پیوندهای مفید
اخبار و اعلانات
آمار
| تعداد نشریات | 43 |
| تعداد شماره‌ها | 1,714 |
| تعداد مقالات | 14,051 |
| تعداد مشاهده مقاله | 34,000,372 |
| تعداد دریافت فایل اصل مقاله | 13,616,601 |
بهینه‌سازی تولید قند زایلیتول توسط یک سویه مخمر کندیدا تروپیکالیس با استفاده از روش سطح پاسخ | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| زیست شناسی میکروبی | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مقاله 14، دوره 5، شماره 18، شهریور 1395، صفحه 153-168 اصل مقاله (627.17 K) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| نوع مقاله: پژوهشی- فارسی | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| شناسه دیجیتال (DOI): 10.22108/bjm.2016.20390 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| نویسندگان | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| امید زاهد1؛ غلامرضا صالحی جوزانی* 2؛ فرامرز خدائیان3 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1دانشجوی کارشناسی ارشد صنایع غذایی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران، کرج، ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2دانشیار بیوتکنولوژی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی (AREEO)، کرج، ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 3دانشیار صنایع غذایی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران، کرج، ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| چکیده | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مقدمه: زایلیتول یکی از قندهای رژیمی پرمصرف در صنایع غذایی و بهداشتی است. روش معمول تولید این قند، شیمیایی و بسیار پرهزینه و انرژی‌بر است. درحالی‌که تولید آن با استفاده از فناوری زیستی یک روش دوستدار محیط زیست و با صرفه اقتصادی است. هدف از اجرای پژوهش حاضر بهینه‌سازی شرایط تولید زایلیتول از قند زایلوز توسط یک سویه مخمر کندیدا تروپیکالیس با استفاده از طرح مرکب مرکزی و روش سطح پاسخ بود. مواد و روش ها: چهار فاکتور متغیر مستقل شامل دما (27، 32 و 37 درجه سلسیوس)، اسیدیته (3، 5 و 7)، غلظت قند زایلوز (30، 50 و 70 گرم در لیتر) و غلظت عصاره مخمر (3، 5/7 و 12 گرم در لیتر ) انتخاب شد و درنهایت میزان بازده تولید قند زایلیتول (نسبت میزان گرم تولیدشده زایلیتول به گرم زایلوز اولیه Yp/s) محاسبه شد. نتایج: براساس مدل به‌دست‌آمده بیشترین میزان بازده زایلیتول (73/0Yp/s=) توسط سویه مخمر مطالعه‌شده در دمای 7/32 درجه سلسیوس، اسیدیته 7/4، غلظت قند زایلوز 2/54 و غلظت عصاره مخمر 12 گرم در لیتر برآورد شد. به‌منظور ارزیابی مدل به‌دست‌آمده، آزمایش تولید زایلیتول در شرایط بهینه توسط سویه انجام شد و در آن بازده تولید زایلیتول، میزان تولید زایلیتول و میزان تولید زیست‌توده در شرایط ذکرشده، به‌ترتیب 69/0 و 7/36 گرم در لیتر و 1/11 گرم در لیتر بود و با مدل به‌دست‌آمده مطابقت داشت. بحث و نتیجه گیری: با توجه به نتایج به‌دست‌آمده، فاکتورهای محیطی شامل نوع منبع ازت، دما، اسیدیته، غلظت زایلوز و غلظت منبع نیتروژن برای تولید زایلیتول توسط سویه مطالعه‌شده بهینه‌سازی شد که در نتیجه آن زایلیتول با غلظت 7/36 گرم در لیتر با بازده 69/0 تولید شد. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| کلیدواژه‌ها | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| بهینه‌سازی؛ روش سطح پاسخ؛ زایلوز؛ زایلیتول؛ کندیدا تروپیکالیس | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| اصل مقاله | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
مقدمه. زایلیتول[1] به‌عنوان یک قند الکل 5 کربنه طبیعی در صنایع مختلف از قبیل صنایع غذایی، داروسازی و دندان‌پزشکی استفاده می‌شود. شیرینی زایلیتول برابر با ساکارز است؛ اما میزان کالری و جذب آن در بدن حدود یک‌سوم ساکارز است و به همین دلیل، بیماران دیابتی می‌توانند آن را به‌عنوان یک قند رژیمی مصرف کنند. علاوه بر این، زایلیتول در فرمولاسیون مواد غذایی دارای مزیت‌ها و خواص فراوانی است و ازاین‌رو در محصولاتی مانند انوع آبنبات، نوشیدنی‌ها، بستنی و آدامس استفاده می‌شود. این قند الکل در واکنش میلارد شرکت نمی‌کند و به همین دلیل در فرمولاسیون‌های مواد غذایی بدون اینکه در طول دوره نگهداری این مواد باعث تغییراتی در آن‌ها شود، به بهبود رنگ و طعم مواد غذایی کمک می‌کند (1 و 2). زایلیتول از سال 1970 به‌روش شیمیایی از راه هیدروژن‌دارکردن قند زایلوز در حضور کاتالیست و در فشار بالای 50 اتمسفر هیدروژن و دمای بین 140-80 درجه سلسیوس تولید می‌شود (3). تولید زایلیتول با این روش نیاز به قند زایلوز خالص دارد و مراحل خالص‌سازی و رنگ‌بری آن انرژی‌بر و پرهزینه است؛ بنابراین تولید شیمیایی زایلیتول از لحاظ اقتصادی گران تمام می‌شود (2 و 4). روش دیگر تولید زایلیتول، استفاده از فناوری زیستی به کمک باکتری‌ها و مخمرهای مختلف (5) و همچنین دستکاری ژنتیکی ژن‌های دخیل در فرایند تولید آن در میکروارگانیسم‌های مختلف است که اخیراً بسیار به آن توجه شده است (6). میکروارگانیسم‌هایی مانند پیشیا اس‌پی[2]، دیبارو مایسس اس‌پی[3]، و کندیدا اس‌پی[4] قابلیت تبدیل زایلوز به زایلیتول را دارند و میکروارگانیسم‌هایی دیگر مانند ساکارومایسس سرویزیه[5] توانایی تولید اتانول از هگزوزها را دارند (7 و 8). به‌طورکلی از بین میکروارگانیسم‌ها، به مخمرها به‌عنوان بهترین تولیدکنندگان زایلیتول توجه شده است؛ بنابراین، بیشتر مقالات منتشرشده درباره آن‌ها بوده و تلاش‌های زیادی هم جهت انتخاب بهترین تولیدکنندگان زایلیتول انجام شده است. بهترین تولیدکنندگان زایلیتول عمدتاً گونه‌های کندیدا گوییلیرموندی[6] و کندیدا تروپیکالیس[7] هستند (9- 11). تعداد کمی از باکتری‌ها مانند کورینه باکتریوم اس‌پی[8]، اینتروباکتر لیکیوفیسینس،[9] و مایکوباکتریوم اسمیگماتیس[10] نیز به‌عنوان تولیدکننده زایلیتول گزارش شده‌اند (10 و 12). همچنین تعداد کمی از قارچ‌ها از قبیل پترومایسس آلبرتنیسیس[11]، پنی‌سیلیوم[12]، آسپرژیلوس[13]، و نوروسپورا اس‌پی[14] نیز توانایی تولید زایلیتول را به‌میزان کمی نشان داده‌اند (13- 15). البته باید توجه کرد که اخیراً از باکتری‌ها، مخمرها و قارچ‌های نوترکیب مثل اشرشیا کلای[15] (16)، پیشیا پاستوریز[16] (17) و تریکودرما ریسه ای[17] (18) نیز به‌عنوان منبع تولید زایلیتول استفاده شده است. از جمله عوامل تأثیرگذار در تولید زایلیتول توسط میکروارگانیسم‌ها، شرایط و عوامل مختلفی مانند نوع و گونه میکروارگانیسم، دما، نوع و غلظت منبع نیتروژنی، غلظت منبع کربنی و قند موجود در محیط کشت، اسیدیته محیط کشت، و میزان اکسیژن موجود در محیط است (5 و 8 و 19). هنگامی که عوامل زیادی در تولید یک محصول دخالت داشته باشند، روش پاسخ سطح[18] (آر. اس. ام) یک ابزار مناسب برای بهینه‌کردن شرایط است. این طرح می‌تواند با آزمایش‌های کمتر و در حداقل زمان مناسب‌ترین اطلاعات را تأمین کند؛ بنابراین، در بسیاری از فرایندهای بهینه‌سازی تولید، انواع فراورده‌های زیستی مبتنی بر فناوری زیستی از قبیل آنزیم‌ها (20)، ترکیبات آنتی‌اکسیدانی (21)، پروبیوتیک‌ها (22)، ترکیبات ضدمیکروبی (23)، سوخت‌های زیستی (24)، پالایش زیستی (25) و... استفاده شده است . با وجود پژوهش‌های متعدد صورت‌گرفته در دنیا برای تولید زایلیتول توسط میکروارگانیسم‌های مختلف، در کشور ما پژوهش‌های بسیار اندکی دراین‌خصوص انجام شده است (26)؛ بنابراین، هدف از اجرای پژوهش حاضر، بررسی آثار و بهینه‌سازی فاکتورهای مختلف در تولید مبتنی بر فناوری زیستی زایلیتول مانند نوع منبع ازت، دما، اسیدیته، غلظت زایلوز و غلظت منبع نیتروژنی انتخاب‌شده بود که برای رسیدن به این اهداف از روش سطح پاسخ استفاده شد.
مواد و روشها. مواد مصرفی: منابع نیتروژنی شامل عصاره مخمر و سولفات آمونیوم از کمپانی مرک (آلمان) و قند زایلوز و استاندارد آن برای کروماتوگرافی (اچ. پی. ال. سی) از کمپانی سیگما (آلمان) تهیه شد. .میکروارگانیسم استفاده شده و کشت و نگهداری آن: در پژوهش حاضر از مخمر کندیدا تروپیکالیس سویه NCIM 3119 (تخمیرکننده قند زایلوز) که در پژوهش‌های قبلی نویسندگان (27) از بین سویه‌های متعدد به‌عنوان سویه برتر تولیدکننده زایلیتول انتخاب شده بود استفاده شد. سویه ذکرشده در محیط کشت حاوی گلوکز (10 گرم در لیتر)، قند زایلوز (3 گرم در لیتر)، سولفات آمونیوم (5 گرم در لیتر)، عصاره مخمر (3 گرم در لیتر)، پپتون (5 گرم در لیتر) و آگار (15 گرم در لیتر) کشت شد. سپس نمونه‌های کشت‌داده‌شده به‌مدت 24 ساعت در داخل انکوباتور در دمای 29 درجه سلسیوس قرار داده شدند. مخمر ذکرشده پس از کشت در محیط حاوی 40درصد گلیسرول قرار داده شد و در 70- درجه سلسیوس نگهداری شد. .بررسی قابلیت سویه کندیدا تروپیکالیس درتولید زایلیتول:برای بررسی قابلیت سویه مخمر در تولید زایلیتول، سویه ذکرشدهدر 40 میلی‌لیتر محیط کشت حاوی قند زایلوز (20 گرم در لیتر) و عصاره مخمر (8 گرم در لیتر) به‌مدت 96 ساعت در دمای 30 درجه سلسیوس و اسیدیته 5 در انکوباتور و در دور 200 آر پی ام کشت داده شد. درنهایت میزان زایلیتول تولیدشده با اچ‌پی‌ال‌سی اندازه‌گیری شد. حجم مایه تلقیح اولیه در این سیستم 3 درصد بود. وزن خشک سلولی: برای تعیین وزن خشک سلولی، مقدار مشخصی از سوسپانسیون میکروبی از فیلترهای 2/0 میکرومتر که قبلا به مدت 4 ساعت در دمای 65 درجه سلسیوس خشک شده بودند، عبور داده شدند. سپس سلولها با آب مقطر شست‌وشو داده شده و به مدت 48 ساعت تا رسیدن به یک وزن ثابت در دمای 105 درجه سلسیوس قرار داده شدند. درنهایت با توزین آن، مقدار زیست توده بر حسب گرم در لیتر ماده خشک سلولی گزارش شد. بررسی اثر عوامل محیطی بر تولید زایلیتول: برای تولید زایلیتول از ارلن‌های 150 میلی‌لیتری که هر کدام حاوی 40 میلی‌لیتر از محیط کشت حاوی غلظت‌های مختلف قند زایلوز و عصاره مخمر طبق طرح موردِنظر بود، استفاده شد. به هر ارلن به میزان 3 درصد از مایه تلقیح اضافه شد. ارلن‌ها در اسیدیته و دماهای مختلف (طبق طرح تعریف‌شده) به‌مدت 5 روز در انکوباتور و در دور 200 آر پی ام کشت داده شدند. برای بررسی اثر چهار متغیر دما (X1)، غلظت زایلوز (X2)، اسیدیته (X3) و غلظت منبع نیتروژنی (X4) بر رشد و تولید زایلیتول از طرح مرکب مرکزی[19] و روش سطح پاسخ[20] استفاده شد. در این طرح هریک از متغیرها در سه سطح به کار رفتند (جدول 1). طبق ماتریس طرح مرکب مرکزی تعداد واحدهای آزمایشی 27 و تعداد سطوح مرکزی متغیرها جهت تعیین خطای خالص نیز 3 بود که در سه تکرار انجام شد. روش‌های اندازه‌گیری: غلظت قند زایلوز و قند الکل زایلیتول با استفاده از روش اچ‌پی‌ال‌سی (کناور[21]) با مشخصات: پمپ k1001، دتکتور RI مدل K-2301، ستون یورو کت اچ [22]،حلال آب اسیدی با اسیدیته 2 و نرم‌افزار کروم‌گیت[23] اندازه‌گیری شد. میزان 20 میکرولیتر از نمونه با جریان 1 میلی‌لیتر در دقیقه از ستون یوروکت اچ به قطر ذرات 10 میکرومتر عبور داده شد. مدت‌زمان هر تجزیه 10 دقیقه بود.
جدول 1- متغیرها و سطوح هریک در طرح مرکب مرکزی برای بهینه‌سازی تولید زایلیتول
نتایج. نتایج نشان داد که سویه NCIM 3119 در شرایط کشت پایه اولیه، توانایی تولید 9/9 گرم در لیتر زایلیتول با بازده زایلیتول 49/0 را دارند. برای بهینه‌کردن 4 فاکتور دما (X1)، غلظت زایلوز (X2)، اسیدیته (X3) و غلظت عصاره مخمر به عنوان منبع نیتروژنی (X4) برای رشد و تولید زایلیتول توسط سویه مطالعه شده از طرح مرکب مرکزی و روش سطح پاسخ استفاده شد که نتیجه مدل سطح پاسخ به‌صورت آنالیز واریانس در جدول 2 آورده شده است. نتایج مدل به‌دست‌آمده در فرم آنالیز واریانس بر این نکته اشاره دارد که در تولید زایلیتول، معادله درجه دوم به‌دست‌آمده معنی‌دار است (جدول 3). همچنین در تست عدم تطابق[24] مشخص شد که داده‌های آزمایشگاهی در وضعیت مناسبی قرار دارند؛ زیرا داده‌های این تست معنی‌دار نیست (P=0.322). از طرف دیگر مدل ریاضی به‌دست‌آمده در طرح یک مدل قابلِ‌اطمینان بود (R2=94.6%) و این بدین معنا است که 6/94 درصد داده‌ها با این مدل مطابقت دارند و تنها 39/5 درصد داده‌ها با آن در تطابق نیستند. مدل ریاضی به‌دست‌آمده به شرح زیر است (معادله 1): Y=0.646 + 0.004 X1 - 0.031X2 - 0.013 X3 + 0.109 X4 - 0.118(X1)2 - 0.059(X2)2 - 0.126(X3)2 - 0.059(X4)2-0.001 X1X2 + 0.0755 X1X3 + 0.031 X1X4 + 0.0529 X2X4 - 0.025 X3X2- 0.027 X3X4
در این فرمول Y، X1، X2، X3، X4 به‌ترتیب معادل بازده زایلیتول (میزان گرم زایلیتول تولیدشده نسبت به گرم زایلوز اولیه)، دما (درجه سلسیوس)، غلظت قند زایلوز (گرم در لیتر)، اسیدیته و غلظت عصاره مخمر (گرم در لیتر) هستند. اثر سطوح مختلف متغیرها بر تولید زایلیتول را می‌توان از طریق حل معادله ۱ به دست آورد. معادله حاضر میزان تأثیرگذاری هرکدام از فاکتورهای محیطی مطالعه‌شده را نشان می‌دهد و براساس آن می‌توان پیش‌بینی کرد که در اثر تغییرات هرکدام از فاکتورها چه بازده تولید زایلیتولی می‌توان انتظار داشت. براساس t تست (t-test) و مقدار p در جدول 3 مشخص شد که غلظت عصاره مخمر و غلظت قند زایلوز تأثیر معنی‌داری بر تولید زایلیتول دارند؛ درحالی‌که در بین آثار متقابل چهار فاکتور، اثر متقابل غلظت عصاره مخمر و غلظت قند زایلوز و همچنین اثر دما و اسیدیته معنی‌دار است ( p<0.05 ).
جدول 2- ماتریس طرح مرکب مرکزی بر راندمان تولید زایلیتول
جدول3- آنالیز واریانس داده‌ها برای تولید زایلیتول
* دما (X1)، غلظت زایلوز (X2)، اسیدیته (X3) و غلظت عصاره مخمر (X4)
در شکل 1 (الف-و) اثر مختلف متغیرها بر تولید زایلیتول به دو صورت نمودارهای کانتور و سطح پاسخ آمده است. در نمودارهای کانتور، پاسخ برای دو متغیر مستقل به تصویر کشیده می‌شود. این در حالی است که متغیرهای دیگر ثابت هستند (معمولاً در سطوح صفر در نظر گرفته می‌شوند). شکل 1 (الف) نشان می‌دهد که افزایش دما تا حدود 32 درجه سلسیوس مقدار زایلیتول را افزایش می‌دهد، ولی در دماهای بالاتر از آن تولید زایلیتول کاهش می‌یابد. این شکل همچنین نشان می‌دهد که اسیدیته بالا اثر منفی بر روی رشد میکروارگانیسم داشته و تولید زایلیتول کاهش می‌یابد. دلیل کاهش میزان تولید زایلیتول در اسیدیته‌های بالاتر، دورشدن از اسیدیته مطلوب رشد مخمر مطالعه شده می‌تواند باشد. همان‌طور که شکل 1 (ب) دیده می‌شود با افزایش غلظت زایلوز تا حدود 55 گرم در لیتر و افزایش دما تا حدود 32 درجه سلسیوس، میزان بازده زایلیتول افزایش می‌یابد ولی در مقادیر بالاتر تولید زایلیتول کاهش می‌یابد.
شکل 1 (ج) نشان می‌دهد که در یک دمای ثابت، با افزایش غلظت عصاره مخمر، تولید زایلیتول و بازده آن افزایش می‌یابد؛ این در حالی است که در غلظت ثابت عصاره مخمر با افزایش دما تا 32 درجه سلسیوس، میزان زایلیتول افزایش می‌یابد و پس از آن کاهش می‌یابد. شکل 1 (د) تأثیر دو فاکتور غلظت زایلوز و اسیدیته را بر بازده زایلیتول بیان می‌کند و همان‌گونه که مشاهده می‌شود با افزایش غلظت زایلوز تا حدود 55 گرم در لیتر و افزایش اسیدیته تا حدود 5/4 میزان بازده زایلیتول افزایش می‌یابد. تأثیر دو فاکتور اسیدیته و عصاره مخمر در شکل 1 (ه) نشان داده شده است. با مشاهده شکل می‌توان دریافت که میزان غلظت عصاره مخمر با بازده تولید زایلیتول رابطه خطی دارد؛ این در حالی است که این رابطه درمورد اسیدیته رابطه‌ای درجه دوم است. درنهایت تأثیر دو فاکتور غلظت زایلوز و عصاره مخمر بر بازده زایلیتول در شکل 1 (و) مشاهده می‌شود و همان‌طور که از شکل دیده می‌شود رابطه غلظت زایلوز با تولید و بازده زایلیتول رابطه‌ای درجه دوم است؛ درحالی‌که رابطه غلظت عصاره مخمر با بازده زایلیتول رابطه‌ای خطی است و با افزایش غلظت عصاره مخمر میزان بازده زایلیتول نیز افزایش می‌یابد.
(الف)
(ب)
(ج)
(د)
(ه)
(و) شکل 1. الف: بررسی تأثیر دما و اسیدیته بر بازده زایلیتول در شرایط غلظت 50 گرم در لیتر زایلوز و 5/7 گرم در لیتر عصاره مخمر. ب: تأثیر دما و غلظت زایلوز بر بازده زایلیتول در شرایط اسیدیته 5 و غلظت 5/7 گرم بر لیتر عصاره مخمر. ج: تأثیر دما و غلظت عصاره مخمر بر بازده زایلیتول در شرایط اسیدیته 5 و غلظت 50 گرم در لیتر زایلوز. د: تأثیر اسیدیته و غلظت زایلوز بر بازده زایلیتول در شرایط دمای 32 درجه سلسیوس و غلظت 5/7 گرم در لیتر عصاره مخمر . ه: تأثیر اسیدیته و غلظت عصاره مخمر بر بازده زایلیتول در شرایط دمای 32 درجه سلسیوس و غلظت 5/7 گرم در لیتر زایلوز . و: تأثیر تغییرات غلظت زایلوز و عصاره مخمر بر بازده زایلیتول در شرایط دمای 32 درجه سلسیوس و اسیدیته 5 .
شکل2- اثر بهینه 4 فاکتور دما، اسیدیته، غلظت زایلوز و عصاره مخمر در تولید و بازده زایلیتول (اعداد قرمز در شکل میزان بهینه فاکتور بررسی‌شده هستند).
افزایش غلظت زایلوز از 30 تا 54 گرم در لیتر باعث افزایش بازده زایلیتول شد. اما مقادیر بالاتر زایلوز منجر به کاهش تولید شد. دو عامل محیطی بررسی‌شده دیگر دما (X1 ) و اسیدیته (X3 ) بود که افزایش میزان آن‌ها به‌ترتیب تا 32 درجه سلسیوس و 69/4 باعث افزایش بازده زایلیتول شد؛ درحالی‌که میزان بالاتر آن‌ها باعث کاهش تولید شد. شرایط بهینه برای تولید زایلیتول توسط سویه مطالعه‌شده در شکل 2 یاد شده است که در آن 4 فاکتور متغیر دما (X1) برابر 32 درجه سلسیوس، غلظت زایلوز (X2) 24/54 گرم در لیتر، اسیدیته (X3) 69/4 و غلظت عصاره مخمر (X4) 12 گرم در لیتر بود. در این شرایط بهینه بالاترین میزان تولید زایلیتول و بالاترین بازده تولید به دست آمد (Y=0.73). با افزایش میزان غلظت عصاره مخمر(X4) تولید زایلیتول و بازده افزایش یافت؛ به‌طوری‌که بیشترین غلظت عصاره مخمر (12 گرم در لیتر) به تولید بیشترین میزان زایلیتول منجر شد. برای تأیید مدل به‌دست‌آمده، کشت در شرایط بهینه (دمای 32 درجه سلسیوس، غلظت عصاره مخمر برابر 12 گرم بر لیتر، اسیدیته 69/4 و غلظت قند زایلوز 24/53 گرم در لیتر) در سه تکرار انجام شد. بالاترین بازده و تولید زایلیتول در این شرایط برابر با 69/0 بود که با نتایجی که مدل ارائه‌شده پیش‌بینی کرد، در تطابق بود. مشاهدات نشان داد که این مدل به‌خوبی می‌تواند اثر چهار فاکتور بررسی‌شده بر تولید زایلیتول را پیش‌بینی کند. شکل 3 نمودار تولید زایلیتول و زیست‌توده سویه مطالعه‌شده را در شرایط بهینه نشان می‌دهد. بیشترین میزان تولید زیست‌توده (3/0±1/11 گرم در لیتر) و بیشترین میزان زایلیتول (6/0±7/36 گرم در لیتر) تا روز چهارم کشت سویه به دست آمد.
شکل 3- نمودار تولید زایلیتول و زیست‌توده توسط سویه NCIM 3119 در شرایط بهینه
بحث و نتیجه گیری. هدف از اجرای پژوهش حاضر بهینه‌سازی شرایط تولید زایلیتول از قند زایلوز توسط یک سویه مخمر کندیدا تروپیکالیس با استفاده از طرح مرکب مرکزی و روش سطح پاسخ بود. براساس مدل به‌دست‌آمده بیشترین میزان بازده زایلیتول (73/0Yp/s=) توسط سویه مخمر مطالعه‌شده در دمای 7/32 درجه سلسیوس، اسیدیته 7/4، غلظت قند زایلوز 2/54 و غلظت عصاره مخمر 12 گرم در لیتر برآورد شد (شکل 2). در پژوهشی که کاو[xxv] و همکاران انجام دادند، بهترین دامنه اسیدیته برای تولید زایلیتول توسط مخمرها بین 4 تا 5 به دست آمده بود (28) و بنابراین، نتایج پژوهش حاضر نیز با نتایج ذکرشده در تطابق‌اند. به‌منظور ارزیابی مدل به‌دست‌آمده، آزمایش تولید زایلیتول در شرایط بهینه توسط سویه انجام شد و در آن بازده تولید زایلیتول، میزان تولید زایلیتول و میزان تولید زیست‌توده در شرایط ذکرشده به‌ترتیب 69/0 ، 7/36 گرم در لیتر و 1/11 گرم در لیتر بود و با مدل به‌دست‌آمده در تطابق بود. از جمله پژوهش‌هایی که در بهینه‌سازی شرایط محیطی برای تولید زایلیتول انجام شده، پژوهش‌های راوو[xxvi] و همکاران است که آن‌ها در پژوهش ذکرشده اثر تغییرات برخی از شرایط محیطی مانند دما، اسیدیته، میزان قند زایلوز، میزان عصاره مخمر و میزان درصد مایه تلقیح مخمر کندیدا اس پی را بر تولید زایلیتول با روش تاگوچی بررسی کردند و نشان دادند که مهم‌ترین فاکتورها در افزایش تولید زایلیتول در سویه ذکرشده دما، غلظت زایلوز و منبع ازت هستند. آن‌ها موفق شدند با بهینه‌سازی شرایط بازده تولید زایلیتول را تا 78درصد افزایش دهند (5). این نتایج با نتایج به‌دست‌آمده در پژوهش حاضر در تطابق بوده و بازده بهینه زایلیتول نیز در پژوهش حاضر به حدود 73 درصد رسید. پژوهش حاضر نشان داد که یکی از عوامل مهم در تولید زایلیتول، دما است و در دمای 32 درجه سلسیوس بالاترین بازده مشاهد شد (شکل 1-الف و شکل 2). البته با افزایش دما از میزان بازده کاسته شد که احتمالاً دلیل آن این است که دمای بهینه رشد و فعالیت سویه مخمر مطالعه‌شده دمای 32 درجه سلسیوس است. باربوسا[xxvii] و همکاران (9) نیز در پژوهش خود نشان داده بودند که دمای بهینه برای تولید زایلیتول توسط مخمر کندیدا گوییلیرموندی بین 30 تا 35 درجه سلسیوس است که در تطابق با پژوهش حاضر بود. این در حالیست که ژانگ[xxviii] و همکاران (29) بالاترین میزان تولید زایلیتول توسط کلایورومایسس مارکسیانوس[xxix] نوترکیب را به‌دلیل گرمادوست‌بودن این میکروارگانیسم در دمای 42 درجه سلسیوس به دست آورد. پژوهش‌های دیگری که فلیپه[xxx] و همکاران (30) و همچنین کانورتی و دومینگوئز[xxxi] انجام دادند (31) نشان دادند که اسیدیته در تولید زایلیتول توسط کندیدا گوییلیرموندی و دبارومایسس هنسنی[xxxii] دارای اثر بسیار معنی‌داری است و برای این دو میکروارگانیسم اسیدیته مطلوب حدود 5/5 است و به نتایج پژوهش حاضر که اسیدیته مطلوب 7/4 بود، نزدیک است. درخصوص غلظت زایلوز، در پژوهش حاضر با افزایش میزان زایلوز تا 55 گرم در لیتر بازده تولید زایلیتول افزایش یافت؛ اما بعد از آن کاهش یافت (شکل 1-ب وشکل 2). دلیل کاهش میزان بازده تولید زایلتول با افزایش میزان غلظت زایلوز بیش از 55 گرم در لیتر، احتمالاً تحمل‌نداشتن سویه مخمر مطالعه‌شده به غلظت بالای این ماده است. این موضوع را قبلاً ژانگ و همکاران (29) نیز گزارش کرده بودند. این نتایج با پژوهش‌های هوریتسو[xxxiii] و همکاران (32) که نشان دادند میزان بازده تولید زایلیتول توسط این مخمر با افزایش غلظت زایلوز تا 172 گرم در لیتر افزایش دارد، متفاوت بود. به نظر می‌رسد دلیل این امر اختلاف ژنتیکی نوع سویه‌های استفاده شده باشد. این گروه همچنین نشان داده بودند که غلظت عصاره مخمر نیز دارای اثر بسیار معنی‌داری بر عملکرد تولید زایلیتول دارد که این موضوع در پژوهش حاضر نیز مشخص شده است (شکل 1- ج). علاوه بر این، نتایج پژوهش حاضر نشان داد که فاکتورهای محیطی مختلف شامل غلظت زایلوز و اسیدیته (شکل 1-د)، غلظت عصاره مخمر و اسیدیته (شکل 1-ه) و غلظت عصاره مخمر و غلظت زایلوز (شکل 1-و) دارای آثار متقابل است و آثار مثبت آن‌ها از نوع خطی (عصاره مخمر) و یا درجه دوم (غلظت زایلوز و اسیدیته) هستند. این موارد در پژوهش‌های سایر محققان نیز به‌نحوی مشاهده شده است (30- 32). سیلوا و همکاران نیز با استفاده از کاه و کلش برنج هیدرولیزشده موفق شدند به کمک مخمر کندیدا گوییلیرموندی زایلیتول با بازده 60درصد تولید کنند (33). تاجیک[xxxiv] و همکاران نیز با استفاده از روش یک فاکتور در زمان و آنالیز تاگوچی توانستند تولید زایلیتول را در مخمر پیشیا گوییلیرموندی با تغییر فاکتورهای منبع کربن و ازت بهینه‌سازی کنند. آن‌ها نشان دادند که برای سویه ذکرشده بهترین منبع کربنی زایلوز است و بهترین منبع ازت نیز عصاره مخمر و پپتون است (26). به‌طورکلی، با توجه به نتایج به‌دست‌آمده، در پژوهش حاضر فاکتورهای محیطی شامل نوع منبع ازت، دما، اسیدیته، غلظت زایلوز و غلظت منبع نیتروژنی برای تولید زایلیتول توسط سویه NCIM 3119 مخمر کندیدا تروپیکالیس بهینه‌سازی شد و در نتیجه آن زایلیتول با غلظت 7/36 گرم در لیتر با بازده 69/0 تولید شد که با نتایج سایر محققان قابلِ‌مقایسه است. اخیراً به تولید بیوتکنولوژیک زایلیتول با استفاده از گونه‌های مخمر کندیدا اس پی و استفاده از پسماندهای لیگنوسلولزی کشاورزی (34) مثل کاه و کلش برنج (29)، پسماندهای ذرت (1 و 6 و 19)، ساقه و کاه و کلش سورگوم (8)، پسماندهای همی سلولزی درختان میوه (11) و سایر مواد لیگنوسلولزی و همی‌سلولزی حاوی زایلوز بسیار توجه شده است. از نتایج پژوهش حاضر به‌عنوان مقدمه پژوهش‌های آتی نویسندگان برای بهینه‌سازی تولید زایلیتول از منابع لیگنوسلولزی ارزان‌قیمت کشور مثل کاه و کلش برنج که حاوی درصد بالایی از زایلوز است، استفاده خواهد شد. تشکر و قدردانی: نویسندگان بر خود لازم می‌دانند تا از همکاری‌های صمیمانه آقای مهندس سعید عباسعلیزاده و همچنین سایر همکاران بخش تحقیقات بیوتکنولوژی میکروبی پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران تقدیر و تشکر کنند. این پژوهش در قالب پروژه مصوب پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران (با شماره 90009-05-05-2 ) طراحی و اجرا شده است. [1]- Xylitol [2]- Pichia sp. [3]- Debaryomyces sp. [4]- Candida sp. [6]- Candida guilliermondii [7]- Candida tropicalis [8]- Corynebacterium sp. [9]- Entrobacter liquificiens [10]- Mycobacterium smegmatis [11]- Petromyces albertenisis [12]- Penecillium [13]- Aepergillus [14]- Neurospora sp. [15]- E. coli [16]- Pichia pastoris [17]- Trichoderma Reesei [18]- Response Surface Methodology (RSM) [19]- Central Composite Design (CCD) [20]- Response Surface Methodology (RSM) [21]- Knauer [22]- Eurokat H [23]- Chromgate [24]- Lack of fit [xxv]- Cao [xxvi]- Rao [xxvii]- Barbosa [xxviii]- Zhang [xxix]- Kluyveromyces marxianus [xxx]- Felipe [xxxi]- Converti and Domínguez [xxxii]- Debaryomyces hansenii [xxxiii]- Horitsu [xxxiv]- Tajik
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مراجع | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
(1) Wang L., Yang M., Fan X., Zhu X., Xu T., Yuan Q. An environmentally friendly and efficient method for xylitol bioconversion with high-temperature-steaming corncob hydrolysate by adapted Candida tropicalis. Process Biochemistry 2011; 46 (8): 1619- 26. (2) Mohamad NL., Mustapa Kamal SM., Mokhtar MN. Xylitol biological production: A review of recent studies. Food Review International 2014; Online First. DOI: 10.1080/87559129.2014.961077 (3) Mussatto SI., Dragone G. Influence of the toxic compounds present in brewer's spent grain hemicellulosic hydrolysate on xylose-to-xylitol bioconversion by Candida guilliermondii. Process Biochemistry 2005; 40 (12): 3801- 06. (4) Silva CJSM., Mussatto SI., Roberto., IC. Study of xylitol production by Candida guilliermondii on a bench bioreactor. Journal of Food Engineering 2006; 75 (1): 115- 9. (5) Rao RS., Prakasham R. Xylitol production by Candida sp.: parameter optimization using Taguchi approach. Process Biochemistry 2004; 39 (8): 951- 6. (6) Guo X., Zhang R., Li Z., Dai D., Li C., Zhou X. A novel pathway construction in Candida tropicalis for direct xylitol conversion from corncob xylan. Bioresource Technology 2013; 128: 547- 52. (7) Lachke A. Biofuel From xylose the second most abundant sugar. Resonance 2002; 7 (5): 50- 8. (8) Sene L., Arruda PV., Oliveira SMM., Felipe MGA. Evaluation of sorghum straw hemicellulosic hydrolysate for biotechnological production of xylitol by Candida guilliermondii. Brazilian Journal of Microbiology. 2011; 42 (3): 1141-1146. (9) Barbosa MFS., De Medeiros M., De Manchila. Screening of yeasts for production of xylitol from xylose and some factors whit affect xylitol yield in Candida guilliermondii. Journal of Industrial Microbiology 1988; 3: 241- 51. (10) Winkelhausen E., Kuzmanova S. Microbial conversion of D-xylose to xylitol. Journal of Fermentation and Bioengineering 1998; 86 (1): 1- 14. (11) Zhang J., Geng A., Yao C., Lu Y., Li Q. Xylitol production from d-xylose and horticultural waste hemicellulosic hydrolysate by a new isolate of Candida athensensis SB18. Bioresource Technology 2012; 105: 134- 41. (12) Girio MF., Pelica F., Collaco MTA. Charactrization of xylitol dehydrogenase from Dobaryomyces Hansenii. Applied Biochemestry and Biotechnology 1996; 56: 79- 87. (13) Nigam P., Singh D. Processes for fermentative production of xylitol. Process Biochemistry 1995; 30: 117- 24. (14) Parajo JC., Dominguez H., Dominguez JM. Biotechnological production of xylitol. Part 1: Interest of xylitol and fundamental of its biosynthesis. Bioresource Technology 1998; 65: 191- 201. (15) Sampaio FC., Silveira WBD., Chaves-Alves VM., Passos FML., Coelho JLC. Screening of filamentous fungi for production of xylitol from D-xylose. Brazilian Journal of Microbiology 2003; 34 (4), 321- 24. (16) Chin JW., Cirino PC. Improved NADPH supply for xylitol production by engineered Escherichia coli with glycolytic mutations. Biotechnology Progress 2011; 27 (2): 333-41. (17) Cheng H., Lv J., Wang H., Wang B., Li Z., Deng Z. Genetically engineered Pichia pastoris yeast for conversion of glucose to xylitol by a single-fermentation process. Applied Microbiology and Biotechnology 2014; 98 (8), 3539- 52. (18) Hong Y., Dashtban M., Kepka G., Chen S., Qin W. Overexpression of D-Xylose reductase (xyl1) gene and antisense inhibition of D-Xylulokinase (xyiH) gene increase xylitol production in Trichoderma reesei. BioMed research international 2014; 1- 8. (19) Li M., Meng X., Diao E., Du F. Xylitol production by Candida tropicalis from corn cob hemicellulose hydrolysate in a two‐stage fed‐batch fermentation process. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 2012; 87 (3): 387- 92. (20) Chicatto J A., Costa A., Nunes H., Helm C V., Tavares L. Evaluation of hollocelulase production by Lentinula edodes (Berk.) Pegler during the submerged fermentation growth using RSM. Brazilian Journal of Biology 2014; 74 (1): 243- 50. (21) Khodaiyan F., Razavi H., Mousavi M. Optimization of canthaxanthin production by Dietzianatronolimnaea HS-1 from cheese whey using statistical experimental methods. Biochemical Engineering Journal 2008; 40: 415- 22 (22) Meena GS., Kumar N., Majumdar GC., Banerjee R., Meena PK., Yadav V. Growth characteristics modeling of Lactobacillus acidophilus using RSM and ANN. Brazilian Archives of Biology and Technology 2014; 57 (1): 15- 22. (23) Kumari R., Singh S., Pradhan N., Chandni S., Karthik L., Kumar G., Rao KV. RSM Optimized media to increase the antibacterial activity of wild and mutated strain of nocardiopsis VITSRTB. Research Journal of Pharmacy and Technology 2014; 7 (2): 213- 20. (24) Nasser Al-Shorgani NK., Mohd Isa MH., Yusoff WMW., Kalil MS., Hamid AA. Response Surface Methodology for biobutanol optimization using locally isolated Clostridium acetobutylicum YM1. International Journal of Green Energy 2014; 12 (12): 1236- 43. (25) Perchestan SN., Borghei SM., Gholami RM. Optimization of metals bio recovery process from spent catalysts using Thiobacillus thiooxidans and RSM methodology. The AYER 2015; 1: 194- 201. (26) Tajik M., Faezi Ghasemi M., Chaichi Nostrati A., Besharat Vesal N. Optimization production of xylitol by Pichia guilliermondii DSMZ 6381 strain at laboratory level. Environmental Microorganisms and Biotechnology 2012; 3 (6): 19- 32 [In Persian]. (27) Zahed O. Continuous coproduction of ethanol and xylitol from rice straw using a co-culture system in a membrane bioreactor [dissertation]. Tehran: University of Tehran; 2011 [in Persian]. (28) Cao NJ., Tang R., Gong C S., Chen LF. The effect of cell density on the production of xylitol fromd-xylose by yeast. Applied Biochemistry and Biotechnology 1994; 45 (1): 515- 19. (29) Zhang J., Zhang B., Wang D., Gao X., Hong J. Improving xylitol production at elevated temperature with engineered Kluyveromyces marxianus through over-expressing transporters. Bioresource Technology 2015; 175: 642- 5. (30) Felipe MG., Vitolo M., Mancilha IM., Silva SS. Fermentation of sugar cane bagasse hemicellulosic hydrolysate for xylitol production: effect of pH. Biomass and Bioenergy 1997; 13 (1): 11- 14. (31) Converti A., Domínguez JM. Influence of temperature and pH on xylitol production from xylose by Debaryomyces hansenii. Biotechnology and Bioengineering 2001;75 (1): 39- 45. (32) Horitsu H., Yahashi Y., Takamizawa K., Kawai K., Suzuki T., Watanabe N. Production of xylitol from D-xylose by Candida tropicalis: Optimization of production rate. Biotechnology and Bioengineering 1992; 40 (9): 1085- 91. (33) Silva CJ., Roberto IC. Optimization of xylitol production by Candida guilliermondii FTI 20037 using response surface methodology. Process Biochemistry 2001; 36 (11):1119- 24. (34) de Albuquerque TL., da Silva IJ., de Macedo GR., Rocha MVP. Biotechnological production of xylitol from lignocellulosic wastes: A review. Process Biochemistry 2014; 49 (11): 1779- 89. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
آمار تعداد مشاهده مقاله: 1,931 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 749 |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||