جداسازی پروتئین لایه سطحی کالوباکتر و کریستالیزاسیون آن به روی سطوح صاف

مقدمه

لایه S ساختارهای متخلخل متصل به دیواره سلولی یا غشا خارجی باکتری‏هاست که از یک گونه پروتئین یا گلیکوپروتئین ساخته شده‏است. آن‏ها توانایی مجمتع شدن به شکل شبکه‏های بسته در تمامی مراحل رشد و تقسیم سلولی را دارا بوده و ساده‏ترین ‏‏نوع غشای زیستی که در روند تکامل زیستی شکل گرفته را نمایندگی می‏کند. زیرواحدهای لایه S که از تعداد وسیعی از ارگانیسم‏های پروکاریوت جداسازی شده‏است پس از جداسازی توانایی ذاتی برای مجتمع شدن به شکل آرایه‏های تک مولکولی در سوسپانسیون، در سطح مشترک هوا- مایع، بر فیلم‏های چربی، لیپوزوم‏ها و پایه‏های جامد (مانند پلیمرها، فلزات، ورقه‏های سیلیکونی) را دارند(1- 5).

این ویژگی‏های بی‏همتا برای لایه‏های S کاربردهای وسیعی فراهم می آورد، به ویژه در زمینه نانوتکنولوژی و ایجاد ساختار‏های بیومیمتیک (6). شبکه‏های لایه S با آرایه‏های تک مولکولی و خواص تکرار شونده فیزیکی- شیمیایی تا حد مقیاس نانومتر سیستم‏های تجمعی بی همتایی هستند. از آن‏ها می‏توان به عنوان مبنای ساختاری برای یک کیت ساختمانی بیومولکولی شامل مولکول‏های زیستی استفاده کرد (5). محل و ساختار شبکه‏های لایه S به طریق میکروسکوپی الکترونی و نیروی اتمی پژوهش شده است. لایه‏های S نوعی دارای تقارن مورب (p1, p2)، مربعی (p4) و 6 وجهی (p3, p6) هستند (7- 10) (شکل 1).

 
ویژگی‏های مهم لایه S عبارتند از:

1. تخلخل‏های موجود در لایه‏های S از نظر اندازه و ریخت شناسی یکسان هستند و در گستره غشاهای اولترافیلتراسیون می‏گنجند.
2. گروه‏های عاملی موجود بر سطح و در درون تخلخل‏ها از نظر مکان و جهت در موقعیت‏های مناسبی قرار گرفته‏اند و برای امر پیوند مولکول‏های عاملی به شکلی بسیار دقیق در دسترس هستند.
3. زیر واحدهای لایه S جداسازی شده از بسیاری از میکروارگانیسم‏ها قابلیت خود تجمعی مجدد به شکل تک لایه‏های بسته به روی سطوح جامد در سطوح مشترک هوا- آب، به روی تک لایه‏های چربی، و یا روی سطح لیپوزوم‏ها را دارند (1).

شکل 1- تصویر شماتیک از ساختار‏های خودآرایه لایه S تقارن مورب (p1, p2)، مربعی (p4) و 6 وجهی (p3, p6)

در حال حاضر، کاربردهای بالقوه آن از ساخت شاهای اولترافیلتراسیون تا حسگرهای زیستی، کیت‏های تشخیص واکسن، ماتریس‏های جذب و سیستم‏های انتقال برای عاملی کردن سطوح غیرآلی است.
استفاده از این لایه‏ها برای خودآرایی مولکول‏های دیگر بر روی سطوح صاف مبحثی بسیار جدید بوده که امکان ایجاد سطوح هوشمند را می‏دهد. هنگامی که ماکرومولکول‏ها به روش جذب سطحی بر سطوح نشانده می‏شوند عملکرد ساختاری آن‏ها کاهش می‏یابد. علت این امر در دسترس نبودن ساختار عملگرای مولکول زیستی و غیر منظم تثبیت شدن آن است. به همین علت ساختار‏های خود آرایه اهمیت زیادی دارند (11 و 12).

یکی از کاربرد‏های مهم این لایه‏ها ایجاد الگویی برای ساخت لایه‏های خود آرایه از مولکول‏های دیگر زیستی است. به علت اینکه گروه‏های عاملی فعال تکرار شده‏اند با برقراری لیگاند مولکول‏های زیستی دیگر نیز به شکل خود آرایه ایجاد می‏شوند (13). سطوح جامدی که به طور موفقیت آمیزی برای پوشش دهی لایه‏های S استفاده شده‏اند عبارتند از میکا، لیپوزوم‏ها و محلول‏ها. سطوح صاف سیلیکون به علت استفاده گسترده از حسگر‏ها کاندید مناسبی برای خود آرایه کرد‏ن لایه S هستند (14 و 15). در فرایند کریستالیزاسیون عواملی مانند (ترکیب یونی، قدرت یونی، غلظت پروتئین، اسیدیته و دما) که شاخص‏های اساسی به شمار می آیند باید به دقت انتخاب شوند (1). یکی از نکات مهم دیگر نیز اینست که ساختار لایه S تشکیل شده بر سطوح جامد در تمامی سطوح یکسان نیست و شامل حوزه‏های بلوری است که به طور تصادفی به هم اتصال داده شده اند بنابراین، شناخت و مطالعه خود آرایگی آن‏ها اهمیت زیادی دارد (16- 18). در این پژوهش برای نخستین بار کریستالیزاسیون لایه سطحی کالوباکتر بر روی سطوح مختلف بررسی شد. لایه سطحی باکتری‏های گرم منفی کمتر بررسی شده‏اند، این در حالیست که مزایایی از قبیل جداسازی راحت‏تر دارند. ضمن اینکه به علت آن که باکتری کالوباکتر دارای زایده است میزان بالاتری از لایه سطحی بر روی آن وجود دارد. هدف استفاده از سطوح سیلیکون و میکا (به علت امکان به کارگیری این سطوح در حسگر‏های زیستی) تیمار‏های مختلف این سطوح و بررسی تأثیر نوع پوشش بر توانایی ایجاد لیگاند لایه سطحی این باکتری به مولکول مورد نظر بود. شناخت و بررسی این موارد اهمیت زیادی در تولید حسگر‏های بر پایه لایه سطحی دارند.

.مواد و روش‏ها

.کشت باکتری کالوباکتر بر روی‏ محیط پایه با پپتون کم: پودر لیوفیلیزه شده باکتری کالوباکتر از مرکز کشت آمریکا تهیه شده (ATCC No. 19089) و بر روی 50 میلی‏لیتر از محیط کشت کم پپتون (پپتون 2 گرم، عصاره مخمر 1 گرم و 2/0 گرم منیزیم سولفات) کشت داده شد. پس از 4 روز گرمخانه‏گذاری در 25 درجه، نمونه به محیط کشت آگاردار منتقل شد (22). پس از اطمینان از خالص بودن نمونه یک پلیت در دمای منفی 80 درجه سانتی‏گراد و بدون گلیسرول ذخیره‏سازی و پلیت دیگر به 500 میلی‏لیتر پپتون براث منتقل شد. پس از 4 روز گرمخانه‏گذاری در 25 درجه سانتی‏گراد نمونه ‏برای جداسازی پروتئین لایه سطحی استفاده شد (2).

.جداسازی پروتیین‏های خود آرایه لایه S: 500 میلی‏لیتر از پپتون براث در 4000 دور سانتریفیوژ شد. پلت جداسازی شده 2 بار با سرم فیزیولوژی شستشو شد و 10 میلی‏لیتر گوانیدین هیدرو کلراید 5 مولار (شکننده پیوندهای هیدروژنی) به منظور جداسازی لایه S از دیواره باکتری‏ها به آن اضافه شد. پس از 2 ساعت نمونه سانتریفیوز و سوپرناتانت حاوی پروتئین جداسازی شده استخراج شد (3).

.خالص سازی لایه S: به منظور خالص‏سازی پروتئین از گوانیدین هیدروکلراید و سایر نمک‏های موجود، نمونه به کمک کیسه دیالیز (استات سلولز KDa MWCO 12) و در حضور آب به مدت 8 ساعت دیالیز شد. پس از دیالیز نمونه توسط غشا پلی استیرن کات آف 50 و 100 کیلودالتون یک مرحله دیگر خالص‏سازی را نیز گذارند. غلظت لایه سطحی به وسیله محلول بردفورد حاوی کومسی بریلیانت بلو G و اندازه‏گیری جذب آن در طول موج 500 نانومتر تعیین شد. محلول استاندارد با غلظت‏های معین بووین آلبومین سرم تهیه و غلظت آن‏ها به روش بردفورد تعیین شد و غلظت نمونه پروتئین براساس آن اندازه‏گیری شد (23).

.تحلیل SDS-Page الکتروفورز: نمونه پروتئین به وسیله روش سدیم دودسیل سولفات پلی اکریل آمید ژل تحلیل شد. ژل‏های آماده اس دی اس از شرکت سیگما تهیه شد. ژل در بافر MES و در دستگاه مخصوص قرار داده شد. 10 میکرولیتر از محلول پروتئین با 10میکرولیتر بافر الکتروفورز ترکیب و نمونه در چاهک‏های الکتروفورز بارگزاری شد. نمونه‏ها با برقراری ولتاژ 200 ولت و 125 میلی‏آمپر به مدت 30 دقیقه الکتروفورز شدند. سپس، ژل به وسیله کومسی بریلیانت بلو R 250 رنگ آمیزی و به وسیله اسید استیک 10 درصد شسشتو داده شد (1 و 3).

.کریستالیزاسیون لایه S بر روی سیلیکون و میکا: غلظت پروتیئن مورد نظر بر روی یک میلی‏گرم بر میلی‏لیتر تنظیم شد. محلول 10 میلی‏مولار کلرید کلسیم در 5/0 میلی‏مولار بافر تریس هیدروکلریدریک اسید حل شده و به مدت 2 ساعت در تماس با سیلیکون و میکا قرار داده شد. پس از 2 ساعت سیلیکون به وسیله سرم فیزیولوژی شستشو داده شد که واحد‏های کریستاله نشده شسته شوند (4).

.میکروسکوپ نیروی اتمی: سیلیکون که پروتئین بر روی‏ آن خود ارایه شد به منظور تحلیل AFM استفاده شد. عکس‏ها در شرایط هوا و دمای محیط و مد تماسی به وسیله میکروسکوپ آراپژوهش تحلیل و به وسیله نرم افزار (اسپیپ) بررسی شد.

.برقراری لیگاند با مولکول‏های هدف (آنتی بادی ایمینو گلوبولین G): به منظور اتصال گروه‏های عاملی آرایش یافته پروتئین لایه سطحی به مولکول‏های هدف، آنتی بادی ایمینو گلوبولین G به عنوان مدل انتخاب و بررسی شد. ابتدا لایه S به روش یاد شده در حضور بافر کلرید کلسیم بر روی‏ سطوح سیلیکون آرایش یافت و به وسیله سرم فیزیولوژی شستشو شد. سطوح مورد نظر به کمک بافر 2 میلی‏مولار EDC (فعال کننده گروه‏های کربوکسیل) در اسیدیته 5 به مدت 20 دقیقه تیمار شد و اسیدیته آن بلافاصله بر روی 7 تنظیم شد تا از ادامه واکنش و تبدیل گروه‏های کربوکسیل فعال به دیگر گروه‏های عاملی جلوگیری شود. سپس، آنتی بادی متصل به آنزیم پراکسیداز در غلظت 10 میکروگرم بر میلی‏لیتر به سطح سیلیکون اضافه شد و در دمای 4 درجه سانتی‏گراد به مدت 60 دقیقه تیمار و سپس، به وسیله سرم فیزیولوژی شستشو شد. به منظور شناسایی میزان مولکول‏های آنتی بادی متصل شده به لایه S، میزان مولکول‏های پراکسیداز متصل شده به سطح توسط روش جذبی اندازه گیری شد. بدین منظور OPD که سوبسترای واکنش دهنده به این آنزیم پرکسیداز می‏باشد در بافر با اسیدیته 5 آماده شد و به میزان یک میلی‏لیتر به سطح سیلیکون اضافه شد (تمام واکنش در تاریکی انجام شد). جذب محلول در450 نانومتر اندازه گیری شد (3 و 17). به وسیله رسم منحی استاندارد با غلضت معین، میزان مولکول‏های متصل شده به سطح تعیین شدند.

.نتایج

.جداسازی و خالص سازی لایه S: شکل 2 نتایج حاصل از جداسازی و خالص‏سازی پروتئین‏های لایه S از کالوباکتر توسط ژل SDS-Page را نشان می‏دهد. همان‏طور که مشخص است وزن مولکولی پروتئین مورد نظر حدود 96 کیلودالتون است (شکل 2). پروتئین لایه S پس از جداسازی و تأیید وجود آن در تحلیل اس دی اس، به کمک روش برد فورد تعیین غلظت شدند. نمودار غلظت‏های متفاوت سرم آلبومین گاوی ترسیم شد و با استفاده از آن غلظت پروتیئن مورد نظر مشخص شد. نتایج نشان می‏دهد غلظت پروتئین1/0 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر است.

شکل 2- از چپ به راست ردیف 1: پروتئین مارکر، ردیف 2 و 3 لایه جداسازی شده از کالوباکتر در شرایط گوانیدین هیدروکلراید 5 و 4 مولار

.کریستالیزاسیون لایه S به روی سطوح جامد: برای نشان دادن تاثیر نوع سطح جامد بر خودآرایه لایه S، پروتیئن مورد نظر به همراه بافر حاوی کلرید کلسیم (که برای کرسیتالیزاسیون مجدد آن‏ها ضروری است) بر بسترهای سیلیکون و میکا نشانده و ساختار آن‏ها به کمک میکروسکوپ نیروی اتمی بررسی شد. به کمک خراشیدن لایه توسط کانتیلور میکروسکوپ نیروی اتمی با اعمال نیروی بالاتر، ضخامت لایه تشکیل شده مشخص شد. به منظور بررسی نوع تیمار بستر نیز، سیلیکون با مواد هیدروفوب و پلی مرهای هیدروفیل پوشش داده شد (20 و 21).

نتایج نشان می‏دهد لایه S بر روی‏ هر دو سطح ساختار‏های خود آرایه را ایجاد می‏کند که بر روی‏ سطح میکا و سطوح باردار پلی یونی سیلیکون، این دومین‏های بزرگ و به اندازه 800 تا 1000 نانومتر بوده و بر روی‏ بستر سیلیکون هیدروفوب دومین‏های کوچک‏تر و فشرده‏تر تشکیل می‏شوند (شکل 3). شبکه کریستال کاملا منظم در نمونه‏های که بر روی‏ سیلیکون هیدروفوب کریستاله شده بودند، یافت شد (شکل 4) و در باقیمانده نمونه‏ها ساختار‏های خود آرایه با دومین‏های بزرگ 800 تا 1000 نانومتر مشاهده شد. ضخامت لایه 32 نانومتر گزارش شد (شکل 5)

.نتایج ایجاد لیگاند به آنتی بادی: لایه S کریستاله شده بر سطوح سیلیکونی به منظور اتصال لیگاند با آنتی بادی استفاده شد. به این منظور ابتدا گروه‏های کربوکسیل آن فعال‏سازی شد و سپس، به آنتی ایمینو گلوبولین G پراکسیدازدار متصل شد. نتایج نشان ‏داد که آنتی بادی تثبیت شده بر سطوح هیدروفوب در حضور لایه S و بدون حضور آن به ترتیب 100 و 20 میکروگرم آنتی بادی بر روی‏ سطح 1*1 سانتی‏متر است. در مورد سطوح سیلیکون هیدروفوب میزان توانایی سطح در اتصال نسبت به سیلیکون‏های هیدروفیل (70 میکروگرم) بالاتر گزارش شد.

شکل 3- پروتئین لایه S کریستاله شده بر روی‏ سیلیکون هیدروفوب (مقیاس 2 میکرومتر)

شکل 4- کریستال تشکیل شده لایه S بر روی‏ سیلیکون هیدروفوب در بزرگنمایی بالا‏تر (مقیاس 650 نانومتر)

شکل 5- ضخامت لایه S اندازه گیری شده توسط ایجاد خراش به وسیله کانتیلور میکروسکوپ نیروی اتمی