بررسی میزان مقاومت به تنش خشکی گیاهچه‌های دو لاین گیاه تریتیکاله (Triticosecale × Wittmack) با تأکید بر برخی آنتی‌اکسیدان‌های آنزیمی و غیرآنزیمی

بررسی میزان مقاومت به تنش خشکی گیاهچه‌های دو لاین گیاه تریتیکاله (Triticosecale × Wittmack) با تأکید بر برخی آنتی‌اکسیدان‌های
آنزیمی و غیرآنزیمی

سیده سارا حسینی، منیره چنیانی *، مهرداد لاهوتی و علی گنجعلی

گروه زیست‌شناسی، دانشکدة علوم، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران

چکیده

خشکی، یکی از مهم‌ترین عوامل بازدارندة رشد و نمو گیاهان در محیط است. بنابراین برای بررسی تنش خشکی و ارزیابی سیستم‌های مقاومتی دو لاین ET83-20 و Sanabad گیاه تریتیکاله (Triticosecale × Wittmack)، غلة جدید ساختة دست بشر، آزمایشی در قالب طرح کاملا تصادفی و با سه تکرار به‌شکل گلدانی در شرایط گلخانه انجام شد. سطوح خشکی آزمایش‌شده شامل 30 و 60 درصد ظرفیت زراعی برای شرایط تنش و 90 درصد ظرفیت زراعی برای شاهد انتخاب شد. یک هفته پس از اعمال تنش خشکی نمونه‌برداری برای بررسی برخی صفات مورفوفیزیولوژیک و بیوشیمیایی درمرحلة گیاهچه‌ای انجام شد. نتایج حاصل از بررسی آماری نشان داد که در هر دو لاین گیاه با افزایش سطح تنش خشکی، شاخص‌های رشد کاهش یافت. مقایسة محتوای کلروفیل a، b، کلروفیل‌کل و کاروتنوئید نشان داد که با افزایش تنش خشکی محتوای رنگدانه‌های فتوسنتزی در هر دو لاین به‌طور معنی‌داری افزایش یافت (05/0P<)؛ ولی میزان افزایش این رنگدانه‌ها در ET83-20 بیشتر از Sanabad بود. گرچه تنش خشکی در هر دو لاین، محتوای آنتی‌اکسیدان غیرآنزیمی پرولین و کربوهیدرات‌های محلول (از انواع اسمولیت‌ها)، و نیز فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان سوپراکسید دیسموتاز و گایاکول پراکسیداز را افزایش داد، این افزایش در Sanabad بیشتر از ET83-20 بود. شدت آسیب‌دیدگی شاخص‌های رشد و نحوة بروز ساز‌و‌کار‌های دفاعی دو لاین نشان می‌دهدکه ET83-20 در برابر تنش خشکی، نسبت به Sanabad مقاومت کمتری دارد. از‌این‌رو Sanabad جایگزین بهتری برای گندم نان معرفی شد.

واژه‌های کلیدی: آنتی‌اکسیدان غیرآنزیمی، آنتیپ‌اکسیدان غیرآنزیمی، تریتیکاله، تنش خشکی

مقدمه.

تنش خشکی از جمله تنش‌های فیزیکی است که مهم‌ترین عامل محدودکنندة رشد و تولید محصول در گیاهان زراعی شناخته شده است (Borzooi et al., 2006 Razavizadeh et al., 2014;). برمبنای گزارش‌ها خشکی، عامل مهم کنترل‌کنندة عملکرد محصولات، تقریبا بر کلیة فرایندهای رشد گیاه تاثیرگذار است (Siddique et al., 1999). در تنش خشکی و کمبود آب، روزنه‌های گیاه بسته می‌شوند؛ به‌دنبال آن، غلظت CO₂ در بافت مزوفیل برگ کاهش می‌یابد که پیامد آن، مختل‌شدن واکنش‌های تاریکی فتوسنتز و مصرف‌نشدن محصولات حاصل از واکنش‌های روشنایی ATP) و (NADPH است. در چنین وضعیتی به‌علت اکسید‌نشدن مولکول NADPH، مصرف NADP⁺ برای دریافت الکترون کاهش می‌یابد و مولکول اکسیژن (پذیرندة الکترون) بیشتری در مسیر زنجیرة انتقال الکترون عمل می‌کند. به‌این‌ترتیب شکل‌گیری رادیکال‌های سوپراکسید (O₂^°-)، پراکسید هیدروژن (H₂O₂)، رادیکال هیدروکسیل (OH^°-) و ... افزایش می‌یابد (Sairam and Saxena, 2000). فعالیت گونه‌های فعال اکسیژن (Reactive Oxygen Species؛ ROS) ممکن است بروز آسیب‌هایی مانند اکسیدشدن لیپیدهای غشا، اکسیدشدن گروه‌های سولفیدریل (‌-SH) و تغییر ساختار پروتئین‌ها، غیرفعال‌شدن آنزیم‌ها، آسیب به سیستم‌های فتوسنتزی و... را سبب شود. کاهش تنش اکسیداتیو و افزایش مقاومت به چنین تنش‌های محیطی اغلب به سیستم‌های دفاع آنتی‌اکسیدانی قوی مربوط می‌شود. این سیستم دفاعی، شامل آنتی‌اکسیدان‌های آنزیمی (سوپر اکسیددیسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT)، آسکوربات‌پراکسیداز (APX)، گلوتاتیون‌ردوکتاز (GR)، گایاکول‌پراکسیداز (POD) و ...) و آنتی‌اکسیدان‌های غیر‌آنزیمی (آسکوربات، توکوفرول، فلاونوئیدها، مانیتول‌ها، پرولین، قندهای محلول، پلی‌فنل‌ها و ...) است (Blokhin et al., 2003). فراوانی سیستم‌های دفاعی شاید به‌علت تولید انواع ROSها در سلول‌ها و بخش‌های مختلف زیرسلولی باشد. ازسوی‌دیگر، این مولکول‌ها در ویژگی‌هایی مانند توانایی انتشار، حلالیت و گرایش به واکنش با مولکول‌های زیستی مختلف، بسیار متنوع هستند. بنابراین وجود مجموعة به‌هم‌پیوسته ازسیستم‌های دفاعی برای عمل در بخش‌های ساختاری و غشایی، و در همة قسمت‌های سلول برای غیرفعال‌کردن رادیکال‌ها ضروری است (Borzooi et al., 2006).

تریتیکاله (Triticosecale)، گونه‌ای جدید و هیبرید در غلات، ساخته‌شده به‌دست بشر است. این گیاه در نتیجة تلاقی ژنوم‌های جنس گندم (Triticum) (والد ماده) و جنس چاودار (Secal) (والد نر) به وجود آمده است. اگر در تلاقی بین گندم و چاودار از گندم تتراپلوئید یا هگزاپلوئید استفاده شود، تریتیکالة حاصل به‌ترتیب هگزاپلوئید (6x=42) یا اکتاپلوئید (8x=56) خواهد بود. تریتیکالة اکتاپلوئید به‌ سبب عقیمی نسبی ناشی از تعداد زیاد کروموزوم، چندان مطلوب نیست و به همین دلیل محققان مطالعات خود را بر تریتیکاله‌های هگزاپلوئید که عملکرد بهتری دارند متمرکز کرده‌اند (Mergom and Maspherson, 2004 ). این گیاه را موفق‌ترین گیاه غلة ساخت بشر می‌دانند که با هدف کسب محصولی با کیفیت برتر گندم (پتانسیل زیاد تولید محصول و کیفیت مطلوب دانه) و متحمل به تنش‌های زیستی و غیرزیستی چاودار تولید شده است (Lelley, 2006; Mergoum and Gomez, 2009; Sairam and . Saxena, 2000). با‌توجه‌به اینکه تریتیکاله مقاومت خوبی نسبت به وضعیت نامناسب محیطی نشان می‌دهد، جایگزین خوبی برای غلات (به‌ویژه گندم نان) در وضعیت محیطی نامناسب و کم‌بازده به شمار می‌رود (Campuzano et al., 2008 Erekul and Kohn, 2006;). با‌وجود این، مشخص شده است که بین لاین‌های مختلف این گیاه از نظر تحمل به تنش خشکی تفاوت وجود دارد. هدف از پژوهش حاضر، بررسی معیارهای مقاومت دو لاین ET83-20 و Sanabad نسبت به تنش خشکی و معرفی لاین مناسب‌تر برای جایگزینی احتمالی با سایر غلات است.

مواد و روش‌ها.

پژوهش حاضر، در آزمایشگاه فیزیولوژی گیاهی دانشگاه فردوسی مشهد در قالب طرح کاملا تصادفی، با سه تکرار و در شرایط گلخانه انجام شد. به این‌منظور، بذر‌های چهار لاین گیاه تریتیکاله با نام‌های Sanabad، Juanilo، ET83-20 و ET84-17 از موسسة تحقیقات جهاد کشاورزی مشهد تهیه شد. پس از بررسی ویژگی‌های جوانه‌زنی بذر‌ها (درصد و سرعت جوانه‌زنی)، دو لاین Sanabad و ET83-20 با بهترین صفات جوانه‌زنی انتخاب شدند. بذرهای سالم، هم‌اندازه و فاقد هرگونه ظاهر معیوب انتخاب شدند و پس از ضدعفونی با محلول سدیم هیپوکلریت 10% (v/v) و شستشو با آب مقطر، به‌مدت نصف روز روی کاغذ صافی مرطوب قرار گرفتند. درنهایت بذرها به گلدان‌های پلاستیکی با قطر دهانة 25 سانتی‌متر، محتوی خاک رس و ماسه به نسبت 3 به 1 منتقل شدند. هر گلدان یک واحد آزمایشی در نظر گرفته شد. در هر گلدان، 8 بذر در عمق 5/1 سانتی‌متری خاک کاشته شدند. گلدان‌ها در سه رژیم رطوبتی شامل 30 و 60% ظرفیت زراعی (شرایط تنش) و 90% ظرفیت زراعی (شاهد) قرار گرفتند. برای ایجاد ظرفیت‌های زراعی یاد‌شده، در ابتدا سه گلدان انتخاب و به‌طور کامل آبیاری شدند. سپس سطح گلدان‌ها با کیسه‌های پلاستیکی پوشانده شد و پس از گذشت 12 ساعت، گلدان‌ها در فواصل زمانی معین توزین شدند. با ثابت‌ماندن وزن گلدان‌ها، ظرفیت زراعی 10% مشخص شد و سایر سطوح خشکی نیز بر اساس این ظرفیت تعیین شدند. اعمال تنش، یک هفته پس از رشد گیاهچه‌ها و با توزین روزانة گلدان‌ها با روش بالا انجام شد. گلدان‌ها در شرایط گلخانه و با درجه حرارت 26 درجة سانتیگراد و دورة نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی نگه‌داری شدند.

روش بررسی شاخص‌های رشد: نمونه‌برداری گیاهچه‌ها یک هفته پس از اعمال تنش خشکی انجام شد. به‌این‌ترتیب که گلدان‌ها برای بررسی صفات مورفوفیزیولوژیک، تخریب شد و وزن تر بخش هوایی و ریشه (با ترازوی دیجیتال مدل TE313s، Sartorius، آلمان)، مجموع سطح برگ‌ها به ازای هر گیاه و مجموع سطح و قطر ریشه‌ها (با دستگاه اسکنر متصل به کامپیوتر مدل ADC، BioScientific Ltd، انگلستان) بررسی شدند. برای اندازه‌گیری وزن خشک اندام‌ها، بافت نمونه‌ها پس از 48 ساعت قرارگیری در دمای 70 درجة سانتیگراد توزین شدند.

.روش سنجش محتوای رنگدانه‌های فتوسنتزی:برای ارزیابی محتوای کل رنگدانه‌های فتوسنتزی، 2/0 گرم از قطعات برگ گیاهچه‌ها، جداگانه در 10 میلی‌لیتر استون 80% ساییده شد و به‌مدت 10 دقیقه در دستگاه سانتریفوژ (مدل Z230، شرکت Berthold Hermle GmbH ، آلمان) در4000 دور در دقیقه سانتریفوژ شد. حجم نهایی نمونه‌ها پس از پایان سانتریفوژ به 25 میلی‌لیتر رسانده شد. جذب نمونه‌های حاصل، در طول موج‌های 440، 646 و 663 نانومتر خوانده شد و درنهایت محتوای کلروفیل a، کلروفیل b و کلروفیل کل با روش Mackinney (1941) و محتوای کاروتنوئیدها با روش Arnon (1956) و بر‌مبنای رابطه‌های 1، 2، 3 و4 برحسب میلی‌گرم در گرم وزن تر نمونه محاسبه شد.

رابطة 1:

Chl_a =[(12.25 A₆₆₃) - (2.55 A₆₄₆)] × V/W×1000

کلروفیل a (Chl_a) (واحد میلی‌گرم در گرم وزن تر نمونه= mg/g FW): A₆₆₃جذب نمونه در طول موج 663 نانومتر، A₆₄₆ جذب نمونه در طول موج 646 نانومتر، V حجم نمونه، W وزن تر نمونه

رابطة 2:

 Chl_b= [(22.31 A₆₄₆) - (4.91 A₆₆₃)] ×V/W×1000

کلروفیل b (Chl_b) (واحد میلی‌گرم در گرم وزن تر نمونه= mg/g FW): A₆₄₆ جذب نمونه در طول موج 646 نانومتر، A₆₆₃ جذب نمونه در طول موج 663 نانومتر، V حجم نمونه، W وزن تر نمونه

رابطة 3:

 Chl_{a + b} = [(17.76 A₆₄₆) + (7.34 A₆₆₃)] × V/W×1000

کلروفیل کل (Chl_a+b) (واحد میلی‌گرم در گرم وزن تر نمونه= mg/g FW): A₆₄₆جذب نمونه در طول موج 646 نانومتر، A₆₆₃ جذب نمونه در طول موج 663 نانومتر، V حجم نمونه، W وزن تر نمونه

رابطة 4:

Car = [(4.69 A₄₄₀) - (0.267 Chl_a+b)] × V/W×1000

کاروتنوئید (Car) (واحد میلی‌گرم در گرم وزن تر نمونه= mg/g FW): A₄₄₀ جذب نمونه در طول موج 440 نانومتر، Chl_a+b میزان کلروفیل کل، V حجم نمونه، W وزن تر نمونه

روش تعیین شاخص پایداری غشاء: برای تعیین این شاخص، دو برگ میانی از هر گلدان انتخاب و 1/0 گرم از آن در وضعیت غوطه‌ور در آب، به مدت 10 دقیقه در بن ماری (مدل سرولوژی، شرکت Kavoosh Mega، ایران) 40 درجة سانتیگراد و 1/0 گرم دیگر از آن به‌مدت 30 دقیقه در بن ماری 100 درجة سانتیگراد قرار داده شد و سپس هدایت الکتریکی (EC) نمونه‌ها با دستگاه EC متر (مدل 45-10، شرکتJenway ، انگلستان) اندازه‌گیری و شاخص پایداری غشاء بر مبنای رابطة 5 محاسبه شد (Azizpour et al., 2010).

MSI = ))1-EC₄₀(/EC₁₀₀(×100رابطة 5:                     

شاخص پایداری غشاء (MSI): EC₄₀ هدایت الکتریکی نمونه در دمای 40 درجه سانتیگراد (واحد دسی‌زیمنس‌بر‌متر= ds/m)، EC₁₀₀ هدایت الکتریکی نمونه در دمای 100 درجه سانتیگراد (واحد دسی‌زیمنس‌ بر ‌متر = ds/m)

روش ارزیابی میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء: برای ارزیابی میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء، از روش Heath و Packer (1969)، براساس تشکیل کمپلکس مالون دی آلدهید (MDA) حاصل از پراکسیداسیون لیپیدهای غشا با تیو باربیتوریک اسید (TBA)، انجام شد. 2/0 گرم از بافت تازة برگ با 5 میلی‌لیتر تری کلرو استیک اسید (TCA) 1/0% (w/v) سائیده شد. عصارة حاصل به مدت 15 دقیقه در 10000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. به 1 میلی‌لیتر از محلول رویی حاصل از سانتریفیوژ، 4 میلی‌لیتر محلول TCA 20% (w/v) محتوی 5/0% (w/v) تیو ‌باربیتوریک ‌اسید اضافه شد. مخلوط حاصل، ابتدا به‌مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم (دمای 95 درجة سانتیگراد) و سپس بلافاصله به‌مدت 5 دقیقه در حمام آب یخ قرار داده شد و در‌ نهایت به‌مدت 10 دقیقه در 10000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. جذب نوری این محلول در طول موج 532 نانومتر، با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل UV/Vis1800، شرکت JASCO، آلمان) خوانده شد. مادة مد نظر برای جذب در این طول موج، کمپلکس قرمز (MDA-TBA) است. جذب سایر رنگدانه‌‌های غیراختصاصی در 600 نانومتر تعیین و از این مقدار کسر شد. برای محاسبة غلظت MDA ‌برحسب میکرومول در گرم وزن تر نمونه، از ضریب خاموشی (ε) معادل 155 میلی‌مول بر سانتی‌متر و بر‌مبنای رابطة 6، استفاده شد:

A= εbc                                                        رابطة 6:

جذب نمونه (A): ε ضریب خاموشی (واحد میلی‌مول بر سانتی‌متر)، b پهنای کووت (معادل 1 سانتی‌متر)، c غلظت MDA

روش سنجش محتوای پرولین: محتوای پرولین برگ با روش Bates و همکاران (1973) اندازگیری شد. 2/0 گرم از بافت تر برگ در 4 میلی‌لیتر محلول سولفو سالیسیلیک اسید 3% (w/v) ساییده و همگنای حاصل به مدت 15 دقیقه در 3000 دور در دقیقه سانتریفوژ شد. 2 میلی‌لیتر از روشناور با 2 میلی‌گرم معرف نین هیدرین و 2 میلی‌لیتر استیک ‌اسید‌گلاسیال مخلوط و به‌مدت 1 ساعت در حمام آب گرم (دمای 100 درجة سانتیگراد) قرار گرفت. برای قطع انجام کلیة واکنش‌ها، لوله‌های محتوی محلول روشناور بلافاصله در حمام یخ قرار داده شدند و سپس 4 میلی‌لیتر تولوئن به آن‌ها اضافه و به‌مدت 30 ثانیه به‌شدت هم زده شدند. با ثابت نگه‌داشتن لوله‌ها به‌مدت 15 تا20 ثانیه، 2 لایة کاملا مجزا تشکیل شد. از لایة رنگی رویی که تولوئن حاوی پرولین بود، برای اندازه‌گیری غلظت پرولین استفاده شد. پس از گذشت 20 دقیقه، جذب مقدار معینی از این مادة رنگی در طول موج 520 نانومتر، با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل UV/Vis1800، شرکت JASCO، آلمان) تعیین شد و مقدار پرولین در هر نمونه برمبنای منحنی استاندارد پرولین (صفر تا 16 میکروگرم در میلی‌لیتر) و معادلة خط y=0.0177x+0.003، برحسب میکرومول در گرم وزن تر نمونة گیاهی و براساس رابطة 7 محاسبه شد:

رابطة 7:

= میکرومول پرولین در گرم وزن تر نمونه

.روش ارزیابی محتوای کربوهیدرات‌های محلول: برای سنجش کربوهیدرات‌های محلول از روش Dubious و همکاران (1956) استفاده شد. 02/0 گرم نمونة خشک برگ در 3 میلی‌لیتر اتانول 80% (v/v)کاملا سائیده، سپس همگنای حاصل به‌مدت 15 دقیقه در 5000 دور در دقیقه سانتریفوژ شد و از محلول روشناور برای سنجش قندهای محلول استفاده شد. بدین‌منظور، به 1 میلی‌لیتر از عصارة حاوی کربوهیدرات‌های محلول،1 میلی‌لیتر محلول 5% فنل (w/v) افزوده و به‌خوبی هم زده شد. در مرحلة نهایی، 5 میلی‌لیتر سولفوریک اسید غلیظ به هر نمونه اضافه و به‌شدت مخلوط شد. نمونه‌ها به‌مدت نیم ساعت در دمای اتاق قرار گرفتند. در نهایت مقادیر جذب آن‌ها در طول موج 480 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل UV/Vis1800، شرکت JASCO، آلمان) خوانده شد. با داشتن غلظت‌های معلوم گلوکز (صفر تا 100 میلی‌گرم در میلی‌لیتر)، رسم منحنی استاندارد و معادلة خط y=0.0111x-0.0576 ، مقدار کربوهیدرات‌های محلول بر حسب میلی‌گرم در 100 گرم بافت خشک نمونه محاسبه شد.

فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز:برای سنجش فعالیت این آنزیم از روش Giannopolitis و Ries (1977) استفاده شد. فعالیت این آنزیم با قابلیت آن در بازدارندگی واکنش احیای فتوشیمیایی نیترو بلو تترازولیوم (NBT) تعیین شد. به این منظور، ابتدا محلول بافر فسفات 50 میلی‌مولار با 5/7 pH= تهیه شد. سپس برای تهیة مخلوط واکنش، به ترتیب ترکیبات نیترو بلو تترازولیوم 75 میکرومولار، متیونین 13 میلی‌مولار، ریبوفلاوین 4 میکرومولار و اتیلن دی‌آمید تترا استیک‌اسید (EDTA) 1/0 میل‌مولار، به بافر فسفات پتاسیم افزوده شد. سپس 200 میکرولیتر از هر نمونة عصارة آنزیمی، به 3 میلی‌لیتر از مخلوط واکنش افزوده و با قرار دادن آن‌ها در روشنایی لامپ فلورسنت40 وات با تابش 75 میکرو‌مول‌ فوتون بر متر‌مربع بر ثانیه، بلافاصله واکنش آغاز شد. پس از گذشت 20 دقیقه، تابش نور قطع و جذب نمونه‌ها در طول موج 560 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل UV/Vis1800، شرکت JASCO، آلمان) خوانده شد. برای نمونة شاهد 3 میلی‌لیتر از محلول یاد‌شده که فاقد عصارة آنزیمی بود استفاده شد. برای سنجش فعالیت این آنزیم علاوه بر شاهد، نیاز به شاهد روشنایی شامل 3 میلی‌لیتر از محلول واکنش (فاقد عصارة آنزیمی) قرار گرفته در مقابل نور فلورسنت نیز بود تا میزان فعالیت آنزیم SOD در نمونه‌ها در مقایسه با شاهد روشنایی سنجیده شود. اختلاف جذب نمونه‌ها و شاهد روشنایی در طول موج 560 نانومتر، نشان‌دهندة مهار احیای نوری NBT در حضور آنزیم SOD موجود در نمونه است. به بیان دقیق‌تر، یک واحد آنزیمی SOD، مقدار آنزیمی است که 50% ممانعت را از احیای NBT موجب می‌شود. با داشتن این اختلاف جذب بین نمونه‌ها و شاهد روشنایی در طول موج 560 نانومتر، واحد آنزیمی نمونه‌ها محاسبه و فعالیت آنزیمی بر حسب واحد آنزیم در میلی‌گرم پروتئین بیان شد.

فعالیت آنزیم گایاکولپراکسیداز: برای سنجش فعالیت این آنزیم براساس روش Putter (1974)، 3 میلی‌لیتر محلول بافر فسفات 1/0 مولار با 7pH= با 03/0 میلی‌لیتر محلول پراکسید هیدروژن و 1/0 میلی‌لیتر عصارة آنزیمی در کووت ریخته و مخلوط شد. سپس جذب آن در طول موج 436 نانومتر خوانده و برای افزایش جذب تا 05/0 مکث شد. در این موقع، زمان آزمایش یادداشت شد تا جذب به 1/0 افزایش یابد و بتوان t∆ را ارزیابی کرد. فعالیت آنزیمی در هر لیتر عصاره بر اساس رابطة 8 محاسبه شد.

رابطة 8:                                                   u/lit=500/Δt

(u): واحد فعالیت آنزیمی

t∆: مدت زمان آزمایش

تحلیل داده‌ها: تجزیه و تحلیل آماری داده‌ها با نرم‌افزارSPSS نسخة 20 انجام و برای مقایسة میانگین داده‌ها از آزمون چند دامنه‌ای دانکن در سطح احتمال 5% (05/0P≤) استفاده شد و نمودارهای مربوطه با نرم‌افزار EXCEL Microsoft (Office 2007) رسم شدند.

نتایج.

نتایج حاصل از آنالیز واریانس نشان داد که تنش خشکی در هر دو لاین، تاثیر معنی‌داری بر بیشتر شاخص‌های رشد گیاهچه‌ها داشت) 05/0(PET83-20 بیشتر از Sanabad بود (شکل1- A و B). با افزایش سطح خشکی، سایر صفات مورفولوژیک گیاهچه‌ها از جمله مجموع سطح ریشه‌ها، قطر ریشه‌ها، میانگین طول ریشه‌ها و مجموع سطح برگ‌ها نیز کاهش یافت (شکل1- C، D، E و F). این روند کاهش معنی‌دار، در لاین ET83-20، درخور‌توجه‌تر از Sanabad بود. ارزیابی‌ها نشان داد که لاین Sanabad در وضعیت فراهمی رطوبت، دارای سطح بیشتر این صفات و لاین ET83-20 در وضعیت تنش 30%، کمترین حد صفات بیان‌شده را داشتند (شکل 1).

نتایج آنالیز واریانس داده‌ها نشان داد که تاثیر تنش خشکی بر کلروفیل a، b، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها معنی‌دار بوده است) 05/0(PET83-20 نسبت به Sanabad شاخص بود. نکتة شایان توجه، شیب بیشتر تغییرات مربوط به محتوای کارتنوئیدها در لاین ET83-20 نسبت به Sanabad بود (شکل 2- A، C و D).

شکل 1- تاثیر سطوح مختلف تنش خشکی بر A) وزن خشک ریشه؛ B) وزن خشک بخش هوایی؛ C) مجموع طول ریشه؛ D) قطر ریشه؛ E) مجموع سطح ریشه؛ F) مجموع سطح برگ. مقادیر میانگین 3 تکرار ± StD است. حروف مشترک بیانگر نبود تفاوت معنی‌دار برمبنای آزمون دانکن در سطح 05/0 P<است. 90% ظرفیت زراعی = شاهد.

تحلیل مقایسه‌ای داده‌ها نشان داد که تنش خشکی، لاین و برهم‌کنش این دو عامل، بر محتوای پرولین، کربوهیدرات محلول، مالون دی‌آلدهید، شاخص پایداری غشاء و میزان فعالیت آنزیم‌های SOD و POD معنی‌دار بود) 05/0(P< (داده‌ها نشان داده نشده‌اند). بررسی محتوای پرولین در دو لاین نشان داد که با افزایش شدت تنش، در هر دو لاین، به‌طور‌پیوسته بر میزان پرولین برگ افزوده شد. در همة سطوح بررسی‌شده، مقدار افزایش پرولین در لاین Sanabad بیشتر از ET83-20 بوده است؛ به‌طوری‌که بیشترین محتوای پرولین گزارش شده، متعلق به لاین Sanabad در سطح خشکی30% بود (شکل 3-A).

شکل 2- تاثیر سطوح مختلف تنش خشکی برA ) محتوای کلروفیلa؛ B) محتوای کلروفیلb؛ C) محتوای کاروتنوئید؛ D) محتوای کلروفیل کل. مقادیر میانگین 3 تکرار ± StD است. حروف مشترک بیانگر نبود تفاوت معنی‌دار برمبنای آزمون دانکن در سطح 05/0P< است. 90% ظرفیت زراعی = شاهد.

بررسی‌ها معین کرد که تنش خشکی، بر محتوای کربوهیدرات‌های محلول نیز به‌شدت تاثیر گذاشت و افزایش معنی‌دار قندهای محلول در هر دو لاین را باعث شد؛ اما میزان این افزایش در لاین Sanabad بیشتر از لاین دیگر در همة دوره‌های بررسی‌شده بود؛ به‌طوری‌که افزایش درخور‌توجهی در مقدار کربوهیدرات اندازه‌گیری شدة لاین Sanabad در سطح تنش30% ثبت شد (شکل 3- B). بررسی نتایج در بخش میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء نشان داد که روند تنشی، میزان تغییرات لیپیدهای غشا را افزایش داد؛ به‌طوری که این آسیب در لاین ET83-20 و به‌طور عمده در سطح تنش30% شایان توجه بود (شکل 3- C). بررسی شاخص پایداری غشاء نیز نشان داد که گرچه در هر دو لاین Sanabad وET83-20، ثبات غشای سلول‌ها در نتیجة اعمال تنش خشکی کاهش یافت، آثار تخریبی آن بر غشای سلول‌های لاین ET83-20 بیشتر بود (شکل 3- D).

با مقایسة میانگین نتایج در هر دو لاین مشخص شد تنش خشکی افزایش در میزان فعالیت آنزیم‌های SOD و POD را باعث شد؛ ولی میزان این افزایش در لاین Sanabad بیشتر از ET83-20 بود. بیشترین میزان فعالیت SOD وPOD، متعلق به لاین Sanabad در سطح ظرفیت زراعی 30% و با تفاوت معنی‌دار نسبت به لاین ET83-20 بود (شکل 3- E وF). فعالیت آنزیم SOD در سطح تنش 30% در مقایسه با نمونه‌های شاهد، افزایش 7/4 برابری در لاین Sanabad و افزایش 8/3 برابری در لاین ET83-20 نشان داد. همچنین فعالیت آنزیم POD در سطح تنش 30%، افزایش 3 برابری را در لاین Sanabad و افزایش 5/2 برابری را در لاینET83-20 در مقایسه با نمونه‌های شاهد نشان داد.

شکل 3- تاثیر سطوح مختلف تنش خشکی بر A) محتوای پرولین؛ B) محتوای کربوهیدارت محلول؛ C) محتوای مالون دی آلدهید؛ D) شاخص پایداری غشاء؛ E) فعالیت آنزیم SOD؛ F) فعالیت آنزیم POD. مقادیر میانگین 3 تکرار ± StD است. حروف مشترک بیانگر نبود تفاوت معنی‌دار برمبنای آزمون دانکن در سطح 05/0 P<است. 90% ظرفیت زراعی = شاهد.

بحث.

نتایج حاصل از اندازه‌گیری صفات رشد در مرحلة گیاهچه‌ای دورة رویشی نشان داد که تنش خشکی، کاهش معنی‌دار وزن خشک ریشه و بخش هوایی، مجموع سطح برگ‌ها، مجموع سطح، طول و قطر ریشه‌ها را در دو لاین گیاه تریتیکاله باعث می‌شود؛ ولی میزان کاهش نهایی این تغییرات در لاین ET83-20 بیشتر از Sanabad بود. Khazai و همکاران (2010) طبق آزمایشی که روی ژنوتیپ‌هایی از گیاه تریتیکاله انجام دادند، به این نتیجه رسیدند که وزن خشک بخش هوایی، ریشه و سنبلة گیاهان با اعمال محدودیت رطوبتی کاهش می‌یابد (Khazai et al., 2010). مشخص شده است که پاسخ‌های فنولوژی ژنوتیپ‌های متفاوت تریتیکاله در برابر محدودیت‌های رطوبتی، متفاوت است (Campuzano et al., 2008). با توجه به اینکه کاهش مدت این دوره، فتوسنتز را کاهش می‌دهد، نتیجه‌گیری می‌شود که در تحقیق حاضر، کاهش وزن خشک اندام هوایی و ریشه در تنش خشکی ممکن است ناشی از کاهش فتوسنتز باشد. سایر محققان نیز این موضوع را تایید کرده‌اند (Grzesiak et al., 2007 Ivandic et al., 2000; McMaster and Wilhelm, 2003;).

بررسی‌های انجام‌شده دربارة رنگدانه‌های فتوسنتزی نشان داد که تنش خشکی، محتوای کلروفیل a و b، کلروفیل کل و کاروتنوئید را در هر دو لاین افزایش داد؛ اما میزان این افزایش در لاین ET83-20 بیشتر از لاین Sanabad بود. افزایش بیشتر محتوای رنگدانه‌ها در لاین ET83-20 ممکن است به‌علت کاهش بیشتر سطح برگ، ایجاد شده باشد که خود ساز‌و‌کاری برای اجتناب از خشکی است. در گزارش‌های به‌دست‌آمده از برخی محققان، تغییرات فیزیولوژیک سریع مانند لوله‌ای‌شدن برگ، کاهش سطح برگ و افزایش مقاومت روزنه‌ای جزء ساز‌و‌کار‌های اجتناب از تنش خشکی و شوری معرفی شده‌اند (Machado and Paulsen, 2001). طبق پژوهش انجام‌شده بر ارقام مختلف گندم در تنش خشکی، مشخص شد که نسبت کلروفیل a به b در وضعیت تنش، 5% افزایش یافته است (Siosemardeh et al., 2004). گرچه تحقیقات متعددی برکاهش میزان کلروفیل هنگام تنش خشکی دلالت دارد، بسیاری از تحقیقات دیگر بیانگر افزایش محتوای کلروفیل و کاروتنوئید در وضعیت تنش است (Movahedi Dehnavi et al., 2004؛ Rahbarian et al., 2011؛ Matloubi, 2014). در برخی تحقیقات نیز افزایش محتوای کاروتنوئیدها، محافظان کلروفیل‌ها از فرایند تجزیه‌شدن، در هنگام تنش گزارش شده است (Dias et al., 2014؛ Sedghi et al., 2012).

افزایش چشمگیر محتوای پرولین در هر دو لاین تریتیکاله در تنش خشکی نشان‌دهندة اهمیت این ترکیب در تنظیم فشار اسمزی در گیاه است. میزان افزایش این ماده در لاین Sanabad بسیار بیشتر از لاین ET83-20 بوده است که این امر ممکن است یکی از دلایل مقاومت بیشتر این لاین به تنش خشکی باشد. اثبات شده است که تنش خشکی در گیاهان، نسخه‌برداری mRNA ژن‌های کدکنندة آنزیم‌های مسیر بیوسنتز پرولین (دلتا پرولین 5-کربوکسیلات سنتاز P5CS و دلتا پرولین 5-کربوکسیلات ردوکتاز P5CR) و در نهایت محتوای پرولین را افزایش می‌دهد تا ساز‌و‌کار دفاعی در برابر تنش اعمال شده باشد (Verslues et al., 1998).

ارزیابی قندهای محلول دو لاین، روند افزایشی و معنی‌دار محتوای این ترکیبات را با افزایش تنش خشکی نشان داد. ثابت شده است که تجمع قندهای محلول در هنگام تنش خشکی به پایداری غشاء کمک می‌کند، پروتئین‌ها و آنزیم‌های عمل‌کننده را حفاظت می‌کند و آن‌ها را همچنان فعال نگه می‌دارد (Arabzadeh, 2012؛ Lipiec et al., 2013؛Sinay and Karuwal, 2014). از سوی دیگر، یک راه ممکن برای تنظیم اسمزی گیاهان، تبدیل پلی‌ساکاریدهای نامحلول مانند نشاسته و فروکتان به قندهای محلول مانند الیگو‌ساکاریدها، ساکارز و گلوکز است (Hendry, 1993). قندهای محلول که محافظت‌کننده‌های اسمزی هستند، در تنظیم اسمزی سلول نقش دارند و در پاسخ به تنش‌های محیطی تجمع می‌یابند. از‌ این رو تعیین میزان قندهای محلول در کنار ارزیابی سایر صفات بیوشیمیایی یکی از روش‌های مفید در انتخاب گونه‌های مقاوم و حساس به تنش خشکی و شوری است (Pagter et al., 2005؛ Amirjani and Mahdiyeh, 2013).

در سایر گزارش‌ها آمده است که بین شدت تحمل به تنش خشکی و افزایش تجمع قندهای محلول در گونه‌های مختلف گیاهی ارتباط مستقیم وجود دارد و ژنوتیپ‌ها و ارقام با تحمل بیشتر، تجمع بیشتری از قندهای محلول دارند (Amirjani and Mahdiyeh, 2013؛ Salehi Shanjani et al., 2014؛Sinay and Karuwal, 2014). افزایش بیشتر قندهای محلول لاین Sanabad در پاسخ به تنش خشکی نسبت به ET83-20 ممکن است یکی از دلایل سیستم مقاومتی کارآمدتر این لاین به تنش خشکی باشد.

تخریب غشای سلولی، یکی از پیامدهای مستقیم کمبود آب است و به‌این‌ترتیب، بین پایداری غشاء، میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی و شدت تنش خشکی ارتباط مستقیم وجود دارد (Sofo et al., 2004). افزایش محتوای مالون ‌دی‌آلدهید در برگ تریتیکاله در تنش خشکی نشان می‌دهد که سازوکار ترمیم سلولی با سازوکارهای تخریب حاصل از کمبود آب، همگام نبوده است و در نتیجه افزایش کنترل نشدة ROSها در حین تنش خشکی، پراکسیداسیون انواع فسفولیپیدهای غشای پلاسمایی و گلیکولیپیدهای تیلاکوئید کلروپلاستی و به دنبال آن تولید دی‌آسیل‌گلیسرول و تری‌آسیل‌گلیسرول و د‌ر ‌نهایت اسیدهای چرب اتفاق می‌افتد که حاصل آن افزایش محتوای MDA در بافت گیاهی است (Smirnoff et al., 1993؛ Ragab Mouss and Adbel-Aziz, 2008؛ Mohammadi et al., 2011). در تحقیق حاضر، محتوای MDA لاین ET83-20 بیشتر از لاین Sanabad به ثبت رسید؛ درحالی‌که لاین ET83-20، پایداری غشایی کمتری دارد. این نتایج نشان می‌دهد که لاین Sanabad می‌تواند در برابر پراکسیداسیون انواع لیپیدهای ساختاری ناشی از تجمع بیش از اندازة انواع ROSها، مقاومت بیشتری از خود نشان دهد و ثبات سلول‌های خود را بهتر حفظ کند.

سیستم دفاع آنتی اکسیدانی در همة مراحل رشد گیاهان، فعال است (Hoshani et al., 2012). در پژوهش حاضر، ارزیابی فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان مشخص کرد که تنش خشکی، فعالیت آنزیم سوپراکسید‌ دیسموتاز و گایاکول‌پراکسیداز را در هر دو لاین بررسی‌شده افزایش داد؛ اما میزان این افزایش در لاین Sanabad بیشتر از لاین ET83-20 بود. ‌Borzooi و همکاران (2006) گزارش کردند که تنش خشکی، افزایش SOD را در ارقام مختلف گندم موجب می‌شود و ارقام مقاوم به خشکی نسبت به ارقام حساس فعالیت بیشتر آنزیم SOD را دارند. افزایش فعالیت SOD در تنش خشکی در بسیاری از گونه‌های گیاهی مثل گندم (Bakalova et al., 2004)، ذرت (Ragab Moussa and Adbel-Aziz, 2008)، Populus cathayana (Xiao et al., 2008) و... نیز گزارش شده است. بین روش‌های مختلف پیشرفته برای انتخاب ژنوتیپ‌های مقاوم به خشکی در گونه‌های مختلف گیاهی، اندازه‌گیری و بررسی میزان فعالیت SOD، بسیار کارآمد تشخیص داده شده است (Amirjani and Mahdiyeh, 2013؛ Shinde and Laware, 2015). در‌ واقع SOD، آنتی‌اکسیدانی قوی و جاروب‌کنندة اصلی O₂^°- است که نخستین مادة تولید‌ شده از احیای یک ظرفیتی اکسیژن یعنی رادیکال سوپراکسید را از بین می‌برد. بنابراین نخستین خط دفاعی در برابر ROSها به شمار می‌رود (Borzooi et al., 2006؛Abedi et al., 2010؛ Mohammadi et al., 2011؛Momeni et al., 2012؛ Sharma et al., 2012). به عبارت دیگر، فعالیت SOD به‌طور مستقیم مقدار ROSها را متعادل می‌کند و این موضوع نشان می‌دهد که سازگاری به تنش خشکی، افزایش ظرفیت آنتی‌اکسیدانی آنزیمی را موجب می‌شود (Huseynova, 2012؛Amirjani and Mahdiyeh, 2013).

 PODجزء آنزیم‌هایی است که تبدیل H₂O₂ به آب و اکسیژن را کاتالیز می‌کند (Gratao et al., 2005). Abedi و همکاران (2010) براساس تحقیقی که روی ژنوتیپ‌های مختلف کلزا انجام دادند افزایش چشم‌گیر این آنزیم را در سطح تنش 30% خشکی گزارش کردند. افزایش آنزیم POD تحت شرایط تنش خشکی در بسیاری از گونه‌های گیاهی از جمله مورد (Myrtus communis) (Caravaca et al. 2005)، جو (Hordeum vulgare L.) (Salekjalali et al., 2012)، Achillea tinctoria (Salehi Shanjani et al., 2014)، بادام زمینی(Arachis hypogaea L.) (Shinde and Laware, 2015) و... نیز گزارش شده است. در حین عملکرد SOD، مقدار زیادی H₂O₂ تولید می‌شود که به‌شدت برای سلول سمی هستند.آنزیم پراکسیداز در کنار سایر آنزیم‌های آنتی اکسیدان، در حذف سریع H₂O₂ حاصل از عمکرد SOD در حین تنش خشکی، نقش بسیار مهمی را بر عهده دارد (Gue et al., 2006).

نتیجه‌گیری

نتایج حاصل از تحقیق حاضر نشان داد که لاین ET83-20 در برابر تنش خشکی مقاومت کمتری نسبت به لاین Sanabad دارد. این مسئله به‌سبب کمتربودن ترکیبات تنظیم‌کنندة اسمزی، فعالیت کمتر آنتی‌اکسیدان‌های آنزیمی و افزایش بیشتر پراکسیداسیون لیپیدها در لاین ET83-20 است. با‌وجود‌این، لاین ET83-20 سعی می‌کند با ساز‌و‌کارهای اجتناب از تنش، همانند کاهش سطح برگ و افزایش بیشتر محتوای کلروفیل‌ها به مقابله با تنش خشکی بپردازد. بر مبنای پژوهش حاضر، لاین Sanabad جایگزین بهتری برای سایر غلات معرفی می‌شود.

سپاسگزاری

نگارندگان از حوزة معاونت پژوهشی دانشگاه فردوسی مشهد برای تامین هزینه‌های مالی و از سازمان تحقیقات جهاد کشاورزی مشهد برای در اختیار قراردادن بذر‌های گیاهی سپاسگزاری می‌کنند.