پیوندهای مفید
اخبار و اعلانات
آمار
| تعداد نشریات | 43 |
| تعداد شمارهها | 1,682 |
| تعداد مقالات | 13,762 |
| تعداد مشاهده مقاله | 32,211,722 |
| تعداد دریافت فایل اصل مقاله | 12,749,433 |
بررسی اثر تنظیمکنندههای رشد (BAP و IBA) بر باززایی، پرآوری و ریشهزایی گیاه گلابی نطنز با روش کشت در شیشه | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| علوم زیستی گیاهی | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مقاله 7، دوره 8، شماره 29، مهر 1395، صفحه 77-90 اصل مقاله (1.18 M) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| نوع مقاله: مقاله پژوهشی | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| شناسه دیجیتال (DOI): 10.22108/ijpb.2016.21037 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| نویسندگان | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| عباس صفرنژاد* 1؛ سیده بیبی لیلا علمداری2؛ هادی درودی2؛ مرضیه دلیر2 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی خراسان رضوی یا شعبه مشهد، پژوهشکدۀ بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، مشهد، ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2بخش تحقیقات کشت بافت، شعبه مشهد، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، مشهد، ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| چکیده | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| گلابی یکی از مهمترین درختان میوۀ مناطق معتدل و سردسیر محسوب میشود که به سبب طعم مناسب و ارزش اقتصادی بالای آن، سالهای متمادی است که در ایران پرورش مییابد. هدف از انجام پژوهش حاضر، تعیین محیط بهینه برای تکثیر سریع گیاه گلابی سالم از طریق کشت بافت است. ابتدا نمونههای گلابی از باغ آستان قدس رضوی، جمعآوری و از جوانههای انتهایی و جانبی برای ریزنمونه استفاده شد. بهترین تیمار برای استریلسازی جوانهها محلول 1/0 درصد کلرید جیوه به مدّت سه دقیقه و اتانول 70 درصد به مدّت یک دقیقه شناخته شد. آزمایش بر اساس طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار انجام شد. نتایج نشان داد بهترین محیط برای باززایی (Regeneration)، محیط MS (Murashige and Skoog) همراه با سه میلیگرم در لیتر BAP(6-Benzylaminopurine) و 01/0 میلیگرم در لیتر IBA(Indole-3-Butyric Asid)است. بهترین محیط برای پرآوری(Proliferation)، محیط MS همراه با پنج میلیگرم در لیتر BAP و 1/0 میلیگرم در لیتر IBA است. بیشترین طول شاخه در محیط، سه میلیگرم در لیتر BAP و 01/0 میلیگرم در لیتر IBAتشخیص داده شد.نتایج تحلیل واریانس نشان داد که تفاوت معنیداری بین تیمارهای ریشهزایی وجود نداشت. گیاهچههای ریشهدارشده برای سازگاری به جیفیپات و سپس به خاک منتقل شدند. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| کلیدواژهها | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| کشت بافت؛ گلابی؛ هورمونهای گیاهی | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| اصل مقاله | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
بررسی اثر تنظیمکنندههای رشد (BAP وIBA) بر باززایی، پرآوری و ریشهزایی گیاه گلابی نطنز با روش کشت در شیشه
عباس صفرنژاد 1*، سیده بیبی لیلا علمداری 2، هادی درودی 2 و مرضیه دلیر 2 1 مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی خراسان رضوی یا شعبه مشهد، پژوهشکدۀ بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، مشهد، ایران 2 بخش تحقیقات کشت بافت، شعبه مشهد، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، مشهد، ایران
چکیده گلابی یکی از مهمترین درختان میوۀ مناطق معتدل و سردسیر محسوب میشود که به سبب طعم مناسب و ارزش اقتصادی بالای آن، سالهای متمادی است که در ایران پرورش مییابد. هدف از انجام پژوهش حاضر، تعیین محیط بهینه برای تکثیر سریع گیاه گلابی سالم از طریق کشت بافت است. ابتدا نمونههای گلابی از باغ آستان قدس رضوی، جمعآوری و از جوانههای انتهایی و جانبی برای ریزنمونه استفاده شد. بهترین تیمار برای استریلسازی جوانهها محلول 1/0 درصد کلرید جیوه به مدّت سه دقیقه و اتانول 70 درصد به مدّت یک دقیقه شناخته شد. آزمایش بر اساس طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار انجام شد. نتایج نشان داد بهترین محیط برای باززایی (Regeneration)، محیط MS (Murashige and Skoog) همراه با سه میلیگرم در لیتر BAP(6-Benzylaminopurine) و 01/0 میلیگرم در لیتر IBA(Indole-3-Butyric Asid)است. بهترین محیط برای پرآوری(Proliferation)، محیط MS همراه با پنج میلیگرم در لیتر BAP و 1/0 میلیگرم در لیتر IBA است. بیشترین طول شاخه در محیط، سه میلیگرم در لیتر BAP و 01/0 میلیگرم در لیتر IBAتشخیص داده شد.نتایج تحلیل واریانس نشان داد که تفاوت معنیداری بین تیمارهای ریشهزایی وجود نداشت. گیاهچههای ریشهدارشده برای سازگاری به جیفیپات و سپس به خاک منتقل شدند. واژههای کلیدی: کشت بافت، گلابی، هورمونهای گیاهی.
مقدمه. گلابی Pyrus sp. به خانوادۀ Rosaceaeو زیرخانوادۀ Pomoidea با 17 جفت کروموزوم (34=x2=n2) متعلّق است (Jakson, 2003). بیش از 22 گونه از Pyrus وجود دارد که 16 گونۀ آن از آسیا منشأ گرفته است (Nee et al., 2002). گلابی یکی از مهمترین درختان میوۀ مناطق معتدل و سردسیر محسوب میشود که به سبب طعم مناسب و ارزش اقتصادی بالای آن، سالهای زیادی است که در ایران پرورش مییابد. از ارقام گلابی بومی ایران میتوان به رقمهای تاشکندی، درگزی، دمکج، سبری، شکری، سردرودی، سهفصله، سیف تبریز، شاهک، شاهمیوه، فلسطینی، قوسی، محمدعلی و نطنزی اشاره کرد (Tahzibi Hagh et al., 2011). بر اساس آمار سازمان خوار و بار جهانی (FAO, 2011)، کشور چین با تولید 9/15 میلیون تن مقام اول، ایتالیا با تولید 926 هزار تن، مقام دوم و آمریکا با 850 هزار تن، مقام سوم تولید گلابی را در جهان به خود اختصاص دادهاند. در این میان ایران با تولید 145 هزار تن در مقام بیستم تولید این محصول در دنیا قرار دارد. یکی از مشکلات اصلی پرورش ارقام بومی ایران، مشکل دیرباروری آنها روی پایههای بذری و ناسازگاری آنها روی پایههای کوئینز است (Davarynejad et al., 2007). طبق نظر Zhu و همکاران (2003)، پایههای کوئینز به خاکهای قلیایی حساسیت دارند و استقرار مناسبی ندارند. از آنجا که بیشتر مناطق ایران که مستعدّ کاشت گلابی است، خاکهای قلیایی دارد در نتیجه محدودیت بیشتری در تولید این محصول در ایران ایجاد شده است. علایم ناسازگاریهای مشاهدهشده در انواع نهالهای پیوندی عبارتند از: ناپیوستگی پوست درخت، اختلالات کامبیومی و تجمّع نشاسته در محلّ پیوند. این موضوع تأخیر در باردهی درخت را موجب میشودErmel et al., 1999) ؛ Davarynejad et al., 2007). علاوه بر این، به علّت ضعف عمومی درخت، میوههای حاصل نیز کیفیت مطلوبی ندارند. بهکارگیری سایر روشهای ازدیاد غیر جنسی که به تولید درختان خودریشه منجر میشود، میتواند راه حلّ مناسبی برای مشکلات ذکر شده باشد. استفاده از ریزازدیادی (Micropropagation) در تکثیر و تولید گیاهان، سالهاست که توجّه پژوهشگران را به خود جلب کرده است. این شاید به آن دلیل است که کاربرد شیوههای سنّتی در تکثیر گیاهان بهویژه گیاهان کلونی، علاوه بر طولانیبودن، میتواند گسترش بیماریها را موجب شود. بنابراین برای تولید گیاهان سالم، یکدست و یکنواخت در مدّت زمان اندک، استفاده از روشهای کشت بافت لازم است (Baghery and Safari, 2004). روش کشت درون شیشه جاذبۀ تجاری بالایی دارد؛ زیرا امکان رشد سریع گیاهان و تولید گیاهان با کیفیت بالا را فراهم میکند و ابزار مناسبی برای رسیدن به اهدافی است که در شرایط کشت در محیط طبیعی، دستیابی به آنها دشوار است (Lambardi and Rugini, 2003). تکثیر گلابی به روشهای مختلف امکانپذیر است، ولی معرّفی عملیترین و اقتصادیترین روش تکثیر آن مستلزم شناخت همۀ روشهای ازدیاد از جمله تکثیر درون شیشهای است. ارقام مختلف گلابی به سبب قابلیت بالای هتروزیگوسی از طریق بذر بهخوبی قابل تکثیر نیستند (Shibli et al., 1997). کارهای بسیاری در رابطه با کشت بافت گلابی در دنیا انجام شده است. تکثیر درون شیشهای، این امکان را فراهم میکند که در طول سال برای استفاده در دسترس باشند و همچنین ژرمپلاسم گلابی تکثیرشده در محیط استریل به سبب نداشتن عوامل بیماریزا با اطمینان کامل از سدهای قرنطینۀ کشاورزی کشورهای مختلف قابل تبادل هستند (Songül and Yucel, 1998). آزمایشهای Previati و همکاران (2002) برتری محیط پایۀ QL (Quoirin and Lepoivre) را نسبت به محیط MS برای ریزازدیادی (Micropropagation) هیبریدهای گلابی نشان داده است. Abdollahi و همکاران (2006) در ریزازدیادی ارقام گلابی، محیط رشدی دربردارندۀ نمکهای پایۀ QL تغییریافته، غنیشده با 3/0 ساکاروز، یک میلیگرم در لیتر BAP، یک میلیگرم در لیتر ip2 (N6-2-Isopentenyladenine) و 5/0 درصد پکتین خوشۀ انگور را توصیه کردهاند. Nosrati و همکاران (2009) برای بررسی ریزازدیادی چهار رقم گلابی، سه آزمایش جداگانه انجام دادهاند. نتایج آنها نشان دادهاست که محیط کشت MS/2 و MSN/2 بهترتیب بیشترین میزان پرآوری شاخه و بلندترین شاخهها را تولید کردهاند. گونههای شاهمیوه و درگزی در غلظت دو میلیگرم در لیتر و گونههای ویلیامز و نطنزی در غلظت سهمیلیگرم در لیتر BA، بیشترین میزان پرآوری شاخه را نشان دادهاند. غلظت یکسان IBAو NAA (Naphthalene)Acetic Acid) 1/0 میلیگرم در لیتر) در ترکیب باBA نشان داده است که اثر IBAبر طول شاخه بیشتر از NAA بوده است. Chghani Khodaee و همکاران (2011) برای تکثیر درون شیشهای دو پایۀ همگروه گلابی OH×F69 وOH×F333، چهار آزمایش جداگانه انجام دادهاند. نتایج آنها نشان داده است که برای ریزازدیادی این دو پایۀ گلابی و بقای مطلوب ریزشاخهها، محیط رشدی دربردارنده نمکهای پایۀ QL تغییریافتۀ غنیشده با 5/0 میلیگرم در لیتر ip2 و یک میلیگرم در لیتر BAP برای بهبود پرآوری شاخه و تیمار کوتاهمدّت با دومیلیگرم در لیتر IBA برای ریشهزایی این پایهها لازم است. D`Amico و همکاران (2002) در ریزازدیادی (Micropropagation) چهار گونه گلابی اروپایی، سه روش کشت در محیطکشت جامد، مایع و تکنیک غوطهورسازی موقّت را استفاده کردهاند. در پژوهش حاضر، محیطهای مایع، شیشهایشدن ریزنمونهها را موجب شده است. Reed و همکاران (2013) برای ریزازدیادی گلابی بیان کردهاند که ضریب رشد ساقه در محیطکشت MS با غلظت بالایی از کلرید کلسیم، فسفات پتاسیم و سولفات منیزیم و 4/4 میکرومولار BAP افزایش پیدا کرده است و رشد شاخهها بیشتر از رشد ریشهها بوده است. در آزمایشی برای ریزازدیادی گلابی Pyrus pyrifolia، بهترین پرآوری (Proliferation) در محیطکشت MS با 2/2 میلیگرم در لیتر هورمون BAP و یک میلیگرم در لیتر کینتین پس از چهار هفته به دست آمده است. بهترین پاسخ ریشهدهی نیز در محیطکشت MS که مقدار نمکهای آن نصف شده است و با ترکیب 25/0 میلیگرم در لیتر هورمون (IBA+NAA) به دست آمده استZafrul and Kaloo 2010)). کشت بافت گلابی با اهداف گوناگون از جمله تکثیر انبوه گیاهان سالم و بدون بیماری و تولید انبوه گیاهان یکنواخت از نظر ژنتیکی انجام شده است. بهویژه در سالهای گذشته به علّت بیماری آتشک، همۀ باغهای گلابی آستان قدس رضوی یا در معرض نابودی قرار گرفتهاند یا نابود شدهاند. بنابراین برای توسعه و اصلاح باغهای گلابی، حفظ ژنوتیپهایی که در سالهای طولانی جمعآوری شده است، اهمّیت ویژهای دارد و استفاده از روش کشت بافت در تکثیر انبوه گیاهان سالم و بدون بیماری و حفظ ژرمپلاسم موجود، مناسب و ضروری به نظر میرسد. از این رو پژوهش حاضر برای دستیابی به روش مناسب و موفّقیتآمیز تکثیر انبوه و بهبود میزان ریشهزایی این گونۀ ارزشمند اقتصادی انجام شد. در این پژوهش، میزان و نوع هورمونها بر اساس نتایج بررسیهای قبلی روی گونههای دیگر گلابی انتخاب شده است. با توجّه به این که با استفاده از دو هورمون ذکرشده نتایج مناسبی حاصل شد و هزینههای این دو هورمون نیز نسبتاً پایین است، غلظتهای مختلف این دو هورمون بررسی شد.
مواد و روشها در پژوهش حاضر از ریزنمونه های گلابی رقم نطنز جمعآوریشده از باغ آستان قدس رضوی استفاده شد که جوانههای انتهایی و جوانههای جانبی را شامل میشدند. شاخههای تهیّهشده به طول 20-15 سانتیمتر به آزمایشگاه منتقل، برگهای آن حذف و شاخهها به قطعات کوچک تقسیم شدند که هریک به طول 1 تا 5/1 سانتیمتر بودند و در هر قطعۀ برشخورده حداقل یک جوانه وجود داشت. ضدّ عفونی ریزنمونهها: ریزنمونهها مهمترین منبع آلودگی در کشت بافت هستند. این مرحله برای حذف بیشترین میزان آلودگی باکتریایی و قارچی از ریزنمونهها انجام میشود. قطعات شاخههای جوانهدار پس از شستوشو با آب جاری به قطعات کوچکتر (هر قطعه دارای یک عدد جوانه) تقسیم شد و برای استریلکردن از محلولهای مختلف ضدّ عفونی استفاده شد (جدول 1).
جدول 1- تیمارهای ضدّ عفونی بهکاربردهشده در آزمایش
باززایی مستقیم (Direct Regeneration): ریزنمونهها از سرشاخههای ضدّ عفونی شده به اندازۀ ۱ تا 5/1 سانتیمتر جدا شدند و به ظروف شیشهای محیطکشت باززایی مستقیم (جدول 2) منتقل شدند و شرایط محیطی لازم برای رشد آماده شد. دمای اتاق رشد، 2±25 درجۀ سانتیگراد و شدّت نور در حدود 5000 میکرومول فوتون بر متر مربّع بر ثانیه تنظیم شد. دورۀ نوری اتاق رشد، 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی بود. در دو هفتۀ اول، ریزنمونههای آلوده حذف شدند. نخستین باززایی پس از یک هفته ظاهر شد.
جدول 2- محتوای هورمونی مربوط به محیطکشت باززایی مستقیم
پرآوری (Proliferation) مواد گیاهی: در پایان هر ماه، شاخسارههای جدید جدا شدند و به محیطکشت جدید منتقل شدند. به این ترتیب تعداد نمونهها به صورت تصاعدی افزایش یافت. این کار تا زمانی انجام شد که شاخسارۀ کافی برای آزمایشهای ریزازدیادی (Micropropagation) به دست آمد. ریشهزایی :پس از بهدستآمدن بهترین تیمار برای شاخهزایی، شاخههایی با طول دو تا سه سانتیمتر برای ریشهزایی در محیط MS دربردارندۀ 5/0، 1، 2، 3، و 5 میلیگرم در لیتر IBA و محیط نصف MS دربردارندۀ 2 میلیگرم در لیتر IBA واکشت شدند. جدول 3- مقادیر هورمونی مربوط به محیط ریشهزایی
تجزیه و تحلیل آماری:آزمایشهای مربوط به کشت بافت در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام شد. دادهها در نرمافزار Excel وارد و با نرمافزار آماری SAS تجزیه شدند. مقایسۀ میانگینها با روش دانکن و در سطح احتمال 5 درصد انجام شد.
نتایج و بحث ضدّ عفونی ریزنمونهها: برای کاهش آلودگی و بهینهسازی روش استریلسازی از تیمارهای مختلف برای بهدستآوردن بهترین روش ضدّ عفونی استفاده شد. نتایج حاصل نشان داد که تیمار سه یعنی کلرید جیوۀ 1/0 درصد (3 دقیقه) + اتانول 70 درصد (1 دقیقه) کمترین میزان آلودگی را دارند (جدول 4).
جدول 4- درصد آلودگی تیمارهای ضدّ عفونی
باززایی مستقیم (Direct Regeneration): پس از انتقال ریزنمونهها به محیطهای مختلف هورمونی برای باززایی، جوانهها شروع به رشد کردند و پس از حدود یک هفته، شاخه تشکیل شد (شکل 1). نتایج تجزیۀ واریانس نشان داد که اختلاف معنیداری بین تیمارهای هورمونی باززایی وجود دارد. بهترین محیط برای باززایی محیط MS + 3 mg/l BAP + 0.01 mg/l IBA شناخته شد (شکل 2).
شکل 1- باززایی و گلدهی گلابی
شکل 2- مقایسۀ میانگین تیمارهای باززایی مستقیم 1: MS, 2: MS+ 0.2 mg/l BAP, 3: MS+ 0.5 mg/l BAP, 4: MS+ 1 mg/l BAP, 5: MS+ 2 mg/l BAP, 6: MS+ 3 mg/l BAP, 7: MS+ 0.2 mg/l BAP+0.1 mg/l IBA, 8: MS+ 0.5 mg/l BAP+0.1 mg/l IBA, 9: MS+ 1 mg/l BAP+0.1 mg/l IBA, 10: MS+ 3 mg/l BAP+0.1 mg/l IBA, 11: MS+ 5 mg/l BAP + 0.1 mg/l IBA, 12: MS+ 3mg/l BAP+0.01 mg/l IBA دادهها میانگین 5 تکرار± انحراف معیار، حروف یکسان، بیانکنندۀ نبودن اختلاف معنیدار با استفاده از آزمون دانکن است.
تنظیمکنندههای گیاهی معمولاً در باززایی (Regeneration) گیاهان جایگاه مهمی دارند و در مرحلۀ باززایی، غلظت سیتوکینینها از اکسینها بیشتر است. دربارۀ گونۀ بررسیشده در پژوهش حاضر نیز بهترین باززایی در محیط MS + 3 mg/l BAP + 0.01 mg/l IBA شناخته شد. در این رابطه بیان شده است که بیشترین ترکیب تنظیمکنندۀ رشد مورد استفاده در مرحلۀ استقرار کشت درون شیشهای گلابی، یک میلیگرم در لیتر BA و 01/0 میلیگرم در لیتر NAA یا IBA بوده است. Shibli و همکاران (1997) و Reed و همکاران (2013) برای ریزازدیادی (Micropropagation) گلابی بیان کردهاند که ضریب رشد ساقه در محیطکشت MS با غلظت بالایی از کلرید کلسیم، فسفات پتاسیم و سولفات منیزیم و 4/4 میکرومولار 6N-بنزیل آدنین افزایش پیدا کرده است و رشد شاخهها بیشتر از رشد ریشهها بوده است. با این حال، اضافهکردن شیب تیماری 5 تا 10 میلیلیتر نفتالن استیک اسید قبل از کشت در محیط پایۀ MS بدون تنظیمکنندههای رشد گیاهی برای رشد بسیاری از ژنوتیپها مؤثّر است. Safarnejad (2015) در بررسی روی عنّاب نشان داده است که بیشترین میزان باززایی (Regeneration) در محیطکشت MS دربردارندۀ 2 mgl-1 BAP + 0.01 mgl-1 IBA به میزان 6/96 درصد به دست آمده است. Saeedi Heidari و Safarnejad (2015) در بررسی روی افرا کیکم گزارش کردهاند که بهترین محیط برای باززایی، دربردارندۀ 0002/0 میلیگرم در لیتر TDZ (Thidiazuron) و 5 میلیگرم در لیتر BAP و 1/0 میلیگرم در لیتر IBA بوده است. Karami و همکاران (2013) در پژوهشی روی بهینهسازی شرایط باززایی گیاه لوبیا (Phaseolus vulgaris L.) نشان دادهاند که در فرایند ساقهزایی با افزایش غلظت هورمون بنزیل آمینو پورین، درصد ساقهزایی تا غلظت 2 میلیگرم در لیتر افزایش و پس از آن کاهش یافته است. Modarres و همکاران (2012) در بررسی روی گیاه نوروزک نشان دادهاند که ترکیب BAP و IBA نتیجۀ مناسبتری در ارتباط با ساقهزایی به ازای هر ریزنمونه داشته است و BAP در غلظت 2 میلیگرم در لیتر همراه با IBA در غلظت 5/0 میلیگرم در لیتر بهترین تیمار ساقهزایی بوده است. نتایج Goleyjani Moghaddaam و همکاران (2012) در پژوهش روی بهینهسازی شرایط باززایی (Regeneration) و تراریختی گیاه کلزا، رقمهای Hyola 308 و RGS003 نشان داده است که در غلظت 5/3 میلیگرم در لیتر BAP، میزان باززایی رقم Hyola 308 به 112 درصد و رقم RGS003 به 120 درصد افزایش یافته است. پرآوری(Proliferation): پس از کشت جوانهها در محیطهای دارندۀ غلظتها و ترکیبات مختلف هورمونی، شاخهزایی انجام شد (شکل 3). نتایج تجزیۀ واریانس نشاندهندۀ تفاوت معنیدار بین تیمارهای پرآوری بود. در برخی ریزنمونهها تعدادی شاخه به وجود آمد. با بررسی تیمارهای هورمونی مختلف، مشخّص شد که بهترین محیط برای شاخهزایی، محیط MS دربردارندۀ پنج میلیگرم بر لیتر BAP و 1/0 میلیگرم بر لیتر IBA بود (شکل4).
شکل 3- مرحلۀ پرآوری گلابی
شکل 4- مقایسۀ میانگین تعداد شاخه 1: MS, 2: MS+ 0.2 mg/l BAP, 3: MS+ 0.5 mg/l BAP, 4: MS+ 1 mg/l BAP, 5: MS+ 2 mg/l BAP, 6: MS+ 3 mg/l BAP, 7: MS+ 0.2 mg/l BAP+0.1 mg/l IBA, 8: MS+ 0.5 mg/l BAP+0.1 mg/l IBA, 9: MS+ 1 mg/l BAP+0.1 mg/l IBA, 10: MS+ 3 mg/l BAP+0.1 mg/l IBA, 11: MS+ 5 mg/l BAP + 0.1 mg/l IBA, 12: MS+ 3mg/l BAP+0.01 mg/l IBA دادهها میانگین 5 تکرار± انحراف معیار است. حروف یکسان نشاندهندۀ نبودن اختلاف معنیدار با استفاده از آزمون دانکن است.
همچنین نتایج مقایسۀ میانگین طول شاخه در نمونهها نشان داد که بیشترین طول شاخه در محیط سه میلیگرم بر لیتر BAP و 01/0 میلیگرم بر لیتر IBA مشاهده میشود (شکل5).
شکل 5- مقایسۀ میانگین طول شاخه 1: MS, 2: MS+ 0.2 mg/l BAP, 3: MS+ 0.5 mg/l BAP, 4: MS+ 1 mg/l BAP, 5: MS+ 2 mg/l BAP, 6: MS+ 3 mg/l BAP, 7: MS+ 0.2 mg/l BAP+0.1 mg/l IBA, 8: MS+ 0.5 mg/l BAP+0.1 mg/l IBA, 9: MS+ 1 mg/l BAP+0.1 mg/l IBA, 10: MS+ 3 mg/l BAP+0.1 mg/l IBA, 11: MS+ 5 mg/l BAP + 0.1 mg/l IBA, 12: MS+ 3mg/l BAP+0.01 mg/l IBA دادهها میانگین 5 تکرار± انحراف معیار است. حروف یکسان نشاندهندۀ نبودن اختلاف معنیدار با استفاده از آزمون دانکن است.
یکی از مهمترین مراحل کشت بافت، مرحلۀ پرآوری (Proliferation)است که در آن به تکثیر ساقههای گیاهچه اقدام میشود. در مرحلۀ پرآوری معمولاً نسبت سیتوکینینها به اکسینها بیشتر است. در پژوهش حاضر نیز از هورمون BAP جهت پرآوری استفاده شد. Shibli و همکاران (1997) برای پرآوری گلابی P. syrica بهترین رشد را روی محیط 5/1 تا دو میلیگرم در لیترBAP و Freire و همکاران (2002) در ریزازدیادی گلابی (Rocha)، غلظت بالای BAP را موجب افزایش تعداد شاخه بیان کردهاند که یافتههای حاصل از این بررسی را تأیید میکند. Berardi و همکاران (1992) گزارش کردهاند که غلظت بهینۀ BA برای تولید شاخسارۀ P. calleryana، 5/0 میلیگرم در لیتر است. Saadat و همکاران (2013) در پژوهشی روی ریزافزایی گلابی خودروی گونۀPyrus syriaca بیان کردهاند که محیط MS دارای 8/0 تا 1 میلیگرم در لیتر BA مناسب شاخسارهزایی است. در پژوهشی بیان شده است که افزایش یک میلیگرم در لیتر BA به محیطکشت برای تولید شاخساره در گلابی کافی است، اما مقدار آن بر اساس نوع گونه و رقم گلابی میتواند تغییر یابد (Morreti et al., 1991). Moghimi و Safarnejad (2014) در بررسی روی زالزالک، بهترین محیط برای پرآوری (Proliferation)محیط MS همراه با 1 میلیگرم در لیتر BAو 5/0 میلیگرم در لیتر IAA (Indole-3-Acetic Acid) به دست آوردهاند. همچنین در پژوهش دیگری اثر سایتوکینینهای مختلف را روی رقمهای گلابی ژاپنی متعلّق به گونۀ P.pyrifolia بررسی کردند و بالاترین میزان پرآوری را در غلظت 5/2 میلیگرم در لیتر BAP مشاهده کردهاند (Kadota and Niimi, 2003). Saboora و Shokri (2013) در بررسی روی گیاه دارویی برازمبل نتیجه گرفتهاند که بیشینۀ میانگین تعداد نوشاخههای تشکیلشده با کاربرد 5/2 میلیگرم در لیترBAP بهتنهایی حاصل شده بود. Karami و همکاران (2013) در پژوهشی روی گیاه لوبیا نتیجه گرفتهاند که در فرایند ریشهزایی با افزایش غلظت هورمون آلفا-نفتالین استیک اسید، ریشهزایی افزایش یافته است. ریشهزایی: نتایج حاصل از تحلیل دادههای ریشهزایی نشان داد که بین تیمارهای استفادهشده از نظر درصد ریشهزایی، طول ریشه و تعداد ریشه تفاوت معنیداری وجود ندارد. مقایسۀ میانگین درصد ریشهزایی با آزمون دانکن نشان داد که درصد ریشهزایی در اثر تیمارهای مختلف، تفاوت معنیداری از خود نشان نداد (شکل 6). درصد ریشهزایی مربوط به تیمار 4 و 6 (بهترتیب MS + 3 mg/l IBA و MS/2 + 2 mg/l IBA)، 50 و 53 درصد ریشهزایی به دست آمد.
شکل 6- مقایسۀ میانگین تیمارهای مختلف ریشهزایی از جنبۀ صفات مختلف از طریق آزمون دانکن 1: MS +0.5 mg/l IBA, 2: MS+1 mg/l IBA, 3: MS+2 mg/l IBA, 4: MS+3 mg/l IBA, 5: MS+5mg/l IBA, 6: MS/2+2mg/l IBA دادهها میانگین 5 تکرار± انحراف معیار است. حروف یکسان نشاندهندۀ نبودن اختلاف معنیدار با استفاده از آزمون دانکن است. نتایج بررسی میانگین طول ریشه نیز نشان داد که تیمار MS/2 + 2 mg/l IBA، طول ریشه به اندازۀ Cm 6/2 داشت. نتایج مقایسۀ میانگین تعداد ریشۀ نهالها نشان داد که گیاهچهها در اثر تیمار MS + 1 mg/l IBA، 7/5 عدد ریشه داشت. گیاهان ریشهدارشده پس از گذراندن مراحل مختلف سازگاری به خاک منتقل شدند (شکل 7).
شکل 7. نمونۀ ریشهدارشده و گیاهچههای سازگارشدۀ گلابی
در گیاهان معمولاً اکسینها مسئول تحریک ریشهزایی هستند. یکی از متداولترین اکسینهای استفادهشده در کشت، بافت گیاهی IBA است. در مرحلۀ ریشهزایی عمدتاً نسبت اکسینها به سیتوکینینها بیشتر است. در بررسی حاضر برای ریشهزایی از هورمون IBA استفاده شد و غلظتهای 2 و 3 میلیگرم در لیتر، نتایج مناسبتری دربرداشتند. در پژوهشی، تیمار کوتاهمدّت با 2 میلیگرم در لیتر IBA برای ریشهزایی پایههای گلابی توصیه شده است که با نتایج این پژوهش مطابقت دارد (Khodaee Chghani et al., 2011). همچنین در آزمایشی برای ریزازدیادی (Micropropagation) گلابی Pyrus pyrifolia، بهترین پاسخ ریشهدهی در محیطکشت MS که مقدار نمکهای آن نصف شده بود، مشاهده شد که یافتههای پژوهش حاضر را تأیید میکند Zafrul and Kaloo, 2010)). Darroudi و همکاران (2015) در بررسی روی قرهقات نتیجه گرفتهاند که بستر MS همراه با 5/0 یا 2 میلیگرم در لیتر IBA برای القای ریشهزایی مطلوبتر بوده است. Poordad و همکاران (2014) در پژوهشی روی سماق گزارش کردهاند که بیشترین میزان ریشهزایی در محیطکشت MS کامل با غلظت 1 میلیگرم در لیتر IBA رخ داده است. Saadat و همکاران (2013) بیان کردهاند، شاخسارههای گلابی خودروی گونۀ Pyrus syriaca کشتشده به مدّت 24 ساعت در تاریکی روی محیط کشت ویژۀ گردوی درایور و کانی یوکی DKW)) با نصف غلظت عناصر ماکرو و با 75 میلیگرم در لیتر IBA پس از انتقال به گلدانهای جیفی، 100 درصد ریشهدار شدهاند. Shibli و همکاران (1997) 72 درصد ریشهزایی را با استفاده از محیطکشت MS دارای 3 میلیگرم در لیتر IBA در Pyrus syriaca نشان دادهاند. Modarres و همکاران (2012) در بررسی روی گیاه نوروزک بیان کردهاند که برای ریشهزایی ساقهها، وجود اکسین ضروری است. IBA در غلظت 1 میلیگرم در لیتر، بهترین تیمار ریشهزایی بوده است. با توجّه به نتایج بهدستآمده، تیمار 4 و 6 (MS + 3 mg/l IBA و MS/2 + 2 mg/l IBA) بهترتیب 50 و 53 درصد ریشهزایی داشتند، ولی چون تیمار MS + 3 mg/l IBA علاوه بر ریشهزایی، القای کالوس فراوان را نیز موجب میشود، از سوی دیگر کالوس، آلودگی بستر پس از انتقال به شرایط خارج از شیشه را ایجاد میکند و تیمار MS/2 + 2 mg/l IBA دارای ریشههای قطورتر، متراکمتر و طویلتر است، بنابراین تیمارMS/2 + 2 mg/l IBA برای القای ریشهزایی مناسبتر به نظر میرسد.
نتیجهگیری کلّی با توجّه به نتایج میتوان گفت که غلظتهای 1 تا 3 میلیگرم در لیتر هورمون BAP همراه با 01/0 تا 1/0 میلیگرم در لیتر هورمون IBA، میزان باززایی (Regeneration) مطلوبتری نسبت به محیطهای فاقد اکسین دارد. با افزایش غلظت سیتوکینین استفادهشده، میزان ضریب تکثیر بهبود مییابد و با توجّه به طول ساقۀ گیاهچهها و ضریب تکثیر آن، غلظت پنج میلیگرم در لیتر برای تکثیر گیاهچهها مناسبتر است.
منابع Abdollahi, H., Muleo, R. and Rugini, E. (2006) Optimization of regeneration and maintenance of morphogenic callus in pear (Pyrus communis L.) by simple and double regeneration techniques. Scientia Horticulturae 108: 352-358. Baghery, A. and Safari, M. (2004) Plant Tissue Culture. Mashhad Ferdowsi University Publication, Mashhad (in Persian). Berardi, G., Infante, R. and Neri, D. (1992) Micropropagation of Pyrus calleryana Dcn. from seedlings. Scientia Horticulturae 53: 157-165. D`Amico, C., Frattarelli, A. and Giorgioni, M. (2002) Micropropagation of pear through temporary immersion. Acta Horticulturae 596: 425- 429. Darroudi, H., Akbarinia, M., Safarnejad, A., Hosseini, S. M. and Hajian Shahri, M. ( 2015) Micropropagation of Ribes khorasanicum species by tissue culture. Iranian Journal of Rangelands Forests Plant Breeding and Genetic Research 23 (1): 65-76 (in Persian). Davarynejad, GH., Hassanpour, H., Azizi, M. and Sgahriaree, F. (2007) Investigation on the possibility of reducing graft incopatibility in some Iranian pear cultivars on Quince A by inter stocks. Agriculture Sciences and Technology Journal 21)1(: 45-55. Ermel, F. F., Kervella, J., Catesson, A. M. and Poessel, J. L. (1999) Localized graft incompatibility in pear/quince (Pyrus communis/Cydonia oblonga) combinations: multivariate analysis of histological data from 5-month-old grafts. Tree Phsiology 19: 645-654. Freire, I., Oelho, C. and Barros, M. (2002) Improved culture media for the in vitro establishment of pear from nodal cuttings. Acta Horticulturae 569: 457- 461. Goleyjani Moghaddaam, R., Motallebi, M., Zamani, M. R. and Rezanejad, H. (2012) Optimization of regeneration and transformation of canola Hyola 308 and RGS003 lines. Iranian Journal of Plant Biology 4(11): 47-60 (in Persian). Khodaee Chghani, F., Abdollahi, H., Ershadi, A. and Asna Ashari, M. (2011) Assessment micropropagation of pear OH×F69 and OH×F333. Seed and Plant Production Journal 27-2(3): 297-312 (in Persian). Kadota, M. and Niimi, Y. (2003) Effects of cytokinin types and their concentration on shoot proliferation and hyperhydricity in in vitro pear cultivar shoots. Plant Cell, Tissue Organ Culture 72: 261-265. Karami, M., Bagherieh-Najjar, M. B. and Aghdasi, M. (2013) Optimization of conditions suitable for bean (Phaseolus vulgaris L.) regeneration. Iranian Journal of Plant Biology 5(15): 1-14 (in Persian). Lambardi, M. and Rugini, E. (2003) Micropropagation of Olive (Olea europaea L.), In: S. M. Jain and K. Ishii, Eds., Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands pp 621-646. Jakson, J. E. (2003) Biology of Apples and Pears. Cambridge: Cambridge University Press Cambridge. Julesm, J. and James, N. M. (1996) Pears in Fruit breeding .Tree and Tropical Fruits 1: 441-514. Modarres, M., Lahouti, M., Gangeali, A. and Asili, J. (2012) Study of micropropagation of Salvia leriifolia Benth using shoot tip. Iranian Journal of Plant Biology 4(14): 89-100 (in Persian). Moghimi, Z. and Safarnejad, A. (2014) Assessment of micropropagation and flavonoid content of hawthorn through tissue culture. Iranian Journal of Rangelands Forests Plant Breeding and Genetic Research 22(2): 181-191 (in Persian). Moretti, C., Scozzoli, A., Passini, D. and Pagannelli, F. (1991) In vitro propagation of pear cultivars. Acta Horticulturae 300: 115-122. Nee, C. C., Tsai, C. H. and Anstine, D. D. (2002) Asian pears germplasm future trends and current research in the industry. Acta Horticulture 587: 61-69. Nosrati, S. Z., Zamani, Z. and Babalar, M. (2009) Micropropagation of four cultivar of pear )Pyrus communis L.). Iranian Journal of Horticulture Science 40(2): 83-91. Poordad, B.,Safarnejad, A.,Ebrahimi, M. A. and Bakhshi Khaniki, Gh. ( 2014) Investigation of effective factors on sumac In vitro propagation. Iranian Journal of Rangelands Forests Plant Breeding and Genetic Research 22(1): 25-33 (in Persian). Previati, A., Darei, F., Bassi, D., Tagliavini, M. and Marangoni, B. (2002) Development of protocols for in vitro propagation of advanced selections of Pyruscommunis rootstocks 69BIS. Acta Horticulturae 596: 505-508. Reed, B. M., DeNoma, J., Wada, S. and Postman, J. ( 2013) Micropropagation of Pear (Pyrus sp.). Methods in Molecular Biology 11013: 3-18. Saadat, Y. A., Mousavi, B. and Beheshti Rooy, S. H. (2013) Micropropagation of Wild Pear (Pyrus syriaca). Agricultural Biotechnology 11(2): 1-8 (in Persian). Saboora, A. and Shokri, M. (2013) Effect of plant growth regulators on in vitro germination and micropropagation of Brazmbl (Perovskia abrotanoides), a medicinal plant. Iranian Journal of Plant Biology 5(18): 95-114 (in Persian). Saeedi Heidari, A. and Safarnejad, A. (2015) Micropropagation of Acer monospessulanum through tissue culture. Iranian Journal of Rangelands Forests Plant Breeding and Genetic Research 23(2): 237-246 (in Persian). Safarnejad, A. (2015) Effects of growth regulators on in vitro regeneration of Ziziphus Jujube. Iranian Journal of Rangelands Forests Plant Breeding and Genetic Research23(1): 40-48 (in Persian). Shibli, R. A., Ajlouni, M. M., Jaradat, A., Aljanabi, S. and Shatnawi, M. (1997) Micropropagation in wild pear (Pyrus syrica). Scientia Horticulturae 68: 237-242. Songül, G. and Yucel, G. (1998) The effects of different sucrose, Agar and pH Levels on In vitro shoot production of Almond (Amygdalus communis L.). Tr. Journal of Botany 22: 363-373. Tahzibi Hagh, F., Abdolahi, H., Ghasemi, A. and Fathi, D. (2011) variation of vegetative traits in pear )Pyrus communis L.) native to Iran under weather condition of Karaj. Seed and Plant Improvement Journal 27(1): 37-55 (in Persian). Zafrul, H. and Kaloo, Z. A. (2010). In vitro micropropagation of “sand pear”Pyrus pyrifolia (Burm. f.) Nakai. Frontiers of Agriculture in China 4(3): 358-361. Zhu, L. H., Li, X. Y., Ahlman, A. and Welander, M. (2003) The rooting ability of the dwarfing pear rootstock BP 100030 (Pyrus communis) was significantly increased by introduction of the rolB gene. Plant Science 165: 829-853.
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مراجع | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Abdollahi, H., Muleo, R. and Rugini, E. (2006) Optimization of regeneration and maintenance of morphogenic callus in pear (Pyrus communis L.) by simple and double regeneration techniques. Scientia Horticulturae 108: 352-358.
Baghery, A. and Safari, M. (2004) Plant Tissue Culture. Mashhad Ferdowsi University Publication, Mashhad (in Persian).
Berardi, G., Infante, R. and Neri, D. (1992) Micropropagation of Pyrus calleryana Dcn. from seedlings. Scientia Horticulturae 53: 157-165.
D`Amico, C., Frattarelli, A. and Giorgioni, M. (2002) Micropropagation of pear through temporary immersion. Acta Horticulturae 596: 425- 429.
Darroudi, H., Akbarinia, M., Safarnejad, A., Hosseini, S. M. and Hajian Shahri, M. ( 2015) Micropropagation of Ribes khorasanicum species by tissue culture. Iranian Journal of Rangelands Forests Plant Breeding and Genetic Research 23 (1): 65-76 (in Persian).
Davarynejad, GH., Hassanpour, H., Azizi, M. and Sgahriaree, F. (2007) Investigation on the possibility of reducing graft incopatibility in some Iranian pear cultivars on Quince A by inter stocks. Agriculture Sciences and Technology Journal 21)1(: 45-55.
Ermel, F. F., Kervella, J., Catesson, A. M. and Poessel, J. L. (1999) Localized graft incompatibility in pear/quince (Pyrus communis/Cydonia oblonga) combinations: multivariate analysis of histological data from 5-month-old grafts. Tree Phsiology 19: 645-654.
Freire, I., Oelho, C. and Barros, M. (2002) Improved culture media for the in vitro establishment of pear from nodal cuttings. Acta Horticulturae 569: 457- 461.
Goleyjani Moghaddaam, R., Motallebi, M., Zamani, M. R. and Rezanejad, H. (2012) Optimization of regeneration and transformation of canola Hyola 308 and RGS003 lines. Iranian Journal of Plant Biology 4(11): 47-60 (in Persian).
Khodaee Chghani, F., Abdollahi, H., Ershadi, A. and Asna Ashari, M. (2011) Assessment micropropagation of pear OH×F69 and OH×F333. Seed and Plant Production Journal 27-2(3): 297-312 (in Persian).
Kadota, M. and Niimi, Y. (2003) Effects of cytokinin types and their concentration on shoot proliferation and hyperhydricity in in vitro pear cultivar shoots. Plant Cell, Tissue Organ Culture 72: 261-265.
Karami, M., Bagherieh-Najjar, M. B. and Aghdasi, M. (2013) Optimization of conditions suitable for bean (Phaseolus vulgaris L.) regeneration. Iranian Journal of Plant Biology 5(15): 1-14 (in Persian).
Lambardi, M. and Rugini, E. (2003) Micropropagation of Olive (Olea europaea L.), In: S. M. Jain and K. Ishii, Eds., Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands pp 621-646.
Jakson, J. E. (2003) Biology of Apples and Pears. Cambridge: Cambridge University Press Cambridge.
Julesm, J. and James, N. M. (1996) Pears in Fruit breeding .Tree and Tropical Fruits 1: 441-514.
Modarres, M., Lahouti, M., Gangeali, A. and Asili, J. (2012) Study of micropropagation of Salvia leriifolia Benth using shoot tip. Iranian Journal of Plant Biology 4(14): 89-100 (in Persian).
Moghimi, Z. and Safarnejad, A. (2014) Assessment of micropropagation and flavonoid content of hawthorn through tissue culture. Iranian Journal of Rangelands Forests Plant Breeding and Genetic Research 22(2): 181-191 (in Persian).
Moretti, C., Scozzoli, A., Passini, D. and Pagannelli, F. (1991) In vitro propagation of pear cultivars. Acta Horticulturae 300: 115-122.
Nee, C. C., Tsai, C. H. and Anstine, D. D. (2002) Asian pears germplasm future trends and current research in the industry. Acta Horticulture 587: 61-69.
Nosrati, S. Z., Zamani, Z. and Babalar, M. (2009) Micropropagation of four cultivar of pear )Pyrus communis L.). Iranian Journal of Horticulture Science 40(2): 83-91.
Poordad, B.,Safarnejad, A.,Ebrahimi, M. A. and Bakhshi Khaniki, Gh. ( 2014) Investigation of effective factors on sumac In vitro propagation. Iranian Journal of Rangelands Forests Plant Breeding and Genetic Research 22(1): 25-33 (in Persian).
Previati, A., Darei, F., Bassi, D., Tagliavini, M. and Marangoni, B. (2002) Development of protocols for in vitro propagation of advanced selections of Pyrus communis rootstocks 69BIS. Acta Horticulturae 596: 505-508.
Reed, B. M., DeNoma, J., Wada, S. and Postman, J. ( 2013) Micropropagation of Pear (Pyrus sp.). Methods in Molecular Biology 11013: 3-18.
Saadat, Y. A., Mousavi, B. and Beheshti Rooy, S. H. (2013) Micropropagation of Wild Pear (Pyrus syriaca). Agricultural Biotechnology 11(2): 1-8 (in Persian).
Saboora, A. and Shokri, M. (2013) Effect of plant growth regulators on in vitro germination and micropropagation of Brazmbl (Perovskia abrotanoides), a medicinal plant. Iranian Journal of Plant Biology 5(18): 95-114 (in Persian).
Saeedi Heidari, A. and Safarnejad, A. (2015) Micropropagation of Acer monospessulanum through tissue culture. Iranian Journal of Rangelands Forests Plant Breeding and Genetic Research 23(2): 237-246 (in Persian).
Safarnejad, A. (2015) Effects of growth regulators on in vitro regeneration of Ziziphus Jujube. Iranian Journal of Rangelands Forests Plant Breeding and Genetic Research23(1): 40-48 (in Persian).
Shibli, R. A., Ajlouni, M. M., Jaradat, A., Aljanabi, S. and Shatnawi, M. (1997) Micropropagation in wild pear (Pyrus syrica). Scientia Horticulturae 68: 237-242.
Songül, G. and Yucel, G. (1998) The effects of different sucrose, Agar and pH Levels on In vitro shoot production of Almond (Amygdalus communis L.). Tr. Journal of Botany 22: 363-373.
Tahzibi Hagh, F., Abdolahi, H., Ghasemi, A. and Fathi, D. (2011) variation of vegetative traits in pear )Pyrus communis L.) native to Iran under weather condition of Karaj. Seed and Plant Improvement Journal 27(1): 37-55 (in Persian).
Zafrul, H. and Kaloo, Z. A. (2010). In vitro micropropagation of “sand pear”Pyrus pyrifolia (Burm. f.) Nakai. Frontiers of Agriculture in China 4(3): 358-361.
Zhu, L. H., Li, X. Y., Ahlman, A. and Welander, M. (2003) The rooting ability of the dwarfing pear rootstock BP 100030 (Pyrus communis) was significantly increased by introduction of the rolB gene. Plant Science 165: 829-853. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
آمار تعداد مشاهده مقاله: 4,175 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 1,984 |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||