین سبز فلورسنت استرین گزارشگر؛ a. شاهد (محیط کینگ ب بدون کیتوزان)، b. محیط کینگ ب محتوی 1 میلی‌گرم بر لیتر کیتوزان، c. محیط کینگ ب محتوی 5/1 میلی‌گرم بر لیتر کیتوزان، d. محیط کینگ ب محتوی 2 میلی‌گرم بر لیتر کیتوزان، e. محیط کینگ ب محتوی 01/0 گرم بر لیتر کیتوزان، f. محیط کینگ ب محتوی 02/0 گرم بر لیتر کیتوزان، g. محیط کینگ ب محتوی 05/0 گرم بر لیتر کیتوزان، h. محیط کینگ ب محتوی 2/0 گرم بر لیتر کیتوزان، i. محیط کینگ ب محتوی 5/0 گرم بر لیتر کیتوزان، j. محیط کینگ ب محتوی 75/0 گرم بر لیتر کیتوزان
.نتیجۀ کمّی میزان عملکرد کیتوزان، بازدارندۀ سیستم حدّنصاب احساس: در این بررسی، مشخص شد غلظت 01/0 گرم بر لیتر کیتوزان با وزن مولکولی کم توانست از حدّنصاب احساس در باکتری Pss B728a(pBQ9) ممانعت کند که نتایج آن در جدول 1 ارائه شده است. .نتیجۀ بررسی اثر کیتوزان با وزن کم بر حرکت تجمعی باکتری Pss 3289: در این بررسی، مشخص شد کیتوزان با وزن مولکولی کم در مقایسه با شاهد، حرکت Pss 3289 را در محیط محتوی آگار 4/0درصد کاهش می‌دهد (شکل 2). این مسئله بیانگر این واقعیت است که کاهش سرعت تهاجمی Pss 3289 توسط کیتوزان می‌تواند روش بالقوه‌ای برای کاهش کلنیزاسیون سطح گیاه در مقایسه با سایر میکروارگانسیم‌ها باشد. ارزیابی کیتوزان با وزن مولکولی کم در ممانعت از تولید بیوفیلم توسط Pss 3289: میزان تشکیل بیوفیلم توسط جدایۀ Pss 3289 تیمارشده با کیتوزان در دو زمان 48 و 96 ساعت در مقایسه با شاهد کاهش یافت و با آن در سطح 01/0 تفاوت معنیداری داشت (جدول 2). تعداد سلولهای پلانکتونی این جدایه نیز در مقایسه با شاهد پس از تیمار 48 و 96ساعته با کیتوزان کاهش پیدا کرد (شکل 3).
جدول 1- بازداری از سیستم حدّنصاب احساس Pss B728a(pBQ9) با استفاده از کیتوزان با وزن مولکولی کم
نتایج میانگین سه تکرار است. اعدادی که با حروف متفاوت علامت‌گذاری شدهاند، براساسِ مقایسۀ میانگین‌ها با آزمون t مستقل در سطح 01/0 اختلاف معنیداری دارند (01/0Sig. <).
شکل 2- کاهش حرکت تجمعی Pss 3289 به‌وسیلۀ کیتوزان با وزن مولکولی کم. (a) شاهد (Pss 3289). (b) کیتوزان با وزن مولکولی پایین+ Pss 3289. اعدادی که با حروف متفاوت علامت‌گذاری شدهاند، براساسِ مقایسۀ میانگین‌ها با آزمون t مستقل در سطح 01/0 اختلاف معنیداری دارند (01/0Sig. <)
جدول 2- میزان تشکیل بیوفیلم توسط جدایۀ Pss 3289 در مقابله با کیتوزان با وزن مولکولی کم پس از 48 و 96 ساعت نگهداری در دمای 28 درجۀ سلسیوس
اعدادی که با حروف متفاوت علامت‌گذاری شدهاند، براساسِ مقایسۀ میانگین‌ها با آزمون t مستقل در سطح 01/0 اختلاف معنیداری دارند (01/0Sig. <).
شکل 3- میانگین سلولهای پلانکتونیPss 3289 تیمارشده با کیتوزان براساسِ OD600nm پس از نگهداری به‌مدتِ 48 ساعت (a) و 96 ساعت (b) در دمای oC28. علامت بار خطا نشان‌دهندۀ انحراف معیار (برای سه تکرار) است. در a و b ستون‌هایی که با حروف متفاوت نشان داده شدهاند، براساسِ مقایسۀ میانگین‌ها با آزمون t مستقل با 99درصد اطمینانْ اختلاف معنیداری دارند (01/0Sig. <).
بحث و نتیجه‌گیری گسترش سریع مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌ها در بیمارگرهای باکتریایی ضرورتِ پیدا‌کردن جایگزینی مناسب در مهار این نوع بیمارگرها را بیش‌ازپیش مشخص می‌کند و این مسئله زمانی ملموس‌تر می‌شود که بیمارگر مدنظر، دامنۀ میزبانی وسیعی داشته باشد؛ ازاین‌رو در پژوهش‌های اخیر، توجه به ترکیبات طبیعی چون کیتوزان با خاصیت آنتی‌باکتریایی زیاد، سطح عملکرد وسیع، سرعت کشندگی زیاد، توان زیاد در تخریب بیوفیلم‌های باکتریایی و سمّیت کم بر سلولهای انسانی، بیش‌ازپیش افزایش یافته است (11). در بررسی اخیر توان کیتوزان در مهار سیستم حدّنصاب احساس باکتری Pss 3289 که تنظیم‌کنندۀ حرکت، بیان حرکت تجمعی، حرکتی وابسته به چگالی سلولی و مرتبط با سطح در باکتری‌هاست که به‌صورتِ هماهنگ و اجتماعی رخ می‌دهد (28). کاربرد کیتوزان در این پژوهش میزان حرکت تجمعی باکتری Pss 3289 را تا 79درصد کاهش داد. پژوهش‌های پیشین نیز حاکی از این است که کیتوزان نقش مؤثری در کاهش میزان اسیل هموسرین لاکتون، بیوفیلم، تولید پیوسیانین و حرکت باکتری P. aerouginosa دارد (29). ازسوی دیگر، ثابت شده است کیتوزان استخراجی[xiv] و کیتوزان تجاری[xv] تا حدّ زیادی در ممانعت از حرکت تجمعی باکتری P. aerouginosa PAO1 مؤثرند و مانع از تشکیل بیوفیلم توسط آن می‌شوند (30). بیوفیلم‌ها، ساختاری از مجموعۀ سلولی میکروب‌ها هستند که به‌صورتِ متصل به سطوح زنده یا غیر‌زنده یافت می‌شوند. این ساختارهای سه‌بعدی همواره در داخل یک ماتریکس پیچیده محصور شدهاند. تشکیل بیوفیلم در هردو ردۀ باکتری‌های گرم‌مثبت و گرم‌منفی مشاهده می‌شود. درحقیقت یکی از اصلی‌ترین سازوکارهای بقای باکتری‌ها در محیط‌های مختلف، استفاده از همین توان تولید بیوفیلم و زندگی در آن است (31). چرخۀ سنتی تشکیل بیوفیلم در باکتری‌ها شامل اتصال سلولهای پلانکتونی‌شکل باکتری به سطح، رشد، بلوغ و توزیع آنهاست؛ بنابراین هر عاملی که بتواند هر مرحله از این چرخه را تخریب کند، می‌تواند به مهار بیماری‌های مرتبط با بیوفیلم‌های باکتریایی کمک کند؛ ازاین‌رو به‌کارگیری کیتوزان به‌عنوانِ پلی‌ساکارید طبیعی می‌تواند راهبردی امیدوارکننده در مهار بیماری‌های باکتریایی باشد (32). میزان حساسیت بیوفیلم‌های باکتریایی به عوامل ضدمیکروبی مختلف در مقایسه با باکتری‌های موجود به حالت پلانکتونی 1000 بار کمتر است (33). در بررسی انجام‌شده، کیتوزانِ به‌کاررفته میزان سلولهای پلانکتونی‌شکل باکتری Pss 3289 را پس از 48 ساعت 26درصد و پس از 96 ساعت 44درصد کاهش داد. بررسی‌های پیشین نیز حاکی از این واقعیت است که دو حالت ریزذره و تعلیق‌شدۀ کیتوزان در اسید استیک 1/0 مولار می‌تواند بقای سلولهای پلانکتونی باکتری Streptococcus mutansرا کاهش دهد (32). در این بررسی کیتوزانِ استفاده‌شده میزان تشکیل بیوفیلم توسط باکتری Pss 3289 را نیز در حدّ درخورِتوجهی کاهش داد. گزارش‌های پیشین نیز هم‌سو با این پژوهش، بیانگر این واقعیت است که ترکیب مساوی از محلول کیتوزان استخراج‌شده از پوستۀ میگو و خرچنگ می‌تواند میزان بیوفیلم در باکتری‌های P. aeruginosa و Staphylococcus aureus را تا حدّ درخورِتوجهی کاهش دهد (34). به نظر می‌رسد اثر ضدمیکروبی کیتوزان به بار گروه‌های آمینوِ[xvi] آن بستگی دارد. این گروه‌ها در برهم‌کنش الکترواستاتیک با گروه‌های بار منفی سطح باکتری نقش دارند (35). این برهم‌کنش ممکن است به تخریب دیوارۀ سلولی و تغییر در نفوذپذیری و خصوصیات دفاعی آن بینجامد (36). نظریۀ دیگر این است که کیتوزان به داخل غشای سلولی نفوذ می‌کند، با DNA یا mRNAهای موجود در سیتوپلاسم باند می‌شود و از سنتز پروتئین ممانعت می‌کند (7) یا اینکه با کلاته‌کردن عناصر ضروری مانع از رشد و انجام متابولیسم در عوامل میکروبی می‌شود (37)؛ هرچند میزان کارایی کیتوزان به عوامل متعددی ازجمله نوع میکروارگانیسم، خصوصیات غشای سلول و خصوصیات ذاتی کیتوزان (ظرفیت کلاته‌کردن، میزان استیلزدایی، وزن مولکولی و خصوصیت آب‌دوستی/آب‌گریزی و...) وابسته است (38). درمجموع، نتایج حاصل از این پژوهش بیانگر این واقعیت است که کیتوزان می‌تواند سیستم تنظیمی حدّنصاب احساس در باکتری Pss را مهار کند و میزانحرکت تجمعی و تشکیل بیوفیلم در آن را که دو خصوصیت مهم در بیماری‌زایی این باکتری است، کاهش می‌دهد؛ بنابراین باتوجه‌به روند افزایش مقاومت آنتی‌بیوتیکی در بیمارگرهای باکتریایی، به‌کارگیری ترکیباتی چون کیتوزان می‌تواند جایگزین مناسبی در مهار بیمارگرهای باکتریایی باشد. سپاسگزاری در اینجا از پروفسور استیون لیندو، استاد بخش بیولوژی گیاهی دانشگاه کالیفرنیا در برکلی آمریکا برای ارسال جدایۀ گزارشگر Pss B728 (pBQ9) و شرکت نانو پویا پلیمر برای در اختیار قراردادن کیتوزان صمیمانه سپاسگزاری می‌شود. نگارندگان همچنین از معاونت پژوهشی و فناوری دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان برای فراهم‌کردن اعتباراتپژوهشی این پژوهش و همچنین از پژوهشکدۀ مرکبات و میوه‌های نیمه‌گرمسیری رامسر برای در اختیار قراردادن جدایۀ Pss 3289 و فضای پژوهشی و آزمایشگاهی صمیمانه سپاسگزاری می‌کنند. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مراجع | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
(1) Zeighami H., Haghghi F., Naderi GH. Quorum sensing in bacteria. Journal of Laboratory and Diagnosis 2014; 24: 9- 22. (2) Fuqua C., Parsek MR., Greenberg EP. Regulation of gene expression by cell to cell communication: Acyl-homoserine lactone quorum sensing. Annual Review of Genetics 2001; 35: 439- 468. (3) Kociolek MG. Quorum-sensing inhibitors and biofilms. Anti-Infective Agents in Medicinal Chemistry 2009; 8: 315- 326. (4) Limam Z., Selmi S., Sadok SE., Abed A. Extraction and characterization of chitin and chitosan from crustacean by products: Biological and physicochemical properties. African Journal of Biotechnology 2011; 10 (4): 640- 647. (5) Sedaghat F., Yousefzadi M., Toiserkani H., Najafipour S. Microbial deproteinization of shrimp shell penaeus merguiensis for chitin extraction. Biological Journal of Microorganism 2016; 18: 141- 152. (6) Sugumar G., Ramesh U., Selvan A. Susceptibility of crab chitosan against Staphylococcus aureus. Bioreseach Bulletin 2010; 1 (1): 7- 9.
(7) Benhabiles MS., Salah R., Lounici H., Drouiche N., Goosen MFA., Mameri N. Antibacterial activity of chitin, chitosan and its oligomers prepared from shrimp shell waste. Food Hydrocolloid 2012; 29: 48- 56. (8) Mohan CO., Ravishankar CN., Lalitha KV., Srinivasa TK. Effect of chitosan edible coating on the quality of double filleted indian oil sardine (Sardinella longiceps) during chilled storage. Food Hydrocolloids 2012; 26 (1): 167- 174. (9) Wei D., Sun W., Qian W., Ye Y., Ma X. The synthesis of chitosan-based silver nanoparticles and their antibacterial activity. Carbohydrate Research 2009; 344: 2375- 2382. (10) Jarmila V., Vavrı´kova´ E. Chitosan derivatives with antimicrobial, antitumour and antioxidant activities a review. Current Pharmaceutical Design 2011; 17 (32): 3596- 607. (11) Zhang A., Mu H., Zhang W., Cui G., Zhu J., Duan J. Chitosan coupling makes microbial biofilms susceptible to antibiotics. Scientific Reports 2013; 3: 3364. (12) Costa EM., Silva S., Pina C., Tavaria FK., Pintado M. Antimicrobial Effect of Chitosan against Periodontal Pathogens Biofilms. SOJ Microbiology & Infectious Diseases 2014; 2 (1): 1- 6. (13) Silva-Dias A., Palmeira-de-Oliveira A., Miranda IM., Branco J., Cobrado L., Monteiro-Soares M., et al. Anti-biofilm activity of low-molecular weight chitosan hydrogel against Candida species. Medical Microbiology and Immunology 2014; 203: 25- 33. (14) Cobrado L., Azevedo MM., Silva-Dias A., Ramos JP., Pina-Vaz C., Rodrigues AG. Cerium chitosan and hamamelitannin as novel biofilm inhibitors? Journal Antimicrob Chemotherapy 2012; 67 (5): 1159- 1162. (15) Mansilla AY., Albertengo L., Rodrĺguez MS., Debbaudt A., Zúñiga A., Casalongué CA. Evidence on antimicrobial properties and mode of action of a chitosan obtained from crustacean exoskeletons on Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Applied microbiology and biotechnology 2013; 97 (15): 6957- 6966. (16) Abbasi V., Rahimian H., Tajick GM., Rezaian V. The assessment of genetic diversity of strains of Pseudomonas syringae pv. syringae causing bacterial canker in stone fruits in some northern provinces of Iran. Iran Journal Plant Pathology 2011; 47 (4): 133- 1354. (17) Golmohammadi M., Banihashemian SN. Methods for management of citrus blast disease. Plant pathology science 2017; 6 (2): 1- 13. (18) Samiei Shirkadeh S., Golmohammadi M., Elahinia SA., Bashiri S. Phenotypic and Genotypic study of Pseudomonas syringae pv. Syringae isolates the causal agents of citrus blast in the west of Mazandran and in the east of Guilan. Journal of Plant Protection 2016; 30 (3): 359- 367. (19) Dulla GF., Krasileva KV., Lindow SE. Interference of quorum sensing in Pseudomonas syringae by bacterial epiphytes that limit iron availability. Environmental microbiology 2010; 12 (6): 1762- 1774. (20) Krzyanowska DM., Potrykus M., Golanowska M., Polonis K., Gwizdek-Wisniewska A., Lojkowska E., et al. Rhizosphere bacteria as potential biocontrol agents against soft rot caused by various Pectobacterium and Dickeya spp. Strains. Journal of Plant Pathology 2012; 94 (2): 367- 378. (21) Quiñones B., Dulla G., Lindow SE. Quorum sensing regulates exopolysaccharide production, motility, and virulence in Pseudomonas syringae. Molecular Plant Microbe Interact 2005; 18:682- 693 (22) Habibipour R., Moradi Haghgou L. Study on hydro-alcoholic extract effect of pomegranate peel on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Avicenna Journal of Clinical Medicine 2015; 22 (3): 195- 202. (23) Cady NC., McKean KA., Behnke J., Kubec R., Mosier AP., Kasper SH., et al. Inhibition of biofilm formation, quorum sensing and infection in Pseudomonas aeruginosa by natural products-inspired organosulfur compounds. PLoS One 2012; 7: e38492. (24) Christiaen SEA., Matthijs N., Zhang XH., Nelis HJ., Bossier P., Coenye T. Bacteria that inhibit quorum sensing decrease biofilm formation and virulence in Pseudomonas aeruginosa PAO1. Pathogens and Disease 2014; 70: 271- 279. (25) Maddula VS., Zhang Z., Pierson EA., Pierson LS. Quorum sensing and phenazines are involved in biofilm formation by Pseudomonas chlororaphis (aureofaciens) strain 30-84. Microbial Ecology 2006; 52 (2): 289- 301. (26) Nyenje ME., Green E., Ndip RN. Biofilm Formation and Adherence Characteristics of Listeria ivanovii Strains Isolated from Ready-to-Eat Foods in Alice, South Africa. The Scientific World Journal 2012; 2012: 7 pages. (27) Namasivayam SKR., Preethi M., Bharani RSA. Biofilm inhibitory effect of Silver nanoparticles coated catheter against Staphylococcus aureus and evaluation of its synergistics effect with antibiotics. International Journal of Biological & Pharmaceutical Research 2012; 3 (2): 259- 265. (28) Eberl L., Molin S., Givskov M. Surface motility of Serratia liquefaciens MG1. Journal of bacteriology 1999; 181: 1703- 1712. (29) Badawy MSEM., Riado KM., Taher FA., Zaki SA. Chitosan chitosan-zinc oxide nanocomposite inhibit expression of LasI and RhlI genes and quorum sensing dependent virulence factors of Pseudomonas aeruginosa. International Journal of Biological Macromolecules 2020; 149: 1109- 1117. (30) Rubini D., Banu SF., Subramani P., Hari BNV., Gowrishankar S., Pandian SK., et al. Extracted chitosan disrupts quorum sensing mediated virulence factors in urinary tract infection causing pathogens. Pathogens and disease 2019; 77 (1): ftz009. (31) Rahmaniphard SH., Zeighami H. Bacterial biofilms. Journal of Laboratory and Diagnosis 2017; 37: 21- 29. (32) Kawakita ERH., Ré ACS., Paula GPM., Ferreira MP., Ricomini-Filho AP., Freitas O., et al. Effect of chitosan dispersion and microparticles on older Streptococcus mutans biofilms. Molecules 2019; 24: 1808. (33) Stewart PS., Costerton JW. Antibiotic resistance of bacteria in biofilms. The Lancet 2001; 358 (9276): 135- 138. (34) Aurestila BJ., Villaver EAM., Tan EY. Anti-biofilm activity of chitosan from crab and shrimp species indigenous to the Philippines on established biofilms of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Journal of Pharmacognosy & Natural Products 2018; 4 (149). (35) Liu H., Du Y., Wang X., Sun L. Chitosan kills bacteria through cell membrane damage, International Journal of Food Microbiology 2004; 95 (2): 147- 155. (36) Chung YC., Chen CY. Antibacterial characteristics and activity of acid-soluble chitosan. Bioresource Technology 2008; 99 (8): 2806- 2814. (37) Rabea EI., Badawy MET., Stevens CV., Smagghe G., Steurbaut W. Chitosan as antimicrobial agent: Applications and mode of action. Biomacromolecules 2003; (4): 1457- 1465. (38) Verlee A., Mincke S., Stevens CV. Recently developments in antibacterial and antifungal chitosan and its derivatives. Carbohydrate Polymers 2017; 164: 268- 283. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
آمار تعداد مشاهده مقاله: 1,061 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 454 |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||