سازگارسازی قارچ تریکودرما به آفت ‏کش کنفیدور و ارزیابی توان رویشی آن در محیط‏ های حاوی سم

مقدمه.

توسعه کشاورزی و تنوع آفات گیاهی سبب افزایش روزافزون استفاده از سموم آفت‏کش شده است. این سموم در غلظت‏های قابل توجه از طریق پساب‏های صنعتی و زهکش‏های کشاورزی وارد محیط زیست می‏‏شوند. آلودگی منابع آب و خاک از تبعات اجتناب‏ناپذیر ورود این آلاینده‏ها به محیط است (1).

ایمیداکلروپید[1] با فرمول مولکولی

. 1-(6-chloro-3-pyridylmethyl)-N-nitro-imidazolidin-2-ylideneamine.

و نام تجاری کنفیدور[2] به خانواده نئونیکوتینوئیدها[3] متعلق است. نئونیکوتینوئیدهاگروه جدیدی از آفت‏کش‏ها هستند که از نیکوتین مشتق شده‏اند و به علت خواص فیزیکی- شیمیایی خاص خود کاربردهای فراوانی در بخش کشاورزی دارند (2 و 3). این سم در سال 1991 وارد بازار شده و از آن زمان تاکنون در 120 کشور دنیا و برای محافظت از 140 نوع محصول کشاورزی از آفات استفاده شده است (4). بر اساس‏ گزارش آژانس حفاظت از محیط زیست ایالات متحده^[4]، ایمیداکلروپید پتانسیل زیادی برای ورود به بدنه آب‏های زیرزمینی دارد (5). همچنین، این ماده با توجه به انحلال‏پذیری و سیالیت بالا، قادر به آلوده کردن آب‏های سطحی نیز می‏باشد (6).

پژوهشگران زیادی به بررسی تحرک این سم در خاک پرداخته‏اند. ولنر و کلوتز[5] نشان دادند تحرک ایمیداکلروپید در خاک از 11 نوع سم مورد مطالعه دیگر بیشتر است (7). همچنین، پژوهشی در یک مزرعه مجهز به سیستم آبیاری قطره‏ای نشان داد سم کنفیدور می‏تواند در مدت 7 روز به اندازه 105 سانتی‏متر در خاک نفوذ کند در نتیجه در مزارعی که به شکل روزانه آبیاری می‏شوند امکان تحرک این سم و ورود آن به بدنه آب‏های سطحی و زیرزمینی بسیار بالاست (8).

زیست‏پالایی از جمله روش‏هایی است که در سال‏های اخیر برای حذف آلاینده‏ها مورد توجه قرار گرفته است. استفاده از انواع میکروارگانیسم‌‏ها از جمله جلبک‏ها، قارچ‏ها و باکتری‏ها در این زمینه اهمیت بسیاری دارد (9). علت استقبال روزافزون از این روش برای کاهش و یا حذف آلاینده‏ها، هزینه‏های کم، سازگار بودن با محیط‏زیست و بازدهی زیاد آن است. در روش‏های زیست‏پالایی انتخاب زیست توده به علت فراوانی در محیط و کم بودن هزینه‏ها اهمیت زیادی دارد (10). تاکنون در مطالعات زیست پالایی به استفاده از قارچ‏ها کمتر از باکتری‏ها توجه شده است هرچند که سازوکار حذف و کاهش آلودگی در هر دو میکرواورگانیسم کمابیش مشابه است (11).

گونه‏های مختلف قارچ تریکودرما[6] کمابیش در همه خاک‏ها و زیستگاه‏ها حضور دارند و از متداول‏ترین قارچ‏های قابل کشت و تکثیر هستند (12). این قارچ به علت توانایی تولید آنتی‏بیوتیک، به‏عنوان کنترل کننده زیستی بسیاری از بیماری‏ها و آفات گیاهی شناخته شده‏است (13). همچنین، این قارچ قابلیت جذب زیستی برخی آلاینده‏ها را دارد (12). اگر آلاینده‏های موجود در طبیعت حاوی ترکیبات مورد نیاز میکروارگانیسم‏ها باشند این مواد به مصرف میکروارگانیسم‏ها رسیده و به تدریج از بدنه محیط زیست حذف خواهند شد. هاگ‏زایی تریکودرما به‏شدت تحت تأثیر کربن و نیتروژن است (14). مطالعات نشان می‏دهد که میکروارگانیسم‏هایی همچون باکتری‏ها و قارچ‏ها می‏توانند آلاینده‏های آلی را به عنوان منبع کربن و انرژی تجزیه کرده و آن‏ها را به مواد مفید و مورد نیاز سایر میکروارگانیسم تبدیل کنند (15 و 16). پژوهش‏های متعددی به بررسی امکان رشد و نمو در نتیجه قابلیت زیست پالایش میکروارگانیسم‏ها در حضور آلاینده‏ها پرداخته‏اند. برای نمونه در پژوهشی در برزیل پتانسیل حذف سم د.د.ت. در حضور 7 نوع قارچ مختلف بررسی شد. نتایج نشان داد قارچ تریکودرما قادر است در محیطی با غلظت حداکثر 15 میلی‏گرم از سم یاد شده رشد و نمو کند و پس از 14 روز، درصد حذف این سم به 58 درصد رسید (11). در مطالعه‏ای دیگر به سازگار کردن 4 جدایه قارچی تریکودرما درحضور نفت خام اقدام شد. نتایج نشان داد قطر پرگنه قارچ‏های یاد شده پس از گذشت 24 ساعت به طور میانگین به میزان 5 سانتی‏متر رشد داشته است (17). در استرالیا به تجزیه میکروبی آفت‏کش‏های ارگانوفسفره اتیون، توسط گونه‏های سودوموناس[7] و آزوسپریلوم[8] پرداخته شد. نتایج، تجزیه سریع اتیون در حضور توده زیستی یاد شده را نشان داد (18). نتایج پژوهش دیگری با عنوان تجزیه زیستی آفت‏کش ارگانوفسفره دیازینون توسط گونه‏های سراتیا[9] و سودوموناس، همبستگی شدید بین فعالیت و رشد میکروبی و فرآیندهای شیمیایی طی تجزیه دیازینون را نشان داد (19). در پژوهش دیگری تجزیه زیستی کلرپیریفوس توسط گونه سنتینل[10] مطالعه شد و کاهش چشم‏گیر غلظت این آلاینده توسط توده زیستی یاد شده گزارش ‏شد (20). بریسنو[11] و همکاران در پژوهشی تأثیر 90 درصدی استفاده از گونه‏های مختلف اکتینون باکتری[12] را در حذف کلرپیریفوس اعلام کردند. راندمان حذف کلرپیریفوس با استفاده از باسلیوس پامیلوس[13]پس از 45 روز به 97 درصد رسید (21).

هدف از پژوهش حاضر، بررسی اثر سم کنفیدور به‏عنوان یک آلاینده محیط زیست بر توان رویش قارچ تریکودرما به عنوان یک میکروارگانیسم جاذب آلاینده از محیط است. اگر امکان رشد این قارچ در حضور آفت‏کش یاد شده تأیید شود می‏توان این قارچ را به‏عنوان عاملی زیستیی برای حذف سم کنفیدور از محیط زیست معرفی کرد.

‏‏مواد و روش‏ها.

تکثیر قارچ در آزمایشگاه: 5 گونه قارچی تریکودرما به نام‏های هارزیانوم[14]، اسپرلوم[15]، تومنتوزوم[16]، بوریکوم پکتوم[17] و کونینگی[18] از دانشکده کشاورزی دانشگاه بوعلی سینا تهیه شد. نمونه‏های قارچ مورد مطالعه برای استفاده در محیط آزمایشگاهی، به محیط کشت استریل جامد سیب‏زمینی- دکستروز[19](مرک[20]، آلمان)انتقالداده شد. محیط کشت طبق توصیه شرکت سازنده، آماده‏سازی، سترون و در پلیت‏های سترون توزیع شد. محیط‏های آماده شده به‏منظور کسب اطمینان از عدم آلودگی به مدت 24 ساعت در آزمایشگاه نگهداری ‏شد. سپس، کشت قارچ‏های مورد نظر در محیط‏های یاد شده، انجام شد. پس از این که قارچ‏ها به حد مطلوبی از رشد رسیدند، نمونه‏ها به یخچال منتقل و در دمای 4 درجه سانتی‏گراد نگهداری شد. این قارچ‏ها تا 3 ماه برای انتقال به محیط‌‏های کشت جدید مناسب هستند (22).

سترون‏سازی سم: با توجه به این نکته که اتوکلاو کردن سم می‏تواند سبب تغییر ساختار شیمیایی آن شود، در این مرحله با عبور دادن سم از میکرو صافی‏های سلولزی به قطر 2/0 میکرون، سترون کردن سم‏ انجام شد.

سازگار کردن گونه‏های قارچی با سم کنفیدور: در هر پلیت، حدود 20 سی‏سی محیط کشت سیب‏زمینی- دکستروزسترون مذاب ریخته و با استفاده از سمپلر، مقادیر محاسبه شده از سم سترون شده به پلیت‏ها افزوده شد و قبل از انجماد محیط‏های کشت، با آن مخلوط ‏شد تا محیط‏های کشت با غلظت‏های 5، 10 و20 میلی‏گرم بر لیتر سم کنفیدور تهیه شود. پس از گذشت 24 ساعت و اطمینان از عدم آلودگی محیط‏های کشت، گونه‏های قارچی موجود، در پلیت‏های حاوی 5 میلی‏گرم در لیتر سم کنفیدور تلقیح و در دمای 25 درجه سانتی‏گراد، گرماگذاری شدند. پس از رشد کامل قارچ‏ها در پلیت، قارچ‏ها به محیط حاوی 10 میلی‏گرم در لیتر و از آنجا به محیط 20 میلی‏گرم در لیتر سم کنفیدور انتقال داده شدند. به این ترتیب از وارد شدن شوک آلودگی به جدایه‏های قارچی ممانعت ‏شد و آن‏ها با غلظت‏های مختلف آلودگی سازگار شدند (23).

.بررسی میزان رشد گونه‏های قارچی مورد مطالعه در غلظت‏های مختلف سم کنفیدور: با کمک قالب‏های استریل، مقادیر مساوی (3 میلی‏متر) از جدایه‏های سازگار شده هر یک از گونه‏های قارچی مورد مطالعه، از قسمت اطراف پرگنه که دارای بیش‏ترین مقدار رشد بود برداشت شد و در محیط‏های کشت حاوی غلظت‏های مختلف سم کنفیدور (صفر، 5، 10 و 20 میلی‏گرم بر لیتر) در سه تکرار تلقیح و در دمای 25 درجه سانتی‏گراد، گرماگذاری ‏شدند. پلیت‏های شاهد (حاوی قارچ و فاقد سم کنفیدور) نیز با سه تکرار همزمان و در شرایط مشابه گرماگذاری شدند. در نهایت، میزان رشد قطری جدایه‏های قارچی در هر یک از پلیت‏ها پس از گذشت 24 ساعت بررسی و با نمونه شاهد مقایسه شد (23).

تجزیه و تحلیل آماری: برای تجزیه و تحلیل آماری داده‏های جمع‏آوری شده از نرم‏افزار SPSS، نسخه 16 استفاده ‏شد. برای بررسی توزیع و آزمون نرمال بودن داده‏ها، از آزمون کولموگروف– اسمیرنوف[21] در سطح اطمینان 95 درصد استفاده شد (24).

نتایج.

.نتایج میزان رشد 5 گونه‏ قارچ تریکودرما در محیط‏های کشت محتوی سم: نتایج حاصل از میزان رشد و تشکیل کلونی برای 5 گونه مختلف قارچ تریکودرما در شکل 1 ارایه شده اند.

نتایج اندازه‏گیری میزان رشد پرگنه جدایه قارچی هارزیانوم پس از گذشت 24 ساعت از کشت نشان داد اگرچه قارچ یاد شده در محیط فاقد سم دارای رشد است، اما میزان رشد قطر پرگنه قارچ در محیط حاوی 5 میلی‏گرم بر لیتر سم در مقایسه با محیط شاهد به مقدار 13/74 درصد افزایش یافته است. این روند افزایش قطر با افزایش غلظت سم در محیط کشت ادامه یافته و میزان رشد پرگنه قارچ در غلظت 20 میلی‏گرم در لیتر سم، نسبت به محیط کشت شاهد به میزان 95/86 درصد بهبود یافت (شکل 1).

با توجه به نتایج حاصل از میزان رشد گونه قارچی کونینگی در حضور غلظت‏های مختلف سم کنفیدور می‏توان نتیجه گرفت گونه قارچی یاد شده در غلظت 5 میلی‏گرم بر لیتر از سم به مقدار 13/74 درصد افزایش رشد داشته است و میانگین رشد قطر پرگنه این قارچ در محیط کشت حاوی 20 میلی‏گرم در لیتر سم در مقایسه با محیط کشت شاهد، افزایش 54/86 درصدی دارد (شکل 1).

شکل 1- میانگین درصد رشد قطر پرگنه 5 گونه قارچ تریکودرما پس از گذشت 24 ساعت از  تلقیح با غلظت‏های مختلف سم کنفیدور