مقدمه

‏باتوجه‏ به‏ افزایش‏ روز‏ افزون‏ جمعیت‏ جهان، نیاز‏ به‏ محصولات‏ غذایی‏ بیش‏ از‏ پیش‏ احساس‏ می‏‏شود. با‏ وجود‏ پیشرفت‏های‏ ‏‏صنعتی‏ بسیاری‏ که‏ از‏ سال1940‏ تاکنون‏ حاصل‏ شده‏ است، آفت‏‏ها شامل‏ علف‏های‏ هرز، حشرات‏ و‏ میکروارگانیسم‏های‏ ‏‏بیماری‏‏زای‏ گیاهی) همچنان‏ مشکل‏ اصلی‏، کاهش‏ تولید‏ در‏ زمین‏های‏ ‏‏کشاورزی‏ به‏ شمار‏ می‏‏روند (1). کنترل‏ علف‏های‏ ‏‏هرز‏ یکی‏ از‏ مسایل‏ اصلی‏ تولید‏ محصولات‏ زراعی‏ در‏ سرتاسر‏ جهان‏ است. روش‏های‏ ‏‏کنترل‏ علف‏های‏ ‏‏هرز‏ شامل‏ روش‏های‏ ‏‏جلوگیری‏ کننده‏‏ از‏ رشد‏ علف‏های‏ ‏‏هرز، روش‏های‏ مکانیکی‏ کنترل‏ شامل‏ رقابت‏ و‏ مدیریت‏ کشت، روش‏های‏ ‏‏کنترل‏ شیمیایی‏ و‏ زیستی‏ است (2). در‏ این‏ میان‏ روش‏ کنترل‏ با‏ کمک‏ علف‏کش‏های‏ ‏‏شیمیایی‏ بیشتر‏ استفاده‏ شده است. با‏ توجه‏ به‏ مقاومت‏ بسیاری‏ از‏ آفت‏‏ها و‏ علف‏های‏ ‏‏هرز‏ به‏ آفت‏کش‏های‏ ‏‏شیمیایی‏ و‏ همچنین،‏ آثار‏‏‏ مضر‏ شدید‏ این‏ آفت‏کش‏‏ها بر‏ سلامت‏ محیط‏ زیست‏ و‏ انسان (3)، استفاده‏ از‏ روش‏های‏ ‏‏جایگزین‏ بسیار‏ مورد‏ توجه‏ قرار‏ گرفته‏ است‏ که‏ در‏ این‏ میان‏ روش‏های‏ ‏‏زیستی‏ و‏ استفاده‏ از‏ عوامل‏ زیستی‏ با‏ توجه‏ به‏ عدم‏ آلودگی‏ محیط‏ زیست‏ و‏ آثار‏‏‏ اختصاصی‏تر‏ مورد‏ توجه‏ زیادی‏ هستند (3).

علف‏کش‏های‏ ‏‏زیستی‏ شامل‏ میکروارگانیسم‏های‏ ‏‏بیماری‏زای‏ گیاهی‏ یا‏ ترکیبات‏ میکروبی‏ حاصل‏ از‏ میکروارگانیسم‏های‏ ‏‏بیماری‏زا‏ ‏‏و‏ غیر‏ بیماری‏زا‏ ‏‏با‏ عنوان‏ فیتوتوکسین‏‏ها هستند‏ که‏ برای‏ کنترل‏ علف‏های‏ ‏‏هرز‏ به‏کار‏ می‏‏روند (2).

پیچک‏ صحرایی‏ با‏ نام‏ علمی‏ Convolvulus arvensis گیاهی‏ دو‏ لپه، چند‏ ساله، خزنده، دارای‏ سطح‏ صاف‏ و‏ بدون‏ کرک‏ بوده‏ و‏ رشد‏ رویشی‏ آن‏ از‏ ابتدای‏ بهار‏ تا‏ شروع‏ سرمای سبک‏ پاییز‏ است. C. arvensisیکی‏ از‏ 10‏ گیاه‏ هرز‏ مهم‏ و‏ مسأله‏‏‏ساز‏ دنیا‏ست‏ و‏ از‏ گیاهان‏ هرز‏ مضر‏ در‏ باغات، مزارع‏ گندم‏ و‏ محصولات‏ تابستانه‏ به‏ شمار‏ می‏‏آید (4‏ و‏ 5). این‏ گیاه،‏ بومی‏ اروپا‏ و‏ غرب‏ آسیا‏ بوده‏ و‏ در‏ مناطق‏ گرمسیری‏ و‏ معتدل‏ توسعه‏ یافته‏ است (5). گیاه C. arvensisبا‏ پیچیدن‏ به‏ دور‏ غلات‏ دانه‏ ریز‏ سبب‏ ایجاد‏ مشکل‏ در‏ امر‏ برداشت‏ آن‏ها‏ می‏‏شود. همچنین، این‏ گیاه ‏به‏ سرما‏ و‏ یخبندان‏ مقاوم‏ بوده‏ و آثار‏‏‏ آسیبی‏ شدیدی‏ بر روی ذرت‏ و‏ نیشکر‏ دارد (4‏ و‏ 5).

استفاده‏ از‏ علف‏کش‏های‏ ‏‏شیمیایی‏ مهم‏ترین‏ راهکار‏ مقابله‏ با‏ این‏ علف‏ هرز‏ است. از‏ جمله‏ مهم‏‏ترین‏ علف‏کش‏های‏ ‏‏شیمیایی‏ مورد‏ استفاده‏ برای‏ کنترل‏ این‏ گیاه‏ می‏‏توان‏ به‏ علف‏ کش [1]‏2,4- D از‏ گروه‏ فنوکسی‏ استیک‏اسید‏ و‏ همچنین،‏ علف‏کش‏ شیمیایی‏ خطرناک‏ [2]MCPA‏ اشاره‏ کرد (4). آثار‏‏‏ تخریبی‏ بالا‏ روی‏ محیط‏ زیست‏ و‏ مقاوم‏ شدن‏ علف‏های‏ ‏‏هرز‏ از‏ جمله‏ پیچک‏ به‏ این‏ علف‏کش‏‏ها از‏ جمله‏ مهم‏ترین‏ مشکلات‏ این‏ آفت‏کش‏های‏ ‏‏شیمیایی‏ است. در‏ روزهای‏ گرم‏ سال‏ اسپری‏ کردن‏ این‏ سموم، سبب‏ تغییر‏ فرمولاسیون‏ آن‏ها‏ و‏ به‏ شدت‏ برای‏ انسان‏ها‏ سمی‏ خواهد شد. همچنین،‏ جذب‏ پوستی‏ این‏ سموم‏ عوارض‏ جبران‏ ناپذیری‏ را‏ به‏ همراه‏ دارد‏ (5). سمیت‏ بالای‏ علف‏کش‏های‏ ‏‏شیمیایی‏ مورد‏ استفاده‏ برای‏ کنترل‏ C. arvensis‏ برای‏ انسان‏ و‏ محیط‏ زیست‏ و‏ مقاوم‏ شدن‏ این‏ علف‏ هرز‏ به‏ این‏ آفت‏کش‏ ها، لزوم‏ توجه‏ به‏ استفاده‏ از‏ عوامل‏ جایگزین‏ با‏ کارایی‏ بالا‏ و‏ سمیت‏ کمتر‏ را‏ روشن‏ می‏کند.

پروتئین‏ Nep1[3]‏ یک‏ علف‏کش‏ زیستی‏ است‏ که‏ اولین‏ بار‏ در‏ سال‏ 1995توسط‏ بیلی[4]‏ از‏ عصاره‏ کشت‏ قارچ‏ Fusarium oxysporum‏‏‏ کشف‏ و‏ خالص‏سازی‏ ‏‏شد (6). این‏ پروتئین‏ باعث‏ تحریک‏ تولید‏ اتیلن‏ و‏ بافت‏ مردگی‏ در‏ گیاهان‏ دولپه‏‏ای‏ می‏‏شود. طیف‏ میزبانی‏ این‏ پروتئین‏ دامنه‏ وسیعی‏ از‏ گیاهان‏ دولپه‏ است، اما‏ در‏ تک‏ لپه‏ای‏‏ها فاقد‏ خاصیت‏ تخریب‏پذیری‏ است. این‏ پروتئین‏ نقش‏ مهمی‏ در‏ توسعه‏ بیماری‏ توسط ‏F. oxysporum‏‏ داشته (7‏ و‏ 8) و‏ به‏ عنوان‏ یک‏ نامزد‏ مناسب‏ از‏ علف‏‏کش‏های‏ زیستی‏ در‏ مزارع‏ تک‏ لپه‏‏ای‏ به‏ ویژه‏ مزارع‏ غلات‏ مثل‏ گندم، برنج، جو، ذرت‏ و‏... معرفی‏ شده‏ است‏ (7‏ و‏ 9).

هدف‏ از‏ انجام‏ این‏ پژوهش‏ که‏ برای‏ نخستین‏ بار‏ انجام‏ می‌شود‏، تولید‏ پروتئین‏ نوترکیب‏ Nep1‏ به‏ عنوان‏ یک‏ عامل‏ زیستی‏ توانمند‏ برای‏ کنترل‏ علف‌های‏ هرز‏ دو‏ لپه‌ای‏ در‏ مزارع‏ غلات‏ تک‏ لپه‌ای‏ است. در‏ این‏ میان‏ از‏ علف‏ هرز‏‏ C. arvensis‏ به‏ عنوان‏ یک‏ علف‏ هرز‏ مقاوم‏ و‏ رایج‏ در‏ مزارع‏ غلات‏ تک‏ لپه‌ای‏ مثل‏ گندم‏ و‏ جو‏ برای‏ ارزیابی‏ فعالیت‏ پروتئین‏ نوترکیب‏ تولید‏ شده‏ استفاده‏ شد.

.مواد‏ و‏ روش‏ها

.کشت‏ قارچ‏ و‏ استخراج‏ RNA: به‏ منظور‏ کشت‏ قارچ‏ از‏ Fusarium oxysporum‏‏‏ f. sp. lycopersici UTMC01733‏ ‏(تهیه‏ شده‏ از‏ کلکسیون‏ میکروارگانیسم‏های‏ ‏‏دانشگاه‏ تهران[5]) در‏ محیط‏ زاپکس‏ داکس‏ برات[6]‏ همراه‏ با‏ یک درصد کازو‏ آمینواسید‏ به‏ مدت‏ 4‏ روز،‏ در‏ دمای‏ 30‏ درجه‏ سانتی‏گراد‏ و‏ 200‏ دور‏ در‏ دقیقه‏ استفاده‏ شد. در‏ روز‏ چهارم‏ مقدار‏ 200‏ میلی‏‏‏‏گرم‏ از‏ میسلیوم‏ قارچی‏ در‏ هاون‏ سرد‏ شستشو‏ داده،‏ با‏ اتانول‏ ریخته‏ شد‏ و‏ به‏ آن‏ گوانیدین‏ ایزوتیوسیانات‏ 4/5‏ مولار‏ با‏ اسیدیته 5/6‏ به‏ همراه‏ نیتروژن‏ مایع‏ اضافه‏ و تا‏ رسیدن‏ به‏ یک‏ پودر‏ نرم‏ به‏ خوبی‏ خرد‏ شد. به‏ منظور‏ استخراج‏ RNA، محلول‏ سلول‏های‏ خرد‏ شده‏ به‏دست‏ آمده‏ از‏ مرحله‏ قبل پس ‏‏از‏ هوموژن‏ کردن‏ در‏ 75000‏ دور‏ در‏ دقیقه‏ با‏ هموژنایز‏ (هایدولف- آلمان‏ مدل‏ سایلنت‏ کروشر- اس[7]‏) با‏ کیت‏ استخراج‏ RNA‏ با‏ خلوص‏ بالا[8]‏ شرکت روشه‏ آلمان[9]‏ استخراج‏ شد.

.ساخت‏ cDNA‏ و‏ انجام‏ RT- PCR: مقدار دو‏ میکرولیتر‏ از‏ RNA‏ استخراج‏ شده‏ به‏ منظور‏ ساختن‏ cDNA‏ تک‏ رشته‏ توسط‏ کیت‏ اکسپند‏ ریورس‏ ترانس‏ کریپتاز[10]‏ شرکت‏ روش‏ آلمان‏ استفاده شد. cDNA‏ ساخته‏ شده‏ در‏ ادامه‏ برای‏ تکثیر‏ ژن‏ nep1‏ با‏ استفاده‏ از‏ پرایمر‏های‏ ‏‏اختصاصی‏ ژن‏ استفاده شد. برای‏ انجام‏ PCR‏ از‏ پرایمر‏ اختصاصی‏ ژن‏ رفت:

.5´CATATGGCCGTAGTTAACCAT3´.

با‏ جایگاه‏ برش‏ آنزیمی‏ NdeI‏ و‏ پرایمر‏ اختصاصی‏ ژن‏ برگشت:‏

.5´GGATCCTCAGGACCAGGCCTT3´‏.

با‏ جایگاه‏ برش‏ آنزیم‏ BamHI‏ استفاده‏ شد. چرخه‏‏های‏ PCR‏ انجام‏ شده‏ برای‏ تکثیر‏ ژن‏ nep1شامل‏ مرحله‏ واشرست‏ در‏ دمای‏ 94‏ درجه‏ سانتی‏گراد‏ به‏ مدت‏ 30‏ ثانیه، دمای‏ اتصال‏ پرایمر‏ 60‏ درجه‏ سانتی‏گراد‏ به‏ مدت‏ 30‏ ثانیه‏ و‏ دمای‏ پلیمریزاسیون‏ 72‏ درجه‏ سانتی‏گراد‏ به‏ مدت‏ 90‏ ثانیه‏ و‏ به‏ شکل‏ 30‏ چرخه‏ انجام‏ شد. محصول‏ PCR‏ به‏ منظور‏ تایید‏ ژن‏ جداسازی‏ شده‏ توسط‏ شرکت‏ ماکروژن‏ (کره‏ جنوبی) تعیین‏ توالی‏ شد‏ (10).

.کلونینگ‏ ژن‏ nep1:محصول‏ PCR‏ به‏ دست‏ آمده‏ به‏ شکل انتهای‏ صاف‏ در‏ ابتدا‏ درون‏ حامل‏ pUC19‏ کلون‏‏ و‏ با‏ روش‏ شوک‏ حرارتی‏ و‏ تیمار‏ با‏ CaCl_2‏ به‏ داخل‏ سلول‏های‏ ‏‏شایسته‏ E. coli‏ نوا- بلو[11]‏ انتقال‏ داده‏ شد. پلاسمید‏ نوترکیب‏ از‏ کلونی‏های‏ سفید‏ استخراج‏ شده‏ و‏ با‏ آنزیم‏های‏ ‏‏NdeI‏ و‏ BamHI‏ شرکت‏ فرمنتاس‏ بریده‏ شد. ژن‏ nep1‏ بریده‏ شده‏ از‏ روی‏ ژل‏ خالص‏سازی‏ ‏‏شد. برای‏ تولید‏ کلون‏های‏ ‏‏نهایی‏ واکنش‏ اتصال‏ بین‏ حامل‏ بیانی‏ pET16b‏ بریده‏ شده‏ با‏ آنزیم‏های‏ ‏‏NdeI‏ و‏ BamHI‏ با‏ قطعه‏ nep1‏ با‏ انتهای‏ چسبنده‏ مرحله‏ قبل‏ انجام‏ شد. برای‏ انتقال‏ به‏ میزبان‏ نهایی‏ از‏ روش‏ شوک‏ حرارتی‏ و‏ تیمار‏ با‏ CaCl_2‏ استفاده‏ شد‏ و‏ محصول‏ واکنش‏ لیگاسیون‏ به‏ میزبان‏ بیانی‏ (DE3) BL21 E. coli‏ انتقال‏ داده‏ شد. از‏ کلون‏های‏ ‏‏نوترکیب،‏ پلاسمید‏ استخراج‏ و‏ برای‏ تایید‏ نهایی‏ انجام‏ صحیح‏ فرایند‏ کلونینگ‏ به‏ شرکت‏ ماکروژن‏ (کره‏ جنوبی) ارسال‏ شد‏ (10).

.تولید‏ پروتئین‏ Nep1‏ نوترکیب‏ و‏ خالص‏سازی‏ ‏‏آن: در‏ ابتدا‏ باکتری‏ نوترکیب‏ داخل‏ محیط‏ کشت‏ LB‏ همراه‏ با‏ 100‏ میکروگرم‏ در‏ میلی‏‏‏‏لیتر‏ از‏ آمپی‏سیلین‏، دمای‏ 37‏ درجه‏ سانتی‏گراد‏ و‏ دور‏ همزن‏ 200‏ دور‏ در‏ دقیقه‏ کشت‏ داده‏ شد‏ و‏ پس‏ از‏ اینکه‏ میزان‏ جذب‏ در‏ طول‏ موج‏ 600‏ نانومتر‏ به‏ حدود‏ 5/0‏ رسید،‏ یک‏ میلی‏‏‏‏مولار‏ از‏ محلول‏ IPTG[12]‏ برای‏ القای‏ بیان‏ ژن‏ به‏ آن‏ افزوده‏ شد. پس‏ از‏ القای‏ باکتری‏‏ها به‏ مدت‏ 5‏ ساعت‏ در‏ همان‏ دور‏ و‏ دما، روی‏ شیکر‏ قرار‏ داده‏ شدند. باکتری‌های‏ آماده‏ شده‏ در‏ ادامه‏ به‏ مدت‏ 10‏ دقیقه‏ در‏ 4000‏ دور‏ در‏ دقیقه‏ سانتریفیوژ‏ و‏ رسوب‏ سلولی‏ دو‏ بار‏ با‏ محلول‏ سرم‏ فیزیولوژی‏ شستشو‏ داده‏ شدند. برای‏ لیز‏ سلول‏‏ها به‏ رسوب‏ سلولی‏ 100‏ میکروگرم‏ در‏ میلی‏‏‏‏لیتر‏ از‏ پودر‏ لیزوزیم‏ به‏ همراه‏ مهار‏ کننده‏ پروتئاز‏ [13]PMSF‏ با‏ غلظت‏ 1/0‏ میلی‏‏‏‏مولار‏ اضافه‏ و‏ 30‏ دقیقه‏ در‏ دمای‏ 37‏ درجه‏ سانتی‏گراد‏ نگهداری‏ شد. با‏ توجه‏ به‏ بیان‏ برچسب‏ هیستیدینی‏ در‏ ابتدای‏ پروتئین‏ نوترکیب‏ برای‏ خالص‏سازی‏ ‏‏پروتئین‏ از‏ ستون‏های‏ ‏‏کروماتوگرافی
NI- NTI[14]‏ و‏ کیت‏ استخراج‏ پروتئین‏ شرکت‏ کیاژن[15] استفاده‏ شد. از‏ روش‏ SDS- PAGE‏ به‏ منظور‏ بررسی‏ تولید‏ و‏ خالص‏سازی‏ ‏‏پروتئین‏ نوترکیب‏ تولید‏ شده‏ استفاده‏ شد‏ (10).

.کشت‏ گیاه‏ و‏ سنجش‏ فعالیت‏ زیستی‏ پروتئین‏ نوترکیب‏ تولید‏ شده: بذر‏ گیاه‏ هرز‏ C. arvensisاز‏ شرکت‏ ورتا‏ صنعت‏ اصفهان‏ تهیه‏ شد‏ و‏ در‏ شرایط‏ گلخانه‏‏ای‏ درون‏ گلدان‏های‏ ‏‏10‏ سانتی‏ متر‏ کشت‏ داده‏ شد. گیاه‏ بالغ‏ 8 تا 10 هفته‏‏ای‏ به‏ منظور‏ ارزیابی‏ فعالیت‏ زیستی‏ پروتئین‏ نوترکیب‏ تولید‏ شده‏ استفاده شد. به‏ منظور‏ تعیین‏ غلظت‏ پروتئین‏ تولید‏ شده‏ از‏ روش‏ برادفورد‏ استفاده‏ شد. از‏ آلبومین‏ سرم‏ انسانی‏ به‏ منظور‏ رسم‏ منحنی‏ استاندارد‏ و‏ تعیین‏ غلظت‏ پروتئین‏ استفاده‏ شد. پروتئین‏ خالص‏سازی‏ ‏‏شده‏ در‏ محلول‏ Tris- HCl‏ با‏ غلظت‏ 1/0‏ میلی‏‏‏‏مولار‏ رقیق‏سازی‏ ‏‏شد‏ و‏ مقدار‏ 2‏ میلی‏‏‏‏لیتر‏ از‏ پروتئین‏ رقیق‏ شده‏ با‏ غلظت‏ نهایی‏ 60‏ میکروگرم‏ در‏ میلی‏‏‏‏لیتر‏ در‏ بین‏ ساعت‏های‏ ‏‏10 تا14‏ به‏ سطح‏ برگ‏های‏ ‏‏گیاه‏ بالغ‏ اسپری‏ شد. از‏ اسپری محلول‏ Tris- HCl‏ با‏ غلظت 1/0‏ میلی‏‏‏‏مولار‏ به‏ عنوان‏ شاهد‏ بر‏ سطح‏ گیاه‏ اسپری‏ شد. تمامی‏ سنجش‏های‏ ‏‏گیاهی‏ دو‏ بار‏ و‏ هر‏ بار‏ روی‏ سه‏ گیاه‏ مستقل‏ انجام‏ شد.

.نتایج

.جداسازی‏ ژن‏ nep1‏ از‏ قارچ‏ Fusarium oxysporum‏‏: ژن‏ nep1‏ قارچی‏ دارای‏ یک‏ اینترون‏ 58‏ نوکلئوتیدی‏ است‏ که‏ در‏ میان‏ دو‏ اگزون‏ قرار‏ گرفته‏ است. به‏ همین‏ منظور‏ برای‏ جداسازی‏ ژن‏ از‏ واکنش‏ RT- PCR‏ استفاده‏ شد. پس‏ از‏ جداسازی‏ RNA‏ و‏ انجام‏ واکنش‏ RT- PCR‏ با‏ پرایمرهای‏ اختصاصی‏ ژن‏ nep1، یک‏ قطعه‏ حدود‏ 700‏ نوکلئوتیدی‏ جداسازی‏ شد‏ که‏ در‏ شکل‏ 1‏ مشاهده‏ می‏‏شود. قطعه‏ جداسازی‏ شده پس ‏‏از‏ خالص‏سازی‏ ‏‏تعیین توالی‏ شد‏ که‏ نتایج‏ انطباق‏ توالی‏ به‏ دست‏ آمده‏ با‏ توالی‏ ثبت‏ شده‏ در‏ بانک‏ ژنی[16]‏ 99‏ درصد‏ هومولوژی‏ بین‏ ژن‏ جداسازی‏ شده‏ با‏ ژن‏ nep1‏ جداشده‏ از‏ F. oxysporum‏‏ با‏ شماره‏ دسترسی‏ AF036580‏ را‏ نشان‏ داد.

شکل1- ژل‏ الکتروفورز‏ آگاروز‏ واکنش‏ جداسازی‏ ژن‏ nep1‏ با‏ واکنش‏ RT- PCR‏. ردیف‏ 1‏ DNA‏ سایز‏ مارکر[17]‏ از‏ شرکت‏ فرمنتاس‏ و‏ ردیف‏ 2‏ باند‏ به‏ دست‏ آمده‏ از‏ واکنش‏ RT- PCR‏ با‏ طول‏ حدود‏ 700‏ نوکلئوتید‏ را‏ نشان‏ می‏‏دهد.

تولید‏ و‏ خالص‏سازی‏ ‏‏پروتئین: به‏ منظور‏ تولید‏ پروتئین‏ نوترکیب‏ و‏ خالص‏سازی‏ ‏‏آن‏ از‏ روش‏ SDS- PAGE‏ استفاده‏ شد. در‏ این‏ مرحله‏ به‏ منظور‏ بررسی‏ تولید‏ پروتئین‏ نوترکیب، سوپ‏ سلولی‏ تهیه‏ شده‏ از‏ سلول‏های‏ ‏‏القا‏ شده‏ نوترکیب‏ همراه‏ با‏ سلول‏ (DE3) BL21 E. coli‏ حاوی‏ پلاسمید‏ pET16b، اما‏ بدون‏ ژن‏ nep1‏ به‏ عنوان‏ شاهد‏ منفی‏ روی‏ SDS- PAGE‏ انتقال‏ داده‏ شد‏ که‏ نتایج‏ به‏ دست‏ آمده‏ در‏ شکل‏ 2‏ ردیف‏های‏ ‏‏2‏ و‏ 3‏ مشاهده‏ می‏‏شود. با‏ توجه‏ به‏ این‏ شکل‏ در‏ ردیف‏ شماره‏ 2‏ که‏ به‏ عنوان‏ شاهد‏ منفی‏ پروتئین‏های‏ ‏‏سوپ‏ سلولی‏ استفاده‏ شده‏ بیان‏ پروتئین‏ شاخصی‏ در‏ حدود‏ 25‏ کیلو‏ دالتون‏ مشاهده‏ نمی‏‏شود، در‏ مقابل‏ در‏ ردیف‏ 3‏ بین‏ باندهای‏ 20‏ تا‏ 27‏ کیلو‏ دالتون‏ بیان‏ یک‏ پروتئین‏ به‏ صورت‏ شاخص‏ افزایش‏ یافته‏ است. با‏ توجه‏ به‏ اینکه‏ NLPs‏ حدود‏ 22‏ تا‏ 28‏ کیلودالتون‏ وزن‏ دارند. این‏ باند‏ مورد‏ نظر‏ احتمالاً‏ مربوط‏ به‏ پروتئین‏ نوترکیب‏ تولید‏ شده‏ است.

شکل‏ 2-‏ تصویر‏ ژل‏ SDS- PAGE‏ مربوط‏ به‏ خالص‏سازی‏ ‏‏پروتئین‏ Nep1. ردیف‏ 1:‏ پروتئین‏ سایز‏ مارکر[18]‏ شرکت‏ فرمنتاس،
ردیف2:‏ سوپ‏ لیزشده‏ سلولی‏ از‏ باکتری‏ (DE3) BL21 E. coli‏ حاوی‏ pET16b‏ و‏ بدون‏ ژن‏ nep1‏ به‏ عنوان‏ شاهد‏ منفی،

ردیف‏ 3‏:‏ سوپ‏ لیزشده‏ سلولی‏ از‏ باکتری (DE3)  BL21 E. coli‏ حاوی‏ پلاسمید‏ نوترکیب‏ pET16b/nep1‏،

ردیف‏ 4:‏ پروتئین‏ خالص‏سازی‏ ‏‏شده‏ با‏ وزن‏ تقریبی‏ 25‏ کیلو‏ دالتون.

در‏ ردیف‏ چهارم‏ از‏ شکل‏ 2‏ تصویر‏ پروتئین‏ خالص‏سازی‏ ‏‏با‏ نیکل‏ مشاهده‏ می‏‏شود. حضور‏ این‏ باند‏ پروتئینی‏ حدود‏ 24‏ کیلو‏ دالتونی‏ نشان‏ می‏‏دهد‏ که‏ احتمالاً‏ پروتئین‏ تولید‏ شده‏ در‏ ردیف‏ 3‏ در‏ سوپ‏ لیز‏ شده‏ سلولی‏ همان‏ پروتئین‏ نوترکیب‏ Nep1‏ است.

.بررسی‏ فعالیت‏ زیستی‏ پروتئین‏ تولید‏ شده‏ روی‏ گیاه C. arvensis: به‏ دنبال‏ تولید‏ پروتئین‏ نوترکیب‏ Nep1‏ و‏ تعیین‏ غلظت‏ آن‏ با‏ روش‏ براد‏ فورد، میزان 2‏ میلی‏‏‏‏لیتر‏ از‏ پروتئین‏ با‏ غلظت60‏ میکروگرم‏ در‏ میلی‏‏‏‏لیتر‏ بر‏ سطح‏ برگ‏های‏ ‏‏گیاه‏ بالغ‏ پیچک‏ صحرایی‏ اسپری‏ شد. نتایج‏ بررسی‏ فعالیت‏ زیستی‏ پروتئین‏ تولید‏ شده‏ در‏ شکل‏ 3‏ مشاهده‏ می‏‏شود. براساس نتایج به دست آمده، پس ‏‏از‏ اسپری‏ پروتئین‏ به‏ سطح‏ گیاه پس ‏‏از‏ گذشت‏ 2‏ روز‏ نشانه‌های‏ کلروز‏ و‏ زردی‏ و‏ به‏ دنبال‏ آن‏ نکروز‏ بر‏ روی‏ گیاه‏ ظاهر‏ شد‏ و پس ‏‏از‏ 5‏ روز‏ نکروز‏ کامل‏ و‏ مرگ‏ گیاه‏ مشاهده‏ شد. در‏ مورد‏ آزمایش‏ شاهد، یک‏ گیاه‏ تنها‏ با‏ بافر‏ و‏ بدون‏ پروتئین‏ نوترکیب‏ به‏ عنوان‏ شاهد‏ منفی‏ تیمار‏ شده‏ بود‏ و‏ یک‏ گیاه‏ دیگر‏ با‏ 2‏ میلی‏‏‏‏لیتر‏ از‏ پروتئین‏ با‏ غلظت‏ 60 میکروگرم‏ در‏ میلی‏‏‏‏لیتر‏ که‏ قبل‏ از‏ تیمار‏ محلول‏ پروتئینی‏ به‏ مدت‏ 15‏ دقیقه‏ تیمار‏ حرارتی‏ در‏ 100‏ درجه‏ سانتی‏گراد‏ انجام‏ شد. در‏ مورد‏ هر‏ دو‏ گیاه‏ شاهد پس ‏‏از‏ گذشت‏ 5‏ روز‏ هیچگونه‏ علامتی‏ از‏ نکروز‏ و‏ مرگ‏ گیاه‏ مشاهده‏ نشد.

همان‏گونه‏ که‏ در‏ شکل‏ 3‏ مشاهده‏ می‌شود‏ گیاه‏ تیمار‏ شده‏ با‏ پروتئین‏ نوترکیب‏ Nep1‏ دچار‏ آسیب‏ جدی‏ شده‏ و‏ تیمار‏ گیاه‏ هرز‏ با‏ این‏ عامل‏ زیستی پس ‏‏از‏ 5‏ روز‏ باعث‏ مرگ‏ کامل‏ آن‏ شده‌است.

شکل3-‏ در‏ شکل‏ الف- 1‏ گیاه‏ شاهد‏ که‏ فقط‏ با‏ بافر‏ اسپری‏ شده‏ است‏ مشاهده‏ می‏‏شود. در‏ شکل‏ الف- 2‏ تصویر‏ گیاه‏ مورد‏ آزمایش‏ دو‏ روز پس ‏‏از‏ تیمار‏ با‏ پروتئین‏ نوترکیب‏ Nep1‏ مشاهده‏ می‏‏شود. در‏ شکل‏ ب- 1‏ گیاه‏ شاهد‏ و‏ در‏ شکل‏ ب- 2‏ گیاه‏ مورد‏ آزمایش‏ در‏ روز‏ پنجم‏ مشاهده‏ می‏‏شود. ج-‏ تصویر‏ شروع‏ نکروز‏ در‏ برگ‏ گیاه‏ پیچک‏ صحرایی‏ 24‏ ساعت پس ‏‏از‏ اسپری‏ پروتئین‏ نوترکیب‏ Nep1. در‏ شکل‏ د- 1‏ برگ‏ جدا‏ شده‏ گیاه‏ شاهد‏ پیچک‏ و‏ در‏ شکل‏ د- 2‏ برگ‏ گیاه‏ تیمار‏ شده‏ با‏ Nep1‏ نوترکیب‏ در‏ روز‏ چهارم‏ مشاهده‏ می‏‏شود. در‏ شکل‏ ﻫ- 1 و‏ ﻫ- 2‏ گیاه‏ شاهد‏ اسپری‏ شده‏ با‏ پروتیئن‏ Npe1‏ نوترکیب‏ تقلیب‏ شده‏ با‏ حرارت‏ به‏ ترتیب‏ در‏ روز‏ اول‏ و‏ پنجم‏ مشاهده‏ می‏‏شود.