Assessment of genetic variation in different Stachys lavandulifolia accessions using morphological and essential oil content

مقدمه.

گیاهان دارویی دارای ارزش و اهمیت ویژه‌ای در تأمین بهداشت و سلامت جوامع، هم از جنبه درمان و هم جنبه پیشگیری از بیماری‌ها هستند. آثار درمانی گیاهان دارویی از گذشته در میان ایرانیان، مورد توجه بوده است (Zargari, 1987). جنس Stachys از جنس‌های مهم گیاهان دارویی تیره Lamiaceaeاست. یکی از گونه‌های دارویی این جنس که خواص درمانی متعددی دارد، چای کوهی (S. lavandulifolia Vahl) است که در مناطق مختلف ایران رویش دارد (Rabbani et al., 2003). چای کوهی گیاهی است پایا، در بُن چوبی، کوتاه، کُرک‌دار ودارای ساقه‌های متعدد به رنگ سبز یا کم‌وبیش متمایل به خاکستری؛ گل‌ها در گل‌آذین خوشه‌مانند و به رنگ صورتی، ارغوانی و به ندرت سفید یا متمایل به زرد،کاسه گل لوله‌ای و پوشیده از کُرک پرهای بلند، به رنگ سبز تا بنفش تیره و برگ‌ها به صورت ساقه‌ای، پهن و دراز و خطی و یا سرنیز‌ای هستند (Mozaffarian, 2006). عصاره بخش هوایی این گیاه در طب سنتی ایران در درمان عفونت، آسم و بیماری‌های التهابی به ویژه روماتیسم استفاده می‌شود (Rabbani et al., 2003). این گیاه، علاوه بر آثار ضد میکروبی دارای خاصیت ضد درد به ویژه دردهای مفصلی، سردرد، سرگیجه و دردهای عصبی است (Rice-Evans, 2004). ترکیبات فعال این گیاه که دارای فعالیت زیستی هستند شامل: ﻓﻨﻴـﻞ اﺗﺎﻧﻮﺋﻴـﺪ، ﺗﺮﻳﭙﻨﻮﺋﻴـﺪ و ﻓﻼوﻧﻮﺋﻴـﺪ است (Javidnia et al., 2006).

Asghari Zakaria و Zare (2013) در پژوهشی ویژگی‌های کروموزومی سه جمعیت مختلف از این گونه را مطالعه کردند. نتایج مطالعه آنها نشان داد که عدد کروموزومی در همه جمعیت‌ها برابر با 2n=68 بوده و گونه S. lavandulifoliaیک گونه تتراپلویید است. Rezakhanlo و Talebi (2010) ریخت‌شناسی کُرک‌ها را در گونه چای کوهی مطالعه کردند. نتایج این مطالعه نشان داد که شرایط اکولوژیک و خاکی بر ترکیب، تنوع و پراکندگی گیاهی کُرک ها تأثیرگذار بوده و موجب تنوع درون جمعیتی این جنس شده است. اغلب مطالعات انجام شده در چای کوهی به کاربرد اسانس در علوم پزشکی اشاره دارد. Olfati و همکاران (2011) آثار گیاه چای کوهی را بر قاعدگی اولیه بررسی کردند و به این نتیجه رسیدند که استفاده از پودر چای کوهی ﺑﻪ ﺷﻴﻮه ﺳﻨﺘﻲ میﺗﻮاﻧﺪ ﺑﺎﻋﺚ ﺗﺴﻜﻴﻦ درد ﻧﺎﺷﻲ از قاعدگی اوﻟﻴﻪ شود و ﻋﺎرﺿﻪ ﺟﺎﻧﺒﻲ ﻧﺪارد و ﺑﺮ اﻟﮕﻮی درد ﻧﻴﺰ ﻣﺆﺛﺮ اﺳﺖ ﻛﻪ ﺑﺎﻋﺚ ﺗﺤﻤﻞ ﺑﻬﺘﺮ درد میﺷﻮد. همچنین، مطالعه Olfati و همکاران (2011) نشان داد که استفاده از گیاهS. lavandolifulia باعث کاهش خستگی و تهوع در قاعدگی اولیه می‌شود.

آگاهی از تنوع ژنتیکی گونه‌های گیاهی و ارتباط آنها با گونه‌های وحشی از جنبه‌های بهبود عملکرد محصولات است. در به‌نژادی گیاهان دارویی یکی از محدودیت‌ها برای دستیابی به عملکرد بالا و سازگاری، کمبود تنوع ژنتیکی است (Maghsudi Kelardashti et al., 2014). با توجه به پراکندگی توده‌های وحشی گیاه چای کوهی در ایران، امکان بررسی روابط ژنتیکی این گیاه به منظور بررسی تنوع ژنتیکی و روابط تکاملی این گونه در ایران فراهم است. با گرایش به کشت و مصرف فرآورده‌های طبیعی و با توجه به اهمیت دارویی گیاه چای کوهی، مطالعه‌ای در زمینه کشت و به‌نژادی این گیاه انجام نشده است. از آنجا که تنوع ژنتیکی و بررسی روابط بین صفات گیاه از نیازهای اساسی پیشرفت در به‌نژادی است و با توجه به اهمیت این گیاه در زمینه سلامت، هدف از پژوهش حاضر، تعیین میزان تنوع صفات مورفولوژیک ژنوتیپ‌های چای کوهی در جهت انتخاب توده‌های برتر با عملکرد ماده خشک و همچنین عملکرد اسانس بیشتر است.

مواد و روش‌ها.

در پژوهش حاضر، 41 ژنوتیپ گیاه چای کوهی متعلق به چهار جمعیت بومی از استان اصفهان شامل فریدون‌شهر، دامنه ، سمیرم و گاوخفت ارزیابی شدند. بذرهای گیاه از این مناطق جمع‌آوری شد و در شرایط آزمایشگاهی کشت و در مرحله چهارتا پنج برگی به زمین منتقل شدند.

این پژوهش، در مزرعه تحقیقاتی چاه اناری دانشکده کشاورزی دانشگاه صنعتی اصفهان در قالب طرح بلوک کامل تصادفی در سه تکرار انجام شد. عملیات داشت شامل آبیاری و وجین در طی فصل رشد به طور منظم انجام گردید. اندازه‌گیری صفات در سال دوم پس از استقرار کامل گیاهان آغاز شد. آبیاری در ابتدای دوره رشد هر دو روز یک بار و پس از استقرار گیاهان، دو بار در هفته صورت گرفت. صفات ریخت‌شناسی سه بوته در هر واحد آزمایشی شامل: وزن تر، وزن خشک، تعداد شاخه اصلی، تعداد شاخه جانبی، تعداد برگ شاخه اصلی، تعداد برگ شاخه جانبی، ارتفاع گیاه، تعداد گلچه، روز تا گل‌دهی، روز تا بذردهی، طول و عرض برگ و عملکرد اسانس اندازه‌گیری و یادداشت شد.

برای اندازه‌گیری عملکرد اسانس ابتدا حدود 40 تا 60 گرم اندام هوایی خشک شده در سایه، به طور کامل پودر شد، سپس با دستگاه کلونجر از روش تقطیر با آب به مدت 4 تا 6 ساعت عصاره‌گیری شد. برای به دست آوردن عملکرد، دی اتیل اتر استفاده شده برای شستشوی لوله کلونجر حامل اسانس با قرار دادن شیشه حاوی اسانس در هوای آزاد به مدت 12 ساعت تبخیر شد. سپس، با وزن کردن ظرف حامل اسانس و کم کردن ظرف خالی وزن اسانس محاسبه شد. در نهایت، عملکرد اسانس حاصل به صورت درصد بیان گردید.

پس از جمع‌آوری اطلاعات مزرعه‌ای و عملکرد اسانس، تجزیه واریانس و مقایسه میانگین‌ها با آزمون LSD و همبستگی بین صفات محاسبه و تجزیه عامل‌ها انجام شد.

برای تجزیه واریانس، مقایسه میانگین و همبستگی بین صفات از نرم‌افزار تحلیل آماری SAS نسخه 2/9 و برای تجزیه خوشه‌ای، تجزیه عامل‌ها و رسم بای پلات از نرم‌افزار STATGRAFICS نسخه2/16 استفاده شد.

نتایج و بحث.

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که ژنوتیپ‌های بررسی شده از نظر تمامی صفات، تفاوت معنی‌داری در سطح احتمال 1 درصد دارند (جدول 1). بر اساس نتایج مقایسه میانگین ژنوتیپ‌های 8 (دامنه 7) و 37 (گاوخفت 15) با میانگین وزن تر 73/5 و 88/4 گرم به ترتیب بیشترین و ژنوتیپ‌های 8 و 7 (دامنه 6 و 7) با میانگین 26/1 و 87/1 گرم کمترین وزن تر را داشتند (پیوست 1). بررسی‌ها همچنین نشان داد که ژنوتیپ‌های 6 و 8 (دامنه 5 و 7) با میانگین وزن خشک 96/2 و 56/2 گرم به ترتیب بیشترین و ژنوتیپ‌های 30 و 26 (گاوخفت 4 و 8) با میانگین 29/0 و 30/0 گرم کمترین وزن خشک را داشتند. ژنوتیپ‌های مطالعه شده از نظر این دو صفت تنوع خوبی را نشان دادند. بررسی‌های Zeinali و همکاران (2004) نیز حاکی از اختلاف معنی‌دار از لحاظ ویژگی‌های ریخت‌شناسی از جمله: وزن گیاه، تعداد شاخه فرعی، طول و عرض برگ و تعداد و طول گل‌آذین بود که با نتایج مطالعه حاضر همسو بود. از نظر صفت ارتفاع ژنوتیپ‌های 6 (دامنه 5) و 23 (گاوخفت 1) با داشتن متوسط ارتفاع 25/30 و 5/29 سانتی‌متر بیشترین و ژنوتیپ‌های 18 (دامنه 17) و 26 (گاوخفت 4) با متوسط 47/7 و 66/7 به ترتیب کمترین ارتفاع را داشتند. Yousefi و همکاران (2013) در پژوهش خود روی گیاه نوروزک تنوع بالایی را برای این صفت گزارش کردند که با نتایج مطالعه حاضر مطابقت داشت.

جدول 1- تجزیه واریانس صفات مورفولوژی ژنوتیپ‌های مورد مطالعه چای کوهی. ns، * و ** به ترتیب عدم معنی‌داری، معنی‌داری در سطح احتمال ۵ و ۱ درصد است.

بیشترین میانگین تعداد شاخه اصلی مربوط به ژنوتیپ‌های 41 (سمیرم 4) و 18 (دامنه 17) با میانگین 22/22 و 72/7 و کمترین آن مربوط به ژنوتیپ‌های 7 (دامنه 6) با میانگین 5/2 است که نشان‌دهنده این است که ژنوتیپ‌های دامنه بیشترین تنوع را از نظر این صفت در میان دیگر جمعیت‌ها دارند. از نظر تعداد شاخه فرعی، ژنوتیپ‌های گاوخفت بیشترین و کمترین مقدار را داشتند. از لحاظ صفات تعداد برگ در شاخه فرعی ژنوتیپ 31 (گاوخفت 9) بیشترین تعداد را داشت و با بقیه ژنوتیپ‌ها تفاوت معنی‌داری ایجاد کرد. همچنین، ژنوتیپ 15(دامنه 14) بیشترین متوسط طول برگ(29/37) سانتی‌متر را داشت و با بقیه ژنوتیپ‌ها تفاوت معنی‌داری داشت. از نظر عرض برگ ژنوتیپ 41 (سمیرم 4) با داشتن متوسط 59/9 و ژنوتیپ 41 (گاوخفت 4) با میانگین 41/4 سانتی‌متر بیشترین وکمترین عرض برگ را داشتند. Aghaei Noroozloo و همکاران (2015) در مطالعه خود صفات ریخت‌شناسی را در چای کوهی در زیستگاه طبیعی ارزیابی نموده، تنوع بالایی را برای صفت عرض برگ و تعداد شاخه فرعی گزارش کردند. همچنین، تحقیقات Mirzaaie-nodoushan و همکاران (2001) روی گونه‌های مختلف نعناع اختلاف معنی‌داری را از لحاظ ویژگی‌های ریخت‌شناسی (ارتفاع گیاه، قطر ساقه، تعداد شاخه فرعی، طول و عرض برگ) نشان داد که با نتایج این مطالعه همسو بود. ژنوتیپ 28 (گاوخفت 6) از نظر دو صفت: تعداد روز تا گل‌دهی و تعداد روز تا بذردهی با متوسط 33/93 و 104 روز بیشترین مقدار را دارا بود و ژنوتیپ 18 (دامنه 17) با متوسط 4 و 77/18 روز کمترین مقدار را از نظر این دو صفت داشت. صفت روز تا گل‌دهی و روز تا بذردهی در ژنوتیپ‌های مطالعه شده تنوع بالایی را نشان داد. Babalar و همکاران (2013) نیز در مطالعات خود تنوع قابل‌توجهی را برای صفت روز تا گل‌دهی در10 جمعیت آویشن کوهی گزارش کردند. همچنین، ژنوتیپ 19(دامنه 18) و ژنوتیپ 30 (گاوخفت 8) با داشتن متوسط 33/57 و 77/3 گلچه به ترتیب بیشترین و کمترین مقدار را داشتند. به طور کلی، نتایج تجزیه واریانس این آزمایش روی ژنوتیپ‌های چای کوهی، وجود اختلاف معنی‌دار را بین صفات مورد ارزیابی نشان داد که نشان‌دهنده وجود تنوع گسترده برای صفات مورد مطالعه در ژنوتیپ‌های این گونه است. به طوری که با نتایج آزمایش Ardakani و همکاران (2007) در بررسی صفات ریخت‌شناسی بادرنجبویه (Melissa officinalis L.) همسو بود.

از نظر عملکرد اسانس، ژنوتیپ 21 (دامنه 20) با داشتن بیشترین عملکرد اسانس (37/3 درصد) و ژنوتیپ دامنه 17 کمترین درصد (092/0) را دارا بود. درصد اسانس در بین ژنوتیپ‌ها تنوع بسیار بالایی را نشان داد. میزان اسانس از جمله صفاتی است که تحت تأثیر عوامل محیطی و ژنتیکی است. با توجه به این که کلیه ژنوتیپ‌ها در یک محیط و در شرایط اقلیمی تقریباً یکسان کشت شدند، تفاوت در میزان اسانس را می‌توان تا حدی به ژنوتیپ گیاه نسبت داد. بررسی‌های Amiri و همکاران (2008) در مورد شناسایی ترکیب‌های اسانس این گیاه و آثار ضد میکروبی آنها نشان داد که عملکرد اسانس موجود در این گیاه 8/0 درصد است که کمتر از میانگین عملکرد اسانس (07/1 درصد) نمونه‌های مورد مطالعه بود.

صفاتی که ضریب تغییرات بالایی دارند، محدوده وسیع‌تری از کمّیت صفت را دارا هستند و دامنه انتخاب وسیع‌تری برای آن صفت به شمار می‌رود. صفاتی همچون: تعداد شاخه اصلی، تعداد شاخه فرعی، تعداد برگ شاخه اصلی، وزن خشک و تعداد گلچه دارای بیشترین تنوع بودند. با توجه به وجود تنوع بین ژنوتیپ‌های چای کوهی مورد مطالعه برای تعیین نقش هر یک از صفات در تنوع موجود، تجزیه عامل‌ها انجام شد (جدول 2). از این تحلیل می‌توان دریافت که صفات مختلف تا چه حد اجزای مشابهی ازکیفیت یا ویژگی‌های زراعی را اندازه‌گیری می‌کنند و گروه‌ها از صفاتی که بیشترین همبستگی گروهی را دارند، مشخص می‌شوند. هدف این روش، همانند تجزیه مؤلفه‌های اصلی، توجیه میزان تغییرات موجود در متغیرهای اولیه با استفاده از تعداد کمتری متغیر است. مقادیر واریانس توجیه شده توسط مؤلفه‌های اول تا پنجم به ترتیب: 47/26، 318/736،17/13، 324/10 و 317/8 درصد بود و در مجموع، 17/76 درصد از کل واریانس متغیرها را توجیه نمود. ضرایب بردارهای ویژه در عامل اول نشان داد که صفات: وزن خشک، ارتفاع و تعداد گلچه عمده‌ترین نقش را در تشکیل این مؤلفه داشتند که نام پیشنهادی برای این مؤلفه ویژگی‌های زایشی است. در عامل دوم، صفات تعداد برگ شاخه اصلی و تعداد برگ شاخه فرعی دارای ضرایب بردار بیشتری بودند که نام پیشنهادی برای این عامل، عامل سبزینه‌گی بود. ضرایب بردارهای ویژه در عامل سوم که بیشترین سهم را داشتند، عبارتند از: تعداد شاخه اصلی و تعداد شاخه فرعی که این عامل، ویژگی‌های رویشی نام‌گذاری شد. در عامل چهارم، صفات: وزن خشک، طول و عرض برگ، تعداد شاخه فرعی و عملکرد اسانس بیشترین اهمیت را در تبیین این عامل داشتند. بنابراین، این عامل ویژگی‌های عملکرد اسانس نام گرفت. همچنین، ضرایب بردارهای ویژه در مؤلفه پنجم نشان داد که صفات وزن تر و وزن خشک عمده‌ترین نقش را در تشکیل این مؤلفه داشتند که این عامل اجزای عملکرد نامیده شد.

در این مطالعه، به منظور گروه‌بندی ژنوتیپ‌های چای کوهی از تجزیه خوشه‌ای با روش ward و مربع فاصله اقلیدسی به عنوان معیار تشابه استفاده شد. تجزیه خوشه‌ای بر اساس صفات ریخت‌شناسی و درصد اسانس برای 41 ژنوتیپ چای کوهی با روش ward ژنوتیپ‌های مورد نظر را به پنج گروه تقسیم کرد (شکل 1).گروه اول شامل: ژنوتیپ‌های فریدون‌شهر 1، دامنه 3، دامنه 4، دامنه 5، دامنه 8، دامنه 9، دامنه 10، دامنه 15، دامنه 16، دامنه 18، دامنه 20، گاوخفت1، گاوخفت2، گاوخفت 5، گاوخفت 7، گاوخفت9، گاوخفت 11، گاوخفت 12، گاوخفت 15، سمیرم 1، سمیرم 2 و سمیرم 3 بود که این ژنوتیپ‌ها از نظر ویژگی‌های: وزن تر و وزن خشک، تعداد شاخه اصلی، تعداد برگ شاخه اصلی و فرعی، طول برگ و عملکرد اسانس، شباهت داشتند. ویژگی مشترک این ژنوتیپ‌ها وزن تر و وزن خشک و ارتفاع بود.گروه دوم شامل ژنوتیپ دامنه 7 بود که بیشترین طول برگ، وزن تر و وزن خشک را به خود اختصاص داد. همچنین از نظر صفات روز تا گل‌دهی و روز تا بذردهی و تعداد شاخه فرعی دارای مقادیر کمی بودند. در گروه سوم ژنوتیپ دامنه 17 قرار گرفت که از نظر صفت تعداد شاخه اصلی بیشترین و از لحاظ صفات روز تا گل‌دهی، روز تا بذردهی، ارتفاع و وزن تر کمترین مقدار را به خود اختصاص داد. گروه چهارم شامل: ژنوتیپ‌های دامنه 1، دامنه 12، گاوخفت 3، گاوخفت 4، گاوخفت 10 و گاوخفت 13 بود که این ژنوتیپ‌ها از نظر همه صفات مشابه بودند و مقادیر کمی را به خود اختصاص دادند. گروه پنجم شامل ژنوتیپ‌های: دامنه 6، دامنه 11، دامنه 13، دامنه 14، دامنه 19، دامنه 20، گاوخفت 6، گاوخفت 8، گاوخفت 1 و سمیرم 4 بود که از نظر صفات تعداد شاخه فرعی، ارتفاع، روز تا گل‌دهی، روز تا بذردهی و طول برگ مشابه بودند. ژنوتیپ سمیرم 4 بیشترین تعداد شاخه اصلی و کمترین تعداد برگ شاخه فرعی را داشت.

شکل 1- تجزیه خوشه‌ای 41 ژنوتیپ چای کوهی با روش Ward بر مبنای مربع فاصله اقلیدسی

نتیجه‌گیری

آگاهی از جنبه‌های مختلف ریخت‌شناسی، محقق را در تعیین راهکارهای بهره‌برداری، به‌نژادی و اهلی‌سازی گیاهان یاری می‌کند. مطالعه حاضر، تحقیقی مقدماتی و کاربردی جهت تسهیل در گزینش به منظور انتخاب ژنوتیپ مطلوب و مورد نظر به‌نژادگران گیاهان دارویی است. مطالعه حاضر برای نخستین بار ویژگی‌های ریخت‌شناسی و اسانس گیاه چای کوهی را در یک طرح آماری و در شرایط مزرعه مورد بررسی قرار داد. تجزیه و تحلیل صفات ریخت‌شناسی نشان داد که تنوع قابل ملاحظه‌ای برای اکثر صفات وجود دارد. در نهایت، اگر بخواهیم بهترین ژنوتیپ را معرفی کنیم ژنوتیپ دامنه 7 از نظر صفات مورفولوژی و ژنوتیپ دامنه 20 از نظر درصد اسانس بیشترین مقدار را به خود اختصاص دادند. نتایج تجزیه خوشه‌ای داده‌های حاصل از تجزیه عامل‌های بخش ریخت‌شناسی و اسانس را تأیید نمود و تا حدودی ژنوتیپ‌ها را بر اساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی و درصد اسانس از یکدیگر تفکیک نمود. نتایج این مطالعه نشان دادکه بسیاری از ژنوتیپ‌های چای کوهی دارای پتانسیل مطلوب برای وارد شدن به سیستم کشت و تبدیل شدن به رقم و انتخاب در برنامه‌های به‌نژادی را دارند.

سپاسگزاری

نگارندگان از زحمات صمیمانه جناب آقای مهندس خزایی و مهندس کیان‌مهر کارشناسان دانشکده کشاورزی و سرکار خانم اسپنانی به خاطر همکاری صمیمانه در تحلیل داده‌ها کمال تشکر را دارند.