سنجش ‏فعالیت ‏ضد ‏میکروبی ‏باکتری‏ های ‏جداسازی ‏شده ‏از ‏دریای ‏خزر ‏و ‏شناسایی ‏مولکولی ‏سویه ‏های ‏دارای ‏اثر ‏ضد ‏میکروبی

مقدمه. ‏

با ‏وجود ‏تنوع ‏بسیار ‏بالای ‏زندگی ‏در ‏محیط ‏خاکزی، ‏دریاها ‏دارای ‏بزرگترین ‏تنوع ‏زیستی ‏هستند. ‏محیط‏های ‏آبزی ‏منابع ‏بسیار ‏بزرگی ‏برای ‏جداسازی ‏میکروارگانیسم‏های ‏جدید ‏با ‏توانایی ‏تولید ‏متابولیت‏های ‏ثانویه ‏هستند ‏(‏1- ‏3). ‏متابولیت‏های ‏ثانویه ‏ترکیباتی ‏با ‏وزن ‏مولکولی ‏کم ‏هستند ‏که ‏آنتی‏بیوتیک‏ها، ‏سموم، ‏فرومون‏ها، ‏ممانعت ‏کننده‏های ‏آنزیمی ‏و ‏غیره ‏را ‏شامل ‏می‏شوند. ‏این ‏مواد ‏به ‏عنوان ‏تولیدات ‏طبیعی ‏میکروارگانیسم‏ها ‏شناخته ‏می‏شوند ‏و ‏برای ‏رشد ‏طبیعی ‏ارگانیسم‏ها ‏ضروری ‏نیستند ‏(‏4). ‏در ‏مقایسه ‏با ‏ارگانیسم‏های ‏خاکزی، ‏متابولیت‏های ‏ثانویه ‏تولید ‏شده ‏در ‏میکروارگانیسم‏های ‏آبزی ‏جدیدتر ‏و ‏فعالیت‏های ‏زیستی ‏آن‏ها ‏قوی‏تر ‏‏‏است ‏که ‏علت ‏این ‏امر ‏تا ‏حدودی ‏مربوط ‏به ‏شرایط ‏زندگی ‏پیچیده ‏و ‏تنوع ‏گسترده ‏زیستی ‏آن ‏هاست. ‏رقابت ‏بین ‏میکروب‏های ‏آبزی ‏برای ‏فضا ‏و ‏غذا ‏باعث ‏ایجاد ‏یک ‏نوع ‏فشار ‏انتخابی ‏می‏شود، ‏در ‏نتیجه ‏میکروارگانیسم‏ها ‏ترکیباتی ‏طبیعی ‏تولید ‏می‏کنند ‏که ‏ارزش ‏بسیاری ‏در ‏صنعت ‏و ‏پزشکی ‏دارد ‏(‏5). ‏تعداد ‏ترکیبات ‏طبیعی ‏جداسازی ‏شده ‏از ‏میکروارگانیسم‏های ‏آبزی ‏رو ‏به ‏افزایش ‏است ‏به ‏طوری ‏که ‏هر ‏سال ‏صدها ‏ترکیب ‏جدید ‏و ‏مختلف ‏کشف ‏می‏شود ‏و ‏شمار ‏آن‏ها ‏هم ‏اکنون ‏بالغ ‏بر ‏18000 ‏ترکیب ‏است ‏(‏6 ‏و ‏7). ‏تعداد ‏زیادی ‏از ‏این ‏ترکیبات ‏فعالیت ‏دارویی ‏دارند ‏و ‏برای ‏تولید ‏ترکیبات ‏دارویی ‏فعال ‏زیستی ‏بسیار ‏سودمند ‏هستند ‏(‏8). ‏بیماری‏های ‏عفونی ‏تهدید ‏جدی ‏برای ‏سلامت ‏در ‏کشورهای ‏در ‏حال ‏توسعه ‏محسوب ‏می‏شوند. ‏افزون ‏بر ‏این، ‏پیدایش ‏مقاومت‏های ‏دارویی ‏مشکل ‏بسیار ‏جدی ‏در ‏درمان ‏این ‏بیماری‏های ‏عفونی ‏محسوب ‏می‏شود ‏(‏9 ‏و ‏10). ‏آثار ‏بیماری‏های ‏عفونی ‏در ‏محیط‏های ‏آبزی ‏نیز ‏بسیار ‏چشمگیر ‏است. ‏در ‏ابتدا ‏این ‏بیماری‏ها ‏در ‏محیط‏های ‏آبزی ‏با ‏داروهای ‏ضد ‏میکروبی ‏کنترل ‏می‏شد ‏اما ‏استفاده ‏گسترده ‏از ‏داروهای ‏ضد ‏میکروبی ‏در ‏این ‏زمینه ‏سبب ‏ایجاد ‏نوعی ‏فشار ‏انتخابی ‏و ‏ظهور ‏مقاوت ‏باکتریایی ‏شد ‏(‏11). ‏بر ‏اساس ‏گزارش ‏سازمان ‏بهداشت ‏جهانی ‏استفاده ‏گسترده ‏از ‏آنتی‏بیوتیک‏ها ‏‏سبب ‏‏مقاوت ‏‏به ‏‏بسیاری ‏‏از ‏‏پاتوژن‏ها ‏‏شد‏ه ‏است ‏(‏12). ‏باکتری‏های ‏مهم ‏بیمارستانی ‏از ‏قبیل ‏استافیلوکوکوس ‏اورئوس‏[1] ‏به ‏طور ‏معمول ‏به ‏آنتی‏بیوتیک‏های ‏رایج ‏مقاوم ‏شده‏اند‏ ‏(‏13 ‏و ‏14). ‏نگرانی ‏اصلی ‏دیگر ‏در ‏این ‏زمینه ‏مربوط ‏به ‏مقاوت‏های ‏چند ‏دارویی ‏در ‏بین ‏باکتری‏های ‏گرم ‏منفی ‏است. ‏باکتری‏های ‏گرم ‏منفی ‏محیطی ‏به ‏طور ‏جدی ‏بیماران ‏را ‏در ‏بیمارستان‏ها ‏تهدید ‏می‏کنند ‏و ‏به ‏طور ‏وسیعی ‏به ‏نسل‏های ‏اول ‏و ‏دوم ‏و ‏سوم ‏پنی‏‏سیلین‏ها ‏مقاوم ‏هستند. ‏از ‏این ‏دسته ‏باکتری‏ها ‏می‏توان ‏به ‏سودوموناس ‏آئروجینوزا‏[2] ‏اشاره ‏کرد ‏که ‏پاتوژن ‏فرصت ‏طلب ‏بیمارستانی ‏است ‏و ‏بیماران ‏بسیاری ‏را ‏تهدید ‏می‏کند ‏(‏15). ‏امروزه ‏در ‏حدود ‏70 ‏درصد ‏از ‏باکتری‏هایی ‏‏که ‏سبب ‏عفونت ‏دربیمارستان‏ها ‏می‏شوند ‏به ‏طور ‏رایج ‏به ‏یک ‏یا ‏تعداد ‏بیش ‏تری ‏از ‏آنتی‏بیوتیک‏های ‏معمول ‏که ‏برای ‏درمان ‏استفاده ‏می‏شوند، ‏مقاوم ‏هستند ‏(‏16). ‏باکتری‏های ‏آبزی ‏با ‏فعالیت ‏ضد ‏میکروبی ‏از ‏لایه‏های ‏مختلف ‏دریا ‏از ‏قبیل: ‏سطح، ‏عمق، ‏رسوبات ‏و ‏همچنین، ‏از ‏سایر ‏قسمت‏ها ‏و ‏نیز ‏همراه ‏با ‏جلبک‏های ‏دریای ‏استخراج ‏شده ‏اند ‏(‏17). ‏جنس ‏استرپتومایسس‏[3] ‏در ‏میان ‏خانواده ‏اکتینومایست‏ها‏[4] ‏به ‏عنوان ‏عامل ‏تولید ‏کننده ‏آنتی‏بیوتیکی ‏مهمی ‏شناخته ‏شده ‏است ‏و ‏به ‏طور ‏گسترده ‏در ‏اکوسیستم‏های ‏مختلف ‏مانند ‏خاک ‏و ‏آب ‏یافت ‏می‏شود. ‏این ‏جنس، ‏باکتری‏هایی ‏‏گرم ‏مثبت ‏با ‏درصد ‏بسیار ‏بالایی ‏از ‏گوانین ‏و ‏سیتوزین ‏در ‏داخل ‏ماده ‏ژنتیکی ‏خود ‏هستند ‏(‏بالغ ‏بر ‏70 ‏درصد). ‏استرپتومایسس‏ها ‏به ‏طور ‏گسترده ‏به ‏عنوان ‏منبع ‏مهمی ‏برای ‏آنتی‏بیوتیک‏ها ‏و ‏دیگر ‏متابولیت‏های ‏جدید ‏و ‏مهم ‏شناخته ‏شده ‏اند. ‏کمتر ‏از ‏70 ‏نوع ‏از ‏100 ‏نوع ‏آنتی‏بیوتیک ‏تجاری ‏که ‏برای ‏درمان ‏استفاده ‏می‏شوند ‏و ‏نیز ‏بالغ ‏بر ‏55 ‏درصد ‏ازآنتی‏بیوتیک‏های ‏کشف ‏شده ‏بین ‏سال‏های ‏1945 ‏تا ‏1978 ‏از ‏مواد ‏تولید ‏شده ‏از ‏استرپتومایسس‏ها ‏مشتق ‏شده ‏اند ‏و ‏کشف ‏آنتی‏بیوتیک‏های ‏جدید ‏از ‏این ‏جنس ‏همچنان ‏ادامه ‏دارد. ‏(‏18- ‏24). ‏بیشتر ‏استرپتومایسس‏ها ‏تولید ‏کننده ‏محدوده ‏گسترده ‏ایی ‏از ‏آنتی‏بیوتیک‏ها ‏از ‏قبیل: ‏آمینوگلیکوزیدها‏[5]، ‏بتالاکتام‏ها[6]، ‏ماکرولیدها[7]، ‏پپتیدها[8]، ‏پولیین‏ها‏[9]، ‏نوکلوئوزیدها‏[10] ‏و.. ‏. ‏هستند ‏(‏25- ‏28). ‏همچنین، ‏استرپتومایسس‏ها ‏نقش ‏بسیار ‏مهمی ‏در ‏بازیافت ‏مواد ‏آلی ‏و ‏مواد ‏دارویی ‏جدید، ‏آنزیم‏ها، ‏مواد ‏آرایشی ‏و ‏همچنین، ‏تولید ‏مواد ‏ضد ‏تومور ‏ایفا ‏می‏کنند ‏(‏29 ‏و ‏30). ‏تجزیه ‏و ‏تحلیل ‏از ‏طریق ‏روش‏های ‏مولکولی ‏ابزار ‏بسیار ‏ارزشمندی ‏برای ‏جداسازی ‏و ‏تشخیص ‏سویه‏های ‏جدید ‏استرپتومایسس ‏است. ‏شواهد ‏نشان ‏می‏دهد ‏تمایل ‏زیادی ‏برای ‏شناسایی ‏سویه‏های ‏جدید ‏استرپتومایسس ‏از ‏این ‏طریق ‏وجود ‏دارد؛ ‏زیرا ‏این ‏باکتری‏ها ‏تولید ‏کننده ‏قوی ‏متابولیت‏های ‏ثانویه ‏هستند ‏و ‏ارزش ‏چشمگیری ‏در ‏زمینه‏های ‏کشاورزی ‏و ‏پزشکی ‏و. ‏.. ‏دارند ‏(‏31). ‏هدف ‏از ‏پژوهش ‏حاضر،‏ ‏جداسازی ‏و ‏غربال‏گری ‏‏باکتری‏های ‏آبزی ‏از ‏دریای ‏خزر، ‏با ‏توانایی ‏تولید ‏ماده ‏ضد ‏میکروبی ‏بر ‏علیه ‏پاتوژن‏های ‏مقاوم ‏به ‏دارو، ‏گرم ‏مثبت ‏و ‏گرم ‏منفی، ‏و ‏سپس، ‏سنجش ‏قدرت ‏ضد ‏میکروبی ‏آن‏ها ‏برای ‏توجیه ‏بهینه‏سازی ‏‏تولید ‏ماده ‏ضد ‏میکروبی ‏در ‏آن‏ها ‏برای ‏صنایع ‏داروسازی ‏با ‏دو ‏روش ‏کاملا ‏متفاوت ‏آنتاگونیسم ‏میکروبی‏[11] ‏و ‏سنجش ‏از ‏طریق ‏دیسک‏[12] ‏و ‏در ‏انتها، ‏شناسایی ‏مولکولی ‏آن‏ها ‏بود. ‏

 ‏مواد ‏و ‏روش‏‏ها. ‏

نمونه‏گیری ‏و ‏کشت ‏باکتری‏های ‏آبزی: ‏نمونه ‏گیری ‏از ‏غرب ‏دریای ‏خزر، ‏(‏شهرستان ‏رامسر ‏واقع ‏دراستان ‏مازندران)، ‏در ‏شرایط ‏کاملا ‏کنترل ‏شده، ‏در ‏فصل ‏پاییز، ‏در ‏سه ‏نوبت ‏از ‏عمق ‏50 ‏سانتی ‏متری ‏و ‏از ‏فاصله ‏150 ‏تا ‏200 ‏متر ‏از ‏ساحل ‏انجام ‏شد. ‏علت ‏لحاظ ‏کردن ‏این ‏فاصله، ‏دور ‏بودن ‏از ‏آلودگی‏های ‏نزدیک ‏به ‏ساحل ‏و ‏وجود ‏سویه‏های ‏غیر ‏بومی ‏بود. ‏نمونه ‏گیری ‏به ‏طور ‏مستقیم ‏با ‏قرار ‏گرفتن ‏داخل ‏آب، ‏فرو ‏بردن ‏دست ‏تا ‏عمق ‏50 ‏سانتی ‏متری، ‏باز ‏کردن ‏درب ‏شیشه ‏داخل ‏آب ‏در ‏همان ‏عمق ‏و ‏پس ‏از ‏پر ‏شدن ‏شیشه ‏بستن ‏درب ‏ظرف ‏در ‏همان ‏لحظه ‏در ‏زیر ‏آب ‏انجام ‏شد. ‏نمونه‏ها ‏داخل ‏ظروف ‏با ‏درب ‏پیچ ‏دار ‏(‏ظروف ‏شیشه‏ای ‏با ‏درب ‏پیچ ‏دار ‏پلاستیکی ‏با ‏قابلیت ‏اتوکلا ‏شدن ‏که ‏قبل ‏از ‏نمونه ‏گیری ‏در ‏دستگاه ‏اتوکلاو ‏کاملا ‏سترون ‏شد ‏ند) ‏قرار ‏گرفتند ‏و ‏در ‏جعبه ‏یخ ‏به ‏سرعت ‏به ‏آزمایشگاه ‏انتقال ‏داده ‏و ‏در ‏مدت ‏حداکثر ‏24 ‏ساعت ‏کشت ‏داده ‏شدند.

سپس، ‏از ‏هر ‏یک ‏از ‏نمونه‏ها ‏در ‏حالت ‏سترون ‏رقت‏های ‏^1-10 ‏تا ‏^8-10 ‏تهیه، ‏مقدار ‏150 ‏میکرولیتر ‏از ‏هر ‏کدام ‏از ‏رقت‏ها ‏روی ‏سطح ‏پلیتی ‏که ‏حاوی ‏محیط ‏کشت ‏مارین ‏آگار‏[13] ‏بود ‏ریخته ‏و ‏کشت ‏سفره‏ای ‏داده ‏شد. ‏محیط ‏مارین ‏آگار ‏با ‏غلظت ‏یک ‏دهم، ‏ترکیب ‏آن ‏شامل: ‏پپتون‏[14] ‏(‏مرک ‏آلمان) ‏5/0 ‏گرم، ‏عصاره ‏مخمر[15] ‏(‏مرک ‏آلمان) ‏1/0 ‏گرم، ‏فسفات ‏آهن[16] ‏(‏مرک ‏آلمان) ‏1/0 ‏گرم، ‏آگار ‏آگار‏[17] ‏(‏مرک ‏آلمان)[18] ‏15 ‏گرم، ‏آب ‏دریا ‏1 ‏لیتر ‏بود. ‏اسیدیته ‏محیط ‏بین ‏2/7 ‏تا ‏6/7 ‏تنظیم ‏شد. ‏

نمونه‏های ‏مورد ‏نظر ‏در ‏دمای ‏25 ‏درجه ‏سانتی‏‏گراد ‏داخل ‏گرمخانه ‏گذاشته ‏شد. ‏پرگنه‏های ‏مختلف ‏باکتریایی ‏پس ‏از ‏گذشت ‏48 ‏تا ‏72 ‏ساعت ‏و ‏تعدادی ‏نیز ‏پس ‏از ‏20 ‏روز ‏روی ‏پلیت ‏ظاهر ‏شدند ‏(‏32). ‏

. ‏آماده‏سازی ‏‏باکتری‏های ‏جدا ‏شده ‏برای ‏تولید ‏ماده ‏ضد ‏میکروبی: ‏باکتری‏هایی ‏‏که ‏بر ‏اساس ‏شکل ‏و ‏رنگ ‏آمیزی ‏گرم ‏از ‏یکدیگر ‏جدا ‏شده ‏بودند ‏هر ‏یک ‏به ‏طور ‏جداگانه ‏در ‏شرایط ‏سترون ‏و ‏به ‏میزان ‏1 ‏لوپ ‏در ‏300 ‏میلی‏‏لیتر ‏محیط ‏مارین ‏براث‏[19] ‏تلقیح ‏شدند. ‏

ارلن‏های ‏حاوی ‏باکتری ‏تلقیح ‏شده ‏در ‏داخل ‏گرمخانه ‏شیکردار ‏در ‏دمای ‏25 ‏درجه ‏سانتی‏‏گراد ‏و ‏دور ‏rpm ‏220 ‏به ‏مدت ‏7 ‏روز ‏قرار ‏داده ‏شد. ‏پس ‏از ‏گذشت ‏7 ‏روز ‏نمونه‏ها ‏از ‏داخل ‏گرمخانه ‏شیکردار ‏خارج ‏و ‏برای ‏سانتریفیوژ ‏به ‏لوله‏های ‏آزمایش ‏انتقال ‏داده ‏شد. ‏سانتریفیوژ ‏در ‏دور ‏rpm ‏8000 ‏به ‏مدت ‏30 ‏دقیقه ‏انجام ‏و ‏در ‏نهایت، ‏مایع ‏رویی ‏جدا ‏شد ‏(‏32). ‏

استخراج ‏عصاره ‏ضد ‏میکروبی: ‏مایع ‏رویی ‏3 ‏بار ‏و ‏هر ‏بار ‏با ‏100 ‏میلی‏‏لیتر ‏اتیل ‏استات‏[20] ‏تیمار ‏شد. ‏سپس، ‏حلال ‏در ‏دمای ‏37 ‏درجه ‏تبخیر ‏و ‏عصاره ‏میکروبی ‏استخراج ‏شد ‏(‏32). ‏

سنجش ‏فعالیت ‏ضد ‏میکروبی ‏باکتری‏های ‏آبزی: ‏در ‏مرحله ‏سنجش ‏فعالیت ‏ضد ‏میکروبی ‏به ‏یک ‏سری ‏از ‏سویه‏های ‏مرجع ‏برای ‏بررسی ‏اثر ‏ضد ‏میکروبی ‏باکتری‏های ‏آبزی ‏روی ‏آن‏ها ‏نیاز ‏بود. ‏در ‏این ‏مرحله ‏4 ‏باکتری ‏به ‏عنوان ‏سویه ‏مرجع ‏در ‏نظر ‏گرفته ‏شد. ‏این ‏سویه‏ها ‏شامل ‏باسیلوس ‏سوبتیلیس ‏PTCC ‏1720 ‏(‏DSM10)‏[21]، ‏اشریشیاکلی‏[22] ‏PTCC1399 ‏(‏ATCC ‏25922)،‏ ‏استافیلوکوکوس ‏اورئوس ‏PTCC ‏1431 ‏(‏ATCC25923) ‏و ‏سودوموناس ‏آئروجینوزا ‏PTCC ‏1430 ‏(‏ATCC ‏27853) ‏بودند. ‏

بررسی ‏فعالیت ‏ضد ‏میکروبی ‏با ‏دو ‏روش ‏انجام ‏شد:

آنتاگونیسم ‏میکروبی: ‏در ‏این ‏روش ‏باکتری‏های ‏آبزی ‏به ‏شکل ‏زنده ‏برای ‏بررسی ‏اثر ‏ضد ‏میکروبی ‏استفاده ‏شد. ‏در ‏ابتدا، ‏پلیت ‏به ‏دو ‏قسمت ‏مساوی ‏تقسیم ‏شد. ‏در ‏یک ‏قسمت ‏باکتری ‏آبزی ‏به ‏شکل ‏زنده ‏و ‏انبوه ‏کشت ‏داده ‏و ‏به ‏مدت ‏48 ‏ساعت ‏در ‏داخل ‏گرمخانه ‏در ‏دمای ‏30 ‏درجه ‏قرار ‏داده ‏شد ‏تا ‏به ‏اندازه ‏کافی ‏رشد ‏کند ‏و ‏انتشار ‏ماده ‏ضد ‏میکروبی ‏در ‏ژل ‏انجام ‏شود. ‏سپس، ‏از ‏هر ‏یک ‏از ‏سویه‏های ‏مرجع ‏رقت ‏5/0 ‏مک ‏فارلند ‏تهیه ‏شد. ‏سپس، ‏هر ‏یک ‏از ‏سویه‏های ‏مرجع ‏به ‏شکل ‏جداگانه ‏با ‏سوآپ ‏از ‏پایین ‏به ‏بالا ‏به ‏باکتری ‏آبزی ‏که ‏قبلا ‏به ‏شکل ‏انبوه ‏در ‏نیمه ‏بالای ‏پلیت ‏کشت ‏شده ‏بود، ‏به ‏شکل ‏عمود ‏بر ‏آن ‏متصل ‏شدند، ‏به ‏طوری ‏که ‏باکتری ‏مرجع ‏با ‏باکتری ‏آبزی ‏که ‏پیش ‏از ‏این ‏در ‏نیمه ‏بالای ‏پلیت ‏کشت ‏داده ‏شده ‏بود، ‏اتصال ‏یافت. ‏سپس، ‏پلیت‏های ‏حاوی ‏کشت‏های ‏انجام ‏شده ‏به ‏مدت ‏48 ‏ساعت ‏دیگر ‏داخل ‏گرمخانه ‏در ‏دمای ‏30 ‏درجه ‏سانتی‏‏گراد ‏قرار ‏داده ‏شد ‏(‏محیط ‏کشت ‏مورد ‏استفاده ‏در ‏این ‏مرحله ‏مولر ‏هینتون ‏آگار ‏بود ‏که ‏با ‏آب ‏دریا ‏ساخته ‏شده ‏بود. ‏علت ‏استفاده ‏از ‏آب ‏دریا ‏املاح ‏موجود ‏در ‏آن ‏برای ‏رشد ‏باکتری‏های ‏آبزی ‏بود.) ‏نتایج ‏به ‏شکل ‏عدم ‏رشد ‏سویه‏های ‏مرجع ‏بررسی ‏شد. ‏این ‏روش ‏برای ‏اطمینان ‏3 ‏بار ‏تکرار ‏شد. ‏

انتشار ‏از ‏دیسک: ‏در ‏این ‏روش، ‏در ‏ابتدا ‏از ‏هر ‏یک ‏از ‏4 ‏سویه ‏مرجع ‏رقت ‏5/0 ‏مک ‏فارلند ‏تهیه ‏و ‏روی ‏سطح ‏پلیتی ‏که ‏حاوی ‏محیط ‏کشت ‏مولر ‏هینتون ‏آگار‏[23] ‏(‏مرک ‏آلمان) ‏بود ‏کشت ‏سفره‏ای ‏داده ‏شد. ‏سپس، ‏عصاره ‏خام ‏تهیه ‏شده ‏در ‏مراحل ‏قبلی ‏به ‏میزان ‏100 ‏میلی‏‏گرم ‏در ‏میلی‏‏لیتر ‏دراتیل ‏استات ‏حل ‏شد ‏و ‏مقدار ‏20 ‏لاندا ‏(‏میکرولیتر) ‏از ‏آن ‏به ‏دیسک‏های ‏بلانک ‏استریل ‏اضافه ‏شد. ‏دیسک‏های ‏آغشته ‏به ‏مواد ‏ضد ‏میکروبی ‏روی ‏سطح ‏پلیت‏های ‏یاد ‏شده ‏به ‏مدت ‏10 ‏ساعت ‏در ‏دمای ‏8 ‏درجه ‏سانتی‏‏گراد ‏قرار ‏داده ‏شد ‏تا ‏انتشار ‏ماده ‏ضد ‏میکروبی ‏در ‏ژل ‏انجام ‏شود. ‏سپس، ‏پلیت‏ها ‏در ‏دمای ‏37 ‏درجه ‏سانتی‏‏گراد ‏به ‏مدت ‏24 ‏ساعت ‏قرار ‏داده ‏شد. ‏
در ‏نهایت، ‏قطر ‏هاله ‏اطراف ‏هر ‏دیسک ‏بر ‏حسب ‏میلی‏‏متر ‏سنجیده ‏شد. ‏شایان ‏ذکر ‏است ‏که ‏دیسک ‏بلانک ‏حاوی ‏اتیل ‏استات ‏به ‏عنوان ‏شاهد ‏منفی ‏استفاده ‏شد ‏(‏32). ‏(‏این ‏روش ‏نیز ‏برای ‏اطمینان ‏3 ‏بار ‏تکرار ‏شد). ‏

. ‏شناسایی ‏سویه‏های ‏باکتریایی ‏تولید ‏کننده ‏ماده ‏ضد ‏میکروبی ‏با ‏استفاده ‏از ‏روش ‏مولکولی: ‏پس ‏از ‏استخراج ‏DNA ‏از ‏باکتری‏ها ‏با ‏کیت ‏استخراج ‏DNA ‏شرکت ‏سیناژن‏[24]، ‏با ‏استفاده ‏از ‏پرایمرهای ‏جهانی، ‏ماده ‏ژنتیکی ‏SrRNA ‏16 ‏با ‏کمک ‏روش ‏مولکولی ‏واکنش ‏زنجیری ‏پلیمراز ‏تکثیر ‏شد. ‏در ‏این ‏مرحله، ‏باکتری‏هایی ‏‏که ‏توانایی ‏تولید ‏ماده ‏ضد ‏میکروبی ‏را ‏داشتند ‏با ‏استفاده ‏از ‏روش ‏تعیین ‏توالی16S ‏rDNA ‏PCR ‏شناسایی ‏شدند. ‏توالی ‏پرایمرهای ‏ژن ‏مورد ‏نظر ‏در ‏جدول ‏1 ‏نشان ‏داده ‏شده ‏است. ‏

تهیه ‏مخلوط ‏واکنش ‏زنجیری ‏پلیمراز: ‏برای ‏انجام ‏واکنش ‏زنجیری ‏پلیمراز ‏به ‏ترتیب ‏از ‏ddH₂O ‏به ‏غلظت ‏037/0 ‏میلی‏‏لیتر ‏(‏37 ‏لاندا) ‏بافر ‏واکنش ‏زنجیری ‏پلیمراز ‏به ‏غلظت ‏005/0 ‏میلی‏‏لیتر ‏(‏5 ‏لاندا) ‏کلرید ‏منیزیم ‏و ‏دزوکسی ‏نوکلئوتید ‏تری ‏فسفات ‏و ‏مخلوط ‏پرایمر ‏به ‏میزان ‏برابر ‏001/0 ‏میلی‏‏لیتر ‏(‏1 ‏لاندا) ‏و ‏در ‏نهایت، ‏از ‏DNA ‏الگو ‏و ‏آنزیم ‏مقاوم ‏به ‏حرارت ‏تک ‏پلیمراز ‏به ‏ترتیب ‏به ‏میزان ‏005/0 ‏(‏5 ‏لاندا) ‏و ‏0004/0 ‏ ‏میلی‏‏لیتر ‏(‏4 ‏دهم ‏لاندا) ‏استفاده ‏شد. ‏مجموع ‏غلظت ‏کل ‏مواد ‏واکنش ‏زنجیری ‏پلیمراز ‏05/0 ‏ ‏میلی‏‏لیتر ‏(‏50 ‏لاندا) ‏بود. ‏مواد ‏مورد ‏نظر ‏به ‏دقت ‏و ‏با ‏رعایت ‏شرایط ‏مناسب ‏برای ‏اجتناب ‏از ‏آلودگی ‏در ‏یک ‏میکروتیوپ ‏2/0 ‏میلی‏‏لیتری ‏ریخته ‏شد. ‏

پس ‏از ‏انجام ‏واکنش ‏زنجیری ‏پلیمراز ‏مقدار ‏5 ‏میکرولیتر ‏از ‏محصول ‏واکنش ‏زنجیری ‏پلیمراز ‏روی ‏ژل ‏آگاروز ‏1 ‏درصد ‏به ‏همراه ‏اندازه ‏نشانگر ‏100 ‏تا ‏1000 ‏الکتروفورز ‏و ‏باندهای ‏اختصاصی ‏مشاهده ‏شد. ‏

برای ‏تعیین ‏توالی ‏محصول ‏واکنش ‏زنجیری ‏پلیمراز ‏ژن ‏SrRNA ‏16، ‏45 ‏میکرولیتر ‏از ‏محصول ‏نهایی ‏واکنش ‏زنجیری ‏پلیمراز ‏به ‏همراه ‏پرایمر ‏Forward (جدول 1) ‏برای ‏تعیین ‏توالی ‏برای ‏شناسایی ‏مولکولی ‏براساس ‏ژن ‏SrRNA ‏16 ‏به ‏شرکت ‏ماکروژن ‏کره ‏جنوبی‏[25] ‏ارسال ‏شد. ‏

توالی‏های ‏ارسال ‏شده ‏از ‏شرکت ‏ماکروژن، ‏توسط ‏نرم ‏افزار ‏کرومس‏[26] ‏مشاهده ‏و ‏کیفیت ‏تعیین ‏توالی ‏از ‏روی ‏پیک‏های‏های ‏ترسیمی ‏بررسی ‏شد. ‏با ‏استفاده ‏از ‏نرم ‏افزار ‏بلاست‏[27] ‏در ‏پایگاه ‏اینترنتی ‏بانک ‏اطلاعات ‏ژنی‏[28] ‏توالی‏های ‏همسان ‏مشخص ‏و ‏درصد ‏تشابه ‏آن‏ها ‏بررسی ‏شد. ‏

جدول ‏1- ‏توالی ‏پرایمر ‏مورد ‏استفاده ‏در ‏روش ‏واکنش ‏زنجیره‏ای ‏پلی‏مراز ‏(‏PCR) ‏

نتایج. ‏

سویه‏های ‏جدا ‏شده ‏به ‏اختصار ‏با ‏(‏RS) ‏Ramsar ‏strain ‏نمایش ‏داده ‏شد. ‏شکل ‏1 ‏تصویر ‏ماکروسوپی ‏استرپتومایسس ‏گریزئوس ‏[29] ‏را ‏نمایش ‏می‏دهد. ‏

. ‏یافته‏های ‏به ‏دست ‏آمده ‏به ‏روش ‏کشت ‏متقاطع ‏خطی ‏(‏آنتاگونیسم ‏میکروبی)‏: ‏استرپتومایسس ‏اریترئوس[30] ‏به ‏عنوان ‏شاهد ‏مثبت ‏برای ‏بررسی ‏فعایت ‏ضد ‏میکروبی ‏استفاده ‏و ‏اثر ‏آن ‏روی ‏4 ‏سویه ‏مرجع ‏بررسی ‏شد ‏(‏جدول 2).

یافته‏های به دست آمده در روش دیسک‏گذاری و سنجش هاله ممانعت از رشد: در این روش دیسک حاوی اتیل استات به عنوان شاهد منفی استفاده و اثر سویه های دارای اثر ضد میکروبی با آن مقایسه شد (جدول 3).

شکل ‏2 ‏تصاویر ‏اثر ‏مهاری ‏در ‏روش ‏کشت ‏متقاطع ‏خطی ‏(‏آنتاگونیسم ‏میکروبی) ‏را ‏نمایش ‏می‏دهد. ‏
شکل ‏3 ‏تصویر ‏اثر ‏مهاری ‏در ‏روش ‏کشت ‏دیسک‏گذاری ‏را ‏نمایش ‏می‏دهد. ‏

. ‏شناسایی ‏ژنتیکی ‏سویه‏های ‏دارای ‏اثر ‏ضد ‏میکروبی: ‏سویه‏ها ‏پس ‏از ‏استخراج ‏DNA ‏با ‏روش ‏تعیین ‏توالی
16S ‏rDNA ‏PCR ‏تکثیر ‏و ‏روی ‏ژل ‏آگاروز ‏نمایان ‏شدند ( شکل 4). در نهایت، ‏مشخص ‏شد ‏که ‏4 ‏سویه ‏جدید ‏باکتریایی ‏هستند ‏(‏جدول ‏4). ‏

شکل ‏1- ‏تصویر ‏ماکروسکوپی ‏استرپتومایسس ‏گریزئوس

جدول ‏2- بررسی ‏فعایت ‏ضد ‏میکروبی ‏سویه‏های ‏جداشده ‏به ‏روش ‏کشت ‏متقاطع ‏خطی ‏و ‏اثر ‏آن ‏روی ‏هر ‏4 ‏سویه ‏مرجع

جدول 3- ‏یافته‏های ‏به ‏دست ‏آمده ‏از ‏طریق ‏دیسک‏گذاری ‏و ‏سنجش ‏هاله ‏ممانعت ‏از ‏رشد. ‏(‏دیسک ‏حاوی ‏اتیل ‏استات ‏به ‏عنوان ‏شاهد ‏منفی ‏استفاده ‏شد). ‏(‏(‏-) ‏بدون ‏هاله ‏ممانعت، ‏(‏+) ‏هاله ‏بین ‏صفر ‏تا ‏3 ‏میلی‏‏متر، ‏(‏++) ‏هاله ‏بین ‏3 ‏تا ‏5 ‏میلی‏‏متر، ‏(‏+++) ‏هاله ‏بیشتر ‏از ‏5 ‏میلی‏‏متر) ‏

جدول ‏4- ‏چهار ‏سویه ‏جدید ‏باکتریایی ‏جدا ‏شده ‏و ‏ثبت ‏شده ‏در ‏National ‏Center ‏for ‏Biotechnology ‏Information ‏و ‏درصد ‏همسانی ‏آن‏ها ‏با ‏نزدیکترین ‏سویه

شکل ‏2- ‏تصاویر ‏اثر ‏مهاری ‏در ‏روش ‏کشت ‏متقاطع ‏خطی ‏(‏آنتاگونیسم‏ ‏میکروبی) ‏