مقدمه.

واژه تراورتن برگرفته شده از واژه ایتالیایی تیورتیون[1] و نام محلی است که تراورتن به شکل رسوب بیرونی تشکیل شده‌ است (1). تراورتن حاصل تجمع کربنات کلسیم در چشمه‏های کارستی، چشمه‏های آب‏گرم، رودخانه‏های کوچک و باتلاق‌‏هاست. مهم‏ترین عامل رسوب‏گذاری در تراورتن‏ها عوامل شیمیایی مانند تبخیر، خارج شدن CO₂، افت فشار و ... است و میکروارگانیسم‏ها ‏در کنار عوامل شیمیایی در رسوب‏گذاری تاثیرگذار هستند (2). سیمونز در سال 1951 تراورتن‏های چشمه‌ای که در محل خروج چشمه‏ها ‏تشکیل می‏‌شود را معرفی کرد‏، که تراورتن‌‏های چشمه بادآب سورت در کیاسر مازندران از این نوع هستند (3). در حقیقت، تراورتن نوعی سنگ رسوبی کربناته‌ است که در محل چشمه‌‏های آهک‌ ساز تشکیل می‏شود. یک چشمه کربناته معمولاً در کف حوضچه‌‏های کم ‌عمق تشکیل می‌شود و می‌توان گفت تراورتن معمولاً حاصل رسوب مواد آهکی در آب‏های روان است (3).

چشمه تراورتن‌ ساز بادآب سورت اورست در استان مازندران، شهرستان ساری و یک کیلومتری شرق روستای اورست در ارتفاع 1840 متری از سطح دریا واقع شده است (شکل 1). چشمه سورت شامل دو سرچشمه با فاصله اندک بین هم است که از لحاظ ترکیب شیمایی، رنگ و مزه از هم متفاوت هستند (جدول 1). یکی از سرچشمه‏های اصلی سرچشمه شرقی (شکل 1، الف) است که دارای آب‌دهی بیشتر است و شوری بالاتری را نشان می‏دهد و در انتهای آن لجن سیاه‌ رنگ دیده می‌شود که خاصیت درمانی دارد، درحالی‏که سرچشمه غربی (شکل 1، ج) دارای آبی ترش ‌مزه با رنگ قرمز- نارنجی است؛ رنگ قرمز آن به علت وجود ترکیبات آهن اکسیده است.

این چشمه هم اکنون فعال است و قسمت‏های قدیمی هم در حومه آن دیده می‏شود (شکل 1، ب). چشمه بادآب سورت با ایجاد شکل‏های ژئومورفولوژی منحصر به ‌فرد همراه با رنگ‏های گوناگون و به ویژه‏ رنگ‏های قرمز، یکی از جاذبه‏های زمین‌ شناختی استان مازندران محسوب می‏شود. مجموعه تراورتنی بادآب سورت هم زمان با آخرین چین‌خوردگی البرز در پلیوسن و پلیستوسن (دوران چهارم زمین‌شناسی) شکل گرفته است. این چشمه در سال 1387دومین اثر طبیعی ملی بعد از قله دماوند توسط سازمان میراث فرهنگی و گردشگری تعیین شد.

 در شکل 3 موقعیت قرارگیری و خروج سرچشمه‏های بادآب سورت و رابطه سن آن با واحدهای زیرین خود نشان داده شده است.

چشمه‏های تراورتن ساز به علت وجود فعالیت میکروارگانیسم‏ها ‏در رسوب‏گذاری ‏مدل مناسبی برای بررسی رابطه میکروب‏ها ‏و محیط است. کربنات‏های میکروبی و توده‏های میکروبی مهم‏‏ترین ‏مدل بررسی رابطه میکروب‏- محیط هستند (4). زمان آغاز حیات میکروبی ‏حدود 1/4 میلیارد سال پیش در نظر گرفته می‏شود (5) که محیط آن دارای شرایط با 150 درجه سانتی‏گراد‏، قلیایی و حاوی بی سولفید و آهن است و نخستین نشانه‏های توده‏های میکروبی ‏در حدود 5/3 میلیارد سال پیش در آفریقای جنوبی و استرالیا گزارش شده است (6). همان طور که دیده می‏شود موجودات اولیه در زیستگاه‏های پلی‏اکستریم حیات داشته‏اند (7) که گفته شده ابتدا در حباب‏هایی ‏نزدیک به سطح آب حیات شکل گرفته و سپس، تکامل جمعیت‏های میکروبی ‏و تولید فرآیند‏ها ‏و متابولیسم‏های متنوع میکروبی ‏در توده‏های میکروبی ‏شکل گرفته است. برای نمونه نخستین فتوسنتز‏کننده‏ها ‏در توده‏های میکروبی ‏وجود داشته‏اند (4).

شکل 1- چشمه بادآب سورت. الف) چشمه شرقی، ب) سرچشمه‏های قدیمی که در حال حاضر فعالیتی ندارند، ج) چشمه غربی

معدنی شدن به واسطه میکروب‏ها ‏در آغاز حیات میکروبی ‏وجود داشته که با رسوب یافتن کربنات کلسیم، استروماتولیت‏های لایه‏ای‏یی شکل گرفته‏اند که جمعیت‏ها ‏کلسیت را رسوب می‏داده‏ یا اینکه به دام می‏انداخته‏اند (8). به این شکل میکروارگانیسم‏هایی که در زیستگاه‏های کربناته تکامل یافته‏اند توانایی رسوب کربنات کلسیم را دارند، حتی یوکاریوتی مثل مرجان‏ها ‏که به شکل فعال توسط فرآیندی آنزیمی کلسیت را روی خود رسوب می‏دهند (9). این کار سبب شده نیچ‏های مناسب برای ادامه حیات ایجاد شود مثل کاری که در بیوفیلم‏ها ‏رخ می‏دهد. با تشکیل توده‏های میکروبی ‏ارگانیسم‏های مختلف در کنار هم قرار گرفته و تحمل شرایط سخت محیطی برای آنها افزایش می‏یافته در نتیجه شانس ادامه حیات افزایش می‏یافته است.

معدنی شدنی که توسط مرجان‏ها ‏انجام می‏شود فرآیند معدنی شدن زیستی نام دارد. دو فرآیند دیگر به نام معدنی شدن تحریک شونده زیستی[2] و معدنی شدن تحت تاثیر زیستی[3] وجود دارند (10) که باکتری‏ها ‏در کنار فرآیندهای فیزیکی رسوب‏گذاری ‏مثل انتشار، بخارشدن و آزادشده گاز روی رسوب‏گذاری ‏تأثیر می‏گذارند. مشخص شده است که در محیط‏های دریایی دو عامل درونی و بیرونی (11) در رسوب‏گذاری ‏تاثیرگذار هستند (12). عوامل درونی مانند برهم‏کنش‏های اکولوژیکی، تولید و مصرف مواد آلی و غیرآلی است که دو مکانیسم کلی آن یکی تولید پلی‏ساکاریدهای خارج سلولی است که در نتیجه آن میکروارگانیسم‏ها ‏به عنوان هسته اولیه هنگام آغاز رسوب‏گذاری ‏عمل می‏کنند و مکانیسم بعدی موتور قلیالیت[4] نام دارد (9) که به فعالیت‏های متابولیکی سلول‏ها ‏اشاره دارد تغییرات اسیدیته می‏تواند از 6 تا 10 باشد، با این تغییر میکرومحیط‏هایی ‏برای تولید رسوب فراهم آورده می‏شود (9). با توجه به اینکه فعالیت‏های میکروب‏ها ‏متنوع است، تاثیر آن‏ها بر رسوب‏گذاری ‏می‏تواند یا منفی باشد. برای نمونه سیانوباکترها با گرفتن کربن دی اکسید از آب، سبب تسهیل رسوب یافتن کربنات کلسیم می‏شوند در حالی که اکسیداسیون سولفید سبب اسیدی شدن محیط می‏شود که اثر منفی بر رسوب‏گذاری دارد (13). عوامل بیرونی مانند نور، مواد غذایی، فضا، هیدرودینامیک و لایه‏گذاری ‏هستند (14). همان‏طور که دیده می‏شود این دو عامل بیرونی و درونی را باید در کنار هم در نظر گرفت زیرا در محیط‏های مختلف ممکن است یک عامل اصلی در رسوب‏گذاری ‏کلسیت وجود داشته باشد.

در پژوهش حاضر تلاش شد در درجه اول تنوع میکروبی ‏و رابطه بین میکروب ‏و محیط با روش‏های میکرسکوپی و کشت بررسی شود و در مرحله بعد میکروارگانیسم‏های رسوب دهنده کربنات کلسیم جداسازی شوند. این میکروارگانیسم‏ها ‏کابردهای مختلفی مانند کاهش آلودگی‏های فلزی خاک و آب‏های زیرزمینی (15)، افزایش استحکام خاک (16)، کاهش حفرات ساخت‏های زمین‏شناسی (17)، حفاظت و استحکام به ساخت‏‏های سیمانی (18) و حفاظت از سنگ‏های ساختمانی (19) دارند که هر یک از نظر اقتصادی مهم هستند.

‏‏مواد و روش‏ها.

نمونه‏ برداری: نمونه‏های سنگی برای بررسی میکرسکوپی و نمونه آب برای جداسازی باکتری‏‏‏ها ‏در مهرماه سال 1391 جمع‏آوری، به آزمایشگاه در دانشگاه تهران منتقل و در یخچال 4 درجه سانتی‏گراد‏ نگهداری شد.

.تهیه عکس‏های میکرسکوپی و رسم نقشه‏های زمین‏شناسی: از نمونه‏های سنگی ابتدا برش نازک به قطر 30 میکرون تهیه شد و با میکروسکوپ پلاریزان مدل المپیوس[5] با عدسی‏های 5/2، 4 و 10 مشاهده و بررسی شدند (20 و 21). سپس، قطعات کوچکی از آن‏ها برای تصویر برداری میکرسکوپ الکترونی تهیه شد (22 و 23). تصاویر SEM از طریق دستگاه میکروسکوپ الکترونی نگاره مدل KYKY-EM3200 تهیه شد.

موقعیت چشمه بادآب سورت در ایران و لایه‏های سنگی منطقه کیاسر (شکل 2) از روی نقشه زمین‏شناسی منطقه کیاسر (مقیاس 20000/1) با استفاده از نرم افزار کورل درا ایکس [6]6 رسم شد و نقشه توپوگرافی و لایه‏های محدوده چشمه از طریق نرم افزارهای گوگل ارث[7]، سرفر 10[8] و کورل درا ایکس 6 و با استفاده از نقشه زمین‏شناسی منطقه کیاسر با مقیاس 20000/1 رسم شد.

شکل 2- موقعیت چشمه بادآب سورت در (a) مکان چشمه در ایران و نقشه راه‏‏های دسترسی به چشمه و (b) نقشه زمین‏شناسی و موقعیت چشمه بادآب سورت نمایش داده شده است. (رسم شده با استفاده از نقشه زمین‏شناسی منطقه کیاسر با مقیاس 20000/1 و نرم افزار Corel Draw X6)

شکل 3- نقشه توپوگرافی و توالی لایه‏های تشکیل شده در محدوده چشمه بادآب سورت (رسم شده با نرم افزار Surfer 10 و Corel Draw X6)

طراحی محیط کشت و کشت باکتری‏ها:نمونه‏های آب ابتدا توسط دستگاه جذب اتمی مدل پرکین المر [9]100 برای کاتیون‏ها ‏و تیتراسیون برای آنیون‏ها ‏تحلیل شیمیایی شد(جدول 1). با توجه به نوع و مقدار نمک‏ها ‏محیط کشت متناسب با محیط طراحی شد (جدول 2). با توجه به اینکه مشخص شده استفاده از محیط کشت فقیر غذایی سبب افزایش میزان جداسازی می‏شود، در پژوهش حاضر از این نوع محیط استفاده شد. زیرا در محیط‏های طبیعی ماده غذایی به وفور دیده نمی‏شود و جمعیت‏ها ‏در محیط طبیعی در حالت متابولیسمی نیمه فعال وجود دارند (24). محتوی نمکی از تغییر میزان نمک استفاده شده در محیط هالوفیلیک نسبی[10] MH به‏دست آمد (25).

جدول 1- ویژگی‏های فیزیکی و میزان عناصر سرچشمه‏های چشمه بادآب سورت

جدول 2- محیط کشت و شرایط گرماگذاری استفاده شده برای جداسازی و خالص‏سازی ‏باکتری‏ها

* مقادیر بر حسب گرم بر لیتر

** استفاده از دمای بین 30 تا 34 درجه سانتی‏گراد‏ گستره جداسازی باکتری‏ها ‏را افزایش می‏دهد.

¹ محیط طراحی شده برای سرچشمه شرقی1

² محیط طراحی شده برای سرچشمه غربی2

پس از تلقیح، محیط‏ها ‏در دمای 34 درجه سانتی‏گراد‏ به مدت 6 ماه گرماگذاری شدند و جداسازی و خالص‏سازی ‏به روش کشت خطی انجام شد.

کشت سویه‏های جدا شده روی محیط B₄ و تایید رسوب گذاری: برای بررسی تأثیر باکتری‏ها ‏بر رسوب‏گذاری، باکتری‏های خالص شده روی محیط کشت B₄ (کلسیم استات 25/0 درصد، گلوکز 1 درصد، عصاره مخمر4/0 درصد، نمک به میزان مورد نیاز سویه‏ها ‏و آگار 5/1 درصد برای محیط جامد) کشت داده شدند (26). به محیط چند قطره از فنل رد به عنوان شناساگر اضافه شد (مقدار 0025/0 درصد حل شده در سدیم هیدروکسید 1/0 نرمال) و با توجه به اینکه مشخص شده رسوب‏گذاری ‏کربنات کلسیم در اسیدیته‏‏های بالاتر از 8 رخ می‏دهد، اسیدیته محیط روی 8 تنظیم شد (27)، سویه‏ها ‏در دمای 34 درجه سانتی‏گراد‏ به مدت 1 هفته تا یک ماه گرمخانه‏گذاری ‏شدند.

تأیید رسوب‏گذاری ‏کلسیت توسط میکرسکوپ پلاریزان انجام شد، بدین صورت که بلورهای کلسیت در زیر نور پلاریزه به رنگ بژ تا خاکستری دیده می‏شوند، در حالی که بلورهای نمک یا هالیت[11] به علت اینکه زاویه بلور 90 درجه دارند به اصطلاح خاموش می‏شوند یعنی تیره هستند و دیده نمی‏شوند. زاویه بلور کلسیت 120 درجه است به همین علت زیر نور پلاریزه به رنگ بژ یا خاکستری دیده می‏شوند زیرا می‏توانند نور را از خود عبور دهند (شکل 5).

تحلیل سویه ‏های رسوب دهنده کربنات کلسیم: پس از تأیید وجود رسوب کلسیت دمای مناسب رسوب‏گذاری ‏برای یک سویه در بین دماهای 15، 20، 30 و 40 درجه سانتی‏گراد‏ به‏دست آمد. میزان کربنات کلسیم از طریق فیلتراسیون با کاغذ صافی 5/12 سانتی‏متری با اندازه حفره 42 میکرون واتمن به‏دست آمد. تفاوت وزن فیلتر قبل و پس از فیلتراسیون نشان دهنده مقدار کربنات‌کلسیم است (28) که میزان به شکل میلی‏گرم بر میلی‏لیتر گزارش شد[12] و در نهایت، میزان تولید رسوب با استفاده از روش یاد شده در بالا و میزان تغییرات اسیدیته با استفاده از اسیدیته متر مدل Multi7 برای سویه‏ها ‏طی 21 روز و در دمای مناسب به‏دست آمده در آزمایش قبلی محاسبه شد (29).

شناسایی مولکولی و رسم درخت فیلوژنتیکی: برای شناسایی مولکولی جدایه‏ها، ابتدا از آن‏ها بیومس گرفته شد. استخراج DNA به روش جوشاندن انجام شد و واکنش PCR با پرایمر‏‏های عمومی 27F
(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') و 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGCTT-3') با برنامه (دناتوراسیون اولیه 95 درجه سانتی‏گراد به مدت 5 دقیقه در یک چرخه، دناتوراسیون 95 درجه سانتی‏گراد به مدت 1 دقیقه در 30 چرخه، اتصال 56 درجه سانتی‏گراد به مدت 50 ثانیه در 30 چرخه، گسترش 72 درجه سانتی‏گراد به مدت 50 ثانیه در 30 چرخه و گسترش نهایی به مدت 7 دقیقه در یک چرخه) انجام شد. محصول PCR برای تعیین‌ توالی از طریق شرکت ژن فن‌آوران به شرکت ماکروژن[13] تحویل داده‌ شد و توالی به‏دست آمده با استفاده از نرم افزار کرماس پرو [14]4/1 اصلاح شد. سپس، با استفاده از ابزار بلاست[15] توالی با توالی‏های ثبت شده در پایگاه‏های داده اطلاعات ژنوم NCBI و Eztaxon مقایسه و میزان شباهت آن با سویه‌های مختلف ثبت شده تعیین شد (31).

تحلیل فیلوژنتیک سویه‌های منتخب و سویه‌های مشابه آن با استفاده از نرم افزارهای Clustal X2، Bioedit و Mega6 انجام شد و شکل 6 فیلوژنتیک با استفاده از روش‌های Neighbor-joining انجام گرفت (32). بررسی میزان اعتبار شاخه‌‏ها ‏در درخت رسم شده با استفاده از الگوریتم BootstrapAnalysis و با 1000 بار نمونه‏‏گیری انجام شد (33 و 34).

نتایج.

مقاطع تهیه شده توسط میکرسکوپ پلاریزان بررسی شدند و سپس، تصویر SEM از نمونه‏های مناسب گرفته شد (شکل 4 تا 9).

شکل 4- تصاویر نمونه سنگ RS-1 تهیه شده از چشمه بادآب سورت، الف) پیزوئیدها دارای الگوی رسوبی دایره‏ای متحد المرکز هستند، ب) تصویر تهیه شده توسط میکرسکوپ پلاریزان که بلورهای کلسیت به شکل گنید‏هایی ‏به رنگ بژ دیده می‏شود و ج) تصویر SEM از نمونه سنگی که دیاتومه‏ها ‏به خوبی دیده می‏شوند.

شکل 5- تصاویر نمونه سنگ RS-2 تهیه شده از چشمه بادآب سورت، الف) نمونه دارای الگوی رسوبی لایه‏ای است ب) تصویر تهیه شده توسط میکرسکوپ پلاریزان که ترکیبات آهن به رنگ قرمز و ترکیبات آلی به رنگ قهوه‏ای و سیاه دیده می‏شود و ج) تصویر SEM از نمونه سنگ که باکتری‏های باسیلی شکل به وضوح دیده می‏شود.

شکل 6- تصاویر نمونه سنگ RS-3 تهیه شده از چشمه بادآب سورت، الف) الگوی رسوبی لایه‏ای در نمونه دیده می‏شود و همچنین رسوبات آهن دار که به رنگ قرمز دیده می‏شوند، ب) تصویر تهیه شده توسط میکرسکوپ پلاریزان که ترکیبات آهن دار به رنگ قرمز در کنار بلورهای کلسیت به رنگ بژ دیده می‏شوند و ج) تصویر SEM از نمونه سنگی که بلورهای کلسیت دیده شده و همچنین باکتری‏های کوکسی شکل دیده می‏شوند.

شکل 7- تصاویر نمونه سنگ RS-4 تهیه شده از چشمه بادآب سورت، الف) نمونه دارای الگوی رسوبی لایه‏ای بوده و روی سنگ نشانه‏هایی ‏از رسوبات ثانویه و همچنین فعالیت ارگانیسم‏ها ‏دیده می‏شود، ب) تصویر تهیه شده توسط میکرسکوپ پلاریزان که بلورهای کلسیت به رنگ بژ، رسوبات آهن به رنگ قرمز دیده می‏شوند، زمینه سیاه رنگ به علت استفاده از چسب اپوکسی است.

شکل 8- تصاویر نمونه سنگ RS-5 تهیه شده از چشمه بادآب سورت، الف) پیزوئیدها دارای الگوی رسوبی دایره‏ای متحد المرکز هستند،
ب) تصویر تهیه شده توسط میکرسکوپ پلاریزان که بلورهای کلسیت به شکل گنبد‏هایی ‏به رنگ بژ دیده می‏شود و ج) تصویر SEM از نمونه سنگی که باکتری کوکسی شگل در نمونه دیده می‏شود.

شکل 9- تصاویر نمونه سنگ RS-6 تهیه شده از چشمه بادآب سورت، الف) نمونه الگوی رسوبی لایه‏ای داشته و روی آن رنگ‏های سیاه دیده می‏شود که به علت فعالیت ارگانیسم‏هایی ‏مثل جلبک‏ها ‏و گلسنگ‏ها ‏است، ب) تصویر تهیه شده توسط میکرسکوپ پلاریزان که بلورهای کلسیت به رنگ بژ دیده می‏شود و ج) تصویر SEM از نمونه سنگی.

146 جدایه‏ای که در مرحله جداسازی به‏دست آمده بود بر روی محیط B₄ کشت داده و پس از یک ماه بررسی شدند. مشاهده شد که 5 جدایه Bss-3، Bsw-28d، Bss-11a، Bsw-1c1 و Bsw-39b توانایی رسوب کربنات کلسیم را دارند (شکل 10). میزان شباهت آن‏ها به نزدیک‏‏ترین ‏تاکسون در جدول 3 آورده شده است.

شکل 10- مشاهده بیومس میکروبی ‏با میکروسکوپ نوری (شکل الف) و میکروسکوپ پلاریزان (شکل ب)، در شکل ب مکعب‏های نمک در نور پلاریزه به رنگ تیره دیده می‏شوند. رسوب کربنات کلسیم در زیر میکروسکوپ پلاریزان به رنگ بژ و خاکستری دیده می‏شود که شکل ب نمایان است و با فلش نشان داده شده است. در مرکز آن مکعب‏های مشکی رنگ هالیت نمایان است.

جدول 3- ویژگی‏های سویه‏هایی ‏که توانایی رسوب کلسیت در محیط B₄ را داشتنند

شکل 11- درخت فیلوژنتیک مربوط به سویه مربوط به سویه‏های رسوب دهنده کربنات کلسیم با استفاده از روش Neighbor-joining.

ضریب بوت استرپ 1000 و Ferroplasmaacidarmanusfer1 به عنوان برون گروه استفاده شده است.

در بین این سویه‏ها، این توانایی برای نخستین بار است که برای ‏Bss-3 گزارش شده است.

درخت فیلوژنی سویه‏‏‏ها با روش نیبر جوینینگ[16] و ضریب بوت استرپ[17] 1000 رسم شد.
Ferroplasmaacidarmanusfer1 به عنوان برون گروه انتخاب شد و در شکل 11 آورده شده است.

سویه Bss-3 برای انتخاب دمای مناسب رسوب‏گذاری ‏انتخاب شد و آزمایش نشان داد که دمای مناسب 30 درجه سانتی‏گراد‏ است (شکل 12).

سپس، میزان رسوب و تغییرات اسیدیته برای 5 سویه در دمای 30 درجه سانتی‏گراد‏ در 21 روز به‏دست آورده شد (شکل 13 و 14).

شکل 12- میزان رسوب کربنات کلسیم در 4 دمای 15، 20، 30 و 40 درجه سانتی‏گراد‏ برای سویه Bss-3، نتایج نشان می‏دهد که مناسب‏‏ترین ‏دما 30 درجه سانتی‏گراد‏ است که برای انجام آزمایش‏های بعدی استفاده شد، ضریب خطا، خطاهای استاندارد در نسبت با میانگین است.

شکل 13- تغییرات اسیدیته محیط کشت ₄‏‏‏‏B مایع برای سویه‏های رسوب دهنده کننده کربنات کلسیم، ضریب خطا، خطاهای استاندارد در نسبت با میانگین است.

شکل 14- تغییرات رسوب کربنات کلسیم در محیط کشت B₄ مایع برای سویه‏های رسوب دهنده کربنات کلسیم ضریب خطا، خطاهای استاندارد در نسبت با میانگین است.