جداسازی و شناسایی میکروارگانیسم‌های فتوتروف قلعه رودخان به‌عنوان یکی از عوامل فرسودگی زیستی

مقدمه.

سیانوباکتری‌ها و ریزجلبک‌ها از جمله میگروارگانیسم‌های فتوتروف هستند که به دلیل نیازهای غذایی ساده یعنی آب،CO₂ ، نور و عناصر معدنی به‏عنوان اولین ساکنین انواع بسترهای سنگی، آجری، مرمری و غیره شناخته شده‌اند )1). جلبک‌ها از نظر فیزیولوژی، ساختار سلولی و نحوه تولیدِمثل با سیانوباکتری‌ها متفاوت هستند؛ اما هردو تقریباً زیستگاه‌های نسبتاً مشابهی را در طبیعت اشغال می‏کنند. اولین تغییر حاصل از رشد میکروارگانیسم‌های فتوتروف روی سطوح، تغییر شکل و رنگ بستر است (2). این موجودات همچنین زمینه رشد را برای میکروارگانیسم‌های دیگر و تشکیل بیوفیلم‌های میکروبی فراهم می‌کنند. بیوفیلم‌ها ضمن رشد و تولید اسید و متابولیت‌های مخرب، به داخل بستر فرو می‌روند و باعث فرسوده‌شدن این سطوح می‌شوند (3).

قلعه‌رودخان بنایی تاریخی واقع در شهر فومن استان گیلان است که متعلق به دوره ساسانیان است و از آن زمان تاکنون در معرض آسیب‌های فیزیکی، شیمیایی و زیستی بوده است. شهر فومن دارای اقلیم معتدل و مرطوب، با میانگین دمای سالانه 7/15 درجه سانتی‌گراد (حداکثر مطلق درجه حـرارت 5/34 درجه سانتی‌گراد و حـداقل مطلق 1- درجه سانتی‌گراد) و میزان بارندگی سـالانه 1275 میلی‌متر است. حداکثر میزان رطوبت نسبی این شهر 90درصد گزارش شده است و مقدار آن در هیچ زمانی به کمتر از 70درصد نمی‌رسد (4). از آنجا که این قلعه در منطقه‌ای با آب‏و هوای مرطوب قرار گرفته است، دیوارهای آن به بستر مناسبی برای رشد ارگانیسم‌های مختلف مانند گیاهان، قارچ‏ها، خزه‌ها و جلبک‌ها تبدیل شده است. از سوی دیگر قسمت اعظم قلعه از آجر ساخته شده و دارای سطوح متخلخل است که میکروارگانیسم‌ها می‌توانند به‌خوبی به درون بستر فرو روند؛ لذا این بنا نسبت به بناهای سنگی آسیب‏پذیرتر است.

شناسایی ارگانیسم‌های فرسوده‏کننده اولین قدم در حفاظت آثار باستانی از فرسودگی زیستی و مرمت است. در این مطالعه به بررسی و شناسایی مورفولوژی سیانوباکتری‌ها و ریزجلبک‌های جداشده از بنای ارزشمند آجری قلعه‌رودخان پرداخته شد.

‏‏مواد و روش ‏ها.

نمونه‌برداری: نمونه‏برداری در شهریورماه سال 1392 انجام شد. نمونه‌ها از 24 ناحیه از بخش‏های شرقی، غربی و میانی در ارتفاع 665 تا 715متری سطح دریا و از روی سطح دیوارهای بنا برداشته شد. برای این منظور از تکنیک سوزن استریل استفاده شد تا آسیبی به سطح آجر نرسد. سپس جدایه‏ها به میکروتیوپ‌های استریل منتقل شد.

تکنیک‏های کشت و شناسایی: نمونه‌ها روی محیط‏های کشت جامد BGM-11 ]حاوی ترکیباتNaNO₃ (1.5 g), NaHCO₃ (1.7 g) K₂HPO₄ (31 mg), MgSO₄^.7H₂0 (75 mg), CaCl₂ .H₂0 (36 mg), Na₂CO₃ (20 mg), Citric Acid (6 mg), Ferric Ammonium Citrate (6 mg), EDTA (1 mg) ,H₃BO₃ (2.86 mg) ,Mn₂Cl₂.4H₂0 (1.81 mg), ZnS0₄.H₂0 (220 ,ug), Na₂MoO₄^.2H₂0 (390 ,g) ,CUSO₄.H₂0 (80, ug), CoCl₂.6H₂0 (40 g). (مرک)[ و محیط کشت جامد BBM ]حاوی ترکیباتNaNO₃ (2.94 mg) ,CaCl₂.2H₂O (0.17 mg) ,MgSO₄.7H₂O (0.3 mg) ,K₂HPO₄ (0.431 mg) ,KH₂PO₄ (0.129 mg) ,NaCl (0.428 mg) ,EDTA (0.171 mg) ,KOH (0.553 mg) ,FeSO₄.7H₂O (0.0179 mg), H₂SO₄ (1 mL) ,H₃BO₃ (0.185mg) ,ZnSO₄.7H₂O (0.03mg) ,MnCl₂.4H₂O (0.0014mg) ,MoO₃ (4.93 µg) ,CuSO₄.5H₂O (6.29 µg) ,Co(NO₃)₂.6H₂O (1.68 µg) (مرک)[ تحت شرایط استریل کشت داده شد (5) و در دمای 25 درجه سانتی‌گراد و تحت روشنایی 3500 لوکس در دوره‌های روشنایی/تاریکی 16/8 ساعت نگه‌داری شد. جهت جداسازی جدایه‌ها یک هفته گرماگذاری انجام شد. کلنی‌های قابل مشاهده واکشت شد. برخی از جدایه‌ها نیازمند گرماگذاری طولانی‌تری بودند. برای چنین جدایه‌هایی حداکثر به‌مدت 2 ماه گرماگذاری ادامه یافت تا کلنی‌های قابلِ‌مشاهده تشکیل شود. کشت‌های خالص با استفاده از روش‌های مختلف مانند تهیه رقت‌های متوالی و با افزودن رقت‌های مختلفی از آنتی‌بیوتیک‌های پنی‌سیلین (2/0 گرم بر لیتر) و استرپتومایسین (024/0 گرم بر لیتر) به محیط کشت جلبک‌ها و اضافه‌کردن آنتی‌بیوتیک‌های نیستاتین (1/0 گرم بر لیتر) و سیکلوهگزامید (1/0 گرم بر لیتر) به محیط‌های کشت سیانوباکتری‌ها از پلیت‌های اولیه به دست آمد. ویژگی‌های ریخت‌شناسی جدایه‌ها از قبیل کوکوئیدی یا رشته‌ای‌بودن، وجود انشعابات، نوع انشعاب، توانایی تشکیل هتروسیست و یا آکینت با کمک میکروسکوپ نوری بررسی و عکس‌برداری از جدایه‌ها انجام شد. شناسایی مبتنی بر ریخت‌شناسی جدایه‌ها با استفاده از کلیدهای شناسایی ,Prescott, et al.1970 ,Bellinger, et al.2010, Wehr, et al.2003 انجام شد.

نتایج.

جنس‌های Scytonema، Tolypothrix، Leptolyngbya، Phormidium، Gloeocapsa، Plectolyngbya، Microcoleusو 3 گونه متفاوت از جنس Nostoc متعلق به راسته سیانوباکتری‌ها و جنس‌های Cladophora، Trentepohlia، Klebsormidium، Trebouxia، Pleurastrum، Chlorococcumمتعلق به راسته کلروفیتا با روش‌های مورفولوژی شناسایی شدند. برای شناسایی سایر جدایه‌ها نیاز به بررسی‌های مولکولی است. در ادامه ویژگی‌های مورفولوژی جدایه‌ها توصیف می‌شود.

Tolypothrix:تال‌های این ارگانیسم توده‌های پشمی‌شکلی را به وجود می‌آورند و به رنگ سبز-آبی مایل به خاکستری تا زرد و یا قهوه‌ای تیره دیده می‌شوند. تریکوم‌های آن‌ها دارای غلاف محکمی هستند و رشته‌ها انشعاباتی دارند که در جهات مختلف و به‌صورت منفرد از غلاف خارج می‌شوند (اشکال 1-a و 2-a). معمولاً هتروسیست در پایه انشعاب قرار دارد و سلول انتهایی گرد است (6). اندازه سلول‌ها حدود 5 تا 14 میکرون است (7). به نظر می‌رسد که در این جنس هتروسیت منفذ نداشته باشد (8).

Plectolyngbya:رشته‌ها باریک و کمی خمیده‌اند و دارای انشعابات کاذب هستند. بررسی‌ها نشان می‌دهد که تنها یک تریکوم در غلاف وجود دارد و سلول انتهایی گرد است. در این جنس هورموگونیا مشاهده می‌شود (اشکال 1-b و 2-b) و عرض تریکوم‌ها 5/2-1 میکرون است (9).

Scytonema:تال‌های این ارگانیسم توده‌های پشمی‌شکل و دسته‌های نامنظمی را به وجود می‌آورند و به‌رنگ زرد یا قهوه‌ای هستند. تریکوم‌ها دارای غلافی محکم هستند و هتروسیست‌ها منفرد و به‌صورت بینابینی در ردیف‌های تریکوم قرار دارند. رشته‌ها، انشعابات کاذبی تشکیل می‌دهند که به‌صورت جفت از غلاف خارج می‌شوند و به شکل حرف انگلیسی V و گاهی به شکل Y درمی‌آیند (اشکال 1-c و 2-c). رشته‌ها تا انتها به‌صورت استوانه‌ای هستند و سلول‌های انتهایی گرد هستند. هورموگونیا ممکن است در رأس تریکوم به وجود آید (6 و 10). اندازه سلول‌ها 8-6 میکرون است (11).

Phormidium:در این جنس رشته‌ها کمی خمیده‌اند و انشعاب کاذب مشاهده نمی‌شود. غلاف‌ها تحت شرایط خاص محیطی، به‌طور محکم و نازک تشکیل می‌شوند. تریکوم‌ها استوانه‌ای هستند و عرض آن‌ها 11-5/2 میکرون است. سلول‌های انتهایی نوک‌تیز و یا گرد، دارای کلاهک و یا بدون کلاهک هستند (اشکال 1-d و 2-d). این ارگانیسم هورموگونیا تشکیل می‌دهد (6 و 12).

Leptolyngbya:تریکوم‌ها، قطبی و دارای اندازه برابر[1] هستند و معمولاً بدون انشعاب‌اند. غلاف محکمی تریکوم‌ها را احاطه کرده است. هورموگونیا درآن مشاهده می‌شود. این نوع سیانوباکتری هتروسیست تشکیل نمی‌دهد (اشکال 1-e و 2-e). اندازه سلول‌ها بین 3-5/0 میکرون است و سلول‌های انتهایی گرد هستند (13 و 14).

Nostoc:تال‌های میکروسکپی و ماکروسکوپی ژلاتینی در این ارگانیسم تشکیل می‌شود. تریکوم‌ها همه یک شکل‌اند و انشعاب کاذب در آن مشاهده نمی‌شود و به ‌شکل یک کلنی مخاطی محکم با حاشیه مشخص دیده می‌شود (15). غلاف موسیلاژی، محکم و پهن است و گاهی به‌رنگ زرد یا قهوه‌ای مشاهده می‌شود. سلول‌های این ارگانیسم کروی یا خمره‌ای‌شکل است و به‌رنگ سبز-آبی یا سبز-زیتونی دیده می‌شود. هتروسیست‌ها نیز کروی و یا خمره‌ای‌شکل هستند و در انتهای آن و یا در میان تریکوم‌ها قرار دارند. آکینت‌ها بیضی‌شکل‌‌ و کمی از سلول‌های رویشی بزرگ‌تر هستند و در ردیف‌هایی بین هتروسیست‌ها به وجود می‌آیند. مورفولوژی کلنی در مراحل مختلف رشد تغییر می‌کند (شکل‌های 1-f,g,h و 2-f,g,h). طول و عرض سلول‌ها 5-2 میکرون است (16 و 17).

Microcoleus:رشته‌ها در این ارگانیسم داخل غلاف‌های محکم و بی‌رنگ به‌صورت متراکم و یا به‌موازات هم قرار دارند و در انتها نازک می‌شوند. در این ارگانیسم انشعاب کاذب مشاهده نمی‌شود (اشکال 1-i و 2-i). سلول‌ها، استوانه‌ای‌شکل و دارای محتوای گرانولی‌اند و تیلاکوئیدها، درون آن‌ها به‌صورت شعاعی قرار می‌گیرند (6 و 12).

Gloeocapsa:سلول‌های این ارگانیسم در بررسی‌های میکروسکوپی معمولاً کروی دیده می‌شوند و لایه‌های سلولی در یک بستر ماکروسکوپی ژلاتینی قرار دارند (18). سلول‌های کروی پس از تقسیم سلولی، به شکل نیم‌کره دیده می‌شوند و به‌رنگ سبز-آبی یا سبز-زیتونی دیده می‌شوند (اشکال 1-j و 2-j) و قطری معادل 6-7/0 میکرون دارند (6).

Cladophora:رشته‌ها دارای انشعاباتی هستند که بلافاصله از زیر دیواره عرضی منشأ می‌گیرند. سلول‌ها، استوانه‌ای یا خمره‌ای‌شکل‌اند و دارای کلروپلاست جانبی یا شبکه‌ای متشکل از تعداد زیادی هسته سلولی (اشکال 1-k و 2-k) و پیرنوئید[2] هستند (11 و 19).

Klebsormidium:سلول‌ها از ابتدا تا انتهای رشته مشابه یکدیگر هستند و به‌صورت استوانه‌ای و یا دانه‌ای‌شکل دیده می‌شوند. دیواره‌ها نازک یا ضخیم‌اند و گاهی دیواره عرضی را قطعات H شکلی احاطه کرده است (6). کلروپلاست‌های جانبی، دیسکی یا بیضی‌‌شکل‌اند و حدود 50درصد حجم سلول را شامل می‌شود (اشکال 1-l و 2-l) و معمولاً تنها یک پیرنوئید دارد. عرض رشته‌ها 8-6 و طول سلول‌ها 15-8 میکرون است (20).

Trentepohlia:رشته‌های این ارگانیسم دارای انشعابات کاذب هستند که انتهای انشعابات اغلب باریک می‌شود. گامتانژیوم‌ها همیشه در انتها قرار دارند. معمولاً سلول‌های محور اصلی، استوانه‌ای‌شکل و سلول‌های انشعابات آن به‌صورت گرد و متورم است. همچنین کلروپلاست‌ها نواری‌شکل یا دیسک‌مانند هستند (اشکال 1-mو 2-m). عرض سلول‌ها 30-10 و طول آن‌ها به 40-15 میکرون می‌رسد (6 و 21).

Trebouxia:سلول‌های این ارگانیسم کروی یا بیضی‌شکل‌ و تک‌هسته‌ای‌اند و اندازه آن‌ها 16-10 میکرون است. کلروپلاست‌ها ستاره‌ای‌شکل و یا شعاعی هستند وحاوی تعداد زیادی پیرنوئید هستند (اشکال 1-nو 2-n). این ارگانیسم به ‌شکل هم‌زیست با گلسنگ زندگی می‌کنند (22 و 23).

Pleurastrum:سلول‌های این ارگانیسم اغلب کروی‌اند و دارای کلروپلاست جانبی هستند. سلول‌ها رشته‌های کوتاهی را تشکیل می‌دهند. تعداد زیادی آپلانوسپور کروی در داخل اسپورانژیوم‌ها قرار دارند. این جلبک‌ها از نظر بوم‌شناسی روی گیاهانی مانند خزه‌ها رشد می‌کنند (اشکال 1-o و 2-o).

Chlorococcum:سلول‌های این ارگانیسم‌ها گاهی به‌صورت گروهی دیده می‌شوند و کلنی‌های موسیلاژی تولید می‌کنند. کلروپلاست فنجانی‌شکل و جانبی هستند (اشکال 1-p و 2-p) و هر سلول تنها یک پیرنوئید تشکیل می‌دهد (6 و 24). فراوانی جدایه‌های به‌دست‌آمده در این مطالعه به قرار زیر است:

3/8درصد Scytonema، 5/5درصدTolypothrix، 2/22درصدLeptolyngbya، 5/5درصدPhormidium، 7/2درصدGloeocapsa، 7/2درصدPlectolyngbya، 7/2درصدMicrocoleus ، 3/8درصد Nostoc ، 11/11درصد Cladophora، 7/2درصدTrentepohlia، 6/16درصدKlebsormidium، 7/2درصدTrebouxia، 7/2درصدPleurastrum، 7/2درصدChlorococcum، 7/2درصدPhormidium.

رده بندی جدایه ها و ویژگی های مورفولوژی آن‏ها در جدول 1 توضیح داده شده است.

شکل 1- تصویر میکروسکوپی مربوط به جدایه‌ها- a) Tolypothrix؛ b) Plectolyngbya؛ c) Scytonema؛ d) Phormidium؛ e) Leptolyngbya؛ f,g,h) Nostoc؛ i) Microcoleus؛ j) Gloeocapsa؛ k) Cladophora؛ l) Klebsormidium؛ m) Trentepohlia؛n ) Trebouxia؛ o) Pleurastrum؛ p) Chlorococcum

شکل 2- تصویر ماکروسکپی کلنی جدایه‌ها; a) Tolypothrix؛ b) Plectolyngbya؛ c) Scytonema؛ d) Phormidium؛ e) Leptolyngbya؛ f,g,h) Nostoc؛ i) Microcoleus؛ j) Gloeocapsa؛ k) Cladophora؛ l) Klebsormidium؛ m) Trentepohlia؛n ) Trebouxia؛ o) Pleurastrum؛ p) Chlorococcum

جدول 1- رده‌بندی جدایه‌ها و مشخصات آن‌ها