پیوندهای مفید
اخبار و اعلانات
آمار
| تعداد نشریات | 43 |
| تعداد شمارهها | 1,682 |
| تعداد مقالات | 13,758 |
| تعداد مشاهده مقاله | 32,156,335 |
| تعداد دریافت فایل اصل مقاله | 12,731,944 |
غربالگری لاکتوباسیل های بومی ایران از نظر تولید اسید لاکتیک و شناسایی سویه های برتر | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| زیست شناسی میکروبی | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مقاله 15، دوره 4، شماره 15، آذر 1394، صفحه 155-166 اصل مقاله (422.62 K) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| نوع مقاله: پژوهشی- فارسی | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| نویسندگان | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| فاطمه سلیمانی فرد1؛ مریم قبادی دانا* 2؛ زهرا پیراوی ونک3 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات، اراک، ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2استادیار ژنتیک مولکولی، پژوهشگاه استاندارد، کرج، تهران، ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 3استادیار صنایع غذایی، پژوهشگاه استاندارد، کرج، تهران، ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| چکیده | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مقدمه: لاکتوباسیل ها دستهای از باکتریهای اسیدلاکتیک هستند که محصول نهایی تخمیر آنها اسیدلاکتیک است. هدف از پژوهش حاضر، انتخاب لاکتوباسیلهای بومی تولید کننده اسیدلاکتیک تک ایزومره است. مواد و روش ها: در پژوهش حاضر، سویههای بومی بر اساس توانایی تولید اسیدلاکتیک غربالگری شد. غربالگری در دو مرحله انجام شد. مرحله اول به روش تیتراسیون و مرحله دوم به روش آنزیماتیک بود. سویههای برتر حاصل از روش تیتراسیون برای انجام آزمون آنزیمی انتخاب شد. در نهایت، سویههای برتر که توانایی تولید اسیدلاکتیک تک ایزومره را داشتند توسط آزمونهای بیوشیمیایی شناسایی شدند. سپس، شناسایی مولکولی سویه با استفاده از تعیین توالی 16S rRNA انجام شد. نتایج: در پژوهش حاضر، توانایی 79 سویه لاکتوباسیل بومی از نظر تولید اسیدلاکتیک بررسی شد. بالاترین میزان تولید 8/34 و پایینترین میزان تولید 4/12 میلیگرم در گرم محاسبه شد. لاکتوباسیلهای برتر از نظر تولید اسیدلاکتیک توانایی تولید یک نوع ایزومر نوری L (+) را داشتند که بالاترین میزان L (+) اسیدلاکتیک برابر با 99/3 و پایینترین میزان برابر با 03/1 میلیگرم در گرم بود. نتایج بیوشیمیایی و مقایسه سویههای برتر با اطلاعات موجود در بانک ژنومی نشان داد که آن سویهها لاکتوباسیلوس پاراکازئی هستند. سپس، توالی 16S rRNA چهار سویه برتر به شماره دسترسیهای KF735654، KF735655، KJ508201 و KJ508202 در بانک ژنومی، مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی ثبت شد. بحث و نتیجه گیری: میزان تولید اسید لاکتیک توسط لاکتوباسیلهای بومی بسیار متفاوت مشاهده شد و مقدار تولید اسید برخی از سویهها نسبت به گزارشهای موجود، تولید بیشتری را نشان داد. لاکتوباسیلهای برتر تنها توانایی تولید ایزومر نوری L (+) اسیدلاکتیک را داشتند. نتایج پژوهش حاضر، استفاده از سویههای برتر لاکتوباسیل برای تولید اسیدلاکتیک خالص را پیشنهاد میکند. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| کلیدواژهها | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| غربالگری؛ لاکتوباسیل؛ اسیدلاکتیک؛ PCR | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| اصل مقاله | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
مقدمه. اسیدلاکتیک یک اسید آلی هیدروکسیلدار با وزن مولکولی 08/90 گرم بر مول و ثابت تفکیک لاکتوباسیلوسها[3] یکی از باکتریهای مهم تولید کننده اسید لاکتیک هستند. در صنعت از لاکتوباسیلها برای مصارف گوناگون استفاده میشود. این باکتریها در محصولات و فرآوردههای غذایی به علت تولید اسیدلاکتیک نقش نگهدارنده را دارند. همچنین، به علت ایجاد طعمهای مختلف، ترکیبات مغذی و بافت مناسب به عنوان استارتر برای انواع مختلفی از پنیر، تخمیر غذاهای گیاهی، تخمیر گوشت، در تولید شراب، آب جو و نان نقش دارند (10). جنس لاکتوباسیلوس گروه بزرگی از خانواده لاکتوباسیلاسه[4] و به سلسله فرمیکوتها[5] متعلق است. این باکتریها دارای بیش از 100 گونه و زیرگونه هستند (10 و 11). کلونیهای لاکتوباسیلوس روی کشت آگار معمولاً کوچک به اندازه 2 تا 5 میلیمتر با حاشیه کامل، محدب، صاف، درخشان یا کدر و بدون پیگمان است. در موارد نادر پیگمانشان مایل به زرد و یا قرمز شده و برخی گونهها نیز فرم کلونیهایشان خشن است (12). شکل میکروسکوپی این باکتریها به شکل میلهای شکل به اشکال متنوع باسیلهای باریک و بلند تا کوکوباسیل کوتاه است. سلولها بیشتر آرایش زنجیرهای داشته و به شکل گرم مثبت، بدون اسپور و بندرت متحرک هستند (1 و 12). این باکتریها بی هوازی اختیاری یا میکروآئروفیل[6] هستند. وجود 5 درصد دیاکسیدکربن در محیط باعث تحریک رشد آنها میشود (12 و 13). دمای بهینه رشد آنها بین 30 تا 40 درجه سلسیوس است. اسیدیته بهینه برای رشد آنها در حدود 5/5 تا 8/5 است اما آنها در اسیدیته کمتر از 5 نیز قادر به رشد هستند (1 و 12). این باکتریها از نظر نحوه تخمیر کربوهیدراتها، به دو گروه تقسیم میشوند: 1- هموفرمانتاتیو[7] (جور تخمیر) که قند را فقط به اسیدلاکتیک تبدیل میکنند.
مواد و روشها. در پژوهش حاضر، از سویههای جداسازی شده توسط دکتر مریم قبادی دانا از فرآوردههای لبنی سنتی استفاده شد که در گروه پژوهشی میکروبیولوژی پژوهشگاه استاندارد نگهداری میشوند. سویهها در محیط ام آر اس آگار[9] به شکل کشت خطی کشت داده شد. پلیتها به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس در شیشه بیهوازی و در شرایط میکروآئروفیل گرمخانهگذاری شد. سپس، ویژگیهای ریختشناسی سویه با رنگآمیزی گرم مشخص شد. برای بررسی تولید اسید سویهها، از محیط کشت اسکیم میلک استفاده شد. این سویهها از نظر تولید اسیدلاکتیک در دو مرحله غربالگری شدند. در مرحله اول، غربالگری به روش تیتراسیون انجام شد و در مرحله دوم، سویههای برتر به روش آنزیماتیک غربالگری شدند. سپس، سویههای برتر تولید کننده ایزومر L (+)اسیدلاکتیک با استفاده از تخمیر قندها شناسایی بیوشیمیایی شدند و در نهایت، شناسایی دقیق گونه این لاکتوباسیلها با استفاده از تعیین توالی 16S rRNA آنها انجام شد. روش تیتراسیون: ابتدا از کلونی خالص در محیط اسکیم میلک پاساژ داده و در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت 48 ساعت گرمخانهگذاری شد. پس از پایان گرمخانهگذاری و بسته شدن محیط، یک گرم از محیط بسته شده به دقت وزن شده و به آن 10 میلیلیتر آب مقطر، 20 میلیلیتر سود 1/0 نرمال اضافه شد. پس از 30 دقیقه، حدود 5/0 میلیلیتر محلول فنل فتالئین 1درصد به عنوان اندیکاتور اضافه شد. سپس، نمونهها با هیدروکلریک اسید[10] 1/0 نرمال تیتر شدند. مقدار اسیدلاکتیک تولید شده توسط هر سویه بر حسب میلیگرم در گرم طبق فرمول محاسبه شد (هر میلیلیتر هیدروکسید سدیم مصرفی در تیتراسیون که به ایجاد رنگ صورتی منجر میشود برابر است با 1/90 میلیگرم اسیدلاکتیک) (14). برای اعتبار بخشی این آزمون از اسیدلاکتیک خالص تهیه شده از شرکت مرک[11] با درجه خلوص90 درص، به عنوان کنترل مثبت تیتراسیون استفاده شد. سپس، از سویههای لاکتوباسیلی که میزان تولید اسیدلاکتیک آنها در رده تولید زیاد قرار داشتند سه تکرار انجام و تکرار پذیری تولید اسید توسط سویهها بررسی شد. روش آنزیمی: در این روش، آنزیم اختصاصی شناسایی بیوشیمیایی سویههای برتر: آزمونهای تأییدی بیوشیمیایی از قبیل ذوب ژلاتین، تولید اندول از تریپتوفان، آزمایش کاتالاز و تخمیر قندها از جمله آرابینوز، سوربیتول، سلوبیوز، ملیبیوز، مانوز، مالتوز، سالیسین، رامنوز، اینوزیتول، گزیلوز، مانیتول، ریبوز، لاکتوز، گالاکتوز، فروکتوز، سوکروز، تره هالوز و گلوکز برای سویههای برتر انجام شد (12). شناسایی مولکولی سویههای برتر: برای شناسایی مولکولی سویههای برتر ابتدا DNA آنها استخراج شد (16). سپس، با استفاده از آغازگرهای طراحی شده برای ابتدا و انتهای 16S rRNA، واکنش زنجیرهای پلیمراز انجام شد (17). توالی آغازگرهای مورد استفاده عبارت بودند از: F:5' GAGTTTGATCCTGGCTCA 3' و برای طراحی درخت فیلوزنتیکی 16S rRNA با استفاده از بانک ژنومی مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی، توالی 16S rRNA مربوط به چندین باکتری لاکتوباسیل که به طور کامل تعیین توالی شدهاند شناسایی و درخت فیلوژنتیکی توسط برنامه MEGA4 و روش UPGMA با bootstrapt 10000 رسم شد.
نتایج. از میان 79 سویه لاکتوباسیل که به روش تیتراسیون غربالگری شدند، 18 سویه از نظر تولید اسیدلاکتیک در دسته تولید زیاد قرار گرفتند. 8 سویه از نظر میزان تولید اسیدلاکتیک، تولید زیاد و از نظر تکرارپذیری، تولید آنها تکرار پذیر بودند که با روش آنزیماتیک میزان تولید L (+) و D (-) اسیدلاکتیک تولیدی آنها بررسی شد. 4 سویه که زیادترین مقدار L (+) خالص به شکل تکرارپذیر تولید کردند، شناسایی بیوشیمیایی و مولکولی شدند که هر 4 سویه، لاکتوباسیلوس پاراکازئی[17] شناسایی شدند. میزان اسیدلاکتیک تولید شده توسط 79 سویه لاکتوباسیل با روش تیتراسیون بر حسب میلیگرم در گرم محاسبه شد. سپس، سویهها بر حسب میزان تولید به 3 دسته کم، متوسط و زیاد در جدول 1 رده بندی شدند. به این ترتیب که 23 درصد سویههایی که بیشترین تولید را داشتند در رده تولید زیاد قرار گرفتند. 62 درصد که بیشترین تعداد بودند در رده متوسط قرار گرفتند. 15 درصد سویهها که کمترین تولید را داشتند در رده تولید کم قرار گرفتند. میانگین کل مقدار تولید اسیدلاکتیک، 62/22 میلیگرم در گرم، بالاترین میزان تولید مربوط به سویه L175 و L89 با مقدار 8/34 و پایینترین میزان، 4/12 میلیگرم در گرم بود. در جدول 2 نتایج میزان تولید اسیدلاکتیک سویههای رده تولید زیاد اسیدلاکتیک بر حسب میلیگرم در گرم نشان داده شده است. همانطور که در جدول 2 مشاهده میشود برخی از سویهها از نظر تولید اسیدلاکتیک، تکرار پذیر بودند. از این سویهها برای انجام مرحله بعد که سنجش میزان L (+) و D (-) اسیدلاکتیک به روش آنزیمی بود، استفاده شد. نتایج میزان L (+) و D (-) اسیدلاکتیک به روش آنزیمی در جدول 3 نشان داده شده است. با توجه به این که تعیین میزان تولید D (-) اسیدلاکتیک سویهها با استفاده از میزان جذب آنها، قبل و پس از اضافه شدن آنزیم D لاکتات دهیدروژناز در طول موج 340 نانومتر و قرار دادن میزان جذب در فرمول مربوطه محاسبه میشد، D (-) اسیدلاکتیک سویهها منفی گزارش شد. همچنین، L (+) اسیدلاکتیک سویهها مثبت گزارش شده است (15). بر اساس این نتایج سویه L175 بیشترین L (+) اسیدلاکتیک با میزان 99/3 میلیگرم در گرم را در مقایسه با بقیه سویهها داشته است. اسیدلاکتیک خالص با درجه خلوص 90 درصد دارای هر دو ایزومر L و D است.
جدول 1- نتایج رده بندی سویه بر اساس میزان تولید اسیدلاکتیک
جدول 2- نتایج حاصل از روش تیتراسیون در سویههای با تولید زیاد
محاسبه غلظت D (-)اسیدلاکتیک:
CD (-) = × AD (-)؛ Csb = × Asb CD (-) = Cs - Csb
CD (-):غلظت D (-) اسیدلاکتیک، بر حسب گرم در 100 گرم نمونه کشت A D (-): اختلاف جذب نمونه میکروبی و نمونه شاهد Csb: غلظت نمونه شاهد Asb: اختلاف جذب نمونه شاهد و شاهد Cs: غلظت نمونه کشت میکروبی : مقدار گرم برداشته از نمونه کشت و نمونه شاهد : 3/6 در طول موج 340 نانومتر (لیتر بر میلیمول بر سانتی متر) سویههایی که ایزومر L (+) اسیدلاکتیک تولید کردند همه میلهای گرم مثبت، بدون اسپور، بدون حرکت، کاتالاز منفی و اندول منفی بوده و قادر به ذوب ژلاتین نبودند. شناسایی سویهها بر اساس تخمیر هجده کربوهیدرات انجام شد که نتایج آن و نتایج رشد در دمای 15 و 42 درجه سلسیوس در جدول 4 ارایه شده است. شناسایی دقیقتر سویههای برتر تولید کننده ایزومر L (+) اسیدلاکتیک به روش مولکولی با تکثیر ژن 16S rRNA سویههای برتر با استفاده از واکنش زنجیرهای پلیمراز انجام شد. ژن 16S rRNA سویههای برتر با شمارههای KF735654، KF735655، KJ508201 و KJ508202 در بانک ژنومی، مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی ثبت شد. هر 4 سویه برتر لاکتوباسیلوس پاراکازئی شناسایی شدند. ترسیم درخت فیلوژنتیکی: بر اساس 16S rRNA، ارتباط فیلوژنتیکی سویههای برتر با شمارههای KJ508201 (L25)، KJ508202 (L132)، KF735654 (L175) و KF735655 (L67) با هم و با دیگر سویههای لاکتوباسیل موجود در بانک ژنومی مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی، بررسی و تعیین شد. فهرست سویههای لاکتوباسیل موجود در درخت فیلوژنی به ترتیب شکل 1 آمده است.
جدول 3- نتایج حاصل از روش آنزیمی در سویههای با تولید زیاد و تکرارپذیر
جدول 4 - نتایج تخمیر کربوهیدراتها ی سویههای برتر
1) >gi|635200826|gb|KJ508201. 1| Lactobacillus paracasei strain L25 2) >gi|1843427|dbj|D86517. 1| Lactobacillus casei 3) >gi|635200827|gb|KJ508202. 1| Lactobacillus paracasei strain 132 4) >gi|574960707|gb|KF735654. 1| Lactobacillus paracasei strain 175 5) >gi|574960708|gb|KF735655. 1| Lactobacillus paracasei strain 67 6) >gi|191636824:c1991488-1989908 Lactobacillus casei BL23 7) >gi|1843426|dbj|D86516. 1| Lactobacillus zeae 8) >gi|385826720:c2565329-2563756 Lactobacillus rhamnosus GG 9) >gi|175005|gb|M58829. 1|LBARR16SAA Lactobacillus sake 10) >gi|501145339:c1879865-1878295 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum P-8 11) >gi|22027048|dbj|E10216. 1| Lactobacillus brevis L63 12) >gi|283483492|emb|FN185731. 1| Lactobacillus paucivorans type strain TMW 1. 1424T 13) >gi|175006|gb|M58830. 1|LBARR16SAB Lactobacillus sanfrancisco 14) >gi|501673812:627796-629363 Lactobacillus fermentum F-6 15) >gi|184152655:c1414412-1412879 Lactobacillus reuteri JCM 1112 16) >gi|388037|gb|L23507. 1|LBARGDAAAA Lactobacillus reuteri 17) >gi|385824947:c1872967-1871317 Lactobacillus johnsonii DPC 6026 18) >gi|560151351:c1580334-1578755 Lactobacillus johnsonii N6. 2 19) >gi|385816611:c1594383-1592809 Lactobacillus amylovorus GRL1118 20) >gi|175029|gb|M58823. 1|LBARR16SU Lactobacillus lactis شکل 1- تصویر درخت فیلوژنتیکی بر مبنای 16S rRNA بین سویههای برتر با شمارههای KJ508201 (L25)، KJ508202 (L132)، KF735654 (L175) و KF735655 (L67) با دیگر سویههای لاکتوباسیل موجود در پایگاه اطلاعاتی مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی
بحث و نتیجه گیری. اسیدلاکتیک در صنایع غذایی، شیمیایی، نساجی و پزشکی کاربردهای زیادی دارد. برای نمونه، در صنایع غذایی از اسیدلاکتیک به عنوان عوامل اسیدی کننده، طعم دهنده و نگهدارنده استفاده میشود (4 و 19). از اسیدلاکتیک در صنایع پزشکی برای تهیه پلاستیکهای زیست تجزیهپذیر از جمله پلی لاکتیک اسیدها[xviii] و کوپلیمرهایپلی لاکتیکاسید استفاده میشود که در موارد بالینی و ساخت ابزارآلات پزشکی نظیر نخ بخیه کاربرد دارند. ایزومرهای خالص L (+) و D (-) اسیدلاکتیک ارزش بیشتری نسبت به فرم راسمیک DL داشته زیرا هر ایزومر کاربرد صنعتی ویژه خود را دارند (7). در فرآیند تولید اسیدلاکتیک، گزارشهای متعددی درباره باکتریهای تولید کننده اسیدلاکتیک از جمله لاکتوباسیلها وجود دارد. در صنایع تخمیری از سویههای میکروبی هموفرمانتاتیو (جور تخمیر) برای تولید اسیدلاکتیک استفاده شده که با ساز و کار بالایی توانایی تولید L (+) اسید لاکتیک خالص را دارند(3). بنابراین، انتخاب و شناسایی سویههایی که ایزومر L (+) اسیدلاکتیک را به شکل خالص تولید میکنند از نظر اقتصادی مهم است. برای انتخاب سویههای برتر باید از روشهای اندازهگیری میزان اسیدلاکتیک تولید شده توسط سویهها استفاده شود. روشهای زیادی برای این منظور وجود دارد که میتوان به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا[xix]، کروماتوگرافی گازی[xx]، کلریمتری[xxi]، کیت آنزیمی و تیتراسیون اشاره کرد (20). ایشولا و تیو[xxii] در سال 2012 میزان اسیدلاکتیک تولید شده توسط سویههای لاکتوباسیل را با روش تیتراسیون بررسی کردند (21). ترونتل[xxiii] و همکارانش در سال 2011 میزان ایزومرهای L و D اسیدلاکتیک را به روش آنزیمی بررسی کردند (22). پانسار[xxiv] و همکارانش در سال 2010 میزان اسیدلاکتیک تولید شده را به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا بررسی کردند (23). در این پژوهش، به علت زیاد بودن تعداد سویههای مورد غربالگری و هزینه زیاد روشهای کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا و کروماتوگرافی گازی از روش کم هزینه تیتراسیون و برای افزایش دقت از روش آنزیمی به عنوان مکمل روش تیتراسیون استفاده شد. در پژوهش حاضر، توانایی لاکتوباسیلها در تولید اسید لاکتیک بسیار متفاوت مشاهده شد. به این شکل که میانگین کل تیتراسیون سویهها، 62/22 میلیگرم در گرم محاسبه شد و پایینترین میزان تولید در حدود 4/12 و بالاترین میزان 8/34 میلیگرم در گرم بود. پانسار و همکارانش در سال 2010 در کشور ایرلند میزان اسیدلاکتیک تولید شده در سویه لاکتوباسیلوس کازئی[xxv] را به میزان 48/33 میلیگرم بر گرم گزارش کردند (23). ودنر[xxvi] و همکارانش در سال 2009 در کشور رومانی میزان اسیدلاکتیک تولید شده در سویه لاکتوباسیلوس پاراکازئی 168[xxvii] را به میزان 97/45 میلیگرم بر گرم گزارش کردند (24). میردامادی[xxviii] و همکارانش میزان اسیدلاکتیک سویههای لاکتوباسیلوس کازئی و لاکتوباسیلوس رامنوسوس[xxix] را به ترتیب 87/59 و 96/58 میلیگرم بر گرم گزارش کردند (25). ایشولا و تیو در سال 2012 در کشور نیجریه میزان اسیدلاکتیک سویه لاکتوباسیلوس پلانتاروم[xxx] LPF2به میزان 96/1 میلیگرم بر گرم و سویه لاکتوباسیلوس فرمنتوم[xxxi] LFN7 به میزان 91/1 میلیگرم بر گرم را گزارش کردند (21). میزان تولید اسیدلاکتیک در سویههای مورد بررسی نسبت به مقدار اسیدلاکتیک تولید شده سویه لاکتوباسیلوس کازئی در مطالعه پانسار و همکارانش بیشتر است اما نسبت به مقدار اسیدلاکتیک تولید شده سویه لاکتوباسیلوس پاراکازئی، در مطالعه ودنر و همکارانش کمتر است. در این پژوهش، در مرحله دوم غربالگری نتایج حاصل از روش آنزیمی نشان داد که هیچ کدام از سویهها ی برتر توانایی تولید ایزومر D (-) اسیدلاکتیک را نداشتند. اما 4 سویه برتر ایزومر L (+) اسیدلاکتیک را تولید کردند. پس از بررسی با روش آنزیمی، پایینترین میزان L (+) اسیدلاکتیک مربوط به سویه L25 با میزان 03/1 میلیگرم در گرم و بالاترین مربوط به سویه L175 با میزان 99/3 میلیگرم در گرم بود. ترونتل و همکارانش در سال 2011 در کشور کرواتی میزان ایزومرهای L و D اسیدلاکتیک لاکتوباسیلوس آمیلووروس[xxxii] (DSM 20531) را به ترتیب به میزان 008/0±563/0و 017/0±437/0 میلیگرم بر گرم گزارش کردند (22). پانسار و همکارانش در سال 2010 در کشور ایرلند تولید L (+) اسیدلاکتیک توسط لاکتوباسیلوس کازئی را 73/33 میلیگرم بر گرم گزارش کردند (23). مون[xxxiii] و همکارانش در سال 2012 در کشور کره، L (+) اسیدلاکتیک لاکتوباسیلوس پاراکازئی زیرگونه پاراکازئی را به میزان 6/91 میلیگرم بر گرم گزارش کردند (26). میردامادی و همکارانش در سال 1386، میزان L (+) اسیدلاکتیک دو سویه، لاکتوباسیلوس کازئی PTCC1608 و لاکتوباسیلوس رامنوسوس PTCC1637 به ترتیب 95 و 40/81 میلیگرم بر گرم گزارش کردند (25). سرمست قفهرخی[xxxiv] و همکارانش در سال 1391، L (+) اسیدلاکتیک لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس را 8/6 میلیگرم بر گرم گزارش کردند (27). میزان تولید L (+) اسیدلاکتیک در سویههای لاکتوباسیل مورد بررسی نسبت به مقدار L (+) اسیدلاکتیک تولید شده توسط سویه لاکتوباسیلوس آمیلووروس، ترونتل و همکارانش بیشتر است اما نسبت به مقدار L (+) اسیدلاکتیک تولید شده توسط سویه لاکتوباسیلوس پاراکازئی زیرگونه پاراکازئی، در مطالعه مون و همکارانش و سویه لاکتوباسیلوس کازئی، در مطالعه پانسار و همکارانش کمتر است. در پژوهش حاضر، نتایج تخمیر کربوهیدراتها در سویههای برتر نشان داد که سویههای لاکتوباسیل، هموفرمانتاتیو هستند. با مقایسه نتایج شناسایی بیوشیمیایی این سویهها با جدول تخمیر قندها در کتاب برجی، نشان داده شد که نتایج تخمیر قندها اندکی متفاوت با نتایج گزارش شده در کتاب برجی است. برای مثال، لاکتوباسیلوس پاراکازئی توانایی تخمیر قندهای سلوبیوز، مانیتول، سوربیتول و ریبوز را نداشت در حالی که 4 سویه برتر قادر به تخمیر این قندها هستند و این سویهها شبیه به لاکتوباسیلهای دیگر در کتاب برجی[xxxv] بودند. همچنین، لاکتوباسیلوس پاراکازئی بر اساس تولید گاز از گلوکز جزو هتروفرمانتاتیوهای اختیاری است. در حالی که این 4 سویه لاکتوباسیل طی شرایط آزمایش، ویژگی هموفرمانتاتیو را بروز دادند که با اختیاری بودن هتروفرمانتاتیو پاراکازئی قابل توجیه است. تانوک[xxxvi] در سال 1999 بیان کرد که شناسایی لاکتوباسیلهای جدا شده توسط روشهای فنوتیپی مشکل بوده و تعیین خواص این باکتریها فراتر از آزمونهای تخمیری است (28). بنابراین، میتوان این گونه نتیجه گرفت که روشهای بیوشیمیایی دارای معایبی است. از آن جمله این معایب میتوان به وقتگیر بودن آزمونهای بیوشیمیایی، عدم تمیز کامل بین سوشهای مختلف یک گونه، قابلیت تکرارپذیری پایین و قدرت فرق گذاشتن کم بین سویهها اشاره کرد. در منابع توصیه شده که از روشهای ژنتیکی همراه با آزمونهای فنوتیپی برای تایید تشخیص سویههای جدا شده استفاده شود (13). به تازگی ژنهای r RNAبه عنوان روشی قوی برای تشخیص و تحلیل فیلوژنی لاکتوباسیلوسها پذیرفته شدهاند که در این روش با استفاده از پرایمرهای طراحی شده ژنهای 16S rDNA یا 23S rDNA برای تعیین و تشخیص گونههای لاکتوباسیلوسها از واکنش زنجیرهای پلیمراز استفاده میشود (29). بنابراین، شناسایی مولکولی و شباهت توالی 16S rRNA باکتریها نقش تعیین کنندهای دارد. پس از تعیین توالی 16S rRNA و مقایسه توالی آن با توالی 16S rRNA دیگر لاکتوباسیلهای گزارش شده در بانک ژنی، نشان داده شد که این سویهها از نظر مولکولی لاکتوباسیلوس پاراکازئی شناسایی شدند. همچنین، بر اساس درخت فیلوژنتیکی 4 سویه برتر با شمارههای KF735654، KF735655، KJ508201 و KJ508202 با هم شباهت زیادی داشتند و 16S rRNA سویه لاکتوباسیلوس کازئی (gi 1843427) موجود در بانک ژنومی مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی شباهت زیادی به لاکتوباسیلوس پاراکازئی (KJ508201) داشت. با توجه به اینکه سویه L175 از لرستان، سویه L67 از کردستان، سویه L132 از ایلام و سویه L25 از کرمانشاه نمونهبرداری شده بودند، از نظر تولید اسیدلاکتیک نسبت به بقیه سویهها برتری داشتند و فنوتیپ یکسانی را از این نظر نشان میدادند که همگی لاکتوباسیلوس پاراکازئی بودند. در پایان پیشنهاد میشود سویههای تولید کننده اسیدلاکتیک به شکل تک ایزومره L (+) پس از بهینهسازی تولید به صنایع معرفی شوند.
تشکر و قدردانی از کارکنان پژوهشکده صنایع غذایی کشاورزی پژوهشگاه استاندارد که در پژوهش حاضر نگارندگان را یاری دادند، تشکر وقدردانی میشود. [1]- 2-hydroxypropionic acid [2]- Scheele [3]- Lactobacillus [4]- Lactobacillace [5]- Firmicutes [6]- Microaerophile [7]- Homofermentative [8]- Heterofermentative [9]- MRS agar [10]- HCl [11]- Merck [12]- Nicotinamide adenine dinuclotide hydrogen [13]- Denatyring [14]- Annealing [15]- Elongation [16]- National Center for Biotechnology Information (NCBI) [17]- Lactobacillus paracasei [xviii]- Polylactic acid (PLA) [xix]- High-performance liquid chromatography (HPLC) [xx]- Gas chromatography (GC) [xxi]- Colorimetric [xxii]- Ishola and Tayo [xxiii] - Trontel [xxiv]- Pansar [xxv] -Lactobacillus casei [xxvi] -Vodnar [xxvii] - Lactobacillus paracasei 168 [xxviii] -Mirdamadi [xxix]- Lactobacillus ramnosus [xxx] -Lactobacillus plantarum LPF2 [xxxi] -Lactobacillus fermentum LFN7 [xxxii] - Lactobacillus amilovorus [xxxiii] - Moon [xxxiv] - Sarmast Ghahfarokhi [xxxv] - Bergey 's [xxxvi] - Tannock | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| مراجع | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
(1) Gunduz M. Latic acid production by Lactobacillus casei NRRL B-441 immobilized in chitosan stabilized Ca-Alginate beads. Izmir, Turkey: Institute of Technology; 2005. (2) John RP., Anisha GS., Nampoothiri KM., Pandey A. Direct Lactic acid fermentation: Focus on simultaneous saccharification and lactic acid production. Biotechnology Advances 2008; 27: 145- 52. (3) Rashid R. Optimization and Modeling of lactic acid production from pineapple waste. Malaysia: University Technology; 2008. (4) Wee YJ., Kim JN., Ryu HW. Biotechnological production of lactic acid and its recent application. Food Technology Biotechnology 2006; 44 (2): 163- 72. (5) Reddy G., Altaf MD., Naveena BJ., Venkateshwar M., Kumar EV. Amylolytic bacteria lactic acid fermentation-A review. Biotechnology Advances 2007; 26: 22- 34. (6) Buyukkileci AO. L (+) Lactic acid production from whey by Lactobacillus casei NRRL B-441. Turkey: Izmir Institute of Technology; 2000. (7) Abdel-Rahman MA., Tashiro Y., Sonomoto K. Lactic acid production from Lignocellulose-derived sugars using lactic acid bacteria: Overview and limits. Journal of Biotechnology 2011; 156: 286- 301. (8) Kadam SR., Patil SS., Bastawde KB., Khire JM., Gokhale DV. Strain improvement of Lactobacillus delbrueckii NCIM 2365 for lactic acid production. Process Biochemistry 2006; 41: 120- 26 (9) Hetenyi K., Nemeth A., Sevella B. Role of pH-regulation in lactic acid fermentation: Second steps in a process improvement. Chemical Engineering and processing 2011; 50: 293- 9. (10) Giraffa G., Chanishvili N., Widyastuti Y. Improtance of Lactobacilli in food and feed biotechnology. Research in Microbiology 2010; 161: 480- 7. (11) Canchaya C., Claesson MJ., Fitzgerald GF., Sinderen DV., Otoole PW. Diversity of the genus Lactobacillus revealed by comparative genomics of five species. Departement of Microbiology and Alimentary Pharmabiotic center 2006; 152: 3185- 96. (12) Hammes WP., Hertel CH. Genus Lactobacillus. In: Whitman WB., Vos pD., Garrity GM., Jones D., Krieg NR., Ludwig W., et al.editors. Bergey s manual of systematic Bacteriology. 2nd ed. New York: University of Georgia; 2009: 465- 511. (13) Singh S., Goswami P., Singh R., Heller KJ. Application of molecular identification tools for Lactobacillus, with a focus on discrimination between closely related species: A review. LWT-Food Science and Technology 2009; 42: 448- 57. (14) The United States Pharmacopeial convention. The national formulary. Washington: Board of trustees; 2000. (15) International Standard No. 9232- Yogurt-Identification of characteristic microorganisms Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus and Sterptococcus thermophilus 2003. (16) International Standard No. 21571- Foodstuffs-Method of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products nucleic acid extraction 2005. (17) Ghobadi Dana M. Isolation and molecular identification of naturally occurring Lactobacilli from some Iranian local yoghurt and analysis of their properties by proteomics [Dissertation]. Tehran: National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology; 2010. (18) Ghobadi Dana M., Yakhchali B., Salmanian AH., Rastgarjazi Jazii F. High level acetaldehyde production by an indigenous Lactobacillus strain obtained from traditional dairy products of Iran. African Journal of Microbiology Research 2011; 5 (25): 4398- 405. (19) Michelson T., Kask K., Jogi E., Talpsep E., Suitso I., Nurk A. L (+) -Lactic acid producer Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043 and its comparison with Lactobacillus delbrueckii ssp. Lactis DSM 20073. Enzyme and Microbial Technology 2006; 39: 861-7. (20) Sanchez-Machado DI., Lopez-Cervantes J., Martinez-Cruz O. Quantification of organic acids in fermented shrimp waste by HPLC. Food Technology and Biotechnology 2008; 46 (4): 456- 60. (21) Ishola RO., Tayo BC. Screening of lactic acid bacteria isolated from fermented food for Bio-molecules production. Technical Report 2012; 15 (4): 205- 17. (22) Trontel A., Batusic A., Gusic I., Slavica A., Santek B., Novak S. Production of D-and L-Lactic acid by mono-and mired cultures of Lactobacillus sp. Food Technology and Biotechnology 2011; 49 (1): 75- 82. (23) Panesar P., Kennedy J., Knill CJ., Kosseva M. Production of L (+) Lactic acid using Lactobacillus casei from whey. Brazilian Archives of Biology and Technology 2010; 53 (1): 219- 26. (24) Vodnar DC., Venus J., Schneider R., Socaciu c. Lactic acid production by Lactobacillus paracasei 163 in discontinuous fermentation using lucerne green juice as nutrient substitute. Chemistry of Engineering and Technology 2010; 33 (3): 468- 74. (25) Mirdamadi S., Rajabi A., Aziz Mohseni F., Moomem B. Lactic acid production by Lactobacillus various strains. Iranian Journal of Nutrition Sciences and Food Technology 2007; 2 (3): 57- 64. (26) Moon SK., Wee YJ., Choi GW. A novel lactic acid bacterium for the production of high purity L-Lactic acid, Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei CHB2121. Journal of Bioscience and Bioengineering 2012; 114 (2): 155- 9. (27) Sarmast Ghahfarokhi E., Mobini Dehkordi M., Beheshtimaal K. Isolation and evalution of lactic acid production content in native Lactobacillus of Chaharmahal va Bakhtiari province isolated from dairy products. Biological Journal of Microorganism 2012; 1 (3): 41- 52. (28) Jayalalitha V., Balasundaram B., Dhanalakshmi B. Molecular identification of Lactobacilli in milk. National Seminar on Current Perspectives in Biological Siences 2013; 12 (7): 56- 8. (29) Kwon HS., Yang EH., Yeon SW., Kang BH., Kim TY. Rapid identification of probiotic Lactobacillus species by multiplex PCR using species-specific primers based on the region extending from 16S rRNA through 23S rRNA. FEMS Microbiology Letters 2004; 239: 267- 75. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
آمار تعداد مشاهده مقاله: 5,130 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 1,490 |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||