تولید صمغ زانتان توسط سویه بومی باکتری زانتوموناس سیتری در محیط آب پنیر وارزیابی خصوصیات فیزیکو شیمیایی آن

بحث و نتیجه‌گیری

در مطالعۀ حاضر برای نخستین‌بار، تولید صمغ زانتان با استفاده از سویۀ بومی Xci/ NIGEB-386 در محیط آب‌پنیر ارزیابی شد و تمام متغیرهای تخمیر بررسی شدند. نتایج نشان دادند این سویه با داشتن فعالیت بتاگالاکتوزیدازی از لاکتوز موجود در آب‌پنیر استفاده و مقدار درخور توجهی صمغ زانتان (3/20 گرم‌بر‌لیتر) تولید می‌کند. با‌توجه‌به هزینۀ زیاد منابع کربنی مورداستفاده در فرایندهای میکروبی، همیشه استفاده از منابع کربنی ارزان‌قیمتی مانند ضایعات کشاورزی و پساب‌های صنایع غذایی مدنظر بوده است (1). با‌توجه‌به اینکه آب‌پنیر مقادیر زیادی لاکتوز دارد، محیط مناسبی برای تولید کم‌هزینۀ صمغ زانتان با ماهیت پلی‌ساکاریدی توسط باکتری مولد محسوب می‌شود (9). تلاش‌ در راستای استفاده از محیط‌های لاکتوزی نظیر آب‌پنیر برای رشد باکتری و تولید زانتان همواره مدنظر پژوهشگران بوده است.

باکتری صنعتی زانتوموناس کمپستریس، سویۀ صنعتی تولیدکنندۀ زانتان معرفی ‌شده است (11)؛ همان‌طور که نیک‌نژاد^[1] و همکاران بیشترین مقدار تولید زانتان توسط زانتوموناس کمپستریس را در شرایط بهینه برابر با 4/16 گرم‌بر‌لیتر در محیط آب‌پنیر دارای لاکتوز گزارش کرده‌اند (13). باکتری زانتوموناس کمپستریس عموماً قابلیت کمی برای مصرف لاکتوز نشان می‌دهد و پژوهشگران راه دستیابی به سویه‌های جهش‌یافتۀ لاکتوز مثبت را از طریق روش‌های جهش‌زایی و مهندسی ژنتیک فراهم می‌کنند. کانیشک^[xi] و همکاران (1993) سویۀ جهش‌یافتۀ لاکتوز مثبت زانتوموناس کمپستریس را با استفاده از جهش‌زایی تصادفی و عوامل جهش‌زای ان‌متیل، ان‌نیترو، ان‌نیتروز و گوانیدین غربال کردند و سپس با بهینه‌کردن شرایط تولید در محیط دارای 4 درصد لاکتوز توانستند 20 گرم‌برلیتر زانتان به دست آورند (24). به‌تازگی سویه‌های بومی‌ای از جنوب ایران با ‌عنوان باکتری‌های لاکتوز مثبت جدا شده‌اند که به‌طور طبیعی لاکتوز را مصرف می‌کنند؛ به‌طوری‌که رمضانی^[xii] و همکاران (2013) مقدار وزنی زانتان به‌دست‌آمده از سویۀ بومی زانتوموناس سیتری K37 (Xcc/NIGEB K37) در محیط دارای 5 درصد لاکتوز را پس‌از 120 ساعت تخمیر معادل 14 گرم‌برلیتر محاسبه کرده‌اند (15)؛ درحالی‌که مقدار وزن خالص زانتان حاصل از سویۀ 386 روی محیط آب‌پنیر، 3/20 گرم‌بر‌لیتر بود و این نشان‌دهندۀ قابلیت زیاد این سویه برای مصرف لاکتوز و تولید زانتان در محیط آب‌پنیر است؛ هرچند فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز سویۀ Xcc/NIGEB K37 در مطالعۀ رمضانی و همکاران حدود 200 واحد فعالیت آنزیمی نسبت به سویۀ Xci/386 بیشتر بود و این احتمالاً به‌علت استفاده از محیط دارای لاکتوز به‌جای آب‌پنیر است. از سویی، مطالعۀ حاضر نشان داد آنزیم بتاگالاکتوزیداز، آنزیم نسبتاً پایداری است؛ زیرا باتوجه‌به شکل 2 و برخلاف کاهش تعداد سلول‌های زنده در پایان فرایند تخمیر، مقدار آنزیم ثابت بود و افت بسیار ناچیزی در پایان فرایند نشان داد. پژوهش‌ها نشان می‌دهند غلظت اولیۀ سوبسترای لاکتوز در پایداری آنزیم موثر است و حتی اگر سوبسترا هنگام فرایند اضافه شود، اثر منفی روی فعالیت آنزیم خواهد داشت (25).در پژوهش حاضر، غلظت اولیۀ لاکتوز در محیط تولید برابر 5/3 درصد بود و باوجود کاهش لاکتوز در پایان فرایند، همچنان تأثیر مثبت غلظت اولیۀ پیش‌ماده روی پایداری آنزیم مشهود بود.

ویسکومتری ابزار مهمی برای تشخیص ترکیبات شیمیایی اگزوپلیمری سنتزشده در فرایندهای تخمیری است (26) و کیفیت ویسکوزیتۀ ذاتی بر اساس نوع سویه، شرایط تخمیر و روش‌های استخراج متغیر است (27). نتایج بررسی تولید زانتان نشان دادند با افزایش مدت‌ زمان فرایند تولید، مقدار زانتان و ویسکوزیته افزایش می‌یابد. طی 48 تا 72 ساعت پس‌از آغاز فرایند، تغییرات افزایشی در مقدار وزنی زانتان و ویسکوزیته مشاهده شد و این روند افزایشی بین روزهای چهارم تا پنجم معنا‌دار بود. ازآنجاکه تولید صمغ در فاز سکون رشد باکتری اتفاق می‌افتد؛ می‌توان گفت با کاهش لاکتوز، منابع غذایی دردسترس باکتری پایان می‌یابند و باکتری وارد مرحلۀ تولید صمغ برای مقابله با شرایط نامساعد غذایی می‌شود (28 و 29). پژوهش‌ها نشان می‌دهند محتوای استات و پیرووات موجود در ساختار زانتان روی ویسکوزیتۀ زانتان بسیار مؤثر است و با افزایش گروه‌های عاملی استیل و پیروویل، ویسکوزیته افزایش می‌یابد (26 و 30)؛ بنابراین با‌توجه‌به نتایج سنجش ویسکوزیته، این فرضیه وجود داشت که محتوای استات و پیرووات نمونۀ زانتان سویۀ 386 از زانتان استاندارد کمتر باشد و پس‌از بررسی نتایج سنجش طبق جدول 2 مشخص شد محتوای استات در هر دو نمونۀ زانتان نسبتاً یکسان است؛ بنابراین، تجربه‌های پژوهش حاضر از نقش استات در افزایش ویسکوزیته پشتیبانی نمی‌کنند؛ این نتیجه با نتایج رودریگوئز^[xiii] و همکاران (1997) همخوانی دارد (6 و 31). در بررسی‌های دیگر نیز مشخص شده است محتوای زیاد پیرووات و محتوای کم استات موجب افزایش ویسکوزیتۀ محلول زانتان می‌شود (32)؛ به‌طوری‌که با افزایش محتوای پیرووات (حدود 1/0 تا 5/0 درصد)، ویسکوزیته حدود 60 تا 80 درصد افزایش می‌یابد (29). مطالعۀ حاضر نشان داد ارتباط مستقیم و معناداری بین محتوای پیرووات و ویسکوزیته وجود دارد؛ زیرا محتوای پیرووات و همچنین ویسکوزیتۀ محلول 1 درصد نمونۀ زانتان استاندارد نسبت به محتوای پیرووات و ویسکوزیته زانتان سویۀ 386 حدود 5/2 برابر بیشتر بود. درحقیقت، به نظر می‌رسد محتوای پیروویک‌اسید بهترین شاخص کیفیت پلی‌ساکارید زانتان است و درصد استیله و پیروویله‌شدن مانوز ساختار زانتان می‌تواند موجب تغییرات ویسکوزیته و ویژگی‌های روانه‌شناختی آن شود (6)؛ هرچند نوع ریزموجود و تغییر شرایط تخمیر دو عامل مهم در تنوع ساختاری و ویژگی‌های روانه‌شناختی زانتان محسوب می‌شوند (33 و 34). شرایط محیطی در ساختار اولیۀ زانتان تأثیری ندارد، ولی در شکل‌گیری ساختار ثانویۀ زانتان، وزن مولکولی و بازده مؤثر است (4 و 35). FTIR روشی برای تشخیص شباهت‌ها و تفاوت‌ها در ساختار شیمیایی ترکیبات است (23). بررسی‌هایی که تاکنون به کمک FTIR روی ساختار زانتان انجام‌ شده‌اند، نشان می‌دهند هر گروه عاملی در ساختار زانتان در محدودۀ طول ‌موج خاصی پیک می‌دهد. نمونۀ محصول زانتان سویۀ 386 و نمونۀ استاندارد برای شناسایی گروه‌های شیمیایی موجود تجزیه‌وتحلیل شدند و منطقۀ مطالعه‌شده شامل تمام باندهای طیفی در محدودۀ 400 تا 4000 بر سانتی‌متر بود و باوجود تفاوت‌های جزئی جمع‌آوری‌شده در طیف FTIR، این نتیجه نشان می‌دهد ماهیت زانتان تولیدشده توسط سویۀ 386 با نمونۀ زانتان استاندارد (شرکت سیگما با شماره ثبت 2-66-11138) ازنظر جایگاه گروه‌های عاملی مطابقت دارد. دا سیلوا^[xiv] و همکاران (2018) دو سویۀ 1866 و 1867 از باکتریزانتوموناس کمپستریس را ازنظر تولید زانتان ارزیابی کردند و نشان دادند با استفاده از منابع کربنی مختلف و سویه‌های متفاوت، طیف‌های حاصل از FTIR در هر دو سویه گروه‌های عاملی مشابهی دارند (18)؛ اما با‌توجه‌به اینکه روش FTIR به‌‌تنهایی برای شناسایی پلیمر زیستی کافی نیست، روش‌های کامل‌تری ازجمله استروسکوپی با رزونانس مغناطیسی هستۀ کربن و پروتون نیز پیشنهاد می‌شوند. با استناد به نتایج پژوهش حاضر و در مقایسه با سویۀ صنعتی زانتوموناس کمپستریس، سویۀ زانتوموناس سیتری 386 نیز نامزد مناسب تولید زانتان در محیط آب‌پنیر معرفی می‌شود.

سپاسگزاری

نویسندگان از امکانات سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران و پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک ایران که در اختیار پژوهش حاضر قرار گرفتند، سپاسگزاری می‌کنند.

(18) da Silva JA., Cardoso LG., de Jesus Assis D., Gomes JVP., Oliveira MBPP., de Souza OC., et al. Xanthan gum production by Xanthomonas campestris pv. campestris IBSBF 1866 and 1867 from lignocellulose agro industrial wastes. Applied Biochemistry and Biotechnology 2018; 1-14.

(19) Faria S., de Oliveira Petkowicz CL., de Morais SAL., Hernandez Terrones MG., de Resende MM., de Franc FP., et al. Characterization of xanthan gum produced from sugar cane broth. Carbohydrate Polymer 2011; 86: 469-476.

(20) Katsuki H., Kawano C., Yoshida T., Kanayuki H., Tanaka S. The determination of pyruvic acid by 2, 4-Dinitrophenylhydrazin method. Analytical Chemistry 1961; 2: 433-439.

(21) McComb EA., McCready RM. Determination of acetyl in pectin and in acetylated carbohydrate polymer. Analytical Chemistry 1957; 29(5): 819-821.

(22) Hsu CS. Integrated rotating fibrous-bed bioreactor-ultrafiltration process for xanthan gum production from whey lactose [Dissertion]. Athens: Ohio State University; 2011.

(23) Griffiths PR., de Hasseth JA. Fourier transform infrared spectrometry. 2nd ed. New Jersey: Wiley-Blackwell; 2007

(24) Koníček J., Lasík J., Šafář H. Xanthan gum produced from whey by a mutant strain of Xanthomonas campestris. Folia Microbiologica 1993; 38: 403-405.

(25) Warmerdam A., Boom RM., Janseen AEM. β-galactosidase stability at high substrate concentrations. Springerplus 2013; 2(1): 402.

(26) Erten T., Adams GG., Foster TG., Harding SE. Comparative heterogeneity, molecular weights and viscosities of xanthan of different pyruvate and acetate content. Food Hydrocolloids 2014; 1-7.

(27) Bourne MC. Food texture and viscosity concept and measurement. 2nd ed. New York: Academic Press; 1997.

(28) De Vuyst L., Vermeire A. Use of industrial medium components for xanthan production by Xanthomonas campestris NRRL-B-1459. Applied Microbiology and Biotechnology 1994; 42: 187-191.

(29) Silva MF., Fornari RCG., Mazutti M de Oliveira D., Padilha FF., Cichoski AJ., Cansian RL., et al. Production and characterization of xanthan gum by Xanthomonas campestris using cheese whey as sole carbon source. Journal of Food Engineering 2009; 90: 119-123.

(30) Cheetham NWH., Nik Norma NM. The effect of pyruvate on viscosity properties of xanthan. Carbohydrate Polymer 1989; 10: 55-60.

(31) Rodriguez H., Aguilar L., Lao M. Variations in xanthan production by antibiotic-resistant mutants of Xanthomonas campestris. Applied Microbiology and Biotechnology 1997; 48(5): 626-629.

(32) Sandford PA., Pittsley JE., Knutson CA., Watson PR., Cadmus MC., Jeanes A. Variation in Xanthomonas campestris NRRL B-1459: Characterization of xanthan products of differing pyruvic acid content. Extracellular microbial polysaccharide. ACS Symposium Series 1977; 45: 192-210.

(33) Rehm B. Microbial production of biopolymers and polymer precursors: Applications and perspectives. 1st ed. Horizon Scientific Press; 2009.

(34) Mesomo M., Silva MF., Boni G., Padilha FF., Mazutti M., Mossi M., et al. Xanthan gum produced by Xanthomonas campestris from cheese whey: Production optimisation and rheological characterisation. Journal of the Science of Food and Agriculture 2009; 89: 2440-2445.

(35) Savvides AL., Katsifas EA., Hatzinikolaou DG., Karagouni AD. Xanthan production by Xanthomonas campestris using whey permeate medium. World Journal Microbiology Biotechnology 2012; 28: 2759-2764.