جداسازی و غربال‏ گری باکتری بومی سیتروباکتر‏‏ با تحمل‏ پذیری بالا به نیکوتین و معرفی آن به عنوان بیوکاتالیست برای پاک‏سازی زیستی نیکوتین

مقدمه.

نیکوتین با فرمول بسته C10H14N2، آلکالوئید اصلی گیاه توتون [1] بوده، به‏طوری که 3 تا 5 درصد وزن خشک (وزنی/ وزنی) برگ‏های توتون را تشکیل می‏‏دهد. این ماده به عنوان تحریک کننده و در عین حال مهار کننده گیرنده‏های گانگلیوزیدی عمل کرده و ایجاد وابستگی و اعتیاد را در مصرف کننده به همراه دارد (1). در ارتباط با آثار زیان‏بار نیکوتین بر سلامت انسان، پژوهش‏های زیادی انجام شد‏‏ه و امروزه بدون شک نیکوتین در ردیف مواد سمی خطرناک معرفی می‏‏شود. با ورود نیکوتین به بدن، اختلالات فیزیولوژیک شدید از قبیل اختلالات گوارشی، اختلالات بینایی و شنوایی، افت شدید فشار خون، افزایش و نامنظم بودن ضربان‏های قلب، کلاپس قلبی- عروقی، نارسایی تنفسی، تشنج و در نهایت، مرگ را به دنبال خواهد داشت (2). نیکوتین هم در دود ناشی از مصرف دخانیات و هم در شیره حاصل از انواع جویدنی تنباکو وجود دارد. همچنین، نیکوتین در زباله‏ها و پسماندهای صنایع مختلف از جمله کارخانه‏های تولید دخانیات، سموم دفع آفات و صنایع دارویی وجود دارد و سبب آلودگی محیط زیست به ویژه‏‏ منابع آب (به خاطر ماهیت هیدروفیلیک نیکوتین) می‏‏شود (3 و 4). سالانه میلیون‏ها تن پسماند حاوی نیکوتین در سرتاسر دنیا تولید می‏‏شود که در برخی از این پسماندها غلظت نیکوتین ورودی بیش از 8/1 درصد (وزنی/ حجمی) تخمین زده شده است (5). این در حالی است که بر اساس استانداردهای زیست محیطی اتحادیه اروپا، چنانچه غلظت نیکوتین در پساب‏ها و فاضلاب‏های تولیدی از 05/0 درصد (وزنی/ حجمی) تجاوز کند، این فاضلاب‏ها در زمره مواد بسیار سمی و خطرناک رده‏بندی ‏‏می‏‏شوند (6). با توجه به روند رو به رشد صنایع مرتبط با نیکوتین و به تبع آن مشکلات درمانی و زیست- محیطی ناشی از تجمع ضایعات و پسماند‏های نیکوتینی در طبیعت، ضرورت حذف نیکوتین سمی از محیط‏های آلوده کاملا ضروری است. برای تصفیه و پاک‏سازی فاضلاب‏های حاوی نیکوتین روش‏های فیزیکی- شیمیایی و زیستی متعددی وجود دارد که در این میان، استفاده از میکروارگانیسم‏ها به عنوان کاتالیست‏های زیستی برای پاک‏سازی محیط‏های آلوده به نیکوتین می‏‏تواند مؤثر و ارزان باشد و ایمنی محیطی را تضمین کند‏‏ (6 و 7). اگرچه نیکوتین در غلظت‏های پایین برای بیشتر‏‏ میکروارگانیسم‏ها به شدت سمی است، با این حال باکتری‏های مختلفی با پتانسیل تجزیه‏کنندگی نیکوتین از منابع مختلف جداسازی و تعیین هویت شده‏اند. از مهم‏ترین باکتری‏های تجزیه کننده نیکوتین می‏‏توان گونه‏های ‏‏مختلف جنس‏های ‏‏آسینتوباکتر [2] (8)، آگروباکتریوم [3] (9)، آرتروباکتر [4] (10 و 11)، سلولوموناس [5] (12)، انسی فر [6] (4)،آگروباکتروم [7] (13)، سودوموناس [8] (5، 14- 19) و رودوکوکوس [9] (20) را نام برد. با توجه به آثار سمی نیکوتین و اینکه ورود آن به اکوسیستم‏های ‏‏آبی و خاکی می‏تواند زندگی انسان و سایر موجودات را تهدید کند و با توجه به نبود پژوهش متکی بر میکروارگانیسم‏های ‏‏بومی، ضرورت جداسازی و غربال‏گری میکروارگانیسم‏های ‏‏با پتانسیل پاک‏سازی نیکوتین مشخص می‏شود. هدف از انجام پژوهش حاضر، در مرحله اول، جداسازی و تعیین ویژگی باکتری‏های ‏‏با پتانسیل تحمل‏پذیری ذاتی بالا نسبت به نیکوتین، بررسی توانایی این باکتری‏ها در استفاده از نیکوتین به عنوان تنها منبع کربن و ازت و در انتها، تأثیر منابع کربن و ازت کمکی بر فرآیند حذف نیکوتین با هدف بهره‏برداری از این بیوکاتالیست برای پاک‏سازی نیکوتین سمی از محیط‏های ‏‏آلوده در پروژه‏های ‏‏آتی است‏. در این راستا سویه‏های باکتری متعددی از خاک‏های زیر کشت توتون از مناطق مختلف ایران جدا و برای نخستین بار تجزیه زیستی نیکوتین در جنس سیتروباکتر‏‏ [10]گزارش شد.

‏‏مواد و روش‏ها.

.مواد شیمیایی و محیط‏های ‏‏کشت میکروبیولوژیک: نیکوتین (99 درصد) برای آزماش‏های نیکوتین‏زدایی از شرکت سیگما [11] خریداری شد. متانول با درجه خلوص بالا و مخصوص HPLC از مرک [12] تهیه شد. محیط کشت نوترینت آگار [13] (5 گرم در لیتر پپتون، 3 گرم در لیتر عصاره گوشت و 20 گرم در لیتر آگار و pH برابر با 4/7) از شرکت کاردان آزما [14] خریداری شد. نمک‏های KH₂PO₄، K₂HPO₄، NaCl، MgSO₄، FeSO₄ و CaCl₂ برای تهیه محیط‏های پایه نمکی
ʺNic-medium agarʺ متشکل از ترکیبات زیر (بر حسب گرم در لیتر) از کمپانی کیولب [15] خریداری شد‏‏. مواد به کار گرفته شده در واکنش زنجیره‏‏ای ‏‏پلیمراز از شرکت سیناژن تهیه شد.

KH₂PO₄: 4; K₂HPO₄.3H₂O: ‏‏3/13; MgSO₄.7H₂O: ‏‏2/0; CaCl₂: ‏‏015/0; NaCl: 5/0; FeSO₄.7H₂O: ‏‏03/0; Agar: ‏‏20

.نمونه‏برداری ‏‏و غنی‏سازی باکتری‏های تجزیه کننده نیکوتین: با توجه به هدف پژوهش، مناسب‏ترین ‏‏مکان برای نمونه‏گیری خاک‏های زیر کشت توتون بود. برای این منظور 12 مزرعه توتون در اطراف استان‏های مازندران، گیلان، گلستان، اصفهان و کردستان به عنوان محل‏های هدف برای نمونه‏گیری انتخاب شد. نمونه‏های خاکی در ظروف پلاستیکی درب‏دار استریل جمع‏آوری و پس از انتقال به آزمایشگاه تا زمان استفاده در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شد. در ادامه برای غنی‏سازی باکتری‏های بومی تجزیه کننده نیکوتین از یک روش غنی‏سازی طبق روش پیشنهادی لیو [16] و همکاران (19)، با اندکی تغییرات، استفاده شد. برای این منظور، ابتدا سوسپانسیونی از نمونه‏های خاک جمع‏آوری شده در سرم فیزیولوژیک استریل (محلول نمک سدیم کلراید با غلظت 85/0 وزنی/ حجمی) تهیه شد. پس از تهیه رقت‏های متوالی از ^1-10 تا ^5-10 حدود 100 میکرولیتر از سوسپانسیون یاد شده به عنوان مایه تلقیح به محیط‏های پایه نمکی (Nic Medium Agar) انتقال یافت. به محیط یاد شده نیکوتین، پس از استریل شدن از طریق فیلتر‏های سر سرنگی 22/0 میکرونی، در غلظت نهایی 5/2 گرم در لیتر به عنوان تنها منبع کربن و ازت افزوده شد. سپس، محیط‏های کشت تلقیح شده در شرایط تاریکی و در دمای 30 درجه سانتی‏گراد به مدت 3 تا 5 روز گرماگذاری شد. در صورت مشاهده رشد، از تک کلونی‏‏های رشد یافته برای کشت خطی روی پلیت‏های ʺNic-medium agarʺ تا حصول اطمینان از خالص شدن کلونی‏‏ها استفاده شد. پس از بررسی‏های ریخت‏شناسی ‏و انجام برخی آزمون‏های بیوشیمیایی استاندارد، کلونی‏‏های یاد شده به عنوان باکتری‏های واقعی تجزیه کننده نیکوتین در محیط‏های اسلنت دار نوترینت آگار حاوی 1 گرم در لیتر نیکوتین برای آزماش‏های بعدی انتقال داده شدند.

.ارزیابی میزان تحمل‏پذیری ذاتی باکتری‏های تجزیه کننده نیکوتین و انتخاب باکتری کارآمد: با هدف شناسایی و انتخاب سویه‏های باکتری برتر با قابلیت حذف زیستی نیکوتین، در ابتدا آزمون تعیین الگوی تحمل‏پذیری ذاتی جدایه‏ها نسبت به نیکوتین در محیط‏های سنتتیک و کمپلکس با استفاده از روش رقت در آگار[17] انجام شد (21). برای این منظور، ابتدا محیط‏های سنتتیک ʺNic-medium agarʺ و کمپلکس نوترینت آگار با غلظت‏های مختلف نیکوتین تهیه شد (غلظت‏های نیکوتین: 3، 4، 5، 6، 7، 8، 9، 10، 11، 12 و 13 گرم در لیتر). 11 ارلن 250 میلی‏‏لیتری هر کدام حاوی 40 میلی‏‏لیتر محیط نوترینت آگار ذوب شده و 11 ارلن 250 میلی‏‏لیتری حاوی 40 میلی‏‏لیتر
ʺNic-medium agarʺ ذوب شده تهیه و توسط دستگاه اتوکلاو استریل شد. سپس، با استفاده از فیلترهای سرسرنگی 22/0 میکرونی، حجم مورد نیاز از استوک نیکوتین استریل به ارلن‏ها اضافه شد. محیط‏های موجود در ارلن‏های یاد شده درون پلیت‏های (با قطر 12 سانتی‏متری) جداگانه ریخته شد و هر پلیت با خط کش به 20 قسمت مساوی (به تعداد میکروارگانیسم‏های جدا شده) تقسیم شد‏‏. پس از تهیه نیم مک فارلند
 ( CFU/ml10⁸ × 5/1) از سویه‏های باکتری مورد آزمایش، به میزان 10 میکرولیتر از سوسپانسیون میکروبی درون پلیت‏های یاد شده تلقیح شد. پلیت‏ها در دمای 30 درجه سانتی‏گراد به مدت یک هفته گرماگذاری شدند. آزماش‏های سه بار تکرار شد. در ادامه و پس از شناسایی سویه‏های با قابلیت تحمل‏پذیری بالا، به منظور انتخاب سویه منتخب از روش کروماتوگرافی استفاده شد. برای این هدف، سویه‏های تحمل پذیر در محیط غربال‏گری nic-medium brothʺʺ با غلظت نهایی 5/2 گرم در لیتر نیکوتین به مدت 48 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‏گراد و دور شیکر rpm 180 رشد داده شدند. سپس، تحلیل‏‏ کیفی HPLC برای انتخاب سویه باکتری کارآمد انجام شد. در تمام مراحل آزمایش، یک نمونه شاهد بدون تلقیح باکتری استفاده شد (19).

.تعیین هویت سویه منتخب TPS2 بر اساس آزمون‏های فنوتیپیک و فیلوژنیک: شناسایی مقدماتی سویه TPS2 بر اساس ویژگی‏های ریخت‏شناسی ‏و آزمون‏های تشخیصی بیوشیمیایی از جمله رنگ و شکل ظاهری کلونی‏، رنگ آمیزی گرم، آزمون‏‏‏‏های کاتالاز و اکسیداز، آزمون‏‏‏ حرکت، احیای نیترات، هیدرولیز اوره، آزمون‏‏‏ اندول، متیل رد، وژپروسکوئر، مصرف سیترات، رشد در شرایط بی هوازی، تولید H₂S و رشد بر روی محیط کشت مک کانکی آگار انجام شد (22). در ادامه به منظور شناسایی دقیق‏تر سویه باکتری TPS2، از روش توالی‏یابی 16S rRNA استفاده شد. استخراج DNA ژنومی سویه TPS2 با استفاده از کیت [18] انجام شد. کمیت و کیفیت DNA استخراجی با روش‏های اسپکتروفتومتریک و الکتروفورز مشخص شد. به منظور تکثیر بخشی از توالی 16S rRNA به طول 370 جفت باز از یک جفت پرایمرهای همگانی به نام‏های rw01 (پرایمر رفت با توالی AACTGGAGGAAGGTGGGGAT) و dg74 (پرایمر برگشت با توالی AGGAGGTGATCCAACCGC) استفاده شد (23). تکثیر محصول PCR بر اساس اطلاعات جدول‏های 1 و 2 انجام گرفت.

جدول 1- مواد مورد نیاز برای انجام واکنش PCR در سویه

جدول 2- چرخه حراتی واکنش PCR انجام شده برای تعیین جنس

محصول PCR با استفاده از ژل الکتروفورز 5/1 درصد، ولتاژ 90 و در شرایط بافری TBE بررسی شد. محصول حاصل از PCR (در حدود 370 جفت باز) برای توالی‏یابی ‏‏‏‏به کمپانی ماکروژن کره جنوبی ارسال شد. برای تعیین همولوژی، توالی حاصل با توالی‏های موجود در بانک NCBI از طریق الگوریتم [19] BLASTN مقایسه شد. به منظور ثبت توالی نهایی به دست آمده در بانک ژنی GeneBank از نرم افزار [20] sequin 13.05 استفاده شد. تجزیه و تحلیل فیلوژنیک و ترسیم درخت به کمک نرم افزارهای BioEdit و [21] MEGA.6 و بر پایه روش neighbor-joining و با Bootstrap 1000 تکرار انجام شد (24).

.ارزیابی میزان حذف زیستی نیکوتین توسط سویه بومی TPS2 و اثر برخی عوامل بر روی آن: در این مرحله، میزان کمی حذف زیستی نیکوتین در سویه باکتری TPS2 که بر اساس تحلیل‏‏های پروفایل تحمل‏پذیری و تحلیل‏‏ کیفی HPLC به عنوان سویه برتر انتخاب شد، سنجش شد. برای این کار محیط‏های کشت ʺNic-medium brothʺ تهیه و با اتوکلاو استریل و سپس، نیکوتین استریل در غلظت‏های مختلف (5/0، 5/1، 5/2 و 4 گرم در لیتر) استفاده شد‏‏. از سویه برتر، 5/0 مک فارلند تهیه و 3 درصد از آن به محیط‏های یاد شده تلقیح شد. سویه یاد شده در یک دوره 48 ساعته در شیکر انکوباتور با دور 180 و دمای 30 درجه سانتی‏گراد رشد داده شد. درصد حذف نیکوتین با استفاده از دستگاه HPLC تعیین شد. در دستگاه [22] HPLC از ستون C18 (اندازه قطر ذرات فاز ثابت 5 میکرون)، به طول 25 سانتی‏متر و قطر داخلی 6/4 میلی‏‏متر استفاده شد. فاز متحرک به کار گرفته شده مخلوطی از متانول/ اسید سولفوریک یک میلی‏‏مولار (به نسبت 5 به 95 حجمی/ حجمی) بود که به شکل ایزوکراتیک با سرعت 5/0 میلی‏‏لیتر در دقیقه روی ستون فرستاده شد. طول موج استفاده شده 260 نانومتر و حجم تزریق شده 20 میکرولیتر بود. تمام مراحل آزمایش در دمای اتاق انجام گرفت (19). در شرایط کروماتوگرافی یاد شده، زمان بازداری [23] برای نیکوتین در زمان 6/6 دقیقه به دست آمد. در ادامه و پس از تعیین غلظت بهینه نیکوتین و بررسی اثر منابع کربن مختلف (گلوکز، فروکتوز، سوکروز، گلیسرول و سیترات سدیم) و منابع ازت مختلف (عصاره مخمر، تریپتون، اوره و کلرید آمونیوم)، دوره زمانی درصد حذف نیکوتین توسط سویه بومی TPS2 در محیط‏های نمکی حاوی نیکوتین به عنوان تنها منبع کربن و ازت و محیط‏های نمکی نیکوتین دار حاوی منابع کربن و ازت بهینه سنجش شد.

نتایج.

.نتایج غربال‏گری باکتری‏های مقاوم به نیکوتین و انتخاب سویه باکتری بومی برتر: در آزماش‏های غربال‏گری نخستین، 20 سویه باکتری بومی تجزیه کننده نیکوتین از خاک‏های زیر کشت توتون از مناطق مختلف ایران بر اساس روش غنی‏سازی جداسازی شد که در بررسی‏های ریخت‏شناسی ‏نخستین مشتمل بر 10 باسیل گرم منفی، 3 کوکسی گرم مثبت، 2 باسیل گرم مثبت و 5 کوکوباسیل گرم منفی بودند. تحمل‏پذیری ذاتی میکروارگانیسم‏های جداسازی شده نسبت به نیکوتین در محیط‏های کشت سنتتیک و کمپلکس بر اساس روش رقت در آگار تعیین شد (جدول 3).

جدول 3- الگوی تحمل‏پذیری جدایه‏های ‏‏باکتری تجزیه کننده نیکوتین در محیط‏های ‏‏کشت سنتتیک و کمپلکس

میزان تحمل‏پذیری جدایه‏های باکتری نسبت به نیکوتین در محیط‏های سنتتیک بین 3 تا 8 گرم در لیتر و در محیط‏های کمپلکس 6 تا 12 گرم در لیتر بود. با توجه به نتایج و بررسی جدول 3 مشخص شد که 4 سویه باکتری (نام‏گذاری شده با عنوان TPS1-TPS4) بالاترین مقاومت را نسبت به نیکوتین (بالاتر از 5 گرم در لیتر در محیط‏های سنتتیک و بالاتر از 10 گرم در لیتر در محیط‏های کمپلکس) را نشان دادند که بر این اساس به عنوان سویه‏های برتر برای آزماش‏های بعدی غربال‏گری برگزیده شدند. در بخش دیگر از این کار پژوهشی، با هدف انتخاب سویه برتر، ارزیابی میزان حذف زیستی نیکوتین در سویه‏های مقاوم با استفاده از تحلیل‏‏ کیفی HPLC مطالعه شد (شکل 1). همان‏گونه که در شکل 1 نشان داده شده است سویه مقاوم TPS2 (جدا شده از خاک زیر کشت توتون مازندران) در مقایسه با 3 سویه مقاوم دیگر توانایی بالاتری در حذف زیستی نیکوتین از محیط‏های کشت سنتتیک داشت. در کشت‏های کنترل (حاوی 5/2 گرم در لیتر نیکوتین و بدون تلقیح باکتری) حذف زیستی نیکوتین مشاهده نشده است که نشان می‏‏دهد نیکوتین قابلیت حذف شدن در شرایط غیر زیستی‏‏‏‏ را ندارد.

نتایج تعیین هویت سویه بومی TPS2: سویه TPS2 را که بر اساس پروفایل تحمل‏پذیری و تحلیل‏‏ HPLC قابلیت بالاتری در حذف زیستی نیکوتین از محیط‏های کشت حاوی نیکوتین را داشت را انتخاب و بر اساس ویژگی‏های ریخت‏شناسی ‏و بیوشیمیایی شناسایی شد. جدول 4 ویژگی‏های تاکسونومیک سویه باکتری TPS2 را نشان می‏دهد.

جدول 4- آزمون‏های ‏‏ماکروسکوپی، میکروسکوپی و بیوشیمیایی سویه باکتری TPS2

با توجه به صفات فنوتیپیک مطالعه شده، کتاب‏های مرجع و مقالات منتشره در این زمینه، می‏‏توان به‏طور‏‏ موقت سویه TPS2 را در جنس سیتروباکتر‏‏ قرار داد. برای شناسایی دقیق سویه TPS2، ابتدا DNA ژنومی استخراج و سپس، ژن کد کننده 16S rRNA از طریق پرایمرهای جهانی rw01 و dg74 مورد واکنش PCR قرار گرفت (شکل 2 قسمتA ). همان‏گونه که در شکل مشاهده می‏‏شود. توالی نوکلئوتیدی 16S rRNA مورد نظر دارای اندازه‏‏ای ‏‏در حدود 370 جفت باز است که مربوط به ترادف 16S rRNA باکتری اشریشیاکلی [24] (1100-1450/1500 Position) است. پس از توالی‏یابی ‏‏‏‏محصول PCR، تطابق توالی نوکلئوتیدی 16S rRNA سویه باکتری TPS2 با سایر توالی‏های موجود در بانک ژنی NCBI نشان داد که باکتری مورد نظر به جنس سیتروباکتر‏‏ تعلق داشته و دارای درصد تشابه 99 درصدی (با مقدار پوشش E value برابر صفر و query coverage برابر 100) با باکتری سیتروباکتر‏‏ سویه CAS12 (با شماره دسترسی KC550379) است. بنابراین، توالی نوکلئوتیدی 16S rRNA باکتری یاد شده در GeneBank با شماره دسترسی KM110046 ثبت شد. در ادامه نتایج ترسیم درخت فیلوژنیک تایید کرد که سویه TPS2 را می‏‏توان از نظر تاکسونومی به عنوان سویه‏‏ای ‏‏از جنس سیتروباکتر‏‏ طبقه‏بندی ‏‏کرد (شکل 2 قسمتB ).

شکل 1- (A) کروماتوگرام نیکوتین استاندارد و (B) کروماتوگرام هایHPLC ‏‏‏‏حاصل از تجزیه زیستی نیکوتین در شرایط سلول‏های رویشی 4 سویه باکتری مقاوم TPS1، TPS2، TPS3 و TPS4 در محیط ʺʺNic-medium broth حاوی 5/2 گرم در لیتر نیکوتین

شکل 2- (الف): باند الکتروفورز مربوط به تکثیر ژن 16S rRNA باکتری تجزیه کننده نیکوتین (1: مارکر 100 جفت بازی، 2: سویه TPS2 و 3: کنترل منفی). (ب): درخت فیلوژنیک بر اساس توالی ژن 16S rRNA سویه باکتری TPS2 و توالی‏های 11 سویه به دست آمده از بانک ژنی (درخت یاد شده بر اساس الگوریتم neighbor-joining و به کمک نرم افزار MEGA.6 ترسیم شد. اعداد داخل پرانتز نشان دهنده شماره دسترسی سویه‏های باکتری ثبت شده در GenBank است).